JPWO2002080947A1 - 酪酸転化能を有する菌含有組成物及びそれを用いた消化管の乳酸過多及び大腸がんの予防・治療方法 - Google Patents

Abstract

本発明によれば、乳酸から酪酸への転化能を有する細菌、詳しくはメガスフェラ・エルスデニイ又はミツオケラ・マルタシダ又はその処理物を有効成分として含有する組成物が提供される。この組成物を使用することにより、乳酸が異常蓄積している環境下において、乳酸を酪酸に速やかに変換することができる。

Description

技術分野
本発明は、菌含有組成物に関するものであり、さらに詳細には、乳酸から酪酸への転化能を有する細菌又はその処理物を有効成分として含有する組成物およびヒト又は動物用の医薬組成物、該組成物を含む食品または飼料、ならびにこれらを用いてヒト又は動物における消化管の乳酸過多及び大腸がんを予防又は治療する方法に関する。
背景技術
短腸症、潰瘍性大腸炎、抗生物質起因性下痢症、過食による消化不良性下痢症やクローン病などの発症時、消化管切除術後及び成分栄養剤処方時には大腸内での発酵が異常状態になっており、乳酸が高度に蓄積することが知られている。
乳酸は大腸での吸収性が低く、強い酸性物質であることから、一旦乳酸が過剰な状態が生じると、大腸の管腔内は急速に酸性化する。このような状態になると、乳酸を変換する微生物や吸収上皮細胞の機能が抑制されることにより、さらに乳酸の消費が抑制され、乳酸の蓄積がますます進行するという悪循環を繰り返し、病的状態の解消が困難になる。
従来、こうした大腸生理の異常に対しては、乳酸桿菌、ビフィズス菌、腸球菌などの製剤を投与したり、これらの細菌を賦活するためのオリゴ糖などが投与されたりしてきた。
しかしながら、これらの細菌は広義の乳酸菌であり、乳酸を主生成物として生産するので、乳酸の異常蓄積が原因となっている疾患に対する効果は疑わしい。
一方、短鎖脂肪酸のひとつである酪酸は、大腸内での正常な発酵で生成し、大腸粘膜上皮に選択的に利用される。乳酸が大腸粘膜上皮から吸収されにくく、かつ粘膜上皮細胞が乳酸をエネルギー源として代謝利用することができないのに対し、酪酸はエネルギー源となることで大腸粘膜上皮細胞の増殖を刺激し、ミネラルや水の吸収を促進する性能を有する。
このため、大腸粘膜の機能を健全化するためには、乳酸ではなく酪酸の供給が必須である。
加えて、大腸がん患者では、消化管内の酪酸濃度が低下していることが知られている。一方、酪酸は大腸がん細胞の分化を促進して、がん細胞数を減少させることが知られていることから、消化管内の酪酸の増加は、このような疾病状況においても有利と言える。
このように、乳酸が蓄積された状態を積極的に解消するための有効な方法は確立されておらず、また乳酸菌製剤、乳酸菌賦活剤を使用する際に乳酸を速やかに有用な物質に変換する技術が確立されているとは言いがたい。さらに、腸内環境を改善する目的で用いられている材料に、乳酸過多を解消し、さらに酪酸生成を意図したものは存在しない。
本発明は、上記のような従来技術の問題点に着目してなされたものであって、その目的は大腸内で生成する乳酸を速やかに酪酸へ変換する手段を提供し、ひいては乳酸の異常蓄積に由来する疾病状態の改善、酪酸の増加による腸内環境の改善及び乳酸菌賦活を目的とした従来の腸内環境改善手段のいっそうの有効化を図ることにある。
発明の開示
本発明者らは、乳酸を酪酸に転化する方法を種々検討した結果、腸管由来の特定の菌にその機能があることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明によれば、乳酸から酪酸への転化能を有する細菌又はその処理物を有効成分として含有する組成物およびヒト又は動物用の医薬組成物、該組成物を含む食品または飼料、ならびにこれらを用いてヒト又は動物における消化管の乳酸過多及び大腸がんを予防又は治療する方法が提供される。
発明を実施するための最良の形態
この発明において用いられる菌は、作用機序は特定されないが、乳酸を酪酸に転化することができる細菌であればよく、例えばメガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）又はミツオケラ属（Ｍｉｔｓｕｏｋｅｌｌａ）に属する菌、またブチリビブリオ・フィブリソルベンス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属及びクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属に属する菌が挙げられる。
これらのうち、酵素反応によって乳酸から酪酸を生産するメガスフェラ・エルスデニイ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）又はミツオケラ・マルタシダ（Ｍｉｔｓｕｏｋｅｌｌａ ｍｕｌｔａｃｉｄａ）が好ましい。
これらの菌は、通常の条件下での生物活性を十分に発揮できる状態、つまり生きた状態で乳酸を酪酸に転化することができる。
このため、本発明の菌は、このような機能を保持している限り、菌を凍結乾燥、超音波破砕又は溶菌など、当該分野で公知の種々の方法に付した処理物であってもよい。
上記の菌は、ヒト及び動物の大腸内などにみられる過剰量の乳酸を酪酸に転化する。また、本発明者らの実験によれば、乳酸に加えて酢酸が存在する場合には、菌は乳酸の転化を促進してより多くの酪酸を生成する。
酢酸は大腸内で最も普遍的に存在する有機酸であるので、上記の菌により、大腸において乳酸が酪酸により速やかに転化されるものと考えられる。
したがって、この発明によれば、乳酸から酪酸への転化能を有する細菌又はその処理物を有効成分として含有する組成物が提供され、該組成物を、短腸症、潰瘍性大腸炎、抗生物質起因性下痢症、消化不良性下痢症及びクローン病の発症時に生じる乳酸過多、消化管切除術後又は成分栄養剤処方時に生じる乳酸過多、及び大腸がんの予防又は治療を目的に、ヒト又は動物用の医薬組成物として用いることができる。
本発明の組成物は、当該分野で公知の固体又は液体の賦形剤などを用いて常法により製造することができる。固体の賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ゼラチン、澱粉、デキストリン、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、合成又は天然のケイ酸アルミニウム、酸化マグネシウム、乾燥水酸化アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、重炭酸ナトリウム、乾燥酵母が挙げられる。また、液体の賦形剤としては、例えば水、グリセリン、プロピレングリコール、単シロップ、エタノール、脂肪油、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトールが挙げられる。
