CN113892651A - 一种复合益生菌制剂在抗氧化领域中的新应用 - Google Patents

一种复合益生菌制剂在抗氧化领域中的新应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及益生菌技术领域，具体公开一种复合益生菌制剂在抗氧化领域中的新应用。所述复合益生菌制剂可用于制备抗氧化产品。本发明所述的复合益生菌制剂，由嗜热链球菌S709、副干酪乳杆菌L578和瑞士乳杆菌L551组成，可有效清除体内外的氧自由基(DPPH、ABTS、超氧阴离子自由基、羟自由基)，并效降低细胞的氧化应激水平，提高SOD和GSH‑PX的活性，增加基体的抗氧化能力，且无任何毒副作用，为探索益生菌在抗氧化以及调节睡眠的作用机制奠定了基础。

Description

一种复合益生菌制剂在抗氧化领域中的新应用
技术领域
本发明涉及益生菌技术领域，尤其涉及一种复合益生菌制剂在抗氧化领域中的新应用。
背景技术
人类的健康与睡眠直接相关，健康充足的睡眠可以清除体内的代谢产物和氧自由基，增强免疫功能，巩固记忆，保护神经系统等。长期的睡眠不足和压力过大导致的失眠会诱发氧化应激，使细胞代谢产生过多的活性氧自由基，基体的抗氧化功能系统减弱，进而引起多种疾病。
为了清除机体内的氧自由基，减少其对机体的损害，恢复机体健康，常通过抗氧化药物来对付氧自由基。现有的抗氧化药物主要为酶系统(抗氧化酶)药物，包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)和单胺氧化酶抑制剂等。这一类药物抗氧化主要有以下缺点：1)外源性补充，人体自身机能未能真正修复，长期使用，容易扰乱固有的代谢，亲和力低；2)分子量太大，很难顺利透过细胞膜，如果口服，易受蛋白酶水解而失去活性；3)有不良反应，如：恶心、呕吐、头痛和皮疹，亦有过敏者。除了药物以外，脂溶性的维生素E、水溶性的维生素C以及β-胡萝卜素等天然的抗氧化剂也能够与氧自由基发生氧化还原反应，使氧自由基被彻底清除，但这些天然的抗氧化剂具有如下缺点：1)维生素E长期大剂量应用，易引起出血、高血压、荨麻疹、生殖功能障碍和免疫功能下降等；2)维生素C对胃有刺激，会胃酸过多等；3)在体内发挥抗氧化的能力较弱。因此，对于人体内过量的活性氧自由基对人体机能的破坏和疾病的引发，目前天然的抗氧化剂抗氧化能力不够强，还会引发出血、高血压、胃酸过多等等副作用，抗氧化药物作为外源补充，分子量又太大，不能很好地被人体接收，抗氧化效果不好还会引发各种不良反应。
发明内容
针对现有抗氧化剂及抗氧化药物存在的上述问题，本发明提供一种复合益生菌制剂在抗氧化领域中的新应用，该复合益生菌制剂用于作为抗氧化药物可以有效降低细胞的氧化应激水平，并对产生的DPPH、ABTS、超氧阴离子自由基和羟自由基均有一定的清除能力，且无任何毒副作用，拓展了益生菌制剂的应用领域。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种复合益生菌制剂在制备抗氧化产品中的应用，所述复合益生菌制剂包括以下活菌：包含嗜热链球菌S709、副干酪乳杆菌L578和瑞士乳杆菌L551。
所述嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)S709保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.18028。
所述副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)L578，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.15603，保藏日期为2018年4月11日。
