CN112143680A - 具有抗氧化功效副干酪乳杆菌zjuids05及其应用 - Google Patents

具有抗氧化功效副干酪乳杆菌zjuids05及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及食品微生物技术领域，具体涉及具有抗氧化功能的副干酪乳杆菌ZJUIDS05及应用。本发明公开了一种副干酪乳杆菌(Lactobacillus Paracasei)ZJUIDS05，保藏号为CGMCC NO.20515，其具有很强的体内和体外抗氧化能力。该副干酪乳杆菌ZJUIDS05的用途是：制备具有抗氧化功能的活菌制剂，制备具有抗氧化功能的各类产品。

Description

具有抗氧化功效副干酪乳杆菌ZJUIDS05及其应用
技术领域
本发明涉及食品微生物技术领域，具体涉及具有抗氧化功能的副干酪乳杆菌ZJUIDS05及应用。
背景技术
在人体中，自由基主要以超氧阴离子自由基(O2-)、羟自由基(HO·)、脂氧自由基等形式存在，自由基会导致完整细胞结构遭到破坏、功能丧失、基因突变使得人体引发动脉硬化、高血压、心梗、癌症等疾病。自然环境中的大气污染、水污染、紫外线辐射及吸烟等因素均可造成人体活性自由基的过量产生。因此，抑制过量活性自由基的产生，是防止人体衰老与患病的根源。乳酸菌自身具有较强的抗氧化活性，如在面临过多氧自由基时，乳酸菌会产生超氧化物歧化酶(SOD酶)、过氧化氢酶、硫醇类等活性抗氧化性物质。此外食物与乳酸菌在发酵作用下所产生的代谢产物具有一定的抗氧化活性。
乳杆菌与人类生活密切相关，是广泛应用于食品发酵、工业乳酸发酵及医疗保健领域的有益微生物之一。副干酪乳杆菌作为乳杆菌的一种，将其添加到食品中，可以改善食品的口感、质地和风味。副干酪乳杆菌也能够定植于人体肠胃发挥益生作用，如调节肠道菌群、抑制肠道病原菌生长、降低血清胆固醇、增强机体免疫力、提高乳糖消化和抗肿瘤、抗氧化等。
2013100198484的发明《一株副干酪乳杆菌副干酪亚种菌株》，提供副干酪乳杆菌副干酪亚种R37(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei R37)，保藏编号为CCTCCNO:M2012311，该菌株即副干酪乳杆菌副干酪亚种R37不仅具有较强的苹果酸乳酸转化活力、抗逆性和益生特性，而且能在葡萄果汁中快速繁殖，产生与葡萄果汁风味相协调的独特发酵香，并赋予葡萄果汁更多的功能营养因子，提高发酵果汁的抗氧化功能
2015106977109的发明《一种副干酪乳杆菌及其应用》提供了一种副干酪乳杆菌菌株为H9，分类命名为Lactobacillus paracasei，在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC NO.4780。该副干酪乳杆菌对胃肠有较好的耐受性和粘附性，能够产胞外黏多糖，并且具有抑菌、降胆固醇、降血压和抗氧化活性等生物活性。
201911324613X的发明《一种副干酪乳杆菌副干酪亚种及其应用》提供了一种副干酪乳杆菌副干酪亚种，所述副干酪乳杆菌副干酪亚种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.17893。所述副干酪乳杆菌副干酪亚种具有一定的抗氧化能力，能清除DPPH和羟基自由基，该菌株还具有较好的耐盐性、耐酸性、耐胆盐、耐胃液、耐肠液、疏水性，这样就增加了其发挥益生作用的机会，可应用于发酵饲料、发酵食品、保健食品等领域。
2014101321724的发明《具有耐酸性和高还原活性的副干酪乳杆菌FM-LP-4及其用途》筛选到1株具有耐酸和高还原活性的副干酪乳杆菌新菌株，命名为FM-LP-4，经鉴定为副干酪乳杆菌FM-LP-4，该菌具有较强抗氧化能力，优良的发酵性能和较好的耐酸性能，并且具有很高的还原活性。
发明内容
本发明要解决的问题是是提供一株具有较高抗氧化能力的副干酪乳杆菌ZJUIDS05(Lactobacillus Paracasei ZJUIDS05)及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供副干酪乳杆菌(Lactobacillus Paracasei)ZJUIDS05，其保藏号为CGMCC NO.20515。