本発明の組成物は、さらに、所望により緩衝剤、安定化剤、甘味剤、粘滑剤、防腐剤、防カビ剤、抗酸化剤、色素、着香料のような通常の添加剤、あるいは駆虫剤及び酵素のような薬効成分を含んでいてもよく、常法により、細粒剤、散剤、顆粒剤、液剤、錠剤、乳剤、カプセル剤、チュアブル等の所望の形態に製造することができる。
上記のような種々の賦形剤等を用いて製造される本発明の組成物は、食品もしくは飼料の原料、中間製品又は最終製品に混合又は噴霧等することにより、乳酸過多及び大腸がんの予防又は治療効果が期待される食品または飼料とすることができる。
したがって、この発明によれば、上記の組成物、食品または飼料を投与することからなる、ヒト又は動物、例えば牛、豚、馬、羊、山羊、鶏、鴨、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ダチョウ、ならびに犬、猫、インコ、ハトのような愛玩動物における乳酸過多及び大腸がんの予防又は治療方法が提供される。
この発明の組成物を含む食品または飼料は、それぞれに一般的な方法で摂取することができる。
食品としては、固体、液体又は半固形の製品、例えばキャンディ、クッキー、ゼリー、ヨーグルト等の菓子類、清涼飲料、栄養飲料、スープなどが挙げられる。
また、飼料としては、ヒト以外の動物を対象とする食品、具体的には、とうもろこし、米、麦、マイロ、大豆粕、ふすま、脱脂米ぬか、魚粉、脱脂粉乳、乾燥ホエー、油脂、アルファルファミール、北洋ミール、大豆油脂、粉末精製牛脂、小麦粉、なたね油脂、肉骨粉（フェザーミール）、動物性油脂、リン酸カルシウム、コーングルテンミール、糖蜜、コーンジャームミール、炭酸カルシウム、リン酸三カルシウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、ビタミン類（ビタミンＡ、ビタミンＢ_１、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_６、ビタミンＢ_１２、ビタミンＤ、ビタミンＥ、パントテン酸カルシウム、ニコチン酸アミド、葉酸等）、アミノ酸類（リジン、メチオニン等）、微量無機塩類（硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅、硫酸亜鉛、ヨウ化カリウム、硫酸コバルト等）などを適宜混合して調製した飼料及び飲料水が挙げられる。
予防又は治療の対象となるヒト又は動物の健康状態、年齢などにもよるが、この発明の組成物は、医薬目的で使用する場合、細菌数として、ヒト及び動物の双方において１０^４〜１０^１０個／６０ｋｇ／日、好ましくは１０^６〜１０^９個／６０ｋｇ／日で用いることができる。
また、食品または飼料に混合して用いる場合には、組成物は、食品や飼料の味や外観に影響を及ぼさない程度の量、例えば細菌数として１０^２〜１０^８個／ｇの範囲で用いられる。
実施例
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：酪酸生成菌の単離
ブタ（盲腸フィステル装着交雑成メスブタ）から採取した盲腸内容物を、グルコン酸ナトリウム（藤沢薬品工業（株）製）を基質として１．０％（ｗ／ｖ）量を添加したＰＹＦ培地（光岡知足：腸内細菌の世界、叢文社、東京、Ｐ．３２５、１９８０）及びグルコン酸ナトリウムを添加していないＰＹＦ培地に接種し、集積培養（３９℃、１４４時間、嫌気培養）を行った。
次いで、嫌気性非選択平板培地（ＢＬ培地、ニッスイ（株）製）に集積培養液を接種して３９℃で４８時間嫌気培養し、コロニー形態からグルコン酸ナトリウム添加ＰＹＦ培地にのみ生育した菌株を選抜した。
この選抜した菌株を、上記のグルコン酸ナトリウム添加ＰＹＦ培地及び無添加ＰＹＦ培地に接種して３９℃で４８時間嫌気培養し、培養液に６Ｎの塩酸を加えて反応を止めた後、培養液中の有機酸濃度をイオン排除高速液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ製、以下ＨＰＬＣという）を用いて測定した。前処理法及びＨＰＬＣの条件は、Ｕｓｈｉｄａ及びＳａｋａｔａ（Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，６９，５７１−５７５，１９８８）に準拠した。
測定結果に基づいて、酪酸の生成能力を指標に２菌株を選抜した。
この２菌株をＰＹＦ培地に接種し、３９℃で４８時間嫌気培養して得た菌体から１６Ｓ ｒＤＮＡを抽出し、Ｌｉ−ＣＣＲ ＬＩＣ−４２００Ｌ（Ｓ）−２（Ａｌｏｋａ製）を用いてシーケンスを行い、Ｂａｓｅ ＩｍａｇｅＩＲ ｖｅｒ．４（Ａｌｏｋａ製）を用いて解析した配列をＢＬＡＳＴソフトウエアによるＧｅｎｅ Ｂａｎｋデータベースによって既知の細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と比較した。
その結果、一方の菌はメガスフェラ・エルスデニイＡＴＣＣ１７７５２と９８％相同であり、メガスフェラ・エルスデニイであることが同定された。また、他方の菌は、形態面からすればミツオケラ属とセレノモナス（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）属の中間に位置するが、ミツオケラ・マルタシダＮＣＴＣ１０９３４と９４％相同であることから、該株と近縁であるものと判断した。
実施例２：酪酸生成菌の乳酸利用能力の検定
単離した菌２株と類縁の菌株メガスフェラ・エルスデニイＪＣＭ１７７２（理化学研究所より入手）を、ＰＹ培地（ＰＹＦ培地からＦｉｌｄｅｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを除いた組成）を基礎として乳酸（和光純薬工業（株）製）１０ｍＭを添加した培地、及び乳酸と酢酸（和光純薬工業（株）製）１０ｍＭを添加した培地で３７℃で嫌気培養し、２４時間経過後の培地中の酪酸濃度を、イオン排除ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ製）を用いて測定した。前処理法及びＨＰＬＣの条件は、Ｕｓｈｉｄａ及びＳａｋａｔａ（Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，６９，５７１−５７５，１９８８）に準拠した。

