CZ302683B6

CZ302683B6 - Probiotické kmeny Lactobacillus fermentum 16A/1 a Lactobacillus crispatus 13A a jejich využití k vaginální aplikaci

Info

Publication number: CZ302683B6
Application number: CZ20100933A
Authority: CZ
Inventors: Cadová@Lenka
Original assignee: Valosun A.S.
Priority date: 2010-12-15
Filing date: 2010-12-15
Publication date: 2011-08-31
Also published as: CZ2010933A3

Abstract

Rešení se týká probiotických kmenu Lactobacillus fermentum 16 A/1 (CCM 7879) a Lactobacillus crispatus 13A (CCM 7878), uložených v Ceské sbírce mikroorganismu Prírodovedecké fakulty Masarykovy univerzity, Tvrdého 14, 602 00 Brno, a jejich použití k prevenci ci terapii vaginálních infekcí a k obnovení a stabilizaci vaginálního prostredí.

Description

Probiotické kmeny Lactobacillus fermentum 16A/1 a Lactobacillus erispatus 13A a jejich použití k vaginální aplikaci

Oblast techniky

Vynález se týká dvou probiotických kmenů Lactobacillus fermentum 16A/1 (CCM 7879) a Lactobacillus erispatus I3A (CCM 7878), které byly izolovány z vagíny zdravých žen a které jsou určeny k použití ve vaginálních prostředcích určených k prevenci a léčbě vaginálních oneio mocnění způsobených patogenními bakteriemi. Kmeny se svými vlastnostmi a účinky vzájemně doplňují, jejich kombinace je tudíž unikátní. Oba probiotické kmeny jsou uloženy v České sbírce mikroorganismů Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity v Brně.

i? Dosavadní stav techniky

Probiotické bakterie se již po několik desetiletí používají v nej různějších výrobcích pro jejich blahodárné účinky na celkový zdravotní stav organismu. Mechanismus jejich působení spočívá v jejich schopnosti kompetice o místa adheze s patogenními mikroorganismy, dále v produkci anti20 mikrobiálních látek a také v modulaci imunitního systému hostitelského organismu. K vaginální aplikaci se nejčastěji používají kmeny rodu Lactobacillus, v menší míře pak rod Streptococcus. Výrobky jsou obvykle ve formě vaginálních tablet, čípků nebo tobolek a jsou registrovány buď jako zdravotnický prostředek, nebo léčivý přípravek. Jistou nevýhodou těchto výrobků je často nevaginální původ obsažených probiotických kmenů, což může vést k nežádoucím alergickým reakcím (svědění, pálení). Dalším nedostatkem je geografický původ kmenů. Často nelze geografický původ vůbec dohledat, přičemž efektivnost působení probiotických kmenů je na geografickém původu v nemalé míře závislá.

o Podstata vynálezu

Nové probiotické kmeny Lactobacillus fermentum 16A/1 (CCM 7879) a Lactobacillus críspatus 13A (CCM 7878) výše uvedené nedostatky překonávají. Byly izolovány zvaginy zdravých českých žen, čili jak zdroj, tak i geografický původ jsou optimální pro jejich potencionální použití k prevenci či terapii poševních infekcí a k obnovení a stabilizaci poševního prostředí. Probiotické kmeny Lactobacillus fermentum 16A/1 a Lactobacillus erispatus 13A jsou deponovány v České sbírce mikroorganismů a byly u nich stanoveny základní vlastnosti, které zajišťují jejich probiotické působení - vitalita po lyofilizaci, baktericidní a kandidacidní aktivita, produkce kyseliny mléčné, produkce peroxidu vodíku, adherence k vaginálnímu epitelu, odolnost vůči antibiotikům, imunomodulační vlastnosti. Kombinace obou kmenů je stabilní, životaschopná a ve svých účincích výjimečně se doplňující směs splňující přísné požadavky moderní medicíny.