所述副干酪乳杆菌(Lactobacillus Paracasei)ZJUIDS05的16S rDNA全序列为SEQ ID No.1所示。
本发明还同时提供了上述副干酪乳杆菌(Lactobacillus Paracasei)ZJUIDS05的用途：制备具有抗氧化功能的活菌制剂。
作为本发明的副干酪乳杆菌(Lactobacillus Paracasei)ZJUIDS05的用途的改进：制备具有抗氧化功能的产品(包括食品、药物、保健品及饲料)。包括制备具有抗氧化功能的发酵果蔬汁，制备具有抗氧化功能的发酵酸奶和酸肉。
本发明的菌株ZJUIDS05，保藏名称为副干酪乳杆菌Lactobacillus Paracasei，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC NO.20515，保藏时间2020年8月10日。
本发明从蒙古族传统发酵食品酸奶油中筛选出一株副干酪乳杆菌ZJUIDS05(Lactobacillus Paracasei ZJUIDS05)，通过细菌形态学、生理学和培养特征，结合16SrDNA测序等对该菌株进行了鉴定。
本发明所提供的副干酪乳杆菌ZJUIDS05(Lactobacillus Paracasei ZJUIDS05)的菌落形态学特征为：在MRS琼脂培养基上形成明显的菌落，菌落大小0.3-1.5mm。菌落圆形，边缘整齐，白色，表面湿润光滑。其菌体形态特性为：革兰氏染色呈阳性，不产芽孢，圆端直杆菌，单个、成对或短链状。
本发明所提供的副干酪乳杆菌ZJUIDS05(Lactobacillus Paracasei ZJUIDS05)的菌体和发酵液具有较强的体外抗氧化能力，且具有较强的体内(细胞)抗氧化能力。
本发明所提供的副干酪乳杆菌ZJUIDS05(Lactobacillus Paracasei ZJUIDS05)具有较强的胆盐水解酶活力。
本发明所提供的副干酪乳杆菌ZJUIDS05(Lactobacillus Paracasei ZJUIDS05)能耐受胃肠道环境、培养液无抗生素耐性、抑制肠内有害的病原菌。
与现有的副干酪乳杆菌相比，本发明的副干酪乳杆菌ZJUIDS05(LactobacillusParacasei ZJUIDS05)具有如下优势：首先本发明的菌株不仅发酵液有显著效果，菌体本身也有显著的抗氧化效果；此外，本发明利用体内(细胞)抗氧化能力的实验证明，本发明的菌株在体内也具有较强的抗氧化能力。本发明的菌株具有更好的抗菌(具有广谱抗菌能力)和抗生素敏感性，表明该菌株对抗生素敏感，对人体更安全。本发明的菌株还具有自凝集粘附等性能，更容易在肠道存活并粘附，且安全性更高。
综上所述，本发明的副干酪乳杆菌ZJUIDS05是一种功能性乳酸菌，具有很强的体内和体外抗氧化能力。同时，具有较强的胆盐水解酶活力。此外，本发明菌株具有较强的耐酸和胆盐性、表面疏水性、培养液无抗生素耐性、抑制肠内有害的病原菌，证明该菌株具有良好的益生特性。因而副干酪乳杆菌ZJUIDS05具有开发抗氧化功能益生产品的潜能。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为副干酪乳杆菌ZJUIDS05的菌落形态图。
图2为副干酪乳杆菌ZJUIDS05革兰氏染色的菌体形态图。
图3为副干酪乳杆菌ZJUIDS05的16S rDNA的电泳鉴定图。
图4为总抗氧化能力标准曲线。
图5为不同菌悬液和上清液处理下的细胞图。
图6不同样品处理后的细胞荧光强度图。
图7为副干酪乳杆菌ZJUIDS05抗菌效果图；
上左为单增李斯特氏菌，上右为肠炎沙门氏菌；
下左为大肠杆菌，下右为金黄色葡萄球菌。
图8为副干酪乳杆菌ZJUIDS05对抗生素敏感性的平板示例；
上左为氯霉素和四环素，上中为氨苄青霉素和环丙沙星；上右为青霉素和红霉素；
下左为头孢曲松和林可霉素，下中为复方新诺明和庆大霉素；下右为空白对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、副干酪乳杆菌ZJUIDS05的筛选及鉴定：
1.副干酪乳杆菌ZJUIDS05的筛选
1.1样品来源
本发明所使用的菌株分离自内蒙古地区蒙古族牧民自制的酸奶油产品，样品共采集20份。
1.2菌株的分离纯化
