ES2585056T3 - Fermentación en dos fases de Staphylococcus aumenta la actividad de nitrato reductasa - Google Patents

Fermentación en dos fases de Staphylococcus aumenta la actividad de nitrato reductasa Download PDF

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Abstract

Método para aumentar la actividad de nitrato-reductasa de una cepa de Staphylococcus con actividad de nitratoreductasa que incluye las etapas de a) fermentar la cepa en ausencia de nitrato bajo condiciones aeróbicas; b) fermentar la cepa bajo condiciones anaeróbicas o de limitación de oxígeno mientras se suministra continuamente nitrato al medio de fermentación; y c) opcionalmente granular y opcionalmente liofilizar la cepa.

Description

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DESCRIPCION
Fermentacion en dos fases de Staphylococcus aumenta la actividad de nitrato reductasa Campo de la invencion
[0001] La presente invencion se refiere al campo de la formacion de color rojo de productos alimenticios.
En particular la presente invencion se refiere a un metodo de fermentacion en dos fases para el refuerzo de la actividad de nitrato-reductasa de cepas de Staphylococcus con actividad de nitrato-reductasa que comprende una primera fase aerobica en ausencia de nitrato y una segunda fase anaerobica o limitada de oxigeno con suministro continuo de nitrato y uso de las cepas de Staphylococcus para la formacion de color rojo de productos carnicos.
Estado de la tecnica
[0002] Formacion de color y estabilidad de color estan entre los rasgos de calidad mas criticos de los productos carnicos procesados y por tanto son de gran importancia para la industria de la carne.
El color curado caracteristico puede derivar de la concentracion de hemopigmentos (mioglobina, hemoglobina), sus estados y aditivos quimicos tales como oxidos de nitrogeno y agentes reductores.
En los productos carnicos fermentados estandar, tal como el salami, el color curado caracteristico es un resultado de la reaccion quimica entre compuestos derivados de nitrito/nitrato adicionados y la mioglobina roja de origen natural conduciendo a la formacion simultanea de la nitrosilmioglobina roja brillante, donde un ligando axial de oxido nitrico (NO) se coordina con el Fe2+ central en hemo.
A pesar de todas sus propiedades deseadas (formacion de color, inocuidad microbiologica), la inocuidad del nitrito para la salud humana ha sido cuestionada.
El nitrito puede provocar la formacion de compuestos no deseados en la carne curada, como las N-nitrosaminas que son discutibles en cuanto a la salud se refiere.
Estos compuestos se pueden formar en principio debido a la reaccion de nitrito con aminas secundarias y aminoacidos en proteinas musculares al igual que en el tracto gastrointestinal.
[0003] El uso de cepas de Staphylococcus para la formacion de color se basa en su capacidad para reducir nitrato inorganico a nitrito que es posteriormente degradado en el oxido nitrico descrito anteriormente (NO), el compuesto activo en el proceso de formacion de color.
El nitrato podria ser proporcionado directamente como sal de nitrato o indirectamente con una fuente de nitrato natural (polvos vegetales).
Aunque una sal de nitrito sea anadida, se recomienda la adicion de cepas de Staphylococcus porque el nitrito es parcialmente reconvertido en nitrato.
[0004] Staphylococcus carnosus y menos frecuentemente Staphylococcus xylosus son cepas estandar de Staphylococcus usadas para la reduccion de nitrato y formacion de color.
Estas cepas estan funcionando debidamente a temperaturas de fermentacion mas altas pero son menos activas a temperaturas bajas, por debajo de 6°C.
Como temperaturas de production bajas son preferidas por la industria por cuestiones de higiene una cepa de Staphylococcus con actividad de nitrato-reductasa a bajas temperaturas es deseada.
[0005] Staphylococcus vitulinus es una cepa conocida por tener actividad de nitrato-reductasa a bajas temperaturas y ha sido usada en combination con bacterias del acido lactico para la formacion de color rojo de la carne (WO2010/067148).
[0006] Sin embargo, hay una necesidad de metodos que mejoren la reduccion de nitrato y la formacion de color en productos alimenticios y como resultado pueda llevar a una reduccion en el tiempo de produccion necesario para la formacion de color rojo deseada de los productos alimenticios y asi conducir a la reduccion en el coste de produccion de tales productos.
Resumen de la invencion
[0007] Los inventores de la presente invencion han descubierto sorprendentemente que cuando la produccion de una cepa de Staphylococcus con actividad de nitrato-reductasa por una fermentacion en dos fases que implica una primera fase de la fermentacion de la cepa bajo aireacion alta en ausencia de nitrato y una segunda fase de la fermentacion de la cepa bajo aireacion baja mientras se suministra continuamente nitrato la cepa de Staphylococcus desarrolla una actividad de nitrato-reductasa aumentada conduciendo a una formacion de color rojo aumentada cuando se usa para la coloration de productos alimenticios que contienen mioglobina.
[0008] Por lo tanto, en un primer aspecto la presente invencion se refiere a un metodo para aumentar la actividad de nitrato-reductasa de una cepa de Staphylococcus con actividad de nitrato-reductasa que incluye las etapas de
a) fermentar la cepa en ausencia de nitrato bajo condiciones aerobicas;
b) fermentar la cepa bajo condiciones anaerobicas o de limitation de oxigeno mientras se alimenta continuamente
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nitrato al medio de fermentacion; y
c) opcionalmente granular y opcionalmente liofilizar la cepa.
[0009] Otro aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo para la formacion de color rojo de un producto alimenticio que incluye las etapas de
a) tratamiento previo de una cepa de Staphylococcus con actividad de nitrato-reductasa segun el metodo del primer aspecto de la invencion;
b) adicion de la cepa de Staphylococcus pretratada a un producto alimenticio; y
c) fermentacion, maduracion o curacion del producto alimenticio con la cepa de Staphylococcus pretratada.
Breve descripcion de los dibujos
[0010]
La Figura 1 representa el desarrollo de concentracion de nitrato/nitrito al igual que la actividad de nitrato-reductasa (NRA) durante la fermentacion estandar con la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus.
La Figura 2 muestra el desarrollo de la concentracion de nitrato/nitrito durante una fermentacion en dos fases con cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus.
En el punto temporal de 6.3 horas la aireacion fue reducida significativamente y el suministro con nitrato comenzo. Ningun nitrato se anadio al medio de lotes.
La Figura 3 representa el desarrollo de concentracion de nitrato/nitrito durante una fermentacion en dos fases con la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus.
En el punto temporal de 6.3 horas la aireacion fue reducida significativamente y el suministro con nitrato comenzo.
Se anadio nitrato al medio de mezcla.
La Figura 4 muestra las concentraciones de nitrato/nitrito en embutidos tipo mortadela fermentados a 4°C durante 21 horas antes de la coccion con la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion estandar (S. Vitulinus-, estandar) cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases (S. Vitulinus - suministro de nitrato), o Bactoferm® cS-300 (CS-300).
La Figura 5 muestra las concentraciones de nitrato/nitrito en embutidos tipo mortadela fermentados a 12°C durante 21 horas antes de la coccion con la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion estandar (S. Vitulinus-, estandar), cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases (S. Vitulinus - suministro de nitrato), o Bactoferm® CS-300 (CS-300).
La Figura 6 muestra las concentraciones de nitrato/nitrito en embutidos tipo mortadela fermentados a 18°C durante 21 horas antes de la coccion con la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion estandar (S. Vitulinus-, estandar), cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases (S. Vitulinus - suministro de nitrato), o Bactoferm® CS-300 (CS-300).
La Figura 7 representa la intensidad de color rojo (valor a* segun el sistema L*a*b*) de embutidos tipo mortadela fermentados durante 21 horas a 4°C, 12°C o 18°C antes de la coccion con la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion estandar (STAvi_standard), cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases (STAvi_nitrate), o Bactoferm® CS-300 (CS-300).
La Figura 8 muestra la concentracion de nitrato y de nitrito de carne picada para embutidos tipo mortadela antes de coccion despues de diferentes intervalos de incubacion (7, 12 y 24 horas) a 4°C con la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases, nitrato desde el principio (1), cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases, ningun nitrato desde el principio (2), Bactoferm® CS-300 (3) o TEXEL® NatuRed LT (4).
La Figura 9 representa la intensidad de color rojo (valor a* segun el sistema L*a*b*) de embutidos tipo mortadela fermentados durante 7 horas a 4°C, 8°C o 12°C antes de la coccion con la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases, nitrato desde el principio (1), cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases, ningun nitrato desde el principio (2), Bactoferm® CS-300 (3) o TEXEL® NatuRed LT (4).
La Figura 10 representa la intensidad de color rojo (valor a* segun el sistema L*a*b*) de embutidos tipo mortadela fermentados durante 12 horas a 4°C, 8°C o 12°C antes de la coccion con la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases, nitrato desde el principio (1), cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases, ningun nitrato desde el principio (2), Bactoferm® CS-300 (3) o TEXEL® NatuRed LT (4).
La Figura 11 representa la intensidad de color rojo (valor a* segun el sistema L*a*b*) de embutidos tipo mortadela fermentados durante 24 horas a 4°C, 8°C o 12°C antes de la coccion con la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases, nitrato desde el principio (1), cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases, ningun nitrato desde el principio (2), Bactoferm® CS-300 (3) o TEXEL® NatuRed LT (4).
La Figura 12 representa la intensidad de color rojo (valor a* segun el sistema L*a*b*) de jamon cocido fermentado durante 16 horas a 6°C con la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases, ningun nitrato desde el principio (STAvi) o Bactoferm® CS-299 (CS-299).
La Figura 13 muestra placas de Petri con jamon cocido triturado fermentado con Bactoferm® CS-299 (CS-299) o la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases, ningun nitrato desde el principio (S. Vitulinus CHCC10896).
La Figura 14 representa la intensidad de color rojo (a*-valor segun el sistema L*a*b*) de embutidos tipo mortadela
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fermentados durante 20 horas a 4°C antes de la coccion con la cepa CHCC111576 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion estandar (CHCC11576 - estandar), cepa CHCC11576 de Staphvlococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases (CHCC11576 - suministro), o cepa A de Staphylococcus carnosus producida por fermentacion estandar (S. Carnosus).
