JP2001507237A

JP2001507237A - 植物疾病およびコーンルートワームを制御するためのＢａｃｉｌｌｕｓの新規な株

Info

Publication number: JP2001507237A
Application number: JP54855398A
Authority: JP
Inventors: ダーレーンヘインズ，シェリー; キャロルマンカー，デニス; リトジメネズ，デスモンド; ジャイマッコイ，ランディー; エンショオージャラ，ジミー; ジィー．マローネ，パメラ
Original assignee: アグラクエスト，インコーポレイテッド
Priority date: 1997-05-09
Filing date: 1998-05-08
Publication date: 2001-06-05
Anticipated expiration: 2018-05-08
Also published as: US6060051A; DE69835206T2; CZ302152B6; TW592639B; BG103855A; WO1998050422A1; CA2289916C; JP3471815B2; SK149099A3; CA2702750C; MX214455B; HUP0004555A2; JP2003199558A; ID23681A; SK283036B6; DE69835206D1; CN1255143A; HUP0004555A3; PL336716A1; TR199902765T2

Abstract

(57)【要約】本発明は、殺虫活性、抗真菌活性、および抗細菌活性を示す、新規な抗生物質を産生するおよび代謝物質を産生するBacillus subtilis株に関する。この新規な株の上清は、有効な殺虫剤、抗真菌剤、および抗細菌剤を含む。本発明において含まれるものはまた、この上清において生成される溶媒抽出可能な、小分子量（10,000ダルトン未満）の、コーンルートワームに活性な代謝物質である。本発明において含まれるものはまた、真菌および細菌感染、ならびにコーンルートワームの感染から植物を防御または処理する方法であり、この方法は、抗生物質／代謝物質を生成する新規なBacillus subtilis株、新規なBacillus subtilis株によって生成される抗生物質／代謝物質、またはその組み合わせの有効量を、植物に適用する工程を包含し、必要に応じて、別の抗生物質を生成する細菌株および／または化学的な農薬をさらに含有する。本発明はまた、新規なBacillus subtilis株の培養物から得られる全ブロス培養物もしくは上清を、単独でまたは化学農薬および／もしくは他の生物制御剤と組合わせて使用する、真菌および細菌感染を防止または処理するための方法を包含する。本発明はまた、agrastatin類と称される新規な抗真菌および抗細菌化合物を包含し、ならびにＡ型iturin、plipastatin、surfactin、およびagrastatinを含有する新規な組合わせを包含する。植物を真菌および細菌感染およびコーンルートワーム(corn rootwarm)感染から処理または防御する方法であって、新規なagrastatin類、ならびにＡ型iturin、Plipastatin、surfactin、およびagrastatinを含有する新規な組合わせを投与する工程を包含する方法が、提供される。