取大约5g新鲜样品用无菌管收集，立即送至实验室进行菌株分离。取1g样品放入9mL的MRS肉汤培养基中，涡旋混匀后于37℃下富集培养48h；然后在超净台中吸取富集液1mL，用无菌生理盐水进行十倍梯度稀释，选取10-6、10-7、10-8三个稀释梯度，每个梯度取菌液100μL涂于MRS琼脂培养基上，于37℃培养48h。培养结束后，从琼脂培养基中选择生长有50-150个单菌落的平板，挑取典型菌落，在MRS琼脂平板上多次划线纯化，直至整个平板上的菌落形态一致，挑取单菌落到MRS肉汤培养基增菌培养。得到的菌株均在含40％甘油的MRS肉汤培养基中于-80℃冷冻保存。
2.副干酪乳杆菌ZJUIDS05的鉴定
2.1菌落特征
副干酪乳杆菌ZJUIDS05在MRS琼脂培养基培养48h后，直径在0.3-1.5mm之间，菌落圆形，边缘整齐，白色，表面湿润光滑，见图1。
2.2显微镜下形态：
副干酪乳杆菌ZJUIDS05菌落涂片：革兰氏染色呈阳性，不产芽孢，圆端直杆菌，单个、成对或短链状，见图2。
2.3 16S rDNA鉴定
用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取目标菌株基因组DNA，将提取的乳酸菌基因组DNA作为PCR扩增的模板，采用细菌通用引物27F和1492R进行16S rDNA的PCR实验，PCR反应扩增结束后，取PCR产物进行琼脂糖凝胶检测拍照，扩增片段长度为1.2kbp左右，见图3。将PCR产物送至华大基因有限公司进行测序，结果如SEQ ID NO.1所示，在NCBI网站上进行BLAST序列比对，结果显示该序列与副干酪乳杆菌的16S rDNA序列同源性超过99％。
将菌株ZJUIDS05的序列比对结果和生理生化结果相结合，确定筛选的乳酸菌ZJUIDS05为副干酪乳杆菌ZJUIDS05(Lactobacillus Paracasei ZJUIDS05)。
本发明的菌株ZJUIDS05，保藏名称为副干酪乳杆菌Lactobacillus Paracasei，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC NO.20515，保藏时间2020年8月10日。
实施例2、副干酪乳杆菌ZJUIDS05体外抗氧化能力的确认
1.菌株发酵液的制备
将于甘油管中保存的菌株先在MRS琼脂平板上划线活化2-3次，然后挑取单菌落在MRS肉汤培养基中扩大培养18h(培养条件为温度37℃，厌氧条件下培养)，将培养液用蒸馏水调整至乳酸菌菌体浓度为1010CFU/mL，4℃，8000r/min离心20min，收集上清液即为发酵上清液。
用0.02M PBS缓冲液(pH＝7.4)将离心后的菌体沉淀重悬洗涤，4℃、8000r/min离心20min，重复3次。将洗涤干净的菌体细胞重悬于PBS缓冲液中，并调整菌体浓度为1010CFU/mL，即得到完整细胞悬液，作为菌体悬浮液。
每个菌种做3个平行，每组实验重复3次，同时以不接菌的MRS肉汤培养基作阴性对照，以维生素C为阳性对照，同时以实施例1过程中筛选到其余2株副干酪乳杆菌为比较；该2株副干酪乳杆菌也按照上述方法制备获得相应的上清液和菌体悬浮液。
2.菌株及发酵液的抗氧化能力测定
2.1.总抗氧化能力(FRAP法)
总抗氧化能力的测定方法按照Giuberti等的方法稍作修改。向酶标板中加入150μL TPTZ工作液(0.3M醋酸-醋酸钠缓冲液、20mM氯化铁溶液、10mM TPTZ缓冲液，以V:V:V＝10:1:1混合，现用现配)和20μL的样品，振荡混匀，37℃反应10min，测定溶液在593nm处的吸光度。将样品测得的吸光度代入硫酸亚铁标准曲线，样品抗氧化能力以硫酸亚铁当量表示(μmol FeSO4/mL样品)。每个样品重复3次，求平均值。
硫酸亚铁标准曲线：配制不同质量浓度(0μM、50μM、100μM、200μM、400μM、600μM、800μM)的硫酸亚铁溶液，将不同摩尔浓度的硫酸亚铁溶液、10mM TPTZ缓冲液、0.3M醋酸盐缓冲液以V:V:V＝1:1:10混合，取170μL混合液加入酶标板，37℃反应10min，测定溶液在593nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，硫酸亚铁质量浓度为横坐标绘制标准曲线，见图4。
2.2还原能力
