CZ2010933A3 - Probiotické kmeny Lactobacillus fermentum 16A/1 a Lactobacillus crispatus 13A a jejich využití k vaginální aplikaci - Google Patents
Probiotické kmeny Lactobacillus fermentum 16A/1 a Lactobacillus crispatus 13A a jejich využití k vaginální aplikaci Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2010933A3 CZ2010933A3 CZ20100933A CZ2010933A CZ2010933A3 CZ 2010933 A3 CZ2010933 A3 CZ 2010933A3 CZ 20100933 A CZ20100933 A CZ 20100933A CZ 2010933 A CZ2010933 A CZ 2010933A CZ 2010933 A3 CZ2010933 A3 CZ 2010933A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- lactobacillus
- ccm
- vaginal
- strains
- probiotic strains
- Prior art date
Links
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 title claims abstract description 16
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 title claims abstract description 16
- 241000186840 Lactobacillus fermentum Species 0.000 title claims abstract description 9
- 229940012969 lactobacillus fermentum Drugs 0.000 title claims abstract description 9
- 241000218492 Lactobacillus crispatus Species 0.000 title claims abstract description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 8
- 206010046914 Vaginal infection Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims abstract description 3
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims description 12
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 claims description 7
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 15
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 6
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 4
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 4
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 4
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 4
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 4
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 4
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 2
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 2
- JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dimethoxybenzidine Chemical compound C1=C(N)C(OC)=CC(C=2C=C(OC)C(N)=CC=2)=C1 JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 3,7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUSNOPLQVRUIIM-UHFFFAOYSA-N 4-amino-2-(4,4-dimethyl-2-oxoimidazolidin-1-yl)-n-[3-(trifluoromethyl)phenyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C1NC(C)(C)CN1C(N=C1N)=NC=C1C(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 FUSNOPLQVRUIIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 241001478240 Coccus Species 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000027244 Dysbiosis Diseases 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 241000191938 Micrococcus luteus Species 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 101001004672 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) Probable L-lactate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 1
- AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M cefotaxime sodium Chemical compound [Na+].N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C([O-])=O)=O)C(=O)\C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M 0.000 description 1
- 229960000484 ceftazidime Drugs 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- VYVRIXWNTVOIRD-LRHBOZQDSA-N ciguatoxin CTX1B Chemical compound C([C@@]12[C@@H](C)[C@@H]([C@@H]3[C@H]([C@H]([C@H](C)[C@H]4O[C@H]5C[C@@H](C)C[C@H]6O[C@@]7(C)[C@H](O)C[C@H]8O[C@H]9C=C[C@H]%10O[C@H]%11C[C@@H]%12[C@H]([C@@H]([C@H]%13O[C@H](C=CC[C@@H]%13O%12)\C=C\[C@H](O)CO)O)O[C@@H]%11C=C[C@@H]%10O[C@@H]9C\C=C/C[C@@H]8O[C@@H]7C[C@@H]6O[C@@H]5C[C@@H]4O3)O)O2)C)[C@H](O)CO1 VYVRIXWNTVOIRD-LRHBOZQDSA-N 0.000 description 1
- 229960003405 ciprofloxacin Drugs 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229940124558 contraceptive agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003433 contraceptive agent Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 229910000377 hydrazine sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012493 hydrazine sulfate Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006872 mrs medium Substances 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229960001699 ofloxacin Drugs 0.000 description 1
- 230000008621 organismal health Effects 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 230000027758 ovulation cycle Effects 0.000 description 1
- 229960001019 oxacillin Drugs 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229960000707 tobramycin Drugs 0.000 description 1
- 208000013464 vaginal disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011121 vaginal smear Methods 0.000 description 1
- 239000006216 vaginal suppository Substances 0.000 description 1
- 239000000003 vaginal tablet Substances 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Rešení se týká probiotických kmenu Lactobacillus fermentum 16 A/1 (CCM 7879) a Lactobacillus crispatus 13A (CCM 7878), uložených v Ceské sbírce mikroorganismu Prírodovedecké fakulty Masarykovy univerzity, Tvrdého 14, 602 00 Brno, a jejich použití k prevenci ci terapii vaginálních infekcí a k obnovení a stabilizaci vaginálního prostredí.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká dvou probiotických kmenů Lactobacillus fermentum I6A/1 (CCM 7879) a X Lactobacillus crispatus 13A (CCM 7878), které byly izolovány z vagíny zdravých žen a které jsou určeny k použití ve vaginálních prostředcích určených k prevenci a léčbě vaginálních onemocnění způsobených patogenními bakteriemi. Kmeny se svými vlastnostmi a účinky vzájemně doplňují, jejich kombinace je tudíž unikátní. Oba probiotické kmeny jsou uloženy v České sbírce mikroorganismů Přírodovědecké fakulty lO Masarykovy univerzity v Brně.