所述瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)L551，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15604，保藏日期为2018年4月11日。
上述三种菌种均为公开菌种，具体在公开号为CN111778192A，发明名称为“具有降压活性的那曲4580益生菌及其制剂和应用”的专利公开文本中公开。
本发明提供了由嗜热链球菌S709、副干酪乳杆菌L578和瑞士乳杆菌L551组成的复合益生菌制剂在制备抗氧化产品中的新应用，该复合益生菌制剂可有效清除体内外的氧自由基(DPPH、ABTS、超氧阴离子自由基、羟自由基)，并降低细胞的氧化应激水平，提高SOD和GSH-PX的活性，增加基体的抗氧化能力，且无任何毒副作用，为探索益生菌在抗氧化以及调节睡眠的作用机制奠定了基础。
优选的，所述抗氧化产品为清除自由基的产品。
优选的，所述自由基包括DPPH、ABTS、超氧阴离子自由基和羟自由基。
优选的，所述抗氧化产品为体外抗氧化剂、药品、食品和保健品中的一种。
优选的，所述药品包括所述复合益生菌制剂和药学上可接受的载体。
优选的，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、乳剂、片剂和口服液中的一种。
优选的，所述复合益生菌制剂的制备方法包括：
a、按10-30g/L的量向培养基中加入谷氨酸钠，搅拌10-15min，升温至55-60℃，进行灭菌，得到灭菌培养基；
b、将嗜热链球菌S709、副干酪乳杆菌L578和瑞士乳杆菌L551的活化菌种分别按照5-15％的体积比接种至所述灭菌培养基中进行发酵，控制所述发酵的温度为37-45℃，发酵28-48h得到发酵液，所述发酵液经高温灭菌或不经过高温灭菌，浓缩、干燥得到所述复合益生菌制剂。
优选的，每升所述培养基的配方为：脱脂奶粉70-90g、全脂奶粉18-22g、葡萄糖18-22g、蛋白胨8-12g、酵母浸粉4-6g、无水乙酸钠1.5-2.5g、硫酸镁0.55-0.60g和硫酸锰0.2-0.3g，加水定容至1L，PH值调为6.5-7。
附图说明
图1是本发明实施例2中不同浓度的复合益生菌制剂对DPPH的清除率的统计图；
图2是本发明实施例2中不同浓度的Trolox对DPPH的清除率的统计图；
图3是本发明实施例2中不同浓度的复合益生菌制剂对羟自由基的清除率的统计图；
图4是本发明实施例2中不同浓度的复合益生菌制剂对超氧阴离子自由基的清除率的统计图；
图5是本发明实施例2中不同浓度的复合益生菌制剂对ABTS的清除率的统计图；
图6是本发明实施例2中不同浓度的Trolox对ABTS的清除率的统计图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
复合益生菌制剂的制备
复合益生菌制剂的制备方法包括：
a、按20g/L的量向培养基中加入谷氨酸钠，搅拌10min，升温至55℃，进行灭菌，得到灭菌培养基；其中，培养基的配方为：脱脂奶粉80g、全脂奶粉2g、葡萄糖2g、蛋白胨10g、酵母浸粉5g、无水乙酸钠2g、硫酸镁0.58g和硫酸锰0.25g，加水定容至1L，PH值调为6.6；
b、将嗜热链球菌S709、副干酪乳杆菌L578和瑞士乳杆菌L551活化菌种分别按照10％的体积比接种至所述灭菌培养基中进行发酵，控制所述发酵的温度为42℃，发酵30h得到发酵液，所述发酵液经高温灭菌，浓缩、干燥得到复合益生菌制剂。
实施例2
复合益生菌制剂在制备抗氧化产品中的应用
1、材料及设备
1.1、复合益生菌制剂(实施例1中制得)。
1.2、试剂：DPPH自由基检测试剂盒、羟自由基检测试剂盒、ABTS自由基检测试剂盒、超氧阴离子自由基试剂盒(均由苏州格锐思生物科技有限公司提供)。
2、试验方法
2.1、复合益生菌制剂的体外抗氧化能力的检测