Description

【発明の詳細な説明】植物疾病およびコーンルートワームを制御するためのBacillusの新規な株発明の分野本発明は、生物農薬の分野にある。より詳細には、本発明は、Bacillus subti lisの新規な株、AQ713が、広範な範囲の真菌および細菌植物疾病を阻害し得、ならびにまたコーンルートワーム(corn rootworm)に対する活性を有するという知見に関する。本発明はまた、本発明の新規なBacillus株、ならびにこの株によって生成される抗生物質および代謝物質を、単独で、または他の化学的なおよび生物学的な農薬と組合わせて含有する、抗真菌性の、抗殺菌性の、および殺虫性の組成物に関する。関連出願の相互参照本出願は、1997年５月９日に出願された出願番号第08/853,753の一部継続出願である。発明の背景何年もの間、種々の微生物が、植物疾病を制御するのに有用であるような生物学的活性を示すことが知られている。農学的および園芸学的に重要な種々の植物疾病を制御するための生物学的農薬を同定および開発する分野において、進歩がなされたが、使用される大部分の農薬はなお、合成化合物である。これらの化学的な抗真菌剤の多くは、EPAによって発ガン物質として分類され、野生生物および他の非標的種に毒性である。さらに、病原体は、化学的な農薬に耐性になり得る（例えば、Schwinnら、244頁、ADVANCES IN PLANT PATHOLOGY：PHYTOPHTHORAI NFESTANS、THE CAUSE OF LATE BLIGHT OF POTATO（Academic Press、San Diego 1991）。毎年、2億5千万〜3億ドルの化学的な農薬が、コーンルートワーム感染を制御するために使用される。これらの化学的な農薬の多くは、ヒト、野生生物、および他の非標的種に毒性である。また、いくつかは、地下水において見出された。新規な化学的な殺虫剤は、開発するために１億ドルかかる。生物学的な制御は、合成の化学的な抗真菌剤の魅力的な代替を提供する。生物農薬（生存する生物体およびこれらの生物体によって生成される天然に生成された化合物）は、より安全であり得、より生分解性であり得、および開発するのにあまり高価ではなくあり得る。スクリーニングプログラムは、抗真菌活性を示すあるBacillus spp.（Bacillu s ssp.は、B.subtilis、B.cereus、B.mycoides、B.thuringiensisを含む）を同定した。（例えば、Stabbら（1990）Applied Environ．Microbiol.60:4404-4412 ）。これらの株は、Phytophthora medicaginis，P．nicotianae、P．aphaniderm atum,、またはSclerotinia minor（Stabbら、前出を参照のこと）によって引き起こされる土壌伝播性の立ち枯れ病に対して有効である、２つの抗生物質zwitte rmicin-Aおよび／またはkanosamine（Milnerら（1996）Appl．Environ．Microb ．62:3061-3066）を生成することが示された。zwittermicin-Aは、水溶性で、酸安定性の直鎖アミノポリオール分子である(Heら（1994）Tetra．Lett．35（16） 2499-2502を参照のこと)。 Handelsmanらに対する米国特許第5,049,379号は、zwittermicin-Aが、アルファルファおよびダイズにおいてどのように立ち枯れ病を生成するのかを記載する。種子が、B.cereus ATCC 53522でコートされる場合、根腐れ真菌の病原性活性が阻害される。ダイズ種子または種子の周囲の土壌に対する、あるB.cereus株の胞子ベースの処方物の同様の適用は、圃場部位でダイズの収量を改善することが示された。（Osburneら（1995）Am．Phytopathol．Soc．79(6):551-556を参照のこと）。生物農薬を適用する方法は、当該分野において周知であり、ならびに、例えば、有効な薬剤の湿潤性粉末、乾燥流動物、マイクロカプセル化、適切な培養物からの抗生物質画分の液体または固体処方物が挙げられる（例えば、Rossall に対する米国特許第5,061,495号またはHandelsmanに対する米国特許第5,049,379 号を参照のこと）。 Smithら（1993）Plant Disease 77(2)139−142は、cottony cucumber leakを引き起こす土壌伝播性真菌の、Pythium aphanidermatumの活性が、zwittermicin を生成するB.cereus株UW85を使用して抑制され得ることを報告する。Leifertら（1 995）J．Appl．Bacteriol．78:97-108は、２つのBacillus細菌、B.subtilis CL2 7およびB.pumilis CL45による抗Botrytisおよび抗Alternaria抗体の生成を報告する。全ブロスおよび無細胞濾液は、インビトロ試験においてBotrytisおよびAl ternariaに対して活性であり、およびインビボでの、Astilbeに対する小さな植物の試験において、Botrytisに対して活性であった。Leifertら（1997）米国特許第5,597,565号は、収穫後の疾病を引き起こす真菌を阻害するのに特に有効であるB.subtilis、B.pumilis、およびB.polymyxaを開示する。彼らはまた、無細胞培養濾液において生成される抗生物質の存在、および異なるpH値でのそれらの活性を開示したが、これらの化合物を同定していない。 Rossall（1994）米国特許第5,344,647号は、広範な抗真菌活性を有するBacill us subtilis株を開示する。Sholbergら（1995）Can．J．Microbiol．41:247-252 、Swinburneら（1975）Trans．Brit．Mycol．Soc．65:211-217、SinghおよびDev erall（1984）Trans Br．Mycol．Soc．83:487-490、ならびにFerreira（1991）P hytopathology 81:283-287。Bakerら（1983）Phytopathology 73:1148-1152は、真菌植物病原体の生物制御剤として、Bacillus spp.