Dosavadní stav techniky
Probiotické bakterie se již po několik desetiletí používají v nejruznějších výrobcích pro jejich blahodárné účinky na celkový zdravotní stav organismu. Mechanismus jejich působení spočívá v jejich schopnosti kompetíce o místa adheze s patogenními f5 mikroorganismy, dále v produkci antimikrobiálních látek a také v modulaci imunitního systému hostitelského organismu. K vaginální aplikaci se nejčastěji používají kmeny rodu Lactobacillus, v menší míře pak rod Streptococcus. Výrobky jsou obvykle ve formě vaginálních tablet, čípků nebo tobolek a jsou registrovány buď jako zdravotnický prostředek;nebo léčivý přípravek. Jistou nevýhodou těchto výrobků je často nevaginální 20 původ obsažených probiotických kmenů, což může vést k nežádoucím alergickým reakcím (svědění, pálení). Dalším nedostatkem je geografický původ kmenů. Často nelze geografický původ vůbec dohledat, přičemž efektivnost působení probiotických kmenů je na geografickém původu v nemalé míře závislá.
Podstata vynálezu . z
Nové probiotické kmeny Lactobacillus fermentum 16A/1 (CCM 7879) a Lactobacillus crispatus 13A (CCM 7878) výše uvedené nedostatky překonávají. Byly izolovány z vagíny zdravých českých žen, čili jak zdroj, tak i geografický původ jsou optimální pro jejich potencionální použití k prevenci či terapii poševních infekcí a k obnovení a stabilizaci poševního prostředí. Probiotické kmeny Lactobacillus fermentum 16A/1 a Lactobacillus 30 crispatus I3A jsou deponovány v České sbírce mikroorganismů a byly u nich stanoveny základní vlastnosti, které zajišťují jejich probiotické působení - vitalita po lyotllizaci, baktericidní a kandidacídní aktivita, produkce kyseliny mléčné, produkce peroxidu vodíku, adherence k vaginálnímu epitelu, odolnost vůči antibiotikům, imunomodulační vlastnosti. Kombinace obou kmenů je stabilní, životaschopná a ve svých účincích výjimečně se 35 doplňující směs splňující přísné požadavky moderní medicíny.
Izolace: poševní stery žen splňujícíchjpodmínky: zcela zdravé, které pravidelně neužívají žádné léky; premenopauzální, věk 20*40 let; ženy, které neužívaly v posledních 14 dnech antibiotickou léčbu; ženy neužívající hormonální antikoncepci min. 3 měsíce; doba odběru - uprostřed menstruačního cyklu, tj. těsně po ovulaci; min. 2 dny po nechráněném 40 pohlavním styku.
Kultivační podmínky: médium MRS, CCh/anaerobně, 36,5°C
Identifikace: presumptivní identifikace založena na rep-PCR (GTG5), následné identifikace: biotypizace (API 50CH, apirveů; konvenčně), ribotypizace (RiboPrinter), MALDI-TOF MS.
Stanovení růstových křivek a vitality po lyofilizaci
Metodika: kmeny se kultivují na M.R.S. agaru (24 hbd v atmosféře 5% CO2) a naočkují se do tekutého růstového média M.R.S. bujónu. Spektrofotometricky se suspenze nastaví při vlnové délce 540 nm na absorbanci 0,01 oproti čistému M.R.S. bujónu a inkubuje se ve vícero sterilních zkumavkách při teplotě 37°C v prostředí 5% CO2. V hodinových časových intervalech se spektrofotometricky měří absorbance v jednotlivých zkumavkách 10 oproti čistému médiu při vlnové délce 540 nm do dosažení vrcholu exponenciálního růstu.
V průběhu měření se bakteriální kultura udržuje. Ze získaných hodnot absorbance se sestrojí růstová křivka.