2.1.1、样品前处理：将实施例1中的复合益生菌制剂用纯净水稀释成5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、50mg/mL、200mg/mL、300mg/mL的浓度，用于体外实验。
2.1.2、复合益生菌制剂对DPPH自由基清除率测定
采用DPPH自由基检测试剂盒，对不同浓度的复合益生菌制剂对DPPH自由基清除能力进行测定，并严格按照DPPH自由基检测试剂盒的操作步骤进行操作。测得不同浓度的复合益生菌制剂对DPPH的清除率如图1所示；同时根据不同浓度的Trolox对DPPH的清除率制作标准曲线，制作的标准曲线如图2所示。根据图1和图2可知，随着复合益生菌制剂浓度的升高，其对DPPH的清除率也随之增加，其中，30mg/mL的复合益生菌制剂对DPPH的清除率达到50.23％，相当于7.93μg/mL的Trolox抗氧化剂对DPPH的清除能力。
2.1.3、复合益生菌制剂对羟自由基的清除率
采用羟自由基检测试剂盒，对不同浓度的复合益生菌制剂对羟自由基清除能力进行测定，并严格按照羟自由基检测试剂盒的操作步骤进行操作。测得不同浓度的复合益生菌制剂对羟自由基的清除率如图3所示。根据图3可知，随着复合益生菌制剂浓度的升高，其对羟自由基的清除率也随之增加，其中，50mg/mL的复合益生菌制剂对羟自由基的清除率达到84.07％。
2.1.4、复合益生菌制剂对超氧阴离子自由基的清除率
采用超氧阴离子自由基检测试剂盒，对不同浓度的复合益生菌制剂那曲4580对超氧阴离子自由基清除能力进行测定，并严格按照超氧阴离子自由基检测试剂盒的操作步骤进行操作。测得不同浓度的复合益生菌制剂对超氧阴离子自由基的清除率如图4所示。根据图4可知，复合益生菌制剂对超氧阴离子自由基的清除率相对较弱，300mg/ml的复合益生菌制剂对超氧阴离子自由基的清除率为24.1％。
2.1.5、复合益生菌制剂对ABTS的清除率
采用ABTS检测试剂盒，对不同浓度的复合益生菌制剂对ABTS清除能力进行测定，并严格按照ABTS检测试剂盒的操作步骤进行操作。测得不同浓度的复合益生菌制剂对ABTS的清除率如图5所示；同时根据不同浓度的Trolox对ABTS的清除率制作标准曲线，制作的标准曲线如图6所示。根据图5和图6可知，上述复合益生菌制剂对ABTS的清除率很强，且随着复合益生菌制剂浓度的升高，其对ABTS的清除率也随之增加，其中，25mg/mL的复合益生菌制剂对ABTS的清除率达到30.1％，相当于84.06μg/mL的Trolox对ABTS的清除率。
2.2、复合益生菌制剂的体内抗氧化能力的检测
选取健康的30只6周龄雄性SPF级BABL/c健康小鼠(购自北京维通利华公司)，随机分为试验组、对照组和空白组，每组10只小鼠。试验组服用实施例1中的复合益生菌制剂(每次1g)，每日三次，连续服用20d；对照组服用每次服用50mg/片维生素E1/4片和100mg/片维生素C1/4片，每日3次，连续服用20天；空白组不进行任何抗氧化药物的饲喂，所有小鼠均进行普通小鼠饲料的自由进食。
空腹取静脉血进行生理生化指标的测定，分析复合益生菌制剂对小鼠血清丙二醛MDA、超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX和蛋白质羰基含量的数值的影响。具体检测结果如表1和表2所示。
表1 小鼠血清MDA检测指标
Figure BDA0003293138090000061
Figure BDA0003293138090000071
表2 小鼠血清SOD、GSH-PX和蛋白质羰基含量检测指标
Figure BDA0003293138090000072
根据表1和表2中的数据可以看出，试验组和对照组在试验后，体内的SOD和GSH-PX显著上升，而MDA和蛋白质羰基含量显著下降，且试验组(复合益生菌制剂)的效果显著优于对照组(维生素E+维生素C)。这表明，上述复合益生菌制剂可通过提高机体内的SOD和GSH-PX的活性，降低机体内的氧化损伤和自由基的含量，进而在体内发挥极佳的抗氧化能力。
