KR930001383B1

KR930001383B1 - 신규의 바실러스 서브틸리스 아종 및 이로부터 생산되는 항진균 물질 krf-001 복합체의 용도

Info

Publication number: KR930001383B1
Application number: KR1019900017551A
Authority: KR
Inventors: 복성해; 김성욱; 손광희; 김성기; 김영국; 이항우; 이지우; 권혜경; 정태숙
Original assignee: 재단법인 한국화학연구소; 채영복
Priority date: 1990-10-31
Filing date: 1990-10-31
Publication date: 1993-02-27
Also published as: KR920008183A; JPH04166080A

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

신규의 바실러스 서브틸리스 아종 및 이로부터 생산되는 항진균 물질 KRF-001 복합체의 용도

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 신규의 바실러스속 미생물 및 이로부터 생산되는 항생 물질의 새로운 용도에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 토양시료로 부터 채취분리된 신규의 바실러스 서브틸리스아종(Bacillus subtilis subspecies)과 그 변이주 및 그들을 배양 또는 발효시켜 생산한 항진균 물질의 진균감염증 치료제, 피부보습체, 보존제 및 살진균제 등으로서의 용도에 관한 것이다.

최근 수십년간, 유기합성된 생물학적 활성 물질들이 의약과 농약 등 다방면에 널리 사용됨에 따라 인체와 환경에 심각한 폐해를 주고 있어, 여러 연구자들에 의하여 그 생물학적 활성을 보유하면서도 저독성 내지는 무공해성인 천연 화합물을 탐색 개발하고자 하는 시도가 있어 왔다. 그 결과, 자연계 특히 미생물 자원으로부터 의약이나 농약 응용이 가능한 여러가지 천연물질이 발견되어 그대로 혹인 반합성의 변형된 형태로 역가가 높으면서도 그 독성이나 환경적인 오염이 적은 물질이 실용화되는 것이 가능하게 되었고, 오늘날 약해문제나 농작물에의 잔류독성 문제, 환경오염 문제를 해결할 수 있는 돌파구가 되어 왔다.

본 발명의 목적은 이와 같은 견지에서 토양 시료로 부터 미생물 자원을 탐색하여 신규의 미생물을 분리하고 이로부터 생산된 항생물질의 의약·농약 및 기타 여러가지 용도를 제공하는 것이다.

이제까지 항진균 물질은 이미 상당한 수가 미생물로 부터 발견되어 농약과 의약에 널리 이용되고 있다. 예를들어, 그리세오훌빈(griseofulvin)이 1939년 옥스포드(Oxford, A.E.) 등에 의하여 페니실리움 그리세오훌범(Penicillium grisefulvum)의 배양액으로부터 분리되어[Oxford, A.E., Raistrick, H., Simonart, P.(1939). Biochem. J. 33 : 340 참조] 처음에는 농약으로 개발되었다가, 그후 피부사상균증에 효과적인 경구제로 개발되어 현재도 널리 이용되고 있는 것은 그 대표적인 경우이며, 이 외에도 1950년 하젠(Hazen, E.L.)과 브라운(Brown. R.)에 의하여 니스타틴(nystation)[Hazen, E. L. and Brown, R,(1950). Science, 112 : 423 참조]이, 1955년 골드(Gold, W.)등에 의하여 앰포테리신 B(amphotericin B)[Gold, W., Stour, H. A., Pagano, J. F., and Donovick, R(1955). Antibiot. Ann., 1956 : 579 참조]가 각각 방선균들로 부터 발견되어 진균증에 대한 화학요법이 확립되게 되었다.

그러나, 세균 감염증의 화학요법이 상당히 많은 발전을 해온 것에 비하면, 진균증의 화학요법은 그 발전 속도가 완만한 실정이며, 장기적으로 부작용이 적도 캔디다(Candida)나 아스퍼질러스(Aspergillus) 등 여러 진균류에 대해 효과적인 광범위 항진균제의 개발이 요구되고 있다.