Příprava lyofilizátů: kmeny vykultivované na M.R.S. agaru (v atmosféře 5% CO2) se naočkují do růstového média M.R.S. a nechají se inkubovat po dobu do dosažení vrcholu .15 exponenciální fáze růstové křivky při vhodné teplotě v prostředí 5% CO2. Narostlá kultura se centrifuguje při 39 200 m.s'2 po dobu 30 min v centrifuze s chlazením. Supernatant se oddělí a sediment se promyje sterilní vodou. Tento postup se několikrát opakuje. Získaný sediment se po rozsuspendování ve sterilní vodě zlyofilizuje.
Vitalita
2tí Lyofilizáty kmenů se rozsuspendují ve fyziologickém roztoku (pH 7,2). Získaná suspenze se naředí fyziologickým roztokem v geometrické řadě. Z každého ředění se nanese určité množství na desky s M.R.S. agarem a inkubuje se potřebnou dobu při vhodné teplotě v atmosféře 5% CO2. Po inkubaci se vyberou ředění s počitatelným množstvím kolonií (20 až 200 kolonií). Kolonie se spočítají a vypočítá se počet živých buněk na 1 g lyofilizátů.
____________________________________________
| kmen | ředění | počet buněk/ ml |
| 13A | 10‘5 | 7,60 x 107 |
| 16A/1 | itř3 | 2,50 x I08 |
Stanovení imunomodulační aktivity
Fagocytová aktivita a fagoevtový index izolovaných lidských leukocytů: k 100 μΐ suspenze leukocytů (2xlOů/ml) v mikrozkumavkách se přidá 50 μΐ usmrcených buněk Strepto3Ó. coccus faecalis (lxl0s buněk zbarvených 1% metylenovou modří). Zpravidla se dělá 6 paralelních stanovení. Za stálého míchání se vzorky inkubují na vodní lázni při teplotě 37°C po dobu 1 h. Celý obsah mikrozkumavek se opatrně rozetře pomocí mikropipety na podložní sklíčka a nechají se vysušit na vzduchu při laboratorní teplotě. Preparáty se barví podle Wrighta. Sleduje se počet fagocytů stejně jako množství pohlcených bakterií. 35 Fagocytová aktivita se vypočítá jako % fagocytujících buněk ze 100 monocytů.
Fagocytový index se vypočítá jako průměrné množství fagocytovaných bakterií na jednu fagocytující buňku.
Lysozymová aktivita: Princip stanovení lysozymové aktivity spočívá v tom, že důsledkem 40. působení lysozymu na buněčnou stěnu grampozitivních bakterií je lýze buňky, která se projeví poklesem absorbance. Do otvorů mikrotitrační destičky s plochým dnem se napipetuje 150 μΐ supernatantu získaného po dezintegraci suspenze jednotlivých vzorků
2' lidských leukocytů po 15 h inkubace a 50 μΙ suspenze Micrococcus luteus. Z každého vzorku se dělá 6 paralelních stanovení. Měří se absorbance při vlnové délce 410 nm oproti vzduchu v čase 0 a 20 min spektrofotometricky (DYNATECH MR 5000).
Peroxidázová aktivita: Na stanovení peroxidázové aktivity se použije supernatant získaný po dezintegraci suspenze jednotlivých kmenů. Dezintegrované buňky se centrifugují při 39200 m.s’2 po dobu 20 min. Do otvorů mikrotitrační destičky s plochým dnem se nanese 150 μΐ supernatantu získaného po dezintegraci suspenze jednotlivých kmenů a 50 μ| substrátu pro peroxidázu připraveného těsně před použitím. Z každého vzorku se dělá 6 16 paralelních stanovení. Měří se absorbance při vlnové délce 490 nm oproti vzduchu v čase 0 a 20 min spektrofotometricky (DYNATECH MR 5000). Po 20 min se reakce zastaví přidáním 50 μΐ kyseliny sírové (4 mol.1'1) a znovu se změří absorbance.