表１に示されるように、いずれの菌株も、乳酸又は乳酸と酢酸を培地中に添加することにより、高い酪酸生成値を示した。したがって、これらの菌株は、乳酸又は乳酸と酢酸を利用して、酪酸を生成することが明らかとなった。
実施例３：乳酸蓄積による下痢症状に対する酪酸生成菌の作用の検定
易発酵性基質であるフラクトオリゴ糖を多給し、下痢症状を呈したラットにメガスフェラ・エルスデニイを経口投与し、下痢症状が解消されるか検討した。
供試動物には、Ｗｉｓｔｅｒ系の妊娠ラット（日本ＳＬＣから購入）を研究室（非バリアシステム環境）で分娩させて、生育したラット（６週齢）１頭を使用した。
カゼイン２０％、α・コーンスターチ５４％、セルロース５％、大豆油５％、ビタミンミックス１％、ミネラルミックス５％およびフラクトオリゴ糖１０％（フラクトオリゴ糖は明治製菓（株）製、その他の飼料原料はオリエンタル酵母（株）製）の組成からなるフラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）１０％食を、粉末形状として、試験期間中自由に摂取させた。飲水は、全試験期間をとおして自由摂取とした。
また、メガスフェラ・エルスデニイＪＣＭ１７７２株（理化学研究所より入手）を、１Ｌ当たり変法ＧＡＭブイヨン（日水製薬（株）製）４１．７ｇ；グルコース１０ｇ；レザズリン０．４ｍｌ；システイン塩酸塩０．５ｇ；ＮａＨＣＯ_３ ５ｇからなる液体培地５ｍＬに植菌し、３７℃、２４時間、嫌気条件下で増菌培養し、投与菌液とした。培養後の菌数は、２×１０^８ｃｆｕ／ｍｌであった。
ＦＯＳ１０％食給餌開始から毎日２１〜２４時に直腸便を採取し、糞便性状を観察するとともに、イオン排除ＨＰＬＣを用いて糞便中の各種有機酸濃度を測定した。前処理法及びＨＰＬＣの条件は、Ｕｓｈｉｄａ及びＳａｋａｔａ（Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，６９，１００−１０７，１９９８）に準拠した。
その結果、ＦＯＳ１０％食給餌開始後３日目に下痢症状が観察され、継続して下痢症状が認められたので、ＦＯＳ１０％食給餌開始後７日目以降、胃ゾンデを用いて毎日１７時に連続３日間、菌液１ｍｌを強制的に経口投与した。
糞便性状の結果を表２及び直腸便中の有機酸濃度の推移を表３に示す。