还原能力的测定参考Lin等的方法并做一些修改。取1mL样品于离心管中，加入0.2M，pH6.6的PBS溶液及1％(w/v)铁氰化钾溶液各1mL，混匀。50℃水浴20min，冰浴冷却。再加入10％三氯乙酸1mL，6000r/min离心5min，取上清液1mL，加入0.1％(w/v)三氯化铁1mL、蒸馏水1mL，混匀，静置反应10min，于700nm处测定吸光度。用PBS缓冲液或MRS肉汤培养基代替样品为空白组。每个样品重复3次，求平均值。
还原能力(％)＝[(As-Ab)/Ab]*100
式中：As——样品组吸光度；
Ab——空白组吸光度；
2.3.DPPH自由基清除能力
DPPH自由基清除能力的测定方法参考Shimada等的方法并作一些修改。配制VC标准溶液1000mg/ml,稀释成不同浓度梯度(0-30μg/ml)。向酶标板中加入100μL待测样品(或VC标准溶液)和100μL 0.2mM DPPH乙醇溶液(无水乙醇配制，4℃避光保存，现配现用)，摇匀后于室温下避光30min，测定溶液在517nm处的吸光度；用100μL无水乙醇代替100μL DPPH乙醇溶液为空白组；用100μL PBS缓冲液(或MRS肉汤培养基)代替100μL待测样品为对照组，并以100μL PBS缓冲液(或MRS肉汤培养基)和无水乙醇混合液空白调零。每个样品重复3次，求平均值。
DPPH自由基清除能力(％)＝[1-(As-Ab)/Ac]*100
式中：As——样品组吸光度；
Ab——空白组吸光度；
Ac——对照组吸光度；
如表1所示，本发明筛得副干酪乳杆菌ZJUIDS05发酵上清液的总抗氧化能力、还原能力以及DPPH自由基均显著高于其他的副干酪乳杆菌。从而说明副干酪乳杆菌ZJUIDS05发酵上清液具有高效的抗氧化能力。
表1、发酵上清液的抗氧化能力
Figure BDA0002705937550000061
如表2所示，本发明筛得副干酪乳杆菌ZJUIDS05菌体悬浮液的总抗氧化能力、还原能力以及DPPH自由基均显著高于其他的副干酪乳杆菌。从而说明副干酪乳杆菌ZJUIDS05菌体本身也具有高效的抗氧化能力。
表2、菌体悬浮液的抗氧化能力
Figure BDA0002705937550000071
本发明采用总抗氧化能力、还原能力以及DPPH自由基清除能力相结合的方式来评定。同时结合菌株悬浮液和菌体发酵上清液两个方面来进行评价。因此，本发明所得副干酪乳杆菌ZJUIDS05的抗氧化能力更优，即，本发明提供了一株具有高抗氧化能力的菌株。
实施例3、副干酪乳杆菌ZJUIDS05体内抗氧化能力的确认
为进一步验证菌株的抗氧化能力，采用细胞模型进一步评价。发酵上清液及菌悬液的制备同上。
大鼠来源的L6成肌细胞获自美国典型培养物保藏中心。L6成肌细胞在含有10％胎牛血清的DMEM中生长，以1×105cells/mL的密度接种于24孔板中，置于5％CO2和37℃培养箱中培养。待细胞生长至70～80％汇合时，更换为含有2％马血清的DMEM培养基，每48h更换一次培养基，继续培养6～7天，诱导其分化成肌管细胞。ROS可与二氢已啶(DHE)反应形成溴化乙锭，溴化乙锭与细胞核DNA结合产生红色荧光。
设置空白组、损伤组、实验组，空白组为正常的成肌管细胞组；损伤组为正常的细胞加上过氧化氢后造成损伤的细胞组；实验组为损伤后的细胞加上VC、发酵上清液或菌体的细胞组。
VC实验组为损伤后的细胞加入终浓度为2.5mg/L的VC；在图5中对应的是VC；
3个菌体实验组为损伤后的细胞按照1：3的体积比(菌体液1，细胞液3)各自加入该菌的菌体悬浮液，从而分别得如图5所述的“ZJUIDS05菌体、菌体-1、菌体-2”这3个菌体实验组；
3个上清液实验组为损伤后的细胞按照1：3的体积比(上清液1，细胞液3)各自加入该菌的发酵上清液，从而分别得如图5所述的“ZJUIDS05上清液、上清液-1、上清液-2”这3个上清液实验组。
在空白组和损伤组中加入400μL DMEM培养基，7个实验组中加入400μL终浓度为2.5mg/mL的蛋白酶解液，孵育2h(孵育条件为5％CO2和37℃)。随后，空白组各孔加入100μLDMEM培养基，损伤组和实验组加入100μL终浓度为800μL/mL的H2O2溶液，继续孵育1.5h。然后加入终浓度为20μM的DHE，在暗环境中孵育0.5h。培养结束后，用PBS清洗三次，用荧光倒置显微镜拍照，并检测荧光强度。使用Image J软件计算细胞的平均荧光强度。以空白组为1，损伤组与实验组的荧光值表示为与空白组荧光值之比。所有数据均以平均数±标准差表示。数据采用IBM SPSS version 22进行评估，采用单因素方差分析，p<0.05为差异有统计学意义。