实施例3
复合益生菌制剂的制备
复合益生菌制剂的制备方法包括：
a、按20g/L的量向培养基中加入谷氨酸钠，搅拌10min，升温至55℃，进行灭菌，得到灭菌培养基；其中，培养基的配方为：脱脂奶粉80g、全脂奶粉2g、葡萄糖2g、蛋白胨10g、酵母浸粉5g、无水乙酸钠2g、硫酸镁0.58g和硫酸锰0.25g，加水定容至1L，PH值调为6.6；
b、将嗜热链球菌S709、副干酪乳杆菌L578和瑞士乳杆菌L551活化菌种分别按照10％的体积比接种至所述灭菌培养基中进行发酵，控制所述发酵的温度为42℃，发酵30h得到发酵液，所述发酵液经浓缩、干燥得到复合益生菌制剂。
利用实施例2中的检测方法，对实施例3得到的复合益生菌制剂的抗氧化能力进行检测，检测结果如下：
体外抗氧化能力：
30mg/mL复合益生菌制剂对DPPH的清除率为55.81％；50mg/mL复合益生菌制剂对羟自由基的清除率为75.27％；300mg/ml的复合益生菌制剂对超氧阴离子自由基的清除率为28.33％；25mg/mL的复合益生菌制剂对ABTS的清除率为40.36％。
体内抗氧化能力：
试验组(复合益生菌制剂)可显著提高体内的SOD和GSH-PX的活性，并降低MDA的含量；且复合益生菌制剂的效果也明显优于对照组(维生素E+维生素C)。因此，上述复合益生菌的活菌制剂同样可以过提高机体内的SOD和GSH-PX的活性，降低机体内的氧化损伤和自由基的含量，在体内发挥抗氧化能力。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种复合益生菌制剂在制备抗氧化产品中的应用，所述复合益生菌制剂包括以下活菌：嗜热链球菌S709、副干酪乳杆菌L578和瑞士乳杆菌L551；
所述嗜热链球菌S709的保藏号为CGMCCNO.18028；
所述副干酪乳杆菌L578的保藏号为CGMCCNO.15603；
所述瑞士乳杆菌L551的保藏号为CGMCC NO.15604。
2.如权利要求1所述的复合益生菌制剂在制备抗氧化产品中的应用，其特征在于：所述抗氧化产品为清除自由基的产品。
3.如权利要求2所述的复合益生菌制剂在制备抗氧化产品中的应用，其特征在于：所述自由基包括DPPH、ABTS、超氧阴离子自由基和羟自由基。
4.如权利要求1-3任一项所述的复合益生菌制剂在制备抗氧化产品中的应用，其特征在于：所述抗氧化产品为体外抗氧化剂、药品、食品和保健品中的一种。
5.如权利要求4所述的复合益生菌制剂在制备抗氧化产品中的应用，其特征在于：所述药品包括所述复合益生菌制剂和药学上可接受的载体。
6.如权利要求4所述的复合益生菌制剂在制备抗氧化产品中的应用，其特征在于：所述抗氧化产品的剂型为粉剂、颗粒剂、乳剂、晶球、胶囊、块状、棒状、片剂和口服液中的一种。
7.如权利要求1所述的复合益生菌制剂在制备抗氧化产品中的应用，其特征在于：所述复合益生菌制剂的制备方法包括：
a、按10-30g/L的量向培养基中加入谷氨酸钠，搅拌10-15min，升温至55-60℃，进行灭菌，得到灭菌培养基；
b、将嗜热链球菌S709、副干酪乳杆菌L578和瑞士乳杆菌L551的活化菌种分别按照5-15％的体积比接种至所述灭菌培养基中进行发酵，控制所述发酵的温度为37-45℃，发酵28-48h得到发酵液，所述发酵液经高温灭菌或不经过高温灭菌，浓缩、干燥得到所述复合益生菌制剂。
8.如权利要求7所述的复合益生菌制剂在制备抗氧化产品中的应用，其特征在于：每升所述培养基的配方为：脱脂奶粉70-90g、全脂奶粉18-22g、葡萄糖18-22g、蛋白胨8-12g、酵母浸粉4-6g、无水乙酸钠1.5-2.5g、硫酸镁0.55-0.60g和硫酸锰0.2-0.3g，加水定容至1L，PH值调为6.5-7.0。
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