한편, 농업용 항진균 물질의 개발은 유기 합성제 농약이 주류를 이루던, 1960년 초반 부터 일본을 중심으로 이루어져, 그동안 벼의 도열병에 대한 블라스티시딘S (blasticidins S)[Takeuchi, S., Hirayama, K., Ueda, K., Sakai K. and Yonehara, H. (1958). J. Antibiotics, 11A : 1-5 참조]와 카수가마이신(kasugamycin)[Umezawa, H., Okami, Y., Hishimoto, T. Suhara, Y., HM. and Takeuchi, T. (1905). J., Antibiotics, 18 : 101-108 참조]. 문고병에 대한 폴리옥신(polyoxin)[Isono, K., Nagatsu, J., Kawahima. Y. and Suzuki, S(1965). Agric. Blio. Chem., 29 : 848-854 참조]이나 발리다마이신(validamycin)[Iwasa, T., Yamamoto, H. and Shibata, M., (1970). J.Antibiotics, 23 : 595-602 참조], 맥류의 흰가루병에 대한 밀디오마이신(mildiomycin)[Harada, S. and Kishi, J. (1978). J. Antibiotics, 31 : 519-524]등의 항생물질이 개발되어 독성이 강한 일부 유기 합성체 농약을 대체하였다.

이와 같은 일련의 항진균 물질 개발 노력의 차원에서, 본 발명의 발명자들은 각종 진균류에 대해 광범위한 항진균력을 나타내고 독성이 적은 항진균 항생물질을 탐색하고자 국내외 각종 토양으로 부터 신규의 미생물을 분리하고, 이로부터 생산된 항생물질을 분리정제하여 그의 생물학적 및 이화학적 성질을 규명하고 그의 새로운 용도를 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 발명자들은 5200여종에 달하는 토양 미생물의 탐색을 통하여 이중 약 34%의 미생물들이 항진균 작용을 현저히 나타내는 것을 확인하고 생체내 시험(in vivo test)을 통한 스크리닝을 통하여 본 발명의 신규하고도 유용한 미생물을 얻는데 성공하였다.

시험균주로서는 주로 피리큘라리아 오라이재(Piricularia oryzae)와 트리코파이톤 멘타그로파이테스(Trichophyton mentagrophytes : ATCC 9533), 캔디다 알비칸스(Candida albicans : ATCC 10231)등을 이용하였으며, 토양으로 부터 균주를 분리하기 위한 분리용 배지로는 전분-질산연 한천배지(starch-nitrate agar)[Kuster, E. and Williams, S. T. (1964). . Nature, 202 : 928-929]와 HV 한천배지(HVagar)[Hayakawa, M. and Nonomura, H. (1987). J. Ferment, Technol., 65 : 501-509]등을 기본배지로 사용하였다.

본 발명에 따른 신규의 고초균중 야생균주는 대한민국 충청남도 계룡산 갑사 근처에서 채취돈 토양 시료로 부터 분리되었으며 변이균주는 실시예에 상세히 설명된 통상의 자외선에 의한 방법에 의하여 작게 되었다. 이들 미생물의 분류학적 동정은 문헌[Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2, Williams ＆ Wilkins Co. (1986)]에 기술된 방법에 따라 수행하였다.

본 발명의 신규 미생물들은 표준 균주로서 사용된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtils : ATCC 6633)와 거의 동등한 미생물로 동정되었으나, 포자의 위치나 옥시다제 반응에 음성이며, 염분-허용도가 약간 낮고 락토스 이용이 가능하며, 0.001%의 라이소자임에 보다 감수성이 있는 것 등은 특기할 만한 것이었다(하기 표 2 참조).

이러한 이유로, 본 발명의 산규 미생물은 바실러스 서브틸리스 아종(Bacillus subtilis subsp.)으로 동정되었으며, 야생균주는 바실러스 서브틸리스 아종 크릭티엔시스(Bacillus subtilis subsp. Krictiensis)로 변이 균주는 바실러스 서브틸리스 아종 크릭티엔시스 M 18-91(Bacillus subtilis subsp. Krictiensis M 18-91)로 각각 명명되었다. 이들 신규의 미생물들은 1990년 7월 26일 미합중국 균주보존협회(American Type Culture collection : ATCC)에 각각 기탁번호 ATCC 55079 및 ATCC 55078로 기탁되었다.

하기 표 1·2·3은 본 발명의 미생물의 특성을 기술한 것이다.

[표 1]

[본 발명의 신규 미생물(Bacillus subtilis subsp. Krictiensis)의 형태학적 및 배양상의 특징]

[표 2]

[표준균주와 본 발명의 신규 미생물의 생리적 특성 비교]

[표 3]

[표준균주와 분 발명의 신규 미생물의 당 이용성 비교]

본 발명의 신규의 미생물들로 부터 생산된 항진균 물질 KRF-001은 상기 신규의 미생물을 배양하거나 발효시킴으로써 생성되는 일련의 펩티드계 화합물들의 복합체를 의미한다.