细胞的抗氧化效果见图5和图6，从图中可以看出副干酪乳杆菌ZJUIDS05发酵上清液具有显著的抗氧化效果，具有和VC类似的效果。此外，副干酪乳杆菌ZJUIDS05菌体的悬浮液也具有明显的抗氧化效果，显著优于其他的副干酪乳杆菌，结合体内及体外的结果表明菌株副干酪乳杆菌ZJUIDS05具有较高的抗氧化能力。
实施例4、副干酪乳杆菌ZJUIDS05的耐酸性及耐胆盐性的确认
1.耐酸实验
挑取副干酪乳杆菌ZJUIDS05单菌落在MRS肉汤培养基中扩大培养18h，将扩大培养后菌悬液以1％的量接种到MRS肉汤培养基，37℃培养18h后。将培养液于4℃经5000r/min离心5min收集菌体，用磷酸盐缓冲液(pH 6.8)洗涤2次后。菌体悬浮于pH 3.0的MRS肉汤培养基中，将初始活菌数校正至大约1×108CFU/mL，37℃培养3h。采用倾注平板法对0h和3h样品中的活菌进行计数，倾注后的平板于37℃培养48h，测定其存活率，存活率计算公式如下：
Figure BDA0002705937550000081
上式中，N0为测试菌株0h的活菌数(CFU/mL)；Nt为测试菌株3h的活菌数(CFU/mL)。
2.耐胆盐实验
将活化扩大后的副干酪乳杆菌ZJUIDS05菌悬液以1％的量接种到MRS肉汤培养基中，于37℃培养18h后，将培养液于4℃经5000r/min离心5min收集菌体，用磷酸盐缓冲液(pH6.8)洗涤2次后。菌体悬浮于含胆盐0.3％的MRS肉汤培养基中，将初始活菌数校正至大约1×108CFU/mL，37℃培养3h。采用倾注平板法对0h和3h样品中的活菌进行计数，倾注后的平板于37℃培养48h，测定其存活率，存活率计算公式如下：
Figure BDA0002705937550000091
上式中，N0为测试菌株0h的活菌数(CFU/mL)；Nt为测试菌株3h的活菌数(CFU/mL)。
3.如表1所示，副干酪乳杆菌ZJUIDS05在pH为3.0的MRS培养基中的存活率达45％。在含有0.3％的牛胆盐的环境中活菌数可达到106CFU/mL以上，具备较高的胃肠道生存能力。
表3、菌株对酸和胆盐耐受结果
Figure BDA0002705937550000092
实施例5、副干酪乳杆菌ZJUIDS05的病原菌抑制能力的确认
采用国际通用琼脂扩散法测定乳酸菌抗菌活性。将10mL LB琼脂培养基倒入无菌培养皿中，冷却后做为下层培养基。将培养18h菌浓度为108CFU/mL指示菌菌悬液按1％的量加入冷却至45℃左右的灭过菌的LB琼脂培养基中，充分混合，定量加入10ml/皿。在上面摆放灭过菌的的牛津杯。待上层培养基冷凝后，轻轻拔掉牛津杯。
定量以100μL/孔分别加入副干酪乳杆菌(ZJUIDS05，1和2)上清液样品、重悬于磷酸盐缓冲液(pH 6.8)活菌数为1×108CFU/mL的菌悬液样品并且以磷酸盐缓冲液(pH 6.8)作为空白对照，以0.1mg/mL的头孢曲松为阳性对照。将培养皿正面朝上放于37℃培养箱中厌氧培养24h。挑选出小孔周围有明显抑菌圈的菌株，测量抑菌圈直径，每个重复三次。图7为副干酪乳杆菌ZJUIDS05对病原菌抑制能力的平板示例
如表4所示，副干酪乳杆菌ZJUIDS05的代谢产物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和单增李斯特氏菌均有一定的抑制作用。
表4、菌株对病原菌抑制能力的结果
Figure BDA0002705937550000093
Figure BDA0002705937550000101
现有的副干酪乳杆菌副干酪亚种R37、副干酪乳杆菌副干酪亚种(CGMCCNO.17893)、副干酪乳杆菌FM-LP-4并没有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和单增李斯特氏菌的抑菌效果报道。副干酪乳杆菌H9对金葡、大肠和沙门有一定的效果，但没有李斯特效果的报道。且经检测，上述副干酪乳杆菌对单增李斯特氏菌无抑菌效果。因此，ZJUIDS05抗菌效果显著优于上述菌株。
实施例6、副干酪乳杆菌ZJUIDS05的抗生素敏感性的确认
将培养18h的浓度为108CFU/mL副干酪乳杆菌ZJUIDS05菌悬液按2％的量加入冷却至45℃左右的灭过菌的MRS琼脂培养基中，充分混合，定量加入15mL/皿。待凝固后，用镊子取药敏纸片放于培养基上。将培养皿正面朝上放于37℃培养箱中培养24h。以无抗生素的纸片为空白对照。测量抑菌圈直径。每个重复三次。图8为副干酪乳杆菌ZJUIDS05抗生素敏感性的平板示例。