/Xdherence k epitelovým buňkám (alternativní metoda stanovení hydrofobnosti) i 5 Testovaný kmen se naočkuje do M.R.S. bujónu a nechá se růst do vrcholu exponenciálního růstu. Vykultivovaná kultura se centrifuguje při 39 200 m.s2 po dobu 20 min, sediment se promyje v tlumivém roztoku na hydrofobnost a následně se naředí na určenou absorbanci. 4 ml této suspenze se smíchá s 1,0 ml xylenu a směs se 1¾ min promíchává. Následně se nechá 30 min stát. Kapilárou se odebere vodní vrstva do kyvety a měří se pokles 20 absorbance při vybrané vlnové délce oproti absorbanci základní suspenze.
| kmen | % hydrofobnosti | průměr |
| 13A | 74,55 | 64,23 |
| 53,91 | ||
| 16A/1 | 48,71 | 56,90 |
| 65,08 |
Produkce kyseliny mléčné
Jednotlivé kmeny se naočkují do M.R.S. bujónu a inkubují 18 h při 37°C v 5% atmosféře CO2. Vykultivovaná kultura se zcentrifuguje při 39 200 m.s'2 po dobu 20 min. Poté se 2,5 g buněk z mokré masy přenese do 25 ml fosfátového tlumivého roztoku (pH 7,0). Dezintegrované buňky (dezintegrace 4 x 20s při 18 kHz) se centrifugují při 39 200 m.s'2 po dobu 20 min. Do kyvety se vloží: 1 ml supernatantu po centrifugaci, 2 ml roztoku 1 (Glycin 75,1 g + hydrazin sulfát 52,1 g doplnit H2O do 800 ml, pH 9,5) a 2 ml roztoku NAD (900 mg β-NAD v 30 ml vody). Jako porovnávací roztok slouží fosfátový tlumivý roztok (pH 7,0). Měří se absorbance při 340 nm (El), potom se přidá 0,02 mi roztoku LLDH (2250 U/ml L-LDH rozpuštěno ve fosfátovém tlumivém roztoku, pH 7,0). Inkubuje se po dobu 30 min při 37°C, ochladí na laboratorní teplotu a měří se absorbance při 340
3$ nm (E2). Výpočet: E - E2 - El. Roztok kyseliny mléčné standard: kyselina mléčná 0,1 mg/ml.
| Kmen | konc. g/1 | ± SD |
| 13A | 19 | 1,8 |
| 16Λ/1 | 18 | 1 |
Kvantitativní stanovení produkce peroxidu vodíku
Enzym peroxidáza štěpí H2O2 za vzniku molekuly vody a kyslíku, přičemž akceptorem protonů vodíku je o-dianizidin. Touto reakcí vzniká barevná sloučenina odianizidinchinondiimin. Kultivace: jednotlivé kmeny se nechají růst do vrcholu 5’. exponenciálního růstu v M.R.S. bujónu v 5% atmosféře CO2. Suspenze bakteriových kultur se upraví na absorbanci 0,1 při 410 nm a kultivují se 30 min a též 10 h při 37°C v M.R.S. bujónu v 5% atmosféře CCK Buňky se oddělí centrifugací při 39 200 m.s'2 a v supernatantě se stanoví obsah peroxidu vodíku po 30 minutách a po 10 hodinách.
Koncentrace H2O2 se vypočítá z kalibrační křivky.
Reakční směs: Supernatant 163,9 μΐ
0,1% vodný roztok křenové peroxidázy 32,8 μΐ 1 % vodný roztok o-dianizidinu 3,3 μΐ
Celkový objem 200,0 μΐ
Reakční směs se inkubuje 10 min při laboratorní teplotě a reakce se zastaví přidáním 6,5 μΐ 15 mol/l FICI. Následně se měří absorbance při 410 nm.
| 30 min | 13A | 16A/1 |
| 0,149 | 0,142 | |
| 0,211 | 0,198 | |
| 0,196 | 0,15 | |
| 0,192 | 0,171 | |
| 0,226 | 0,154 | |
| 0,163 | 0,146 | |
| průměr | 0,190 | 0,160 |
| 0,085 | 0,055 | |
| Prům. odchylka | 0,029 | 0,021 |
| pg/ml | 116,00 | 41,00 |
| 10 h | 13A | 16A/1 |
| 0,303 | 0,223 | |
| 0,28 | 0,207 | |
| 0,311 | 0,181 | |
| 0,312 | 0,222 | |
| 0,258 | 0,195 | |
| 0,349 | 0,235 | |
| průměr | 0,302 | 0,211 |
| 0,132 | 0,041 | |
| Prům. odchylka | 0,031 | 0,020 |
| pg/ml | 233,50 | 6,00 |
Baktericidní a kandidacidní aktivita .20, Jednotlivé kmeny laktobacilů se kultivují v tekutém M.R.S. bujónu v 5% atmosféře CO2 při teplotě 37°C. Suspenze se ředí podle stupnice McFarlanda 4 (Lj. 2,lxl09 bakterií/ml) v 0,9% roztoku NaCl, což odpovídá Λ 600 = 0,669. Následně se na desce s modifikovaným M.R.S. agarem udělají pruhy použitím kličky o objemu 10 μΙ (Obrázek 5). Desky se inkubují 24 h při teplotě 37°C v 5% atmosféře CO2.