La Figura 15 representa la intensidad de color rojo (valor a* segun el sistema L*a*b*) de embutidos tipo mortadela fermentados durante 18 horas a 8°C antes de coccion con la cepa CHCC111576 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion estandar (CHCC11576 - estandar), cepa CHCC11576 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases (CHCC11576 - suministro), o cepa A de Staphylococcus carnosus producida por fermentacion estandar (S. Carnosus).
La Figura 16 muestra embutidos tipo mortadela fermentados durante 20 horas a 4° antes de la coccion con la cepa CHCC11576 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion estandar (CHCC11576 - estandar), cepa CHCC11576 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases (CHCC11576 - suministro), o cepa A de Staphylococcus carnosus producida por fermentacion estandar (S.carnosus - estandar).
La Figura 17 muestra embutidos tipo mortadela fermentados durante 18 horas a 8°C antes de la coccion con la cepa CHCC11576 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion estandar (CHCC11576 - estandar), cepa CHCC11576 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases (CHCC11576 - suministro), o cepa A de Staphylococcus carnosus producida por fermentacion estandar (S.carnosus - estandar).
La Figura 18 representa las concentraciones de nitrato/nitrito en embutidos tipo mortadela fermentados a 4°C durante 20 horas (4°C) o a 8°C durante 18 horas (8°C) antes de la coccion con la cepa CHCC11576 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion estandar (1), cepa CHCC11576 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases (2), o cepa A de Staphylococcus carnosus producida por fermentacion estandar (3).
La Figura 19 representa la intensidad de color rojo (valor a* segun el sistema L*a*b*) de embutidos tipo mortadela fermentados durante 20 horas a 4°C antes de la coccion con la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases dando solo un pico de nitrato de alta concentracion al principio de la segunda fase (CHCC10896 - pico), cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases con suministro de nitrato continuo durante la segunda fase (CHCC10896 - suministro), o cepa A de Staphylococcus carnosus producida por fermentacion estandar (S. Carnosus).
La Figura 20 representa la intensidad de color rojo (valor a* segun el sistema L*a*b*) de embutidos tipo mortadela fermentados durante 18 horas a 8°C antes de la coccion con la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases dando solo un pico de nitrato de alta concentracion al principio de la segunda fase (CHCC10896 - pico), cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases con suministro de nitrato continuo durante la segunda fase (CHCC10896 - suministro), o cepa A de Staphylococcus carnosus producida por fermentacion estandar (S. Carnosus).
La Figura 21 muestra embutidos tipo mortadela fermentados durante 20 horas a 4°C antes de la coccion con la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases dando solo un pico de nitrato de alta concentracion al principio de la segunda fase (CHCC10896 - pico), cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases con suministro de nitrato continuo durante la segunda fase (CHCC10896 - suministro), o cepa A de Staphylococcus carnosus producida por fermentacion estandar (S. Carnosus - estandar).
La Figura 22 muestra embutidos tipo mortadela fermentados durante 18 horas a 8°C antes de la coccion con la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases dando solo un pico de nitrato de alta concentracion al principio de la segunda fase (CHCC10896 - pico), cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases con suministro de nitrato continuo durante la segunda fase (CHCC10896 - suministro), o cepa A de Staphylococcus carnosus producida por fermentacion estandar (S. Carnosus - estandar).
La Figura 23 representa las concentraciones de nitrato/nitrito en embutidos tipo mortadela fermentados a 4°C durante 20 horas (4°C) o a 8°C para 18 horas (8°C) antes de la coccion con la cepa CHCC110896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases dando solo un pico de nitrato de alta concentracion al principio de la segunda fase (1), cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion en dos fases con suministro continuo de nitrato durante la segunda fase (2), o cepa A de Staphylococcus carnosus producida por fermentacion estandar (3).
Descripcion detallada de la invention
[0011] El uso de los terminos "un" y "una" y "el" y referentes similares en el contexto de describir la invencion (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) se debe interpretar para cubrir el singular y el plural, a menos que se indique aqui lo contrario o se contradiga claramente por el contexto.
Los terminos "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" se deben interpretar como terminos abiertos (es decir, significando "que incluye, pero no se limita a,") a menos que se indique lo contrario.
La enumeration de rangos de valores aqui se destina unicamente a servir como un metodo abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que entre dentro de la gama, a menos que se indique lo contrario aqui, y cada valor separado se incorpora en la especificacion como si fuera enumerado individualmente aqui.
Todos los metodos descritos aqui se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario aqui o se contradiga claramente por el contexto.
El uso de uno y todos los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como") proporcionado aqui, se destina
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unicamente a mejor iluminar la invencion y no plantea una limitation en el ambito de la invention a menos que se reivindique de otro modo.
Ningun lenguaje en la especificacion deberia ser interpretado como indicando cualquier elemento no reivindicado como esencial para la practica de la invencion.
[0012] La presente invencion se refiere a un metodo de fermentation de una cepa de Staphylococcus con actividad de nitrato-reductasa bajo ciertas condiciones para aumentar la actividad de nitrato-reductasa de la cepa de Staphylococcus.
[0013] El termino "cepa de Staphylococcus con actividad de nitrato reductasa" como se utiliza en este caso se refiere a una cepa de Staphylococcus que es capaz de convertir el nitrato en nitrito.
[0014] La fermentacion se realiza como una fermentacion en dos fases donde la primera fase comprende la fermentacion de la cepa en ausencia de nitrato bajo condiciones aerobicas y donde la segunda fase comprende la fermentacion de la cepa bajo condiciones anaerobicas o de limitacion de oxigeno mientras se suministra continuamente nitrato al medio de fermentacion.
Finalmente, la cepa puede opcionalmente ser granulada y/o liofilizada.
[0015] El termino "en ausencia de nitrato" como se utiliza en este caso se refiere a la fermentacion realizada en el medio de fermentacion donde ningun nitrato ha sido adicionado.
[0016] El termino "medio de fermentacion" se destina a significar un medio de fermentacion que permite la production de metabolitos bacterianos y/o el crecimiento de biomasa.
[0017] En una forma de realization preferida las condiciones aerobicas de la primera fase comprende fermentacion de la cepa bajo aireacion alta de al menos 0.5 vvm (volumen por volumen por minuto), tal como al menos 0.6 vvm, tal como al menos 0.7 vvm, tal como al menos 0.8 vvm.
[0018] En una forma de realizacion preferida la primera fase es continuada durante 5 a 12 horas, tal como de 6 a 10 horas.
En otra forma de realizacion preferida la primera fase es continuada hasta que la presion parcial de oxigeno (pO2) del medio de fermentacion alcanza 0.
[0019] El pO2 del medio de fermentacion se puede medir con sensores de oxigeno disuelto optico como se describe en el ejemplo 2 aqui.
El termino "alimentando continuamente nitrato" como se utiliza en este caso se refiere bien a una adicion estable de nitrato al medio de fermentacion o una adicion de nitrato al medio de fermentacion en impulsos de no mas de 15 min. entre cada adicion de una cantidad constante de nitrato.
[0020] En una forma de realizacion preferida el nitrato se adiciona en impulsos de no mas de 10 min. tal como en impulsos de no mas de 8 min., tal como en impulsos de no mas de 6 min., tal como en impulsos de no mas de 5 min.
[0021] Los nitratos utiles para el metodo segun la presente invencion pueden ser de origen quimico.
Ellos pueden, por ejemplo, ser nitrato de potasio, nitrato sodico, salitre, y sus mezclas derivadas.
[0022] Los nitratos tambien pueden ser de origen natural.
Ellos pueden, por ejemplo, ser provistos por plantas y/o extractos de plantas que son ventajosamente elegidos de plantas naturalmente ricas en nitratos, tal como por ejemplo puerro, apio, cebolla, espinaca y repollo.
[0023] Los nitratos se pueden proporcionar en forma liquida y solida.
[0024] En una forma de realizacion preferida el suministro de nitrato en la segunda fase se hace a un indice de 0,5 a 2,0 g/(l*h), tal como de 0,8 a 1,8 g/(l*h).
[0025] El termino "condiciones que limitan el oxigeno" como se utiliza en este caso se destina a abarcar cualquier condition que restringe el oxigeno accesible, tipicamente por aireacion controlada, incluyendo tal aireacion baja que la cepa esta experimentando eficazmente un crecimiento casi anaerobico.
[0026] En una forma de realizacion preferida la segunda fase anaerobica o limitada de oxigeno comprende fermentacion de la cepa bajo aireacion de como mucho 0.08 vvm, tal como como mucho 0.07 vvm, tal como como mucho 0.06 vvm, tal como como mucho 0.05 vvm, tal como como mucho 0.04 vvm, tal como como mucho 0.03 vvm.
[0027] Sin querer cenirse a la teoria se cree que la falta de oxigeno en la segunda fase obliga a la cepa a aumentar la expresion desde el operon nar responsable de la actividad de nitrato-reductasa que se facilita por una concentration continua alta de nitrato.
Durante la respiration aerobica, los electrones provistos por un donante de electrones como NADH se transfieren
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por la cadena de transporte electronico al terminal reductasa para ser transferido al aceptor de electrones 02 final. Durante este proceso una fuerza motriz de proteinas se forma por la separacion de electrones y protones por la membrana.
Por un flujo de protones en la celula por medio de la ATP-sintasa ligada a la membrana ATP es formado.
Bajo condition anaerobica, durante la falta de oxigeno, un aceptor de electrones alternativo se necesita para mantener este proceso en funcionamiento, por ejemplo nitrato.
El nitrato es asi reducido en nitrato por la nitrato-reductasa.
[0028] La cepa de Staphylococcus puede ser cualquier cepa de Staphylococcus con actividad de nitrato-reductasa tal como por ejemplo una cepa de Staphylococcus vitulinus, Staphylococcus carnosus o Staphylococcus xylosus.
[0029] En una forma de realization preferida de la presente invention la cepa de Staphylococcus con actividad de nitrato-reductasa es una cepa de Staphylococcus vitulinus o una cepa de Staphylococcus carnosus con actividad de nitrato-reductasa.
[0030] En una forma de realizacion mas preferida la cepa de Staphylococcus con actividad de nitrato-reductasa es una cepa de Staphylococcus vitulinus.