副干酪乳杆菌ZJUIDS05对抗生素感受性抑菌圈直径如表5所示。参考CLSI(2017)药敏试验标准可得，副干酪乳杆菌ZJUIDS05对青霉素G、氨苄青霉素、头孢曲松、四环素、红霉素、林可霉素、复方新诺名和氯霉素呈现敏感性。对于庆大霉素、环丙沙星呈现中敏感。实验结果表明，副干酪乳杆菌ZJUIDS05对常见的抗生素敏感。
表5、菌株对抗生素敏感性结果
Figure BDA0002705937550000102
Figure BDA0002705937550000111
注意：药敏性判定标准依据抑菌圈直径(diameter of inhibition zone,DIZ)执行如下:"不敏感",DIZ＝0mm；"中敏感",0mm<DIZ≤16mm；"敏感",DIZ>16mm；S，敏感；I，中敏感；R，耐药。
实施例7、副干酪乳杆菌ZJUIDS05疏水性的确认
细菌的粘附特性与菌体表面性质也有一定的相关性。研究菌体的表面性质可以用来快速筛选具有粘附性质的益生菌，益生菌粘附在肠道后可以改善肠道菌群，提高人体免疫力。采用罗森伯格等人改进的方法(1980)测试微生物对不同种类的有机溶剂(二甲苯、三氯甲烷和乙酸乙酯)的粘附性。挑取副干酪乳杆菌ZJUIDS05单菌落在MRS液体培养基中扩大培养18h，将培养液于4℃经5000r/min离心5min收集菌体，用磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤2次后。菌体悬浮于pH7.0的0.1M PBS中，将初始活菌数校正至为108CFU/mL。取3Ml菌悬液与每种有机溶剂的1mL混合后室温下放置30分钟进行两相分离。然后，收集水相，在570nm处检测吸光度。根据以下公式计算疏水性或带电表面的百分比(％)：＝(A-A0/A)×100(A和A0分别是与每种溶剂混合前和混合后的吸光度)，分为低吸光度(0-35％)、中等吸光度(36-70％)或高吸光度(71-100％)。
表6的结果显示副干酪乳杆菌ZJUIDS05在二甲苯、三氯甲烷等溶剂里具有较好的表面疏水性，疏水性的结果优于其他的副干酪乳杆菌，表明ZJUIDS05容易在人和动物的肠道黏附。进而改善肠道菌群，抵御病菌，提高人体的免疫力。
表6、菌株的疏水性结果
Figure BDA0002705937550000112
实施例8、副干酪乳杆菌ZJUIDS05自凝集的确认
菌株的自凝集是指同一种菌间相互凝集形成多细胞簇的现象。乳酸菌的凝集可以形成屏障阻止致病菌的定植和感染，进而提高人体的免疫力和抵抗力。利用Kos等人(2003)改进的分光光度法对乳酸菌和病原菌进行了自聚集。将4mL副干酪乳杆菌ZJUIDS05的菌悬液(108CFU/mL)旋涡10s，然后在37℃下放置24h。通过测量剩余吸光度确定自凝集性，并以百分比表示为(1-A24h/A初始值×100)。
表7、不同菌株自凝集结果
Figure BDA0002705937550000121
表7的结果表明，相对与其他的副干酪乳杆菌，ZJUIDS05具有更好的自凝集性，这说明在肠道里，副干酪乳杆菌ZJUIDS05更容易聚集在一起抵抗肠道的里胆盐等物质，更容易在肠道存活。
本发明的ZJUIDS05自凝集性能显著现有的副干酪乳杆菌副干酪亚种R37、副干酪乳杆菌H9、副干酪乳杆菌副干酪亚种(CGMCC NO.17893)、副干酪乳杆菌FM-LP-4等。
实施例9、利用副干酪乳杆菌ZJUIDS05制备功能性发酵果蔬汁
1.发酵果蔬汁的加工工艺流程:
原料→清洗→闪蒸→打浆→调配→均质→灭菌→
冷却→接种→密闭发酵→后熟→灌装→冷藏
2.操作要点
(1)清洗切块：先将南瓜和火龙果清洗、去皮、去切成小块。
(2)闪蒸：采用闪蒸的方法灭酶，0.5-1min，121℃处理，迅速排气。
(3)打浆：按照南瓜∶水(重量比)＝1∶1的比例，将南瓜和水适量的逐渐放入胶体磨中研磨，进行粗磨和细磨各一次。将火龙果用打浆机打浆至果肉均匀无块状。
(4)调配、均质：按南瓜汁15％，火龙果汁30％，再用蔗糖调节可溶性固形物含量至10°Brix，加入0.2％的稳定剂CMC-Na混合均匀，采用两段均质法，先低压(15MPa)，后高压(25MPa)，使瓜肉颗粒直径粒径为2-3um。