즉, KRF-001은 각각 성분 A, B, C, D, E 및 F로 명명된 일련의 펩티드계 화합물의 복합체로서, 본 발명의 신규 미생물을 배양하거나 발효시킨 후, 생산된 항진균 물질을 정제하여 고압액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석하였 때 상기 6 가지의 펩티드 성분으로 분리되었다. 분리된 성분들을 FAB-MS(JEOL사 제품, Model DX 303, positive ionization, argon gas, gun voltage 3kV, emission 30mA)로 분석한 결과, 분자량이 각각 1042, 1056, 1056, 1070, 1070 및 1084로 확인되었다.

KRF-001의 박층 크로마토그래피(TLC)상에서의 Rf치는 전개 용매로 메탄올만을 사용한 경우 0.75, 메탄올 : 아세토니트릴(1 : 1)을 사용한 경우는 0.53으로 나타났으며 물이나 메탄올에 잘 용해되고, 클로로포름이나 헥산에는 잘 용해되지 않는 것으로 보아, 친수성의 물질인 것을 알 수 있었다. 또한, KRF-001은 pH 1.0 내지 11.0에서 비교적 안정하였으며, 고온처리(100-121℃)하였을 때, 상당기간(100℃에서 5시간, 121℃에서 15분) 안정한 물질로 밝혀졌다.

KRF-001은 닌히드린 반응에 대하여 음성을 나타내었으나, 6N 염산으로 가수분해한 후 분해산물을 GC-MS로 분석한 결과, 아스파라진, 글루타민, 프롤린, 세린, 타이로신이 각 성분에 공통적으로 존재함을 확인하였다. 또한 원소분석 결과에 따르면, 상기 KRF-001로 부터의 각 펩티드 성분중 A는 C₁₄H₂₉NO₂, B와 C는 C₁₅H₃₁NO₂, D와 E는 C₁₆H₃₃NO₂및 F는 C₁₇H₃₅O₂의 특이 아미노산을 함유하는 것으로 각각 확인되었다.

이들을 각각 6N HCl에 용해시켜 116℃에서 6시간 반응시켜 아미노산 자동분석기(amino acid autoanalyzer, Waters Co. 제품)로 분석한 결과, 아스파라진, 글루타민, 세린, 프롤린, 타이로신 등의 존재가 확인되었고 그 몰비는 3 : 1 : 1 : 1 : 1 로 밝혀졌다. 따라서, KRF-001은 아스파리진 3몰, 글루타민 1몰, 세린 1몰, 프롤린 1몰, 타이로신 1몰 및 특이 아미노산 1몰의 올리고 펩티드 화합물의 복합체로 볼 수 있으며, 키모트립신(chymotrypsin) 단백질 분해 효소에 의해 가수 분해되지 않으므로, 이러한 올리고 펩티드는 하기 일반식과 같은 환상구조(circular structrure)인 것을 알 수 있었다.

상기 구조 불명의 특이 아미노산의 구조를 고분해 H¹-NMR로 해석한 결과, 이 구조에는 메틸렌 사슬에 기인한 δ1.25에서의 수소의 적분치와 3번 탄소(C-3)의 양성자가 다른 4개의 양성자와 커플링하고 있음을 나타내는 흡수가 δ4.25에서 나타났으므로, 상기 아미노산의 구조가 베타-아미노산 ()의 구조를 갖고 있음을 알 수 있었다.

또한 각 성분 A, B, C, D, E 및 F의 펩티드 화합물의 δ0.9에 나타나는 메틸기의 시그널을 통하여 확인되는 베타-아미노산 말단구조는 펩티드 A는 정상타입(δ0.9, 3H, t), 펩티드 B는 anteiso 타입(δ0.9, 6H, m) 펩티드 C는 iso 타입(δ0.9, 6H, d), 펩티드 D는 iso 타입(δ0.9, 6H, o), 펩티드 E는 정상 타입(δ0.9, 3H, t), 그리고 펩티드 F는 anteiso 타입(δ0.9, 6H, m)임을 알 수 있다.

따라서, NMR 분석에 의한 KRF-001 복합체를 구성하는 각 펩티드의 베타-아미노산 구조는 하기 일반식과 같다.

[KRF-001의 생물학적 활성]

KRF-001 복합체의 각종 세균들에 대한 최소 억제 농도(minimum Inhibition Concentration : MIC)는 하기 표 4에 기재되어 있다. 표 4에 나타난 바와 같이, KRF-001의 세균에 대한 항생작용은 매우 약한 것으로 확인되었다.