[0031] En una forma de realizacion muy preferida de la presente invencion la cepa de Staphylococcus vitulinus es seleccionada del grupo consistente en la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus que fue depositada con el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) bajo el numero de acceso.
DSM 25789, la cepa de Staphylococcus vitulinus CHCC11576 que fue depositada con el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) bajo el numero de acceso DSM 27311 y sus mutantes derivados.
[0032] En el presente contexto, el termino "mutante" deberia entenderse como una cepa derivada de una cepa de la invencion mediante por ejemplo ingenieria genetica, radiation y/o tratamiento quimico.
Se prefiere que el mutante sea un mutante funcionalmente equivalente, por ejemplo un mutante que tiene sustancialmente las mismas propiedades, o, mejoradas (por ejemplo con relation a la actividad de nitrato-reductasa) como la cepa madre.
Tal mutante es una parte de la presente invencion.
Especialmente, el termino "mutante" se refiere a una cepa obtenida sometiendo una cepa de la invencion en cualquier tratamiento de mutagenizacion usado de forma convencional lo que incluye un tratamiento con un mutageno quimico tal como etano metano sulfonato (EMS) o N-metil-N'-nitro-N-nitroguanidina (NTG), luz UV o a un mutante de origen espontaneo.
Un mutante se puede someter a diferentes tratamientos de mutagenizacion (un tratamiento unico deberia ser entendido un paso de mutagenizacion seguido de una etapa de filtrado/seleccion), pero es actualmente preferido que no mas de 20, o no mas de 10, o no mas de 5, tratamientos (o fases de filtrado/seleccion) sean realizados.
En un mutante actualmente preferido menos del 1%, menos del 0,1, menos del 0,01, menos del 0,001% o incluso menos del 0,0001% de los nucleotidos en el genoma bacteriano se han sustituido por otro nucleotido, o eliminado, en comparacion con la cepa madre.
[0033] La actividad de nitrato-reductasa de la cepa de Staphylococcus que ha sido sometida al metodo de fermentation en dos fases anteriormente descrito no se puede mejorar a la misma extension como la actividad de nitrato-reductasa de la cepa de Staphylococcus que no ha sido sometida a la fermentacion en dos fases de la invencion.
Asi, someter la cepa de Staphylococcus, que ha sido sometida una vez al metodo de fermentacion en dos fases, a por ejemplo una segunda vuelta del metodo de fermentacion en dos fases en las horas siguientes no mejorara la actividad de nitrato-reductasa de la cepa a la misma extension como cuando la cepa es antes sometida al metodo de fermentacion en dos fases.
El periodo exacto entre los puntos temporales donde la cepa se somete a la primera y segunda vuelta del metodo de fermentacion en dos fases y todavia mantiene una alta actividad de nitrato-reductasa depende de las distintas condiciones como la presencia de oxigeno y la temperatura a la que las muestras estan mantenidas.
Preferiblemente, el porcentaje por el cual la actividad de nitrato-reductasa se puede mejorar es determinado sometiendo la cepa al metodo de fermentacion en dos fases no mas de 3 horas despues de la production de la cepa y teniendo la cepa a una temperatura por debajo de 5°C y bajo condiciones anaerobicas.
Sin querer cenirse a la teoria, se cree que otros metodos - distintos del metodo de fermentacion en dos fases de la invencion - para aumentar la actividad de nitrato-reductasa a niveles por encima de aquellos conseguidos por fermentacion estandar en una cepa de Staphylococcus pueden existir.
Puede por ejemplo ser posible inducir el operon nar responsable de la actividad de nitrato-reductasa sometiendo las cepas a otros factores de tension.
En una forma de realizacion preferida la actividad de nitrato-reductasa de la cepa no se puede mejorar mas del 50%, tal como mas del 40%, tal como mas del 30%, tal como mas del 20%, tal como mas del 10%.
La mejora del porcentaje de la actividad de nitrato-reductasa de una cepa de Staphylococcus en cuestion puede ser facilmente determinada usando el metodo para determination de la actividad de nitrato-reductasa como se describe en los ejemplos aqui: la actividad de nitrato-reductasa se determina para la cepa en cuestion antes y despues de someter la cepa al metodo de fermentacion en dos fases segun la invencion y la mejora en la actividad de nitrato-
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reductasa se puede calcular por la determinacion del aumento en la actividad de nitrato-reductasa.
[0034] La cepa de Staphylococcus cuando se anade en una cantidad de 3,6x1010 CFU/kg de carne y se usa para la preparacion de embutidos tipo mortadela fermentados a 12°C durante 21 horas es capaz de formar el color rojo de la carne a una intensidad de color rojo (valor a*) segun el sistema L*a*b* de al menos 14.
[0035] Los embutidos tipo mortadela se pueden preparar segun los ejemplos 3 y 4 aqui.
[0036] La cepa de Staphylococcus cuando se anade en una cantidad de 1,5x1010 CFU/kg de carne y se usa para la preparacion de jamon cocido fermentado a 6°C durante 16 horas es capaz de formar el color rojo de la carne a una intensidad de color rojo (valor a*) segun el sistema L*a*b* de al menos 10, tal como al menos 11, tal como al menos 12.
El jamon cocido se puede preparar segun el Ejemplo 5 aqui.
[0037] En el presente contexto, el termino "mutante" deberia entenderse como una cepa derivada de una cepa de la invention mediante por ejemplo ingenieria genetica, radiation y/o tratamiento quimico.
Se prefiere que el mutante sea un mutante funcionalmente equivalente, por ejemplo un mutante que tenga sustancialmente las mismas propiedades, o mejoradas (por ejemplo con relation a la actividad de nitrato-reductasa) como la cepa madre.
Tal mutante es una parte de la presente invencion.
Especialmente, el termino "mutante" se refiere a una cepa obtenida sometiendo una cepa de la invencion en cualquier tratamiento de mutagenizacion usado de forma convencional lo que incluye un tratamiento con un mutageno quimico tal como etano metano sulfonato (EMS) o N-metil-N'-nitro-N-nitroguanidina (NTG), luz UV o a un mutante de origen espontaneo.
Un mutante se puede someter a diferentes tratamientos de mutagenizacion (un tratamiento unico deberia ser entendido una fase de mutagenizacion seguido de una etapa de filtrado/seleccion), pero es actualmente preferido que no mas de 20, o no mas de 10, o no mas de 5, tratamientos (o fases de filtrado/seleccion) sean realizados.
En un mutante actualmente preferido menos del 1%, menos del 0,1, menos del 0,01, menos del 0,001% o incluso menos del 0,0001% de los nucleotidos en el genoma bacteriano se han sustituido por otro nucleotido, o eliminado, en comparacion con la cepa madre.
[0038] La presente invencion ademas se refiere a un metodo para la formation de color rojo de un producto alimenticio que incluye las etapas del tratamiento previo de una cepa de Staphylococcus con actividad de nitrato- reductasa segun el metodo de fermentation de una cepa de Staphylococcus con actividad de nitrato-reductasa anteriormente descrita, anadir la Staphylococcus pretratada a un producto alimenticio, y fermentar, madurar o curar el producto alimenticio con la cepa de Staphylococcus pretratada.
[0039] El producto alimenticio puede ser cualquier producto basado en una fuente alimenticia que contiene mioglobina.
En una forma de realization preferida el producto alimenticio es un producto carnico.
[0040] El producto carnico puede ser cualquier producto con un contenido de carne.
La carne puede ser carne bovina, carne de cerdo, carne de ave, carne de caza o cualquier otra categoria de carne.
[0041] El producto alimenticio tambien puede ser un producto basado en pescado y/o basado en crustaceos.
En una forma de realizacion preferida la cepa de Staphylococcus se anade en una cantidad de 1.0x108 a 1.0x1012 CFU/kg, tal como de 1.0x109 a 1.0x1011 CFU/kg.
Preferiblemente la cepa de Staphylococcus se anade en una cantidad de 2.0x109 a 5.0x1010 CFU/kg.
[0042] En una forma de realizacion preferida la fermentacion, maduracion o curacion del producto alimenticio con la cepa de Staphylococcus pretratada tiene lugar a una temperatura de 4°C a 45°C, tal como a una temperatura de 4°C a 30°C, tal como a una temperatura de 4°C a 25°C.
[0043] La fermentacion, maduracion o curacion del producto alimenticio puede durar desde 8 horas hasta varios dias/semanas.
[0044] En una forma de realizacion preferida la cepa de Staphylococcus es una cepa de Staphylococcus vitulinus o una cepa de Staphylococcus carnosus.
[0045] En una forma de realizacion mas preferida la cepa de Staphylococcus es una cepa de Staphylococcus vitulinus.
[0046] En una forma de realizacion muy preferida la cepa de Staphylococcus vitulinus es seleccionada del grupo consistente en la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus que fue depositada en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) bajo numero de acceso DSM 25789, la cepa de Staphylococcus vitulinus CHCC11576 que fue depositada con el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) bajo el
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numero de acceso DSM 27311 y sus mutantes derivados.
[0047] En el presente contexto, el termino "mutante" deberia entenderse como una cepa derivada de una cepa de la invention mediante por ejemplo ingenieria genetica, radiation y/o tratamiento quimico.
Se prefiere que el mutante sea un mutante funcionalmente equivalente, por ejemplo un mutante que tenga sustancialmente las mismas propiedades, o mejoradas (por ejemplo con relation a la actividad de nitrato-reductasa) que la cepa madre.
Tal mutante es una parte de la presente invencion.
Especialmente, el termino "mutante" se refiere a una cepa obtenida sometiendo una cepa de la invencion a cualquier tratamiento de mutagenizacion usado de forma convencional lo que incluye un tratamiento con un mutageno quimico tal como etano metano sulfonato (EMS) o N-metil-N'-nitro-N-nitroguanidina (NTG), luz UV o a un mutante de origen espontaneo.
Un mutante se puede someter a diferentes tratamientos de mutagenizacion (un tratamiento unico deberia ser entendido una fase de mutagenizacion seguida de una fase de filtrado/seleccion), pero es actualmente preferido que no mas de 20, o no mas de 10, o no mas de 5, tratamientos (o fases de filtrado/seleccion) sean realizados.
En un mutante actualmente preferido menos del 1%, menos del 0,1, menos del 0,01, menos del 0,001% o incluso menos del 0,0001% de los nucleotidos en el genoma bacteriano se han sustituido por otro nucleotido, o eliminado, en comparacion con la cepa madre.
[0048] Formas de realization de la presente invencion son descritas abajo, por medio de ejemplos no limitativos. EJEMPLOS
Metodo para determination de la actividad de nitrato-reductasa
[0049] El metodo siguiente se puede usar para determinar la actividad de nitrato-reductasa (NRA):
En una primera fase, aproximadamente 5 x 108 UFC/mL se incuban estaticamente en un tampon de induction (10 g/l triptona, 1 g cisteina, 1 g KNO3 pH 7.0) a 30°C en las tazas de reaction de Eppendorf.
La temperatura y periodo de incubation se adaptan al problema particular que deberia ser evaluado.