Vybrané bakterie (Slaphylococcits aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 11229 a Candida albicans CCM 8186) se inkubují v peptonové vodě 24 h. Jednotlivé bakterie se ředí peptonovou vodou podle stupnice McFarlanda 3, což odpovídá A600 = 0,582. Následně se na desku, kde jsou vykultivované laktobacily, inokulují jednotlivé bakterie kličkou o objemu 1 μΙ ve dvou liniích. První se vede od středové linie laktobacilů k okraji desky a druhá opačně - od okraje desky k středové laktobacilové linii s odstupem 2 mm (viz obr.). Desky se inkubují 18 h v 5% atmosféře CO2 při teplotě 37°C. Po inkubaci vybraných bakterií se měří inhibiční zóny v mm. Inhibice růstu patogenu dlouhá Od2 mm se považuje za slabou, 13725 mm za středně silnou a když je inhibiční zóna delší než 25 mm, považuje se za silnou.
| 13 A | 1. miska (mm) | 2. miska (mm) | 3. miska (mm) | 4. miska (mm) | 5. miska (mm) | 0 (mm) | SD ± | |||||
| E. coli | 12 | 13 | 13 | 14 | 13 | 13 | 11 | 12 | 14 | 13 | 12,8 | 0,871 |
| St. aureus | - | 17 | - | 16 | 18 | 18 | 15 | 14 | 13 | 14 | 15,6 | 1,798 |
| C. alhicans | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | o | o | o | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 16 A/l | 1. miska (mm) | 2. miska (mm) | 3. miska (mm) | 4. miska (mm) | 5. miska (mm) | 9 (inm) | SD ± | |||||
| E. coli | 19 | 19 | 21 | 19 | 17 | 17 | 19 | 18 | 15 | 17 | 18,1 | 1,578 |
| St. aureus | 25 | 28 | 25 | 27 | 25 | 26 | 30 | 26 | 27 | 26,5 | 1,571 | |
| C, albicans | 3 | 3 | 2 | 3 | 2 | 2 | 3 | 2 | 3 | 2 | 2,5 | 0,5 |
Antibiogram
Stanovení citlivosti na antibiotika se dělá deskovou metodou podle Fleminga: na Petriho misku o průměru 9 cm se nalije M.R.S. agar a nechá se ztuhnout. Jednotlivé kmeny se 10' nechají kultivovat do vrcholu exponenciálního růstu v M.R.S. bujónu. Bujón se zcentrifuguje (34 580 m.s'2), sediment se rozsuspenduje ve fyziologickém roztoku (pH 7,2) a absorbance se upraví na hodnotu 0,35 při 540 nm. Připravené suspenze sledovaných kmenů se nanesou na ztuhlý M.R.S. agar v množství 100 μΐ a zahnutou skleněnou vysterilizovanou tyčinkou se rovnoměrně rozprostřou po povrchu agaru. Na jednu Petriho I-ý misku se nanese Šest antibiotických (ATB) disků (s průměrem 6 mm) a nechá se kultivovat h v anaerobní atmosféře 5% CO2. Nevykultivované mikroorganismy na desce v blízkosti ATB disku jsou známkou citlivosti testovaného mikroorganismu na ATB. Citlivost na ATB se vyjádří jako průměr prstence inhibice růstu okolo kruhového ATB disku v mm. Jako referenční mikroorganismus byl použit kmen Staphylococcus aureus 20 CCM 2022.