表２に示されるように、下痢症状は、菌液投与開始翌日には解消された。また、表３に示されるように、菌投与開始翌日には乳酸が急激に低下し、酪酸が増加する様相がうかがえた。
実施例４：乳酸過多症に対する酪酸生成菌の作用の検定
フラクトオリゴ糖を過剰摂取させ、人為的に大腸内の乳酸濃度を高めたラットにメガスフェラ・エルスデニイを経口投与し、この菌の大腸内乳酸蓄積に対する効果を検討した。
供試動物には、ＳＤ系雄性ラット（ＳＰＦグレード、日本ＳＬＣから購入）６週齢１２頭を用いた。
ラットは、温度管理した飼育施設内に設置したラット用５連ケージに個体別に収容し、６日間施設馴化した。馴化期間中は市販固形飼料（ラボストックＭＲ、日本農産工業（株）製）及び飲水を自由に摂取させた。
馴化終了後、実施例３と同じ組成のフラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）１０％食を自由に摂取させた。
また、メガスフェラ・エルスデニイＪＣＭ１７７２株（理化学研究所より入手）を表４に示す組成の培地に植菌し、３７℃で２４時間嫌気培養した。培養後のメガスフェラ・エルスデニイＪＣＭ１７７２菌数は２．７×１０^１３ＣＦＵ／ｍＬであり、これを投与菌液とした。