およびBacillus subtilisの使用をを開示する。Bakerら（1983）Phytopathology 73:1148-1152はまた、植物病原体に対する使用のための抗真菌Bacillus subtilisを報告する。Puseyら（19 88）Plant Dis．72:622-626、PuseyおよびRobins（米国特許第5,047,239号）、ならびにMcKeenら（1986）Phytopathology 76:136-139は、B.subtilisを使用する、収穫後の果実腐敗の制御を開示する。McKeenら、前出は、低分子量のiturin 環式ポリペプチドに類似する抗生物質が、B.subtilisのこの真菌活性に寄与することを示した。 Liuら（1995）米国特許第5,403,583号は、Bacillus megaterium、ATCC 55000 および真菌植物病原体のPhizoctonia solaniを制御するための方法を開示する。 IslamおよびNandi（1985）Journal of Plant Diseases and Protection 92(3):2 41-246は、イネ褐色斑点の原因因子のDrechslera oryzaeに対する拮抗作用を有するBacillus megateriumを開示する。同じ著者の、IslamおよびNandi（1985）J ournal of Plant Diseases and Protection 92(3):233-240はまた、Drechslera oryzae、Alternaria alternata、およびFusarium roseumに対するB.megaterium のインビトロ拮抗作用を開示する。彼らは、培養濾液における３つの成分を考察する。最も活性な抗生物質は、255nmでのUVピークおよび260nmでの肩（shoulder ）を有し、水およびメタノールに高度に可溶性であり、これはポリオキシン様リポペプチドになることを証明した。Cook（(1987)Proceedings Beltwide Cotton Production−Mechanization Research Conference、Cotton Council，Memphis、 43〜45頁）は、綿の根腐れ病の原因のPhymatotrichum omnivorumによって殺傷される綿植物の数を減少するための、Bacillus megateriumの懸濁液の使用を開示する。 B.megateriumの抗生物質産生は、Berdy（CRC Handbook of Antibiothic Compo unds、第IからXIV巻（CRC Press，Inc．Boca．Raton、FL 1980-87）によって報告されており、彼は、哺乳動物低毒性のペプチド抗生物質（例えば、ansamitoci n-PDM-O、bacimethrin、megacin、ペンタペプチド、、ホモペプチド類）の生成を報告する。 Bacilliは、抗真菌および抗細菌二次代謝物質を生成することが知られる（Kor zybskiら（1978））。ウィスコンシンおよびコーネル大学の研修者らは、Bacill us sp.によって生成される、新規な抗真菌化合物のzwittermicin Aを同定した（ Heら（1994）Tetra．Lett．35(16):2499-2502）。同じ株によって生成される第２の抗真菌代謝物質は、公知のアミノ糖、Kanosamineとして、最近同定された（ Milnerら（1996）Appl．Environ．Microb．62:3061-3065）。以前に記載されるBacillus代謝物質の別の群は、iturinクラスの環式リポペプチドであり、このいくつかは、強力な抗真菌剤である。これらの薬剤は、７つの αアミノ酸および脂肪族側鎖を伴う１つのβ-アミノ酸を有する環式オクタペプチドからなる。アミノ酸配列の順序および成分が異なるiturin類のいくつかの群が存在する。これらは、以下の表１において示される。一般に、一そろいの関連の分子は、脂肪酸アミノ酸残基の長さおよび枝別れにおける差異を伴って、生成される。Saccaromyces cerevesiaeに対して試験される場合、mycosubtilinが最も活性な薬剤（LC50＝10μg/mL）であり、iturin-Aおよびbacillomycin Lが続く（両方は、LC50＝30μg/mLを有する）ことが見出された（Beesonら（1979）J．A ntibiotics 32(8):828-833）。これらの環式リポペプチドの作用の態様は、生体イオンの放出を許容する膜貫通チャンネルを作製する真菌膜との相互作用に起因することが報告されている（Latoudら（1986）Biochem．Biophys．Acta 856:526 -535）。Iturin-Cは、Penicillium chrysogenumを含む真菌に対して不活性である（Peypouxら（1978）Tetrahedron 34:1147-1152）。表１抗生物質のiturinファミリーの構造 USDAでの研究グループは、アミノ酸鎖長が異なる多くのアナログを作製して、 iturin類の構造／活性関係を調査した。研究者らは、iturin類の活性が、脂肪酸側鎖の長さおよび末端の枝別れ（iso＞通常＞anteisoの順に）とともに増加したことを報告した（Blandら（1995）Proc．Plant Growth Regulation Soc．Am．第 22号：105-107）。彼らはまた、Bacillusの多くのiturin生成株を用いる彼らの研究に基づいて、「天然の産物から得られたiturinの量は、商業的に実行可能であるのに不十分である」と述べる。 B.cereusから単離された環式リポペプチドの別の群は、plipastatinsである。これらの化合物は、アシル化デカペプチドのファミリーであり、その構造は図１において示される（Nishikioriら（1986）J．Antibiotics 39(6)755-761）。これらの化合物は、元来、ブタ膵臓ホスホリパーゼA2のインヒビターとして単離された（Umezawaら（1986）J．Antibiotics 39(6):737-744）が、後に、いくつかの植物病原性真菌（Botrytis、Pyricularia、およびAlternariaを含む）を阻害することが見出された（Yamadaら（1990）Nippon Noyaku Gakkaishi 15(1):95-9 6）。