Izolace: poševní stěry žen splňujících podmínky: zcela zdravé, které pravidelně neužívají žádné látky; premenopauzální, věk 20 až 40 let; ženy, které neužívaly v posledních 14 dnech antibiotic45 kou léčbu; ženy neužívající hormonální antikoncepci min. 3 měsíce; doba odběru - uprostřed menstruačního cyklu, tj. těsně po ovulaci; min. 2 dny po nechráněném pohlavním styku. Kultivační podmínky: médium MRS, CO₂/anaerobně, 36,5 °C

Identifikace: presumptivní identifikace založena na rep-PCR (GTG₅), následné identifikace: biotypizace (API 50CH, apiweó; konvenčně), ribotypizace (RiboPrinter), MALDI-TOF MS.

- 1 CZ 302683 B6

Stanovení růstových křivek a vitality po lyofilizaci

Metodika: kmeny se kultivují na M.R.S. agaru (24 h v atmosféře 5% CO?) a naočkují se do tekutého růstového média M.R.S. bujónu. Spektrofotometricky se suspenze nastaví při vlnové délce

540 nm na absorbanci 0,01 oproti čistému M.R.S. bujónu a inkubuje se ve vícero sterilních zkumavkách při teplotě 37 °C v prostředí 5% CO?. V hodinových časových intervalech se spektroťotometricky měří absorbance v jednotlivých zkumavkách oproti čistému médiu při vlnové délce 540 nm do dosažení vrcholu exponenciálního růstu. V průběhu měření se bakteriální kultura udržuje. Ze získaných hodnot absorbance se sestrojí růstová křivka.

io

Příprava lyofilizátů: kmeny vykultivované na M.R.S. agaru (v atmosféře 5% CO₂) se naočkují do růstového média M.R.S. a nechají se inkubovat po dobu do dosažení vrcholu exponenciální fáze růstové křivky při vhodné teplotě v prostředí 5% CO?. Narostlá kultura se centrifuguje při 39 200 m.s po dobu 30 min v centrifuze s chlazením. Supematant se oddělí a sediment se pro15 myje sterilní vodou. Tento postup se několikrát opakuje. Získaný sediment se po rozsu spěn do vání ve sterilní vodě zlyofilizuje.

Vitalita

2o Lyoťilizáty kmenů se rozsuspendují ve fyziologickém roztoku (pH 7,2). Získaná suspenze se naředí fyziologickým roztokem v geometrické řadě. Z každého ředění se nanese určité množství na desky s M.R.S. agarem a inkubuje se potřebnou dobu při vhodné teplotě v atmosféře 5% CO?. Po inkubaci se vyberou ředění s počitatelným množstvím kolonií (20 až 200 kolonií). Kolonie se spočítají a vypočítá se počet živých buněk na 1 g lyofilizátu.

kmen	ředění	počet buněk/ ml
13A	10’⁵	7,60 x 10’
16A/1	10'³	2,50 x 10*

Stanovení imunomodulační aktivity

Fagocytová aktivita a fagocytový index izolovaných lidských leukocytů: k 100 μΙ suspenze leukocytů (2xl0⁶/ml) v mikrozkumavkách se přidá 50 μΐ usmrcených buněk Streptococcus faecalis (1x10⁸ buněk zbarvených 1% methylenovou modří). Zpravidla se dělá 6 paralelních stanovení. Za stálého míchání se vzorky inkubují na vodní lázni pri teplotě 37 °C po dobu l h. Celý obsah mikrozkumavek se opatrně rozetře pomoct mikropipety na podložní sklíčka a nechají se vysušit na vzduchu při laboratorní teplotě. Preparáty se barví podle Wrighta. Sleduje se počet fagocytů stejně jako množství pohlcených bakterií. Fagocytová aktivita se vypočítá jako % fagocytujících buněk ze 100 monocytu. Fagocytový index se vypočítá jako průměrné množství fagocytových bakterií najedou fagocytující buňku.

Lysozymová aktivita: Princip stanovení lysozymové aktivity spočívá v tom, že důsledkem působení lysozymu na buněčnou stěnu grampozitivních bakterií je lýze buňky, která se projeví poklesem absorbance. Do otvorů mikrotitrační destičky s plochým dnem se napipetuje 150 μΐ supernatantu získaného po dezintegraci suspenze jednotlivých vzorků lidských leukocytů po 15 h inkubace a 50 μΙ suspenze Micrococcus luteus. Z každého vzorku se dělá 6 paralelních stanovení. Měří

4? se absorbance při vlnové délce 410 nm oproti vzduchu v čase 0 a 20 min spektrofotometricky (DYNATECH MR5000).