Es importante reducir el suministro de oxigeno de las celulas en el tampon de induccion a un minirno minimizando la fase de aire sobre la suspension, por ejemplo usando un aceite mineral para el cubrimiento.
Usando el mismo recuento de celulas, periodo de incubacion y temperatura cada vez, los resultados son comparables de un ensayo a otro pero es tambien adecuado dosificar las celulas por medicion de OD600 si se necesita un analisis rapido y ningun recuento de celulas esta disponible.
Por ejemplo cuando los aislados almacenados en placas de agar tengan que ser evaluados para actividad de nitrato- reductasa la inoculation del tampon de induccion deberian ser realizados segun la medicion de OD600.
Aqui es importante incubar una colonia de placas de agar al dia en un medio adecuado e inocular un volumen adecuado de medio fresco por la noche que es luego incubado durante toda la noche.
Las muestras que deberian ser comparadas entre si deberian tener una densidad optica comparable que se podria actuar en la suposicion de que todas las muestras muestren mas o menos la misma proportion de celulas vivas y muertas, lo que hace la dosificacion por medicion de OD600 realizable.
De estos cultivos mantenidos durante toda la noche se podria inocular el tampon de induccion a la misma OD600 de todas muestras.
La OD600 deberia no exceder 0,6 ya que una densidad optica superior a 0,6 esta moderando los resultados.
[0050] La etapa de induccion es importante ya que de alguna manera imita las condiciones que tambien ocurririan en el producto final cuando se aplican cultivos para estabilidad del color en la carne.
El sistema de nitrato-reductasa de Staphylococcus se induce por condiciones anaerobicas en presencia de nitrato como es el caso en el producto de carne.
El proceso regulador de la induccion del sistema de reduction de nitrato (transcription, biosintesis de proteina) necesita algun tiempo en el producto carnico, por lo tanto se considero usar una fase de induccion para dar a las celulas el tiempo para "reactivar" el sistema de reduccion de nitrato cuando este ocurriera en el producto carnico.
[0051] El ensayo mismo se basa en un metodo desarrollado por Lowe y Evans (Lowe y Evans (1964). Biochimica et biophysica acta 85; 377-389) donde la velocidad de reaccion se determina por la medicion de la production de nitrito a partir de nitrato en un sistema de ditionito/bencil viologeno.
Una mezcla reactiva se usa, consistente en tampon de fosfato potasico (100 mM; pH 7.0), bencil viologeno (30 mM) como donante de electrones artificial, nitrato de potasio (12 mM) y el agente reductor ditionito (141 mM).
La adicion de ditionito en exceso facilita la manipulation bajo condiciones de laboratorio sin camara anoxica.
La reaccion comienza por la adicion de las celulas bacterianas.
Mezcla reactiva:
0.2 Ml Suspension de celula preinducida
10. 8 ml Tampon de fosfato potasico (100 MM; pH 7.0)
0.4 Ml Solution de KNO3 (12 MM)
0.4 Ml Solucion de bencil viologeno (30 MM)
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[0052] Precalentar la probeta al bano maria a 30°C durante 2 min por agitacion lenta.
0.4 Ml Solucion de ditionito (141 MM)
• incubar la probeta al bano maria y transferir 0.4 ml de esta solucion a tazas de Eppendorf a varios intervalos de tiempo (por ejemplo 0, 5, 10, 20,30 y 60 minutos)
• las muestras deberian ser aireadas por la agitacion inmediatamente despues del muestreo hasta decoloracion del bencil viologeno reducido
• la taza es luego centrifugada a 10.000 x g durante 3 minutos
• 50 pl del sobrenadante se transfiere a un pocillo de una placa de microtitulacion de 96 pocillos (al menos 5 pocillos)
• 250 pl del reactivo Griess se anade a cada pocillo
• Almacenar la placa a oscuras durante 10 min
• Leer la absorbancia a 540 nm con lector de microplacas
• la absorbancia deberia no exceder 0,8 de lo contrario es necesaria dilucion
Observaciones
[0053] Como control es adecuado no anadir celulas o nitrato.
Se podria crear un grafico estandar donde se usan muestras de concentracion de nitrito conocidas y calcular el coeficiente de extincion molar que corresponde a la pendiente de la linea.
Con la ayuda del coeficiente de extincion molar y la absorbancia medida es posible calcular las concentraciones de nitrito en el tiempo particular.
Por la implementacion del factor temporal se podria calcular la actividad enzimatica pero es tambien adecuado solo coger la absorbancia a 540 nm como una indicacion directa de la actividad de nitrato-reductasa.
[0054] Metodo para determinacion de nitrato y nitrito en la carne y productos carnicos.
El metodo siguiente se puede usar para determinar las concentraciones de nitrato y de nitrito:
Principio de determinacion
[0055] La muestra es extraida con agua caliente y el extracto es filtrado despues de la desnaturalizacion del contenido de proteina.
El filtrado contiene el nitrato y nitrito extraidos.
El nitrito se puede determinar directamente por la reaccion de Griess anadiendo sulfanilamida (reactivo de color I) y N-(1-Naftil-)-etilendiamoniodicloruro (reactivo de color II).
El producto de esta reaccion, un cromoforo con un maximo de absorcion a 546 nm, muestra un color rosa y se puede determinar fotometricamente.
El nitrato no se puede determinar directamente, tiene que ser reducido primero a nitrito.
La reduccion se hace por flujo pasante del filtrado via una columna de reduction que contiene cadmio metalico como agente reductor.
La diferencia entre la cantidad de nitrito determinada despues de la reduccion por medio de la columna de cadmio (nitrito total) menos la cantidad determinada en el filtrado directamente despues de la extraction (nitrito) da la cantidad de nitrato en la muestra.
Experimental
[0056] El lodo de cadmio se prepara disolviendo 60-70 g de cadmiosulfato (3CdSO4 x 8 H2O) en 600 ml de agua desionizada.
Para precipitation de cadmio 3-5 bastones de zinc se sumergen en la solucion.
El cadmio precipitado se cosecha por decantation despues de 6-8 h. El precipitado es lavado en 2x 1000 ml de agua desionizada.
El precipitado lavado se mezcla con 400 ml 0.1 M HCl y se incuba durante toda la noche en HCl.
La columna de reduccion se prepara poniendo lana de vidrio en la reduccion gradual de la columna de vidrio para la retencion del lodo de cadmio.
Despues de la decantacion del HCl el lodo de cadmio se lava en la columna con agua desionizada hasta alcanzar una altura de aproximadamente 170 mm.
Inclusiones y burbujas de aire deberian ser evitadas y necesitan quitarse si aparecen.
La columna deberia permitir un flujo a traves de 6-9 ml/min.
[0057] Las muestras de carne se homogenizan por trituration.
Aproximadamente 10 g de muestra (el peso exacto se anota para el calculo) se pesa en un matraz de Erlenmeyer de 100 ml. 10 ml de una solucion de borato sodico saturado (50 g/l de disodiotetraborato-decahidrato disuelto en agua caliente desionizada) y 50 ml de agua desionizada son agregados.
La suspension se mezcla integramente y se calienta a 95°C durante 15 min. Despues la suspension es transferida de forma cuantitativa a un matraz aforado de 200 ml y se calienta otra vez a 95°C durante 15 min. La suspension es mezclada periodicamente.
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Posteriormente 5 ml de solucion de Carrez I (106 g/l potasiohexacianoferrato(II)-trihidrato disuelto en agua desionizada; la solucion debe ser almacenada en una botella marron y debe ser preparada semanalmente) y de Carrez II (220 g acetato de zinc en 30 ml acido acetico puro y rellenado hasta 1000 ml con agua desionizada) se anaden para desnaturalizar la proteina residual.
La suspension es mezclada integramente.
Si se necesita, dependiendo de la naturaleza de la muestra (por ejemplo contenido alto en grasa) la cantidad de soluciones de Carrez puede ser aumentada.
Tras el enfriamiento a temperatura ambiente el matraz aforado se rellena con agua desionizada hasta la marca y se mezcla.
La solucion de muestra se filtra por un filtro para precipitados medio-finos.
La primera parte del filtrado es descartada; el filtrado tiene que ser claro e incoloro.
[0058] Para la determinacion de nitrito, 10 ml de filtrado se transfieren a un matraz de 100 ml anadiendo 5 ml de reactivo de color I (6g sulfanilamida disuelta en 500 ml de agua desionizada calentando, adicionado 250 ml HCl (37%) por agitacion permanente tras el enfriamiento y rellenado hasta 1000 ml con agua desionizada) y reactivo de color II (0,25 g N-(1-Naftil)etilendiamoniodicloruro disuelto en 250 ml de agua desionizada; la solucion tiene que ser almacenada en una botella marron y tiene que ser preparada semanalmente).
La solucion se incuba a oscuras durante 30 min a temperatura ambiente.
En seguida la extincion de la solucion se determina fotometricamente a 546 nm contra un ciego (reactivo de Color I y II + agua desionizada en una relacion de 1:2).
[0059] Para la determinacion de nitrato, 20 ml del filtrado se transfire en un matraz de 100 ml anadiendo 5 ml de tampon de amoniaco (20 ml HCl (37%) diluido en 500 ml de agua desionizada, adicionado 10 g Titriplex III (EDTA) y 55 ml de solucion de amoniaco (25%) y rellenado hasta 1000 ml con agua desionizada; pH 9,6-9,7).
La solucion mezclada se transfiere a la columna de reduction.
La columna tiene que ser preparada antes por flujo a traves de 25 ml de HCl (0,1M), 50 ml de agua desionizada y 25 ml de solucion de tampon de amoniaco diluido (1:10 dilution en agua desionizada).
La columna nunca deberia ejecutarse en seco.
El eluato para la determinacion de nitrato se recoge en un matraz aforado de 100 ml.
Despues de que el filtrado entero sea anadido la columna es lavada 3-4 veces con aproximadamente 15 ml de agua desionizada.
El flujo a traves es tambien recogido en el matraz aforado.
El matraz aforado que ahora esta conteniendo la solucion de muestra reducida es rellenado hasta la marca con agua desionizada y mezclado integramente.
Para la determinacion de nitrito/nirato reducido, 10 ml de filtrado se transfieren a un matraz de 100 ml anadiendo 5 ml de reactivo de color I y II.
La solucion se incuba a oscuras durante 30 min a temperatura ambiente.
A continuation la extincion de la solucion se determina fotometricamente a 546 nm contra un ciego (reactivo de Color I y II + agua desionizada en una relacion de 1:2).
Calculos
[0060] La concentration de nitrito, indicada como NaNO2 en ppm [mg/kg], es calculada de la siguiente manera:
donde
Concentracion de nitrito [ppm] = a * V / Ew
a: |jg NaNO2 (este valor puede ser leido directamente de una linea de calibration despues de la determinacion de la extincion de la muestra a 546 nm.
La linea de calibracion se genera por la determinacion de la extincion a 546 nm de soluciones con la concentracion de nitrito conocida) en la muestra directamente despues de la extraction.
V: factor de dilucion.
Ew: peso de muestra en g.
[0061] La concentracion de nitrito total, indicada como NaNO2 en ppm [mg/kg], es calculada de la siguiente manera:
Concentracion de nitrito total [ppm] = b * V / Ew
donde
b: jg NaNO2 (este valor puede ser leido directamente de una linea de calibracion despues de la determinacion de la extincion de la muestra a 546 nm.
La linea de calibracion se genera por la determinacion de la extincion a 546 nm de soluciones con concentracion de nitrito conocida) originalmente en la muestra mas el nitrito que es derivado de nitrato por reduccion a traves de la columna de cadmio.