| kmen | PNC R28/C29 | AMP R28/C29 | OX R10/CI3 | CAZ R14/C18 | CTX R14/C23 | VA R9/C12 | CN R12/C15 |
| S1. aureus | 40 | 31 | 25 | 19 | 33 | 13 | 16 |
| C | C | C | C | C | C | C | |
| 13A | 30 | 27 | 12 | 18 | 20 | 0 | 7 |
| C | SC | SC | C | SC | R | R | |
| 16 A/l | 28 | 27 | 18 | 22 | 24 | 0 | 8 |
| SC | R | C | C | C | R | R |
| kmen | TOB R12/C15 | OXF R12/C16 | ClP R15/C21 | TE R14/C19 | E R13/C23 | DA R14/C21 |
| S aureus | 16 | 23 | 27 | 35 | 25 | 25 |
| C | C | C | C | C | C | |
| !3A | 0 | 0 | 0 | 21 | 21 | 22 |
| R | R | R | C | SC | C | |
| I6A/1 | 0 | 0 | 0 | 21 | 23 | 17 |
| R | R | R | C | C | SC |
PNC- penicilín, AMP - ampicilin, OX-oxacilin, CAZ- ceftazidin, CTX cefotaxim, VAvailkomycin, CN-gentamicin, TOB-tobramycin, OFX- ofloxacin, CÍP - ciprofloxacin, ΊΈ - tetracyklin, E - erytromycin, DA - klindamycin,
X
C-citlivý, R-rezistentní, SC-středně citlivý
Přehled obrázků na výkresech
Na obr.laje mikroskopický snímek probiotického kmene Lactobacillus fermentum\6A/í, ICt, pořízený pomocí QuickPhoto Camera 2.1.
Na obr. Ib je mikroskopický snímek probiotického kmene Lactobacillus erispatus 13A, pořízený pomocí QuickPhoto Camera 2.1.
Obr. 2a znázorňuje růstovou křivku probiotického kmene Lactobacillus fermentum 16A/1.
Obr. 2b znázorňuje růstovou křivku probiotického kmene Lactobacillus erispatus 13A.
Obr. 3 ukazuje fagocytovou aktivitu.
Obr. 4 ukazuje fagocytový index.
Na obr. 5 je znázorněna lysozymová aktivita.
Na obr. 6 je znázorněna peroxídázová aktivita.
Obr. 7 ukazuje postup očkování laktobacilů proužkovou metodou na desce.
Příklady provedení vynálezu
Zdravotnický prostředek nebo léčivý přípravek, který obsahuje kombinaci probiotíckých kmenů Lactobacillus fermentum 16A/1 (CCM 7879) a Lactobacillus erispatus 13A (CCM 7878), je určený k vaginální aplikaci s indikací pro prevenci či terapii poševních infekcí, 25. způsobených patogenními mikroorganismy, a k obnovení a stabilizaci poševního prostředí při vaginálních disbiózách.
Claims (2)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Probiotickó kmeny Lactobacillus fermenlum 16 A/l (CCM 7879) a Lactobacillus erispalus 13A (CCM 7878), uložené v České sbírce mikroorganismů Přírodovědccké-5' fakulty Masarykovy univerzity^ Tvrdého 14, 602 00 Brno; -
- 2. Použití probiotických kmenĚ( Lactobacillus fermentum 16 A/l (CCM 7879) a Lactobacillus crispatus 13A (CCM 7878) k prevenci či terapii vaginálních infekcí a k obnovení a stabilizaci vaginálního prostředí. .