動物を、メガスフェラ・エルスデニイ投与群５頭、無投与対照群７頭の計２群に無作為に設定した。メガスフェラ・エルスデニイ投与群には、前記のようにして調製した菌液をＦＯＳ１０％食給餌開始後３日目から３日間毎日１０時に胃ゾンデを用いて０．５ｍＬ／頭ずつ経口投与した。無投与対照群には生理食塩水を同様に投与した。
ＦＯＳ１０％食給餌開始日から毎日１７時に各頭の直腸便を採取し、イオン排除ＨＰＬＣを用いて糞便中の有機酸濃度を測定した。前処理法及びＨＰＬＣの条件は、Ｕｓｈｉｄａ及びＳａｋａｔａ（Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，６９，１００−１０７，１９９８）に準拠した。また、菌液投与開始から３日経過後に全頭を屠殺し、盲腸内容物を採取して有機酸濃度を測定した。
これらの有機酸濃度についてＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔまたはＷｅｌｃｈ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを行い、Ｐ＜０．０５を有意差ありと判定した。
直腸便中および盲腸内容物中の有機酸濃度の推移を表５に示す。

ＦＯＳ１０％食の給餌により、いずれの個体の直腸便にもフラクトオリゴ糖による乳酸の蓄積が確認された。
メガスフェラ・エルスデニイ投与群は、菌液投与開始から乳酸の減少傾向が見られ、菌液投与開始後２日目にはその差が顕著であった（１６．７ｖｓ．３９．０ｍｍｏｌ／ｋｇ，有意差あり）。乳酸の減少に伴い酪酸濃度が増加し、菌液投与開始２日後には対照と比べて７５０％増加した（７．５ｖｓ．１．０ｍｍｏｌ／ｋｇ，有意差あり）。
また、その他の有機酸についても統計学的に有意な変化が認められた（ｐ＜０．０５）。
本発明によれば、乳酸から酪酸への転化能を有する細菌又はその処理物を有効成分として含有する組成物およびヒト又は動物用の医薬組成物、該組成物を含む食品または飼料、ならびにこれらを用いてヒト又は動物における消化管の乳酸過多及び大腸がんを予防又は治療する方法が提供される。
したがって、これらの組成物等を用いることによって、乳酸が異常蓄積している環境下で乳酸を酪酸へ速やかに転化し、その結果、乳酸の異常蓄積に由来する疾病状態を安全かつ有効に予防するとともに、酪酸によって有用な効果がもたらされる疾病の改善を図り、大腸の健全性を回復することができる。

Claims (9)

1. 乳酸から酪酸への転化能を有する細菌又はその処理物を有効成分として含有する組成物。
2. 細菌が、メガスフェラ属又はミツオケラ属に属する菌である請求項１に記載の組成物。
3. 細菌が、メガスフェラ・エルスデニイ又はミツオケラ・マルタシダである請求項１又は２に記載の組成物。
4. 組成物がヒト又は動物用の医薬組成物である請求項１〜３のいずれか１つに記載の組成物。
5. 組成物が、消化管内酪酸が増加することによって改善される疾病及び乳酸過多の予防又は治療に用いられる請求項４に記載の組成物。
6. 消化管内酪酸が増加することによって改善される疾病が、大腸がんである請求項５に記載の組成物。
7. 乳酸過多が、短腸症、潰瘍性大腸炎症、抗生物質起因性下痢症、消化不良性下痢症及びクローン病の発症時、消化管切除術後又は成分栄養剤処方時に生じたものである請求項５又は６に記載の組成物。
8. 請求項１〜３のいずれか１つに記載の組成物を含む食品または飼料。
9. 請求項１〜８のいずれか１つに記載の組成物、食品または飼料をヒト又は動物に投与することからなる、ヒト又は動物における消化管の乳酸過多及び大腸がんの予防又は治療方法。