[표 4]

[KRF-001의 항세균 활성 스펙트럼(MIC : ㎍/㎖)

한편, KRF-001은 실험실 조건에서 매우 광범위한 항진균 작용이 있음이 확인되었다. 특히, 기존의 시판된 항진균 물질들과 비교하였을 때, 엠포테리신 B(amphotericin B)나 니스타핀(nystatin)과 유사한 활성을 나타내었으며, 각종 식물질병 및 인체 질병의 원인이 되는 진균류에 대하여 광범위한 진균 작용을 나타내는 특성이 아울러 확인되었다(하기 표 5 참조).

[표 5]

[KRF-001의 항진균 활성 스펙트럼(MIC : ㎍/㎖)

[KRF-001의 독성시험]

KRF-001의 쥐를 대상으로 한 경구 급성 시험 결과 LD₅₀값이 2500 내지 5000mg/kg으로 나타났으며, 토끼를 대상으로 한 경피 급성 독성 시험에서도 피부자극이나 일러지 등 부작용이 나타나지 않았다. 따라서 KRF-001은 저독성 항진균 물질임이 판명되었다.

[KRF-001의 용도]

우선 농작물의 질병예방 측면에서 KRF-001을 벼의 논에 100 내지 200ppm으로 처리했을 때 벼의 도열병 방제효과가 있었으며, 각종 회색 곰팡이병 예방에도 200 내지 1000ppm에서 유효함이 관찰되었다. 또한, 발아하는 종자, 채소 및 과일의 보존에도 효과가 있어서, 밭에서 수확한 딸기를 KRF-001의 발효액에 10분 동안 담갔다가 꺼내 놓았을 때 곰팡이에 의한 부패가 방지되었다.

한편, KRF-001을 물에 용해시킨 후에 인체의 피부에 바르거나, 크림이나 연고를 만들어 피부에 바를 때 각종 피부관련 곰팡이 질병이 치유되는 것을 관찰하였다.

KRF-001은 물, 메탄올, 에탄올 등에 잘 녹으며 열에 강하고, 121℃에서 15분간 처리해도 항진균 활성을 잃지 않고, 특히 KRF-001은 흡습성이 강해서 KRF-001 분말을 실온에 노출 시킬 때 대기중에서 습기를 흡수하여 겔 상태로 변하는 것이 관찰되었다. 따라서, KRF-001은 각종 화장품, 화학제품 및 식품의 보습제로써 사용될 수 있다.

한편 KRF-001 성분을 동물사료나 기타 다른 공업제품 예컨대 세척제나 소독제속에 첨가했을 때 천연적인 항진균 및 방부작용을 보였다.

상세한 KRF-001의 용도에 관하여는 후술하는 실시예에서 상세히 설명될 것이다.

[실시예 1]

[변이균주 바실러스 서브틸리스 아종 크릭티엔시스 M 18-91(ATCC 55078)의 작제]

본 발명의 신규물질 KRF-001의 생산수율을 높이기 위하여, 모균주인 바실러스 서브틸리스 아종 크릭티엔시스(Bacillus subtilis subsp. Krictiensis : ATCC 55079)에 자외선을 조사하여 변이시킨 후 생산능이 높은 균주를 선별하는 방법을 모색하였다.

모균주를 LBG 배지(트립톤 1%, 효모 추출물 0.5%, NaCl 1%, 글루코스 1%)에 접종한 후, 대수증식기 후기에 모아 원심분리한 후 탁도가 550nm에서 1.0이 되도록 조절하고 동량의 10μM 카페인(caffein)용액을 첨가한 후 1분간 자외선을 조사하였다.

그후 PDA배지에 도말하여 나타난 집락을 시험균주로 이용하였다(6045주). 이들 균주물을 LBG 배지에서 40시간 배양하고 고밀도(2×10⁵포자 /㎖) P.oryzae 평판에서 모균주 보다 생육저지환이 크게 나타나는 균주를 212주 선별하였다. 이들 212주의 균주를 발효용 배지가 5들어 있는 시험관에 접종한 후 40시간 배양하고 다시 모 균주와 P.oryzae 평판에서 저지환의 크기를 비교하여 16균주를 선별하였고, 3차로 500㎖ 삼각 플라스크에 발효용 배지 100㎖을 넣고 16균주를 접종한 후 같은 방법으로 M 18-91, M 26-87, M 27-8, M 28-9, M 31-139의 5균주를 선정하였다.