Peroxidázová aktivita: Na stanovení peroxidázové aktivity se použije supematant získaný po dezintegraci suspenze jednotlivých kmenů. Dezintegrované buňky se centrifugují při 39 200 m.s² po dobu 20 min. Do otvorů mikrotitrační destičky s plochým dnem se nanese 150 μΐ supematantu získaného po dezintegraci suspenze jednotlivých kmenů a 50 μΙ substrátu pro peroxidázu připra7 veného těsně před použitím. Z každého vzorku se dělá 6 paralelních stanovení. Měří se absorbance při vlnové délce 490 nm oproti vzduchu v čase 0 a 20 min spektrofotometricky (DYNATECH MR 5000). Po 20 min se reakce zastaví přidáním 50 μΐ kyseliny sírové (4 mol.l ') a znovu se změří absorbance.

Adherence k epitelovým buňkám (alternativní metoda stanovení hydrofobnosti)

Testovaný kmen se naočkuje do M.R.S. bujónu a nechá se růst do vrcholu exponenciálního růstu. Vykultivovaná kultura se centrifuguje při 39 200 m.s ² po dobu 20 min, sediment se promyje io v tlumivém roztoku na hydrofobnost a následně se naředí na určenou absorbancí. 4 ml teto suspenze se smíchá s 1,0 ml xylenu a směs se 1 až 2 min promíchává. Následně se nechá 30 min stát. Kapilárou se odebere vodní vrstva do kyvety a měří se pokles absorbance při vybrané vlnové délce oproti absorbancí základní suspenze.

kmen	% hydrofobnosti	průměr
13A	74,55	64,23
53,91
16A/1	48,71	56,90
65,08

Produkce kyseliny mléčné

Jednotlivé kmeny se naočkují do M.R.S. bujónu a Ínkubují 18 h při 37 °C v 5% atmosféře CO₂.

2o Vykultivovaná kultura se zcentrifuguje při 39 200 m.s ² po dobu 20 min. Poté se 2,5 g buněk z mokré masy přenese do 25 ml fosfátového tlumivého roztoku (pH 7,0). Dezintegrované buňky (dezintegrace 4 x 20s při 18 kHz) se centrifugují pri 39 200 m.s^-2 po dobu 20 min. Do kyvety se vloží: 1 ml supematantu po centrifugací, 2 ml roztoku 1 (Glycin 75,1 g + hydrazin sulfát 52,1 g doplnit H₂O do 800 ml, pH 9,5) a 2 ml roztoku NAD (900 mg β-NAD v 30 ml vody). Jako porovnávací roztok slouží fosfátový tlumivý roztok (pH 7,0). Měří se absorbance při 340 nm (El), potom se přidá 0,02 ml roztoku L-LDH (2250 U/ml L-LDH rozpuštěno ve fosfátovém tlumivém roztoku, pH 7,0). Inkubuje se po dobu 30 min pri 37 °C, ochladí na laboratorní teplotu a měří se absorbance při 340 nm (E2). Výpočet: Ε = E2 - El. Roztok kyseliny mléčné standard: kyselina mléčná 0,1 mg/ml.

Kmen	konc. g/1	± SD
13A	19	1,8
16A/1	18	1

Kvantitativní stanovení produkce peroxidu vodíku

Enzym peroxidáza štěpí H₂O₂ za vzniku molekuly vody a kyslíku, přičemž akceptorem protonů vodíku je o-dianizidin. Touto reakcí vzniká barevná sloučenina o-dianizidinchinondiimin. Kultivace: jednotlivé kmeny se nechají růst do vrcholu exponenciálního růstu v M.R.S. bujónu v 5% atmosféře CO₂. Suspenze bakteriových kultur se upraví na absorbancí 0,1 při 410 nm a kultivují se 30 min a též 10 h při 37 °C v M.R.S. bujónu v 5% atmosféře CO₂. Buňky se oddělí centrifuga40 cí pri 39 200 m.s² a v supernatantě se stanoví obsah peroxidu vodíku po 30 minutách a po 10 hodinách. Koncentrace H₂O₂ se vypočítá z kalibrační křivky.