V: factor de dilucion.
Ew: peso de muestra en g.
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[0062] La concentracion de nitrato, indicada como KNO3 en ppm [mg/kg], es calculada de la siguiente manera:
Nitrito de la concentracion de nitrato [ppm] = concentracion de nitrito total [ppm] - concentracion de nitrito [ppm]
Concentracion de nitrato [ppm] = nitrito de la concentracion de nitrato [ppm] x 1,465 (factor de conversion de nitrito a nitrato)
[0063] Ejemplo 1: procedimiento de fermentacion estandar para especies de Staphylococcus.
Experimental:
[0064] Las fermentaciones fueron efectuadas en una version modificada del medio de glicerol estandar que se usa para Staphylococcus carnosus MIII.
El contenido de glicerol se reduce en comparacion con el medio estandar usado para Staphylococcus carnosus MIII para asegurar un suministro suficiente con oxigeno.
Medio de fermentacion:
Description del objeto
% Peso (g)
Agua
91.20 10944.00
Aceite antiespumante Erol DF 204 K
0.20 24.00
Nitrato de potasio
0.10 12.00
Extracto de levadura - HyYest 412 (Sheffield Bioscience)
5.00 600.00
Glicerol 99.5%
3.50 420.00
Suma
100.00 12000.00
[0065] Medio de fermentacion fue preparado y el pH fue ajustado a 7.2 antes de esterilizacion por la autoclave a 121°C durante 20 min. El pH fue ajustado a 7.2 y la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus fue inoculada a 0,1% (aprox. 2,6x107 UFC/mL).
La fermentacion se efectuo a 37°C con agitacion de 500 r.p.m. y una corriente de aire de 0,5 vvm (6 L/min) durante 15,5 horas.
[0066] Se tomaron muestras durante el proceso de fermentacion entero en los mismos puntos temporales mostrados en la figura 1.
Las muestras fueron analizadas con respecto a la concentracion de nitrato/nitrito.
Resultados
[0067] Los resultados muestran que la cepa (CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus) esta reduciendo nitrato a nitrito despues de aproximadamente 6-8 horas de fermentacion.
Esto indica una caida en el suministro de oxigeno en ese momento muy probablemente provocada por un aumento en la densidad celular.
La transcription del operon nar (reduction de nitrato) es inducida bajo condiciones anoxicas en presencia de nitrato e inhibida por la presencia de oxigeno.
La Figura 1 muestra que el NRA esta aumentando entre 8 y 9 horas a cierto nivel, donde muy probablemente ocurre una caida en el suministro de oxigeno.
El NRA es maximo alrededor de 9 horas de fermentacion y luego disminuye otra vez muy probablemente debido a la falta de nitrato que es rapidamente reducida cuando ya no se suministra suficiente oxigeno a la cepa.
Sin embargo, el nivel alto de nitrito que ya no es reducido a amoniaco por Staphylococcus vitulinus es tambien conocido por inducir el operon nar.
Esto podria explicar que hay solo una ligera reduccion en NRA al final de la fermentacion.
De los datos mostrados se puede ver claramente que la cepa esta agotando rapidamente los nitratos y esto puede explicar el NRA reducido de la cepa cuando se produce por el procedimiento de fermentacion monofasico estandar. Para mejorar el NRA de Staphylococcus vitulinus se sugirio ejecutar un procedimiento de fermentacion dividido en dos fases.
En la primera fase la cepa tiene que ser suministrada con oxigeno suficiente para generar biomasa eficazmente.
En la segunda fase el proceso deberia ser accionado por condiciones aerobicas a anaerobicas o de limitation de oxigeno acompanadas por un suministro continuo de nitrato.
Se debe evitar que la cepa este agotando el nitrato durante el crecimiento anaerobico o limitado al oxigeno hasta el final de la fermentacion.
Ejemplo 2: adaptation del procedimiento de fermentacion estandar a un proceso bifasico.
[0068] El procedimiento de fermentacion adaptado para optimizar el NRA de la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus se puede dividir en dos fases.
El fin de la primera fase es el desarrollo de la biomasa mientras la cepa se airea suficientemente mientras que la
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segunda fase es para la preparacion para optimizar/aumentar el NRA al reducir la aireacion y suministrar impulsos continuos de nitrato hasta que el final de la fermentacion.
En total dos fermentaciones fueron efectuadas aplicando el proceso descrito de forma aproximada anteriormente. Las fermentaciones fueron efectuadas en una version modificada del medio de glicerol estandar que se usa para Staphylococcus carnosus MIII.
El contenido de glicerol se reduce en comparacion con el medio estandar usado para Staphylococcus carnosus MIII para asegurar un suministro suficiente con oxigeno durante la primera fase de fermentacion aireada.
En total 4 fermentaciones fueron efectuadas, 2 dejando de lado el nitrato que se usa por defecto en el medio de glicerol estandar.
Sin embargo, el suministro de nitrato se aplico en ambos casos despues de reducir la aireacion.
Experimental
[0069] Un lote de medio de fermentacion se preparo segun la receta en el ejemplo 1 y un lote de medio de fermentacion sin nitrato fue preparado.
El pH de ambos medios fue ajustado a 7.2 antes de esterilizacion por autoclave a 121°C durante 20 min. El pH fue ajustado a 7.2 nuevamente y la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus fue inoculada a 0,1% (aprox. 2,6x107 UFC/mL) en cada medio de fermentacion.
[0070] El contenido de oxigeno disuelto (pO2) en el medio de fermentacion fue medido con sensores opticos de oxigeno disuelto (Mettler Toledo InPro6870i/120).
La fermentacion se efectuo a 37°C con agitacion a 500 r.p.m. y una corriente de aire de 0.5 vvm (6 L/min) hasta que pO2 alcanzo 0 (aproximadamente 6,3 horas).
Luego la corriente de aire fue reducida a 0,08 vvm (1 L/min) y el suministro de nitrato (0,17 g/L nitrato de potasio con 10 min de impulsos=1,02 g/(l*h)) comenzo.
La fermentacion se efectuo durante aproximadamente 19 horas en total.
Luego la fermentacion fue enfriada hasta 15°C y las celulas fueron cosechadas.
[0071] Muestras de las fermentaciones anteriormente descritas se tomaron en momentos diferentes y se analizaron con respecto a la concentracion de nitrato y de nitrito.
Los resultados de los analisis se muestran en las Figuras 2 (ningun nitrato anadido al medio de fermentacion inicial) y 3 (nitrato anadido al medio de fermentacion inicial).
Resultados
[0072] Los resultados (figuras 2 y 3) claramente muestran que la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus esta convirtiendo/reduciendo suficientemente nitrato en nitrito en el momento que ya no se suministra oxigeno suficiente. Como ningun nitrato se esta acumulando durante la fase de suministro, el NRA parece ser mas bien alto.
Sin embargo, la actividad maxima de CHCC10896 puede no ser alcanzada aun cuando la concentracion de nitrito sigue aumentando mientras el nitrato es completamente reducido.
Si la actividad maxima hubiera sido alcanzada, el nitrato deberia haberse acumulado y la concentracion de nitrito ya no aceleraria con la misma pendiente o incluso alcanzada una fase de meseta/estacionaria.
[0073] Cuando el nitrato se anade en el medio desde el principio (figura 3) la pendiente de acumulacion de nitrito es ligeramente mas pronunciada en comparacion con la fermentacion donde el nitrato no estaba adicionado desde el principio (figura 2).
Por lo tanto, se decidio usar un medio por lotes donde ningun nitrato se anade desde el principio ya que de todos modos no es reducido por Staphylococcus vitulinus hasta que la aireacion es reducida.
Ejemplo 3: ensayo de aplicacion en embutido tipo mortadela.
[0074] Para probar el efecto del procedimiento de fermentacion en dos fases recien desarrollado en una prueba de aplicacion, 2 fermentaciones diferentes fueron efectuadas; una fermentacion de la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus despues de la fermentacion estandar y una fermentacion despues de un procedimiento en dos fases como se ha descrito anteriormente.
[0075] Las celulas de ambas fermentaciones fueron cosechadas y liofilizadas anadiendo un crioaditivo.
Ambos lotes fueron usados en un contexto de aplicacion por la produccion de 3 lotes de embutidos emulsionadas, 1 lote con Staphylococcus vitulinus fermentado por el procedimiento estandar, 1 lote con Staphylococcus vitulinus fermentado por una fermentacion en dos fases con suministro de nitrato en la segunda fase y 1 lote con el cultivo comercial Bactoferm® CS-300 (Chr. Hansen, Dinamarca) compuesta por 2 cepas de Staphylococcus carnosus que sirve como un control.
Experimental
Determinacion de recuento de celulas de granulado liofilizado.
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[0076] La determination de recuento de celulas se efectuo por citometria de flujo:
Cepa
ID Muestra Activo/g CV Total/g CV Activo / total SD
S. vitulinus
Std 5.97E+11 3.9% 9.97E+11 2.0% 60% 1.1%
S. vitulinus
Suministro de nitrato 4.95E+11 0.2% 5.54E+11 0.5% 89% 0.3%
CV: coeficiente de variacion. SD: desviacion estandar.
Embutidos emulsionados
[0077] Embutidos tipo Mortadela - receta (10 kg lote):
20%
RII (carne magra) 2 Kg
40%
SII (paleta de cerdo) 4 Kg
20%
Grasa (manteca de cerdo) 2 Kg
20%
Hielo 2 Kg
20 g/kg
Sal comun 200 g
2 g/kg
Pimienta blanca 20 g
0.5 g/kg
Cardamomo 5 g
2 g/kg
Dextrosa 20 g
3 g/kg
Di-fosfato 30 g
0.1 g/kg
Nitrato de Na 1 g
• toda la carne y grasa fueron trituradas a traves de una placa de 2 mm
• todos los ingredientes incluyendo cultivos bacterianos fueron puestos en un bol (Mado Supra 35), desmenuzados y cortados a 4000 r.p.m. y velocidad de bol 2
• 10 vueltas seguido de limpieza y adicion de 500 g CO2 (temperatura de troceado inferior)
• 20 vueltas (30 en total) seguido de limpieza
• 20 vueltas (50 en total) para acabar el corte
• la mezcla fue rellenada en envolturas de 75 mm Nalo TOP (+ 8 tazas para analisis)
• el tratamiento de curacion se efectuo a 4°C, 12°C y 18°C durante 21 horas
• tratamiento termico a 80°C en la camara hasta 72°C en el centro
• 20 minutos de ducha de fria
• se dejo en la camara de enfriamiento a 4°C durante 24 hrs Nivel de concentracion/inoculacion de celulas meta
[0078] Como CS-300 fue usado como control, ambas muestras de Staphylococcus vitulinus fueron dosificadas segun el recuento de celulas meta de CS-300 para 100 kg de carne.
Originalmente, ambas cepas en CS-300 fueron dosificadas al mismo nivel pero debido al cambio al medio de fermentacion MIII, esta cepa fue sobredosificada en un 20% como margen de seguridad:
Recuento de celulas meta de CS-300 = 3,2x1012 CFU/100 lg
[0079] Un margen de seguridad del 20% fue anadido en cada producto sobre el recuento de celulas meta.
[0080] El recuento de celulas meta de muestras de Staphylococcus vitulinus = 3.0x1012 CFU/100 kg de carne + 20% margen de seguridad
Staphylococcus vitulinus - estandar (1) = 6,03g/100 kg Staphylococcus vitulinus - suministro de nitrato (2) = 7J g/100 kg
Denominacion de lotes
[0081]
1) Staphylococcus vitulinus - estandar
2) Staphylococcus vitulinus - suministro de nitrato
3) Bactoferm® CS-300
Incubacion/fermentacion
[0082] En cada caso 3 embutidos de cada uno de los tres lotes fueron fermentados a las temperaturas siguientes durante 21 horas antes de coccion para imitar el proceso de volteo:

• 4°C

• 12°C

• 188°C
Resultados Analisis quimico
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[0083] Las concentraciones de nitrato/nitrito en la materia prima antes del relleno, en la materia prima despues de 21 horas de fermentacion y en el producto final despues de la coccion fueron determinadas por el metodo anteriormente descrito (figuras 4-6).
Analisis microbiologico
[0084] Materia prima extraida despues de la fermentacion y antes de la coccion.
1) - 4°C 5,0x106 CFU/g
2) - 4°C 3,9x107 CFU/g
3) - 4°C 4,4x107 CFU/g
1) - 12°C 8,2x106 CFU/g
2) - 12°C 4,7x107 CFU/g
3) - 12°C 4,2x107 CFU/g
1) - 18°C 7,6x106 CFU/g
2) - 18°C 5,9x107 CFU/g
3) - 18°C 5,1x107 CFU/g
Determinacion de intensidad de color de rojo
[0085] Muestras fueron medidas en un colorimetro Konica Minolta y los valores a* fueron determinados segun el sistema de color L*a*b* (figura 7).
Discusion
[0086] Podria ser claramente mostrado que la modificacion del procedimiento de fermentacion de la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus lleva a una mejora significativa de actividad de nitrato-reductasa en la aplicacion de carne.
La cepa producida por un suministro de nitrato durante la fase de crecimiento de oxigeno limitado lleva a una formacion de color rojo agradable incluso a temperaturas bajas que se refleja por los resultados de la determinacion de nitrato/nitrito y la determinacion de intensidad de color rojo.
Hay una ventaja clara de un suministro de nitrato durante la fase de oxigeno limitada en comparacion con el proceso de fermentacion estandar.
Una diferencia significativa puede verse en la intensidad de color rojo especialmente a temperaturas bajas (4°C y 12°C).
Ademas, se muestra que la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por suministro de nitrato muestra un rendimiento de formacion de color rojo significativamente mejor que CS-300 a 4°C y 12°C.
Ejemplo 4: segunda prueba de aplicacion en embutidos tipo mortadela.
[0087] Para confirmar los resultados de la primera y segunda prueba de aplicacion, otra prueba de aplicacion con materia liofilizada recien producida fue realizada para asegurar la robustez del procedimiento de fermentacion en dos fases.
[0088] 4 lotes diferentes de embutidos emulsionados fueron producidos aplicando Staphylococcus vitulinus producida por un procedimiento de fermentacion en dos fases bien con o sin nitrato adicionado desde el principio, CS-300 y NatuRed LT. Los embutidos fueron incubados a temperaturas diferentes (4°C, 8°C, y 12°C) y la fermentacion a estas temperaturas fueron realizadas durante 7 horas, 12 horas y 24 horas para seguir el desarrollo de reduccion de nitrato y proceso de formacion de color rojo.
Experimental
[0089] Determinacion de recuento de celulas de granulado liofilizado producido como se describe en el ejemplo 2
[0090] La determinacion de recuento de celulas se efectuo por citometria de flujo:
Cepa
Muestra ID Activo/g CV Total/g CV Activo / total
S. vitulinus
Suministro de nitrato, nitrato desde el principio 4.17E+11 9.8% 5.54E+11 2.3% 75%
S. vitulinus
Suministro de nitrato, ningun nitrato desde el princi pio 4.23E+11 3.1% 5.18E+11 1.1% 82%
CV: coeficiente de variacion. SD: desviacion tipica.
5
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15
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30
35
40
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50
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Embutidos emulsionados
[0091]
Embutidos tipo Mortadela - receta (15 kg lote):
20%
RII (carne magra) 3 Kg
40%
SII (paleta de cerdo) 6 Kg
20%
Grasa (manteca de cerdo) 3 Kg
20%
Hielo 3 Kg
20 g/kg
Sal comun 300 g
2 g/kg
Pimienta blanca 30 g
0.5 g/kg
Cardamomo 7.5 g
2 g/kg
Dextrosa 30 g
3 g/kg
Di-fosfato 45 g
0.1 g/kg
Nitrato de Na 1.5 g
• toda la carne y grasa fueron trituradas a traves de una placa de 2 mm
• todos los ingredientes incluyendo cultivos bacterianos fueron puestos en un bol (Mado Supra 35), desmenuzado y cortado a 4000 r.p.m. y velocidad de bol 2
• 10 ciclos seguidos de limpieza y adicion de 500 g CO2 (temperatura de troceado inferior)
• 20 ciclos (30 en total) seguido de limpieza
• 30 ciclos (60 en total) para acabar el corte
• la mezcla fue dividida en 3 lotes de 5 kg
• corte otras 15 vueltas a 2000 r.p.m. y velocidad de bol 1
• la mezcla fue rellenada en envolturas de 75 mm Nalo TOP (+ tazas para analisis)
• el tratamiento de curacion se efectuo a 4°C, 8°C y 12°C durante 24 horas
• tratamiento termico a 80°C en la camara hasta 72°C en el centro
• 20 minutos ducha fria
• se dejo en la camara de enfriamiento a 4°C durante 24 hrs.
Nivel de recuento/inoculacion de celulas meta
[0092] El recuento de celulas meta para cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus tal como se ha mencionado anteriormente es 3.0x1012 CFU/100 kg de carne.
Bactoferm® CS-300 y TEXEL® NaturRed LT fueron aplicados como se recomienda por la information de producto. Denomination de lotes
[0093]
1) Staphylococcus vitulinus - suministro de nitrato; nitrato desde el principio
2) Staphylococcus vitulinus - Suministro de nitrato; ningun nitrato desde el principio
3) Bactoferm® CS-300
4) TEXEL® NatuRed LT
Incubacion/fermentacion
[0094] En cada caso 4 embutidos de cada uno de los cuatro lotes fueron fermentados a las temperaturas siguientes para imitar el proceso de volteo:

• 4°C

• 12°C

• 18°C
Periodo de incubation antes de coccion
[0095]
• 7 horas
• 12 horas
• 24 horas
Resultados Analisis quimico
[0096] Para cada cultivo, periodo de incubacion y temperatura antes de la coccion
• un total de 36 muestras (vasos de precipitation de tapa roja) fueron analizados
5
10
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45
50
55
[0097] Para cada cultivo, periodo de incubacion y temperatura despues de la coccion • un total de 36 muestras (embutidos finales) fueron analizadas figura 8.
Determinacion de intensidad de color rojo
[0098] Muestras fueron medidas en un colorimetro Konica Minolta y los valores a* fueron determinados segun el sistema de color L*a*b* (figuras 9-11)
Discusion
[0099] Los datos confirman los resultados de los ensayos precedentes (Ejemplo 3 y 4).
Cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus muestra un nitrato mas eficaz para conversion de nitrito en todas las temperaturas evaluadas comparado con Bactoferm@ CS-300 y es al menos comparable a TEXEL® NatuRed.
El mejor nitrato para conversion de nitrito es tambien documentado por el color rojo mas intensivo de embutidos producidos por la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus.
Sin embargo, la presencia de nitrato en el medio de lote desde el principio de la fermentacion parece tener una influencia negativa en la conversion de nitrato y formacion de color rojo porque este lote parece ser menos eficaz en comparacion con el lote donde ningun nitrato estuvo presente hasta que comenzo el suministro.
La prueba muestra una ventaja clara de la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por un proceso de fermentacion en dos fases, una primera fase aerobica sin la presencia de nitrato en el medio de lote y una segunda fase anaerobica o limitada al oxigeno con un suministro continuo de nitrato.
Ejemplo 5: prueba de aplicacion en jamon cocido.
[0100] Cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus fue evaluada en un modelo de jamon cocido en comparacion con Bactoferm® CS-299 (Chr. Hansen, Dinamarca), el cultivo que es mas frecuentemente usado para esta area de aplicacion ademas de Bactoferm® CS-300.
Bactoferm® CS-299 esta compuesto de solo una cepa de Staphylococcus carnosus mientras que Bactoferm® CS- 300 esta compuesto de dos cepas de Staphylococcus carnosus diferentes.
El recuento de celulas de Bactoferm® CS-300 es dos veces el recuento de celulas de Bactoferm® CS-299. Experimental
[0101] Production de jamon cocido aplicando la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida por un procedimiento de fermentacion en dos fases en comparacion con Bactoferm® CS-299.
El nivel de inoculation de cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus fue alineada con el recuento de celulas meta de Bactoferm® CS-299 (1.5x1012 CFU/kg).
Jamon cocido
[0102]
1. Corte de musculo redondo de pierna de cerdo (nuez) para obtener carne magra.
2. "Trituration" de la carne por triturador (Mado MEW 718) ejecutada con taladro solo.
3. Cultivo bacteriano y solution salina se anadio a la carne. Volteo por la maquina de volteo (Ruhle MKR 150) durante 16 horas a 6°C. Vueltas Totales 5220. 15 Minutos ejecutandose por 10 r.p.m. y 15 minutos de reposo.
4. Vacio de embalaje en bolsas PE/PA .
5. Moldeo.
6. Tratamiento termico en camara Autotherm por vapor a 80°C hasta 75°C en el centro, seguido de 10 minutos de ducha fria.
7. Enfriamiento final a 3-4°C en la camara de enfriamiento.
8. Desmoldeo y corte.
[0103] 100 kg carne mas 15 kg solucion salina (15%)
[0104] Calculo de solucion salina para conseguir: 2% sal comun en el producto final (115 kg, ninguna perdida de peso)
0.2% Dextrosa 0.3% Di-fosfato 0.01% Nitrato de potasio
Carne 8000 g