이중 M 18-91에서 생산된 KRF-001 물질을 XAD-7 수지를 이용하여 예비정체를 행하고 모균주와 생산량을 비교하면 ℓ당 생산량이 2배 이상 증가한 것으로 나타났다(표 6 참조).

[표 6]

[변이균주와 모균주의 KRF-001 생산량 비교]

변이균주 M18-91의 모균주와의 차이점은 첫째, M18-91의 경우는 발효조건 중 pH를 조절하지 않았을때 더 많은 양의 KRF-001 물질을 수득할 수 있었으며, 둘째, M18-91 균주가 세포성장 속도가 더 빠르고 세포 농도가 높았고, 셋째 KRF-001의 생산속도가 M18-91의 경우 모균주에 비하여 30시간 이상 단축되었다.

이상과 같이 모균주인 바실러스 서브틸리스 아종 크릭티엔시스(Bacillus subtilis subsp. Krictienis) ATCC 55079로부터 얻어진 변이균주는 바실러스 서브틸리스 아종 크릭티엔시스 M18-91(Bacillus subtilis subsp. Krictienis, M18-91) ATCC 55079로 명명되었으며, 모균주와 함께 1990년 7월 26일자로 미합중국 균주보존협회(ATCC0에 기탁되었다.

[실시예 2]

[최소억제 농도의 측정]

[1. 진균에 대한 측정]

각종 진균(fungi)류들을 PDA, 사부로 한천배지(Sabouraud's agar), YM한천배지, V-8 juice 한천배지등을 이용하여 24 내지 30℃에서 1 내지 14일간 사면 배양한 후, 5㎖의 증류수를 첨가하고 포자를 현탁시켜 접종 균액으로 사용하였다.

시험하고자 하는 시료 용액의 2배 희석계열을 만든 후, 각종 진균들의 배지와 혼합하여 최종 농도가 100 내지 0.195㎍/㎖이 되도록 5㎝ 직경의 평판에 분주하고 수평으로 굳혔다. 배지가 고형화 되면 상기 접종 균액을 각 평판마다 1백금이씩 접종하고 24 내지 30℃에서 1일 내지 4일간 배양한 후 육안으로 관찰하여 균의 생육이 억제된 농도를 최소 억제 농도로 정하였다.

[2. 세균에 대한 측정]

플레이쉬 익스트랙트 브로스(Fleisch extract broth)(1% 육즙 추출물, 1% 펩톤, 0.3% NaCl, 0.2% NaHPO₄·12H₂O, 2%한천, pH 7.2∼7.5)나 혈청을 첨가한 플레이쉬 익스트랙트브로스에서 18시간 정도 배양한 시험균을 100배 정도 희석하여 접종균액으로 사용하였다.

시험하고자 하는 시료용액의 2배 희석 계열을 만든 후 직경 9㎝평판에 멸균한 뮬러 힌톤(Mueller Hinton) 한천배지와 희석계열의 시료를 4 : 1 의 비율로 분주하여 최종 시료 용액의 농도가 각각 100 내지 0.02㎍/㎖이 되도록 17개의 평판을 제조하였다. 제조한 평판위에 각각 시험균을 자동접종기(automatic inoculator, 미국 Dynatech 사 제품)를 이용하여 10⁴CFU/spot(CFU : Colony Forming Unit)를 접종하고 37℃에서 18시간 배양한 후 육안으로 관찰하여 생육이 억제된 시료의 농도를 최소억제 농도로 정하였다.

[실시예 3]

[KRF-001의 정제 및 구조분석]

-80℃ 냉동기속에 보존되어 있는 바실러스 서브틸리스 아종(Bacillus subtilis subsp.) 바이알(1㎖) 한개를 녹여서 100㎖의 글루코스 LB 배지에 접종한 후 30℃, pH 7.0에서 진탕 배양하였다. 글루코스 LB배지는 글루코스 10g, 박토트립톤 10g, 박토이스트 추출물 5g, 소금 10g 및 증류수 1000㎖로 조제하였으며 pH는 7.0으로 조정하였다. 상기 종균의 생장이 A₅₅₀=0.1 내지 0.5에 달하였을 때 전체 배약액을 8ℓ의 생산용 배지가 들어 있는 14ℓ들이 발효탱크에 무균적으로 옮겼다. 발효탱크속에서의 온도, 공기 소통 속도 및 교반속도는 각각 30℃, 0.5VVM 및 400RPM이다. 2일 후에 발효액을 원심 분리하여 미생물 세포를 제거한 후 상등액을 XAD-7 컬럼에 통과 시킨 후 흡착된 KRF-001을 메탄올로 용출해 냈을 때 황갈색의 조 KRF-001(순도 25%) 12g이 얻어졌다. 생산용 배지는 슈크로스 30g, 쏘이튼 10g, 효모 추출물 5g, k₂HPO₄0.5g, MgSO₄·7H₂O 0.5g, MnCl₂4mg, CaCl₂5mg 및 FeSO₄·7H₂O 25mg을 증류수 1000㎖에 넣어서 용해시키고 pH 7로 조정한 후 121℃에서 40분간 멸균하여 준비하였다.