Reakční směs: Supematant 163,9 μΐ

0,1 % vodný roztok křenové peroxidázy 32,8 μΐ

1 % vodný roztok o-dianizidinu 3,3 μΐ

Celkový objem 200,0 μ!

-3 CZ 302683 B6

Reakční směs se inkubuje 10 min při laboratorní teplotě a reakce se zastaví přidáním 6,5 pl mol/l 1 ICL Následně se měří absorbance při 41 0 nm.

30 min	13A	16 A/l
	0,149	0,142
	0,211	0.198
	0,196	0,15
i	0,192	0,171
	0,226	: 0,154
	0,163	0,146
Γ průměr	0,190	0.160
	0,085	0,055
Prům. odchylka	0,029	0,021

j pg/ml	116,00	41,00

10 h	13Λ	16 A/l
	0,303	0,223
	0,28	0,207
	0,311	0,181
	0,312	0,222
	0,258	0,195
	0,349	0,235
průměr	0,302	0,21 1
	0,132	0,041
Prům. odchylka	0,031	0,020

pg/ml	233,50	6,00

Baktericidní a kandidacidní aktivita

Jednotlivé kmeny laktobacilů se kultivují v tekutém M.R.S. bujónu v 5% atmosféře CO? při teplotě 37 °C. Suspenze se ředí podle stupnice McFarlanda 4 (t,j. 2,1x10⁹ bakterií/ml) v 0,9% roztoku NaCl, což odpovídá A 600 = 0,669. Následně se na desce s modifikovaným M.R.S. agarem udělají pruhy použitím kličky o objemu 10 μΐ (Obrázek 5). Desky se inkubují 24 h pri teplotě 37 °C v 5% atmosféře CO?.

Vybrané bakterie (Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 11229 a Candida alhicans CCM 8186) se inkubují v peptonové vodě 24 h. Jednotlivé bakterie se ředí peptonovou vodou podle stupnice McFarlanda 3, což odpovídá A600 = 0,582. Následně se na desku, kde jsou vykuItivované laktobacily, inokulují jednotlivé bakterie kličkou o objemu 1 μΐ ve dvou liniích. První se vede od středové linie laktobacilů k okraji desky o objemu 1 μΐ ve dvou liniích. První se vede od středové linie laktobacilů k okraji desky a druhá opačně - od okraje desky k středové laktobacilové linii s odstupem 2 mm (viz obr.). Desky se inkubují 18 h v 5% atmosféře CO? při teplotě 37 °C. Po inkubaci vybraných bakterií se měří inhibiční zóny v mm. Inhibice růstu patogenu dlouhá 0 až 12 mm se považuje za slabou, 13 až 25 mm za středně silnou a když je inhibiční zóna delší než 25 mm, považuje se za silnou.

13 A	1. miska	2. miska	3. miska	4. miska	5. miska	Θ	SD
(min)	(mm)	(mm)	(mm)	(mm)	(mm)	±
£. coli	12	13	13	14	13	13	11	12	14	13	12,8	0,871
St. aureus	-	17	-	16	18	18	15	14	13	14	15,6	1,798
C. alhicans	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
16 A/l	1. miska	2. miska	3. miska	4. miska	5. miska	Θ	SD
(mm)	(mm)	(mm)	(mm)	(mm)	(mm)
E. coli	19	19	21	19	17	17	19	18	15	í 17	18,1	1,578
St. aureus	25	28	25	27	-	25	26	30	26	27	26,5	1,571
i C albicans	3	3		3	2	2	3	2			2,5	0,5

Antibiogram

Stanovení citlivosti na antibiotika se dělá deskovou metodou podle Fleminga; na Petrího misku o průměru 9 cm se nalije M.R.S. agar a nechá se ztuhnout. Jednotlivé kmeny se nechají kultivovat