(5)灭菌、冷却：调配好的复合果蔬汁在100℃下保温10min，冷却至40℃左右。
(6)接种、发酵：在无菌条件下，接入活化好的副干酪乳杆菌ZJUIDS05，初始菌数控制在1×107cfu/mL。在37℃条件下恒温发酵24h。
(7)后熟：发酵结束后，放入4℃冰箱中3h。
(8)灌装、冷藏：后熟完成后，灌装到250mL的灭菌玻璃瓶中，送至冷库冷藏。
实施例10、利用副干酪乳杆菌ZJUIDS05制备功能性发酵酸肉
1.发酵酸肉的加工工艺流程:
原料→切片→拌糯米粉→接种→发酵→腌制→
包装→成品
2.操作要点
(1)切片：将市售新鲜五花肉，切成3cm见方薄片。
(2)拌糯米粉：1000g原料肉与250g糯米粉混匀，加入葡萄糖1％。
(3)接种、发酵：在无菌条件下，接入活化好的副干酪乳杆菌ZJUIDS05，初始菌数控制在1×107cfu/mL。在37℃条件下恒温发酵18h。
(4)腌制：加入2％的盐，于25℃下腌制20d。
实施例11、利用副干酪乳杆菌ZJUIDS05制备菌粉
1.副干酪乳杆菌ZJUIDS05菌泥的制备
挑取副干酪乳杆菌ZJUIDS05单菌落接种于50mL MRS肉汤培养基中，放置37℃厌氧培养箱中培养18h。再次按5％的接种量于250m L MRS肉汤培养基中活化，放置37℃厌氧培养箱中培养24h。最后将活化好的副干酪乳杆菌ZJUIDS05以5％接种量于10L发酵罐中进行高密度厌氧培养，于37℃、控制pH 6.8的条件下培养18h。之后在8000r/min、4℃条件下离心15min，弃去上清液，收集菌体沉淀，用无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.0)漂洗菌体2次。即可得到副干酪乳杆菌ZJUIDS05菌泥。
2.保护剂的制备
冻干保护剂含有15％的脱脂乳，5％的海藻糖，3％的谷氨酸钠，1％的甘油，0.5％的半胱氨酸盐酸盐。水作为溶剂。于110℃灭菌备用。％为质量％。
3.副干酪乳杆菌ZJUIDS05菌粉的制备
将上述制备的副干酪乳杆菌ZJUIDS05菌体沉淀按1:5的比例与保护剂溶液充分混匀。于-40℃条件下预冻5h，使其均匀冻结在容器内壁上，然后进行真空冷冻干燥，干燥18-20h后，即可得到副干酪乳杆菌ZJUIDS05菌粉。用生理盐水复水后，洗涤两次，测得副干酪乳杆菌ZJUIDS05菌粉中活菌数为1.0×1010-5×1010CFU/g。
实施例12、利用副干酪乳杆菌ZJUIDS05制备抗氧化酸奶
1.酸奶的制备
将脱脂奶粉复原乳(12％)于115℃高压灭菌20min，再将商用发酵剂、筛选出的抗氧化性较强的乳酸菌菌体细胞接种到灭菌脱脂乳中，37℃下培养12-20h，传代2次，作为酸奶发酵剂。
单发酵剂发酵酸奶：将制备好的商业酸奶发酵剂按3％的比例接种于灭菌脱脂乳中，置于恒温培养箱中42℃条件下发酵，待凝乳后取出，置于4℃冰箱冷藏18-24h。
复合发酵剂发酵酸奶：向灭菌脱脂乳中接种1.5％的商用发酵剂和1.5％的本发明的菌株发酵剂，置于恒温培养箱中42℃条件下发酵，待凝乳后取出，置于4℃冰箱冷藏18-24h。
2.酸奶的抗氧化能力的测，参考实施例2中的测定方法，结果见下表8。
表8、菌株发酵酸奶的抗氧化能力
Figure BDA0002705937550000141
表8的结果表明，副干酪乳杆菌ZJUIDS05加入后酸奶的总抗氧化能力，还原能力以及DPPH具有显著的提高。说明副干酪乳杆菌ZJUIDS05可以显著提高酸奶制品的抗氧化能力。
同时采用ZJUIDS05复合发酵后酸奶的粘度达到了3400mPa/S，显著高于对照的2400mPa/S，滴定酸度92T°也高于对照的84T°，这表明采用ZJUIDS05发酵后有助于提升酸奶的品质。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 具有抗氧化功效副干酪乳杆菌ZJUIDS05及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1196
<212> DNA
<213> 副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)
<400> 1
gtgggggata acatttggaa acagatgcta ataccgcata gatccaagaa ccgcatggtt 60