상기와 같이 얻은 발효액 16ℓ를 이용하여 KRF-001의 정제를 시도하였다. 처음에 약 4ℓ의 발효액을 4ℓ의 Amberlite XAD-7칼럼(미국 Rohm ＆ Hass 사 제품, 9×90㎝)에 흡착시킨 후, 매분 40㎖의 유속으로 베드의 2배분의 증류수(8ℓ)로 불순물을 씻어낸 후, 베드의 2배 분의 메탄올(8ℓ)로 KRF-001을 용출하였다. 용출하여 나온 분획들에 대하여 피리큘라리아 오라이재(Pyriculara oryzae)를 피검균으로 써서 활성물질임을 확인한 후, 감압 농축후 동결건조하여 황갈색의 활성물질을 얻었다. 위의 방법을 4회 반복하여 16ℓ의 발효액으로 부터 약 15g의 황각색의 조 KRF-001을 얻었다. 다음 단계의 정제는 실리카겔(silica gel) 크로마토그라피에 의해서 행하였다. 300g의 실리카겔(미국 Merck 사 제품 7734)을 칼럼(4×50㎝)에 클로로포름을 사용하여 채운 후 상기 조 KRF-001을 최소량의 메탄올-클로로포름(3 : 7) 용액으로 녹여 흡착시켰다. KRF-001의 용출은 메탄올-클로로포름(3 : 7) 750㎖ 및 메탄올-클로로포름(1 : 1) 2100㎖을 흘려서 행하였다. 활성성분이 들어 있는 부분을 동결건조하여 약 7g의 조질의 KRF-001을 얻었다. 예비 TLC 판을 이용하여 다음 단계 정제를 시도했다. 전개용매로는 부탄올-에틸아세테이트-물 (6 : 1 : 1)을 사용하여 R_f0.36의 물질을 회수한 결과 5g의 활성물질이 회수되었다. 다음 단게에는 상기 활성물질 5g을 3차에 걸쳐 Sephadex LH-20 칼럼(0.8×90㎝)을 사용하여 정제하였다. 시료를 소량의 메탄올에 녹여 칼럼에 흡착시켰고, 메탄올을 용출제로 이용하여 매분 0.2㎖의 유속으로 흘렸다. 얻어진 분획중의 활성물질을 동결건조한 결과 1g의 백색 활성 물질이 얻어졌다.

최종적인 정제 단계로서, KRF-001의 각 성분들을 HPLC(Perkin-Elmer Co. 모델)을 써서 분리하였다. HPLC 칼럼으로서는 Allteck 사의 Rsil C(10μ, 10×250mm)을 이용하였다.

1g의 시료를 35% 아세토니트릴에 녹여 10mg/㎖의 농도로 주입하였다. 시료의 용출은 처음 30분간은 35% 아세토니트릴로, 그후 50분까지 50%아세토니트릴이 되기 까지 용매 그레디언트로 행하였으며 유속은 매분 4㎖ 이었으며 UV 225nm에서의 흡수로 모니터링하였다. 흡수 피크들에 대한 생물활성 검색 결과 R_f22.8', 33.8', 38.7', 45.5', 46.5', 49.8'의 피크가 활성을 나타내었고 이들을 각각 KRF-001의 성분 A, B, C, D, E 및 F로 명명하였다. 최종적으로 얻어진 순수한 KRF-001의 각 성분은 성분 A 210mg, 성분 B 30mg, 성분 C 90mg, 성분 D 30mg, 성분 E 30mg 및 성분 F 10mg이었따. 따라서 KRF-001은 최소한 6개 이상의 항진균성 물질성분들의 복합체임을 알 수 있었다.