-4 CZ 302683 B6 do vrcholu exponenciálního růstu v M.R.S. bujónu. Bujón se zcentrifuguje (34 580m.s“²), sediment se rozsuspenduje ve fyziologickém roztoku (pH 7,2) a absorbance se upraví na hodnotu 0,35 při 540 nm. Připravené suspenze sledovaných kmenů se nanesou na ztuhlý M.R.S. agar v množství 100 μΐ a zahnutou skleněnou vy sterilizovanou tyčinkou se rovnoměrně rozprostřou po povrchu agaru. Na jednu Petriho misku se nanese šest antibiotických (ATB) disků (s průměrem 6 mm) a nechá se kultivovat 24 h v anaerobní atmosféře 5% CCS. Nevykultivované mikroorganismy na desce v blízkosti ATB disku jsou známkou citlivosti testovaného mikroorganismu na ATB. Citlivost na ATB se vyjádří jako průměr prstence inhibice růstu okolo kruhového ATB disku v mm. Jako referenční mikroorganismu byl použit kmen Staphylococcus aureus CCM 2022.

io

kmen	PNC R28/C29	AMP R28/C29	OX R10/C13	CAZ R14/C18	CTX R14/C23	VA R9/C12	CN RI2/C15
S. aureus	40	31	25	19	33	13	16
C	C	C	C	C	C	C
I3A	30	27	12	18	20	0	7
C	SC	SC	C	SC	R	R
16A/1	28	27	18	22	24	0	8
SC	R	C	C	C	R	Ř

kmen	TOB R12/05	OXF RI2/CI6	CÍP R15/C21	TE RI4/C19	E R13/C23	DA R14/C21
5. aureus	16	23	27	35	25	25
C	C	C	C	C	C
13A	0	0	0	21	21	22
R	R	R	C	SC	C
16A/1	0	0	0	21	23	17
R	R	R	C	C	SC

PNC- penicilín, AMP - ampicilin, OX-oxacilin, CAZ- ceftazidin, CTX - cefotaxim, VA- vankomycin, CN-gentamicin, TOB-tobramycin, OFX- oíloxacin, CIP - ciprofloxacin, TE-tetracyklin, E - erytromycin, DA - klindamycin,

C—citlivý, R-rezistentní, SC-středně citlivý

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. laje mikroskopický snímek probiotického kmene Lactobacillusfermentum 16A/1, poří2? zený pomocí QuickPhoto Camera 2.1.

Na obr. lb je mikroskopický snímek probiotického kmene Lactobacillus crispatus 13A, pořízený pomocí QuickPhoto Camera 2.1.

Obr. 2a znázorňuje růstovou křivku probiotického kmene Lactobacillus fermentum 16A/1.

Obr. 2b znázorňuje růstovou křivku probiotického kmene Lactobacillus crispatus 13A.

Obr. 3 ukazuje fagocytovou aktivitu.

Obr. 4 ukazuje fagocytový index.

Na obr. 5 je znázorněna lysozymová aktivita.

-5CZ 302683 B6

Na obr. 6 je znázorněna peroxidázová aktivita.

Obr. 7 ukazuje postup očkování laktobacilů proužkovou metodou na desce.

Příklady provedení vynálezu

Zdravotnický prostředek nebo léčivý přípravek, který obsahuje kombinaci probiotických kmenů Lactobacillus fermentum 16A/1 (CCM 7879) a Lactobacillus crispatus 13A (CCM 7878), je io určený k vaginální aplikaci s indikací pro prevenci či terapii poševních infekcí, způsobených patogenními mikroorganismy, a k obnovení a stabilizaci poševního prostředí při vaginálních disbiózách.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

20 1. Probiotický kmen Lactobacillus fermentum 16 A/l (CCM 7879) a Lactobacillus crispatus

13A (CCM 7878).
2, Probiotický kmen Lactobacillus fermentum 16 A/l (CCM 7879) a Lactobacillus crispatus 13A (CCM 7878) pro použití k prevenci či terapii vaginálních infekcí a k obnovení a stabilizaci

25 vaginálního prostředí.