cttggctgaa agatggcgta agctatcgct tttggatgga cccgcggcgt attagctagt 120
tggtgaggta atggctcacc aaggcgatga tacgtagccg aactgagagg ttgatcggcc 180
acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac 240
aatggacgca agtctgatgg agcaacgccg cgtgagtgaa gaaggctttc gggtcgtaaa 300
actctgttgt tggagaagaa tggtcggcag agtaactgtt gtcggcgtga cggtatccaa 360
ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt 420
atccggattt attgggcgta aagcgagcgc aggcggtttt ttaagtctga tgtgaaagcc 480
ctcggcttaa ccgaggaagc gcatcggaaa ctgggaaact tgagtgcaga agaggacagt 540
ggaactccat gtgtagcggt gaaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc 600
ggctgtctgg tctgtaactg acgctgaggc tcgaaagcat gggtagcgaa caggattaga 660
taccctggta gtccatgccg taaacgatga atgctaggtg ttggagggtt tccgcccttc 720
agtgccgcag ctaacgcatt aagcattccg cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact 780
caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg 840
cgaagaacct taccaggtct tgacatcttt tgatcacctg agagatcagg tttccccttc 900
gggggcaaaa tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 960
aagtcccgca acgagcgcaa cccttatgac tagttgccag catttagttg ggcactctag 1020
taagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt 1080
atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg atggtacaac gagttgcgag accgcgaggt 1140
caagctaatc tcttaaagcc attctcagtt cggactgtag gctgcaactc gcctac 1196

Claims (5)

1.副干酪乳杆菌(Lactobacillus Paracasei)ZJUIDS05，其特征在于保藏号为CGMCCNO.20515。
2.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌(Lactobacillus Paracasei)ZJUIDS05，其特征在于：所述副干酪乳杆菌(Lactobacillus Paracasei)ZJUIDS05的16S rDNA全序列为SEQID No.1所示。
3.如权利要求1所述的副干酪乳杆菌(Lactobacillus Paracasei)ZJUIDS05的用途，其特征在于：制备具有抗氧化功能的活菌制剂。
4.根据权利要求3所述的副干酪乳杆菌(Lactobacillus Paracasei)ZJUIDS05的用途，其特征在于：制备具有抗氧化功能的产品。
5.根据权利要求4所述的副干酪乳杆菌(Lactobacillus Paracasei)ZJUIDS05的用途，其特征在于：制备具有抗氧化功能的发酵果蔬汁，制备具有抗氧化功能的发酵酸奶和酸肉。
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