수득된 KRF-001의 각종 기기분석 결과는 다음과 같다.

[1. 원소분석]

HPLC에 의해 최종 분리정제된 KRF-001 시료를 원소 분석기(Perkin-Elmer 사 제품, Model 240C)를 이용하여 탄소, 수소, 질소의 구성비율을 결정하였다. KRF-001은 탄소 52.62%, 수소 6.85% 및 질소 14.59%로 이루어진 것으로 나타났다.

[2. 아미노산 분석]

KRF-001 시료 10mg을 6N HCL에 녹여 110℃에서 6시간 반응시킨 후 아미노산 자동분석기(aminoacid autoanalyzer, Waters Co. 제품)를 이용하여 아미노산을 분석하였다. KRF-001에는 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 프롤린, 타이로신과 로이신 등이 함유되어 있다는 것을 알 수 있었다.

[3. 적외선(IR) 스펙트럼]

KRF-001 시료 2mg을 KBr 200mg과 섞어 디스크로 만든 후 비율 기록 적외선 분광기(Perkin-Elmer 사 제품, 모델 1420)로 분석하였다. KRF-001은 NH그룹의 존재를 나타내는 3300-3500 ㎝^-1와 CH그룹의 존재를 나타내는 2700-3000㎝^-1및 카보닐 그룹의 존재를 나타내는 1660㎝^-1부근에서 흡수를 나타내었다.

[4. 질량분석]

KRF-001시료를 JEOL DX-303 질량분석기를 이용하여 FAB(posivive ionization) 방법으로 분자량을 측정하였다. 1065, 1079, 1093 및 1107에서 [M+Na]⁺이온분자 피크가 나타나, 각각 분자량이 1042, 1056, 1070 및 1184으로 추정되었다.

다시말하면 KRF-001은 분자량이 다른 몇개의 유사물질의 집합체인 것으로 확인되었다.

[5. 헥자기공명(NMR)시험]

KRF-001을 CD₃OD에 녹인 후 5㎜ 튜브에 넣어 (Bruker AM-300와 Bruker AM-500) NMR분석을 하였다(내부 표분시약으로 TMS를 사용하였음).¹H NMR는 300.12㎒, 500.13㎒ NMR로, 13C NMR는 75.473㎒, 125.75 ㎒ NMR로,¹⁵N NMR는 50.57㎒ NMR로 측정하였다. KRF-001의¹H NMR 스펙트럼,¹H-¹H NMR 스펙트럼, 2D 1¹H-1H 코지 스렉트럼, 2D¹H-¹³C 상관-스펙트럼, 2D¹H-¹⁵H 역상관 스펙트럼 등을 해석한 결과, KRF-001 내에 타이로신, 아스파라진, 세린, 프롤린등의 아미노산이 존재함을 알 수 있다.

[실시예 4]

[KRF-001의 피부관련 항진균 치료효과]

항진균성 펩티드물질 KRF-001을 물, 70%에탄올 또는 그리세린과 섞어서 유효농도가 0.1 내지 0.5%(v/v)가 되게 한후, 무좀, 습진, 완선 등의 증상을 보이는 피부 표면에 발랐을때 병징이 현저히 감소하고 3 내지 5일 후에는 치료효과는 현저함을 관찰하였다.

[실시예 5]

[KRF-001의 피부보습 효과]

항진균성 펩티드물질 KRF-001을 피부보호용 로숀 크림이나 샴프속에 0.2%(v/v) 넣어서 피부에 발랐을때, 피부에 부드러운 감을 주고 피부의 건조가 억제되며 청결한 피부를 유지할수 있었다.

[실시예 6]

[KRF-001의 과일보존효과]

잘익은 딸기를 농장에서 직접 채집하여 증류수로 흙을 닦아낸 후 한개의 실험구에는 딸리 표면에 회색곰팡이 포자를 직접 처리하고, 다른 한개의 실험구에서는 딸기들을 KRF-001 생산균주의 배양액속에 10분간 넣었다가 꺼낸 뒤에 딸기표면에 회색곰팡이 포자를 처리했다. 일주일동안 25℃ 배양기속에 배양한 후 관찰한 결과 첫번째 실험구(KRF-001 무처리구)의 딸기는 모두 부패했으나 KRF-001 발효액에 처리된 두번째 실험구의 딸기들은 아직도 신선도를 유지하고 있었다.