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20100933A CZ302683B6 (cs) | 2010-12-15 | 2010-12-15 | Probiotické kmeny Lactobacillus fermentum 16A/1 a Lactobacillus crispatus 13A a jejich využití k vaginální aplikaci |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20100933A CZ302683B6 (cs) | 2010-12-15 | 2010-12-15 | Probiotické kmeny Lactobacillus fermentum 16A/1 a Lactobacillus crispatus 13A a jejich využití k vaginální aplikaci |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2010933A3 true CZ2010933A3 (cs) | 2011-08-31 |
| CZ302683B6 CZ302683B6 (cs) | 2011-08-31 |
Family
ID=44506045
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20100933A CZ302683B6 (cs) | 2010-12-15 | 2010-12-15 | Probiotické kmeny Lactobacillus fermentum 16A/1 a Lactobacillus crispatus 13A a jejich využití k vaginální aplikaci |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ302683B6 (cs) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016026474A1 (en) * | 2014-08-22 | 2016-02-25 | Vysoka Skola Chemicko-Technologicka V Praze | Strains of lactobacteria producing active compounds acting against vaginal pathogens, use thereof and sanitary products |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6093394A (en) * | 1997-04-11 | 2000-07-25 | Gynelogix, Inc. | Vaginal lactobacillus medicant |
| EP2206506A1 (en) * | 2008-12-18 | 2010-07-14 | Bracco Imaging S.p.A | Probiotic formulations |
| FI20095550A0 (fi) * | 2009-05-19 | 2009-05-19 | Bayer Schering Pharma Oy | Vaginaalinen antojärjestelmä |
-
2010
- 2010-12-15 CZ CZ20100933A patent/CZ302683B6/cs unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016026474A1 (en) * | 2014-08-22 | 2016-02-25 | Vysoka Skola Chemicko-Technologicka V Praze | Strains of lactobacteria producing active compounds acting against vaginal pathogens, use thereof and sanitary products |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ302683B6 (cs) | 2011-08-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101808972B1 (ko) | 락토바실러스 크리스파투스 및 이의 사용 | |
| WO2021027740A1 (zh) | 多联乳杆菌组合物及其在女性阴道健康中的应用 | |
| CN116656578A (zh) | 一种发酵粘液乳杆菌vb216及其应用 | |
| CN108004188B (zh) | 一种鼠李糖乳杆菌及其用于制备阴道抑菌药物的应用 | |
| CN110540945B (zh) | 一种詹氏乳杆菌及其用于制备阴道抑菌药物的应用 | |
| CN110777087A (zh) | 一种约氏乳杆菌及其应用 | |
| CN112143680A (zh) | 具有抗氧化功效副干酪乳杆菌zjuids05及其应用 | |
| JP2020526583A (ja) | 高効力かつ安定な膣ラクトバチルス調製物 | |
| CN110982726A (zh) | 一种卷曲乳杆菌及其应用 | |
| Javed et al. | Signature probiotic and pharmacological attributes of lactic acid bacteria isolated from human breast milk | |
| CN116445331B (zh) | 具有高产γ-氨基丁酸功效的乳酸片球菌ZJUIDS17及其应用 | |
| Chen et al. | Lactobacillus paracasei R3 alleviates tumor progression in mice with colorectal cancer | |
| CZ2010933A3 (cs) | Probiotické kmeny Lactobacillus fermentum 16A/1 a Lactobacillus crispatus 13A a jejich využití k vaginální aplikaci | |
| WO2016026474A1 (en) | Strains of lactobacteria producing active compounds acting against vaginal pathogens, use thereof and sanitary products | |
| KR20100079078A (ko) | 락토바실러스 퍼멘툼 Ｎｏ．１９６９ 균주를 유효성분으로 포함하는 세균성질염치료용 질내 투여용 약학조성물 | |
| Volodymyrovych et al. | Pilot research of antimicrobial characteristics of pectin-containing compositions for healing wounds after teeth extraction | |
| Tsai et al. | Toxicity evaluation for an Enterococcus faecium strain TM39 in vitro and in vivo | |
| CN117866853A (zh) | 一株具有宫颈癌细胞促凋亡作用的乳酸片球菌及其应用 | |
| CN120330074A (zh) | 卷曲乳杆菌及其用途 | |
| Imad Abd-AlAziz et al. | Inhibitory Susceptibility of Synthetic Selenium Nanoparticles and some Conjugate Nutritional Compounds in Inhibition of some Bacterial Isolates Causing Food Poisoning | |
| RU2528862C1 (ru) | ШТАММ Lactobacillus fermentum, ОБЛАДАЮЩИЙ ШИРОКИМ СПЕКТРОМ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И ПРОБИОТИЧЕСКИЙ КОНСОРЦИУМ ЛАКТОБАКТЕРИЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ | |
| Abdul-Lateef et al. | Biofilm formation by Streptococcus agalactiae is affected by pH changes in vitro | |
| C Patole et al. | Apple cider vinegar: Effective adjuvant treatment for aerobic vaginitis | |
| Gnanasekaran et al. | In vitro screening of multidrug resistance uropathogenic Escherichia coli from the urban area of Namakkal district | |
| TWI785854B (zh) | 一種生產玻尿酸之乳酸菌株、其用途以及組合物 |