Sal comun 184 g

Dextrosa 18 g

Di-fosfato 28 g

Nitrato de potasio 1 g

Agua del grifo 969 g
Cultivo Ver arriba
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Total 9200 g
Resultados
Determinacion de intensidad de color de rojo
[0105] Debido al hecho de que un jamon cocido normalmente no tiene una superficie homogenea una loncha de 0,5 cm de cada lote fue homogeneizada por la trituracion.
El material triturado de cada lote fue estratificado en una placa de Petri que da una superficie homogenea para determinar el color rojo.
[0106] Las muestras fueron medidas en un colorimetro de Konica Minolta CR-400 y los valores a* fueron determinados segun el sistema de color L*a*b* (figura 12).
Ademas, la intensidad de color rojo fue examinada visualmente (figura 13).
Discusion
[0107] De la observacion visual y determinacion de intensidad de color rojo se puede concluir que la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus producida usando un procedimiento de fermentacion en dos fases da un mejor color que Bactoferm® CS-299 cuando se voltea a temperaturas bajas (6°C): el jamon cocido preparado con la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus pretratada con el metodo de fermentacion en dos fases tiene un color rojo mas intenso y mas luminoso que el jamon cocido preparado con Bactoferm® CS-299 (figura 13).
Este podria tambien ser medido como un valor a* mas alto (intensidad de color rojo) segun el sistema L*a*b* del jamon cocido preparado con la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus pretratada con el metodo de fermentacion en dos fases (figura 12).
El color rojo mas intenso es mas probablemente debido a una conversion/reduccion mas eficaz de nitrato a nitrito.
Ejemplo 6: Cepa CHCC11576 de Staphylococcus vitulinus fermentada segun el procedimiento de fermentacion estandar en comparacion con el procedimiento de fermentacion en dos fases en una aplicacion de embutidos emulsionados
[0108] Para probar si el procedimiento de fermentacion en dos fases esta tambien mejorando la capacidad de una cepa de Staphylococcus vitulinus diferente para convertir metamioglobina en la nitrosilmioglobina para producir un color rojo estable a bajas temperaturas, la cepa CHCC11576 de Staphylococcus vitulinus fue fermentada segun el procedimiento de fermentacion estandar y segun el procedimiento de fermentacion en dos fases como se ha descrito antes.
Las celulas de ambas fermentaciones fueron cosechadas y liofilizadas.
Ambos lotes fueron usados en una prueba de aplicacion por la production de 3 lotes de embutidos emulsionadas; 1 lote con la cepa CHCC11576 de Staphylococcus vitulinus fermentada por el procedimiento estandar, 1 lote con la cepa CHCC11576 de Staphylococcus vitulinus fermentada por una fermentacion en dos fases con suministro de nitrato en la segunda fase, y 1 lote con una cepa A de Staphylococcus carnosus fermentada por el procedimiento estandar.
Experimental
Determinacion de recuento de celulas de granulado liofilizado.
[0109] La determinacion de recuento de celulas se efectuo por citometria de flujo:
Cepa
Lote Activo/g CV Total/g CV Activo/total SD
CHCC11576 de S. vitulinus
Fermentacion estandar 8.65E+11 0.7% 1.18E+12 1.5% 74% 0.5%
CHCC11576 de S. vitulinus
Fermentacion en dos fases 3.47E+11 1.8% 4.52E+11 1.2% 77% 0.4%
CV: coeficiente de variation. SD: desviacion tipica.
Embutidos emulsionados:
Embutidos tipo Mortadela - receta (5 kg lote):
20%
40%
20%
Tipo Mortadela:
RII (carne magra) 1 Kg
SII (paleta de cerdo) 2 Kg
Grasa (manteca de cerdo) 1 Kg
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Hielo 1 Kg
2 g/kg
Dextrosa 10 g
3 g/kg
Di-fosfato 15 g
0,1 g/kg
Nitrato de Na 0.5 g
[0111] El embutido tipo mortadela fue preparado segun el procedimiento descrito antes. Nivel de recuento/inoculacion de celulas meta
Recuento de celulas meta = 3.2E12 CFU/100 kg (incluyendo 20% margen de seguridad)
[0112] Cada lote fue inoculado segun el mismo recuento de celulas meta. Denominacion de lotes
[0113]
1) CHCC11576 - estandar
2) CHCC11576 - suministro de nitrato
3) S.carnosus
Incubacion/fermentacion
[0114] En cada caso 3 embutidos de cada uno de los tres lotes fueron fermentados en las temperaturas siguientes durante 20, respectivamente 18, horas antes de la coccion para imitar el proceso de volteo de jamon cocido:
• 4°C
• 8°C
Resultados
Determinacion de intensidad de color de rojo
[0115] Muestras fueron medidas en un colorimetro Konica Minolta y los valores a* fueron determinados segun el sistema de color L*a*b* (figuras 14 y 15).
Ademas, la intensidad de color rojo fue examinada visualmente (figuras 16 y 17).
Determinacion de concentracion de nitrato/nitrito:
[0116] Muestras de cada lote fueron rellenadas en los vasos de precipitacion de tapa roja e incubadas a 4°C y 8°C con los embutidos durante la misma duracion.
Las muestras fueron almacenadas a -20°C directamente tras la incubacion (4°C = 20h; 8°C = 18h).
Las muestras fueron analizadas con respecto a la concentracion de nitrato/nitrito enzimaticamente como se describe en Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren §64 Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuch (LFGB; German Food and Feed Act) (L 07.00-60) y los resultados se representan en la figura 18.
1) CHCC11576 de S. vitulinus - estandar
2) CHCC11576 de S. vitulinus - suministro de nitrato
3) S. carnosus
Conclusion:
[0117] Se podria mostrar claramente que la modificacion del procedimiento de fermentacion de la cepa CHCC11576 de Stapylococcus vitulinus lleva a una mejora significativa de actividad de nitrato-reductasa en la aplicacion a la carne.
La cepa producida por un suministro de nitrato durante la fase de crecimiento limitado al oxigeno lleva a una formacion de color rojo agradable a temperaturas relativamente bajas de 4°C y 8°C que se refleja por la determinacion de intensidad de color rojo que muestra un valor a* (intensidad de color rojo) segun el sistema L*a*b* significativamente superior al valor a* medido para los embutidos preparados utilizando bien CHCC11576 de Staphylococcus vitulinus producida por fermentacion estandar o cepa A de Staphylococcus producida por fermentacion estandar (figura 14 y 15) y la documentacion fotografica mostrando una coloracion mas roja de los embutidos preparados con CHCC11576 de Staphylococcus vitulinus producida por el metodo de fermentacion en dos fases de la invencion (figura 16 y 17).
Ademas, podria ser mostrado, que se reduce mas nitrato y se desarrolla mas nitrito por CHCC11576 de Staphylococccus vitulinus cuando se fermenta segun el procedimiento de fermentacion en dos fases por el nitrato de suministro durante la fase anaerobica (figura 18).
En el caso de CHCC111576 de Staphylococcus vitulinus cuando se somete a fermentacion estandar ningun nitrito
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pudo ser detectado en las muestras de carne y la concentration de nitrato es significativamente mas alta.
Hay una ventaja clara de un suministro de nitrato durante la fase de oxigeno limitada en comparacion con el proceso de fermentation estandar.
La mejora de CHCC11576 de Staphylococcus vitulinus es comparable a la mejora ya mostrada para CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus, de modo que puede ser concluido, que la optimization de la actividad de nitrato-reductasa por una fermentacion en dos fases como se describe antes no es exclusiva para CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus sino tambien para una cepa diferente, en este caso la cepa CHCC11576 de Staphylococcus vitulinus.
Es muy probable, que se pueda tambien alcanzar una mejora de actividad de nitrato-reductasa para otras especies del genero Staphylococccus, tal como Staphylococcus carnosus.
Ejemplo 7: comparacion de fermentacion de suministro y fermentacion de picos.
[0118] Dos fermentaciones fueron realizadas, evaluando si un suministro continuo durante la segunda fase poco aireada de la fermentacion es necesitado, o si dar solo un pico de nitrato de alta concentracion al principio de la segunda fase es tan eficaz en la mejora de la actividad de nitrato-reductasa como en la capacidad para convertir metamioglobina eficazmente en la nitrosilmioglobina.
[0119] La fermentacion en dos fases se ejecuto aerobicamente hasta que el nivel de oxigeno disuelto alcanzo 0% (pO2=0).
En este punto la aireacion fue bajada de 6 a 1 L/min y el suministro de nitrato comenzo (aprox. 1 G/L*h - dado en suministros pulsados cada 10 min).
El suministro fue continuado hasta que todo el glicerol de la fuente de carbono en el medio habia sido consumido (parada de base).
[0120] La fermentacion de picos fue completamente aireada hasta la parada de base.
En la parada de base (EFT: 10h), la aireacion fue bajada a 1L/min y el pico (que contiene aprox. 72 g/L glicerol y 216 g/L nitrato de potasio, que equivale 3 g/L glicerol y 9 g/L nitrato en el fermentador) se anadio al medio (volumen de pico fue 500 mL).
Glicerol fue dado con el pico de nitrato, ya que el nitrato no se reduce en el nitrito si ninguna fuente de carbono esta disponible.
Experimental
[0121] Determination de recuento de celulas de granulado liofilizado.
[0122] La determinacion de recuento de celulas se efectuo por citometria de flujo:
Cepa
Lote Activo/g CV Total/g CV Activo/total SD
CHCC10896 de S. vitulinus
Fermentacion de picos 1.03E+12 3.2% 1.13E+12 3.0% 91% 0.2%
CHCC10896 de S. vitulinus
Fermentacion en dos fases 3.47E+11 1.8% 4.52E+11 1.2% 77% 0.4%
CV: coeficiente de variation. SD: desviacion tipica.
Embutidos emulsionados:
Embutidos tipo mortadela - receta (5 kg lote):
[0123]
Tipo mortadela:
20%
RII (carne magra) 1 Kg
40%
SII (paleta de cerdo) 2 Kg
20%
Grasa (manteca de cerdo) 1 Kg
20%
Hielo 1 Kg
2 g/kg
Dextrosa 10 g
3 g/kg
Di-fosfato 15 g
0.1 g/kg
Nitrato de Na 0.5 g
[0124] Los embutidos tipo mortadela fueron preparados segun el procedimiento descrito antes. Nivel de concentracion/inoculacion de celulas meta
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Recuento de celulas meta = 3.2E12 CFU/100 kg (incluyendo 20% margen de seguridad)
[0125] Cada lote fue inoculado segun el mismo recuento de celulas meta.
Denominacion de lotes
[0126]
1) CHCC10896 - pico
2) CHCC10896 - suministro
3) S. carnosus
Incubacion/fermentacion
[0127] En cada caso 3 embutidos de cada uno de los tres lotes fueron fermentados en las temperaturas siguientes durante 20, respectivamente 18 horas antes de la coccion para imitar el proceso de volteo de jamon cocido:
• 4°C
• 8°C
Resultados
Determinacion de intensidad de color rojo
[0128] Muestras fueron medidas en un colorimetro Konica Minolta y los valores a* fueron determinados segun el sistema de color L*a*b* (figuras 19 y 20).
Ademas, la intensidad de color rojo fue examinada visualmente (figuras 21 y 22).
[0129] Determination de concentration de nitrato/nitrito:
Muestras de cada lote fueron rellenadas en los vasos de precipitation de tapa roja e incubadas a 4°C y 8°C con los embutidos durante la misma duration.
Las muestras fueron almacenadas a -20°C directamente tras la incubation (4°C = 20h; 8°C = 18h).
Las muestras fueron analizadas con respecto a la concentracion de nitrato/nitrito enzimaticamente como se describe en Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren §64 Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuch (LFGB; German Food and Feed Act) (L 07.00-60) y los resultados se representan en la figura 23.
1) CHCC10896 de S. vitulinus - pico
2) CHCC10896 de S. vitulinus - suministro
3) S. carnosus
Conclusion:
[0130] Podria ser claramente mostrado, que la fermentation en dos fases con suministro de nitrato continuo durante la segunda fase poco aireada del proceso esta conduciendo a una mejora significativa de actividad de nitrato- reductasa, respectivamente, de la capacidad para convertir metamioglobina de color marron en su derivado rojo nitrosilmioglobina en comparacion con la fermentacion estandar de la cepa A de Staphylococcus carnosus.
Cuando solo un pico de nitrato de alta concentracion fue dado al principio de la segunda fase (fermentacion de picos) la intensidad del color rojo, como se determina por el valor a* segun el sistema L*a*b* de los embutidos resultantes es superior que la de los embutidos preparados con Staphylococcus carnosus producida por fermentacion estandar pero significativamente inferior a la intensidad de color rojo de los embutidos preparados con la cepa sometida al metodo de fermentacion en dos fases segun la presente invention (con suministro de nitrato continua durante la segunda fase del metodo de fermentacion en dos fases).
La documentation fotografica refleja estas determinaciones mostrando que unos embutidos preparados con la fermentacion suministrada produjeron Staphylococcus vitulinus.
En comparacion la fermentacion en dos fases con un pico de nitrato al principio de la fase de crecimiento anaerobico, no lleva a ninguna mejora de actividad de nitrato-reductasa puesto que la intensidad de color rojo es comparable a la intensidad de color rojo de los embutidos preparados con la cepa A de Staphylococcus carnosus fermentada por fermentacion estandar.
Esto es tambien reflejado por la concentracion de nitrato y de nitrito en las muestras de carne tras la incubacion antes de la coccion.
La cepa fermentada segun el procedimiento de fermentacion en dos fases es capaz de reducir nitrato en nitrito en la temperatura y periodo de tiempo de fermentacion dados mientras que CHCC10896 fermentada por fermentacion de picos no reduce nitrato en nitrito de forma significativa.
Sin querer cenirse a la teoria, se contempla que un suministro de nitrato continuo se necesita para mantener un nivel alto de expresion del operon nar responsable de la reduction de nitrato.
Depositos y solution de experto
[0131] El solicitante pide que una muestra de los microorganismos depositados declarados a continuation pueda
solo estar disponible para un experto, hasta la fecha en la que la patente sea concedida.
[0132] La cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus fue depositada en 2012-03-15 en DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig y se le dio el
5 numero de acceso: DSM 25789.
[0133] La cepa CHCC11576 de Staphylococcus vitulinus fue depositada en 2013-06-11 en DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig y se le dio el numero de acceso: DSM 27311.
10
[0134] Los depositos fueron hechos segun el tratado de Budapest en el reconocimiento internacional del deposito de microorganismos para los fines de procedimiento de patentes.
REFERENCIAS
15
[0135] WO2010/067148

Claims (7)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    REIVINDICACIONES
    1. Metodo para aumentar la actividad de nitrato-reductasa de una cepa de Staphylococcus con actividad de nitrato- reductasa que incluye las etapas de
    a) fermentar la cepa en ausencia de nitrato bajo condiciones aerobicas;
    b) fermentar la cepa bajo condiciones anaerobicas o de limitacion de oxigeno mientras se suministra continuamente nitrato al medio de fermentacion; y
    c) opcionalmente granular y opcionalmente liofilizar la cepa.
  2. 2. Metodo segun la reivindicacion 1, donde la cepa de Staphylococcus con actividad de nitrato-reductasa es una cepa de Staphylococcus vitulinus o una cepa de Staphylococcus carnosus.
  3. 3. Metodo segun la reivindicacion 2, donde la cepa de Staphylococcus vitulinus es seleccionada del grupo consistente en la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus que fue depositada con el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) bajo el numero de acceso DSM 25789, la cepa CHCC11576 de Staphylococcus vitulinus que fue depositada con el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) bajo el numero de acceso DSM 27311 y sus mutantes derivados.
  4. 4. Metodo para la formacion de color rojo de un producto alimenticio que incluye las etapas de
    a) tratamiento previo de una cepa de Staphylococcus con actividad de nitrato-reductasa segun el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3;
    b) adicion de la cepa de Staphylococcus pretratada a un producto carnico; y
    c) fermentacion, maduracion o curacion del producto de carne con la cepa de Staphylococcus pretratada.
  5. 5. Metodo segun la reivindicacion 4, donde el producto alimenticio es un producto carnico.
  6. 6. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, donde la cepa de Staphylococcus es una cepa de Staphyloccoccus vitulinus o una cepa de Staphylococcus carnosus.
  7. 7. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, donde la cepa de Staphylococcus vitulinus es seleccionada del grupo consistente en la cepa CHCC10896 de Staphylococcus vitulinus que fue depositada con el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) bajo el numero de acceso DSM 25789, la cepa CHCC11576 de Staphylococcus vitulinus que fue depositada con el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelikulturen (DSMZ) bajo el numero de acceso DSM 27311 y sus mutantes derivados.
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