[실시예 7]

[KRF-001의 벼 도열병 예방효과]

낙동벼를 재배하는 논에서 벼도열병 예방을 위한 포장 실험을 행하였다. 조 KRF-001(순도 25%)을 물에 희석하여 유효 농도가 114ppm, 231ppm 및 462ppm되게 한 후 2차례에 걸쳐 벼잎의 표면에 처리하였다. 대조약제로서 블라스티시딘 -S, 카수가마이신, 트리싸이클라졸 등을 각각 20, 20, 375ppm으로 살포하였다. 약 2주일 후 벼열도병 방제 효과를 비교한 결과 KRF-001은 114ppm에서 74%, 231ppm에서 76%, 462ppm에서 77%의 방제효과를 보였고 기존의 대조약제인 블라스티시딘 -S는 65%, 카수가마이신은 75%, 트리싸이클라졸은 82%의 방제효과를 보였다.

[실시예 8]

[KRF-001의 딸기 잿빛 곰팡이병 방제효과]

딸기 잿빛 곰팡이병 방제실험을 위한 포장실험을 행하였다. 조 KRF-001(순도 25%)를 희석하여 유효농도가 500ppm, 1000ppm 되게 한후, 익어가고 있는 딸기들이 있는 포장에 살포하였다. 대조약제로서 베노밀 500ppm을 살포하였다.

일주일 후 병든 딸기의 비율을 조사한 결과 KRF-001 처리구는 500ppm에서 17%, 1000ppm에서 47% 및 1500ppm에서 21%의 발병 방제율을 보였고 대조약인 베노밀은 500ppm에서 48%의 방제효과를 보였다.

[KRF-001의 국소자극성 및 급성 독성시험]

KRF-001의 피부 1차 자극성에 대하여 다음과 같이 시험하였다. 4개월된 수컷 토끼(체중 2 내지 3kg) 2마리를 선정하여 2.5×2.5㎝ 범위로 4군데에 찰과상을 내고 0.5g의 KRF-001을 증류수 0.5㎖에 용해시킨 용액을 상기 찰과 및 비찰과 부위에 24시간동안 적용시켰다. 투여한지 1주일 후, 일반 상태 및 적용부에 특이한 자극성 반응은 관찰되지 않았다.

KRF-001의 급성 경구 독성에 관하여는 7 내지 8주된 ICR 마우스 수컷 7마리(35±5g)와 암컷 7마리(25±5g)를 사용하여 시험하였다. 2 내지 3마리로 이루어진 각 군데 500, 1000 및 5000mg/체중 kg의 용량으로 KRF-001을 존데(sonde)를 사용하여 경구 강제 투여하였다. 투여한지 2주일 후 5000mg/kg 투여군의 수컷군에서만 3만리중 1마리가 투여후 3일째에 사망하였다. 사망전의 임상증상은 웅크림(crouching), 폐안, 털의 곤두섬(ruffled fur) 등이었으나 생존 동물에서는 특이 내용이 관찰되지 않았다. 각 군(500, 1000, 5000mg/kg 투여군) 모두에서 특이적 체중 감소 또는 억제 경향은 관찰되지 않았다. 부검결과 사망동물(500mg/kg 군의 수컷 1마리)에서 장관내 흑갈색 내용물이 관찰되었으나 그 밖의 특이소견은 관찰되지 않았다.

본 시험 결과 시험물질 KRF-001은 직접적인 자극이라도 비교적 독성이 없는 것으로 나타났다. 한편, 마우스의 급성 경구 독성은 5000mg/kg 군에서의 1마리가 사망하여 LD50 값은 5000mg/kg 이상의 용량으로 추정된다.

Claims

하기 구조식을 갖는 올리고 펩티드계 물질 KRF-001을 생산하는 바실러스 서브틸리스 이종 크릭티엔시스(Bacillus subtilis subsp. Krictiensis) ATCC 55079 또는 그의 변이주인 바실러스 서브틸리스 아종 크릭티엔시스 M18-91(Bacillus subtilis subsp. Krictiensis M18-91)ATCC 55078.

상기식에서, 특이 베타-아미노산은 성분 A, B, C, D, E 및 F에서 각각 다음과 같다.
올리고 펩티드계 물질 KRF-001을 포함하는 인간 및 동물에 대한 피부관련 진균감염증 치료제.
올리고 펩티드계 물질 KRF-001을 포함하는 피부 보습제.
올리고 펩티드계 물질 KRF-001을 포함하는 과일, 채소 및 식품 보존제.
올리고 펩티드계 물질 KRF-001을 포함하는 농업용 살진균제.