Yamadaらはまた、両方ともに同じB．subtilis株によって生成される、itur inAとPlipastatin類との間で観察される相乗効果を報告した。研究は、液体（PhaeおよびShoda（1991）J．Ferment．Bioeng．71:118-121）；Ohnoら（1993）J．Ferment．bioeng．75:463-465）および固体状態の発酵物（ Ohnoら（1992）Biotech．Lett．14(9):817-822；Ohnoら（1995）J．Ferment．Bi oeng．5:517-519）の両方におけるiturinの生成を増加するための発酵の改善に対して行われた。同じB．subtilis株によって生成される、それ自身では不活性である、密接に関連するSurfactin類と、iturin類との間での相乗効果の報告がある（Hiraokaら（1992）J．Gen．Appl．Microbiol．38:635-640）。iturin Aおよびsurfactinの合成を同時調節する遺伝子のヌクレオチド配列が公開されている（Huangら（1993）J．Ferment．Bioeng．76(6):455-450）。iturinを生成する株に対する圃場研究は、Rhizoctoniaの制御についての土壌処理に集中し（Asaka およびShoda（1996）Appl．Envlron．Microbiol．62:4081-4085）、ならびにitu rin類の葉の圃場適用は報告されていない。 B.subtilisによって生成される別の環式リポペプチド化合物は、surfactinであり、これは、非常に優れた界面活性剤活性を保有する（Kaninumaら（1969）Ag ric．Biol．Chem.33:973-976）。surfactinは、ラクトン環によってLLDLLDL配列を有するヘプタペプチド部分に連結されるC14またはC15のβ-ヒドロキシ脂肪酸を含む（Arimaら（1968）Biochem．Biophys．Res．Commum．31:488-494）。Sand rinら（（1990）Biotechnol．Appl．Biochem．12:370-375）は、surfactinおよびiturin Aの両方、bacillomycin FおよびL、ならびにmycosubtilinを産生するB .subtilis株を見出した。本発明者らによって発見され、以前は、Bacillus megateriumの株であると考えられ、そして現在、Bacillus subtilisの株として同定された、新規な微生物A Q713は、A iturin類、plipastatin類、およびsurfactin類を生成する。微生物によるリポペプチドのこの組合せの生成は、以前には報告されていなかった。さらに、本発明者らは、AQ713はまた、「agrastatin類」として称される化合物の新規に記載される群を生成することを見出した。全ての３つの上記の公知の化合物と、新規なagrastatin類との組合わせはまた、新規である。１つの一般に使用される生物農薬は、グラム陽性細菌Bacillus thuringiensis である。農薬のB.thuringiensis株は、昆虫および線虫のある目および種に特異的に毒性である結晶タンパク質を、胞子形成の間に生成することが知られる（米国特許第4,999,192号および同第5,208,017号）。B.thuringiensisによって生成されるプロテイナーゼ性のエンドトキシンはまた、コーンルートワームおよび他の甲虫に対する殺虫剤として作用する（例えば、米国特許第5,187,091号；Johns on，T.J.ら（1993）J．Economic Entomology 86:330-333）。B.thuringiensisエンドトキシンは、精製された結晶、洗浄された細胞ペレット、および発現されたタンパク質として有効であることが示された。Warrenら（WO 96/10083）は、Bac illus cereusおよびB.thuringiensisの栄養段階の間に生成される、非エンドトキシンタンパク質を開示する。Vip1およびVip2と呼ばれる、これらの栄養タンパク質は、コーンルートワーム（northernおよびwestern）に対して強力な活性を有する(Estruchら（1997）Nature Biotechnology 15:137-141およびMullinsら（ 1997）、Appl Environ．Microbiol．63（印刷中）。 β-エキソトキシンと呼ばれる１つのB.thuringiensis熱安定性代謝物質はまた、農薬特性を有することが示された。BurgjeronおよびBiache（1979）、Entomop haga 11:279-284は、Colorado potato beetle（Lepinotarsa decemlineata）に対して活性である、βエキソトキシンを報告する。さらに、公知のB.thuringiensi sβ-エキソトキシンは、非特異的な農薬活性を示し、線虫だけでなく、ハエ、アワヨトウの幼虫、ダニ、およびコーンルートワームもまた殺傷する。Sigmaエキソトキシンは、β-エキソトキシンに類似の構造を有し、およびColorado potato beetleに対して活性である（Argauerら（1991）J．Entomol．Sci．26:206-213）。α-エキソトキシンは、Musca domesticaの幼虫に対して毒性である（Cluthy（ 1980）FEMS Microbiol．Lett．8:1-7）。γ-エキソトキシンは、種々のタンパク質分解性酵素、キチナーゼ、およびプロテアーゼである。γエクソトキシンの毒性効果は、β-エキソトキシンまたはδ-エンドトキシンとの組合わせにおいて発現されるのみである。Forsbergら（1976）「Bacillus thuringiensis：環境の質におけるその効果」、National Research Council of Canada。Stonardら（1994 ）ACS Symposium Series 551:25は、Bacillus cereus株の上清中の、コーンルートワームに対する水溶性の二次代謝物質を報告する。抗真菌活性およびコーンルートワーム活性の両方を有するBacillusの記録された株は存在しない。Bacillus subtilisによって生成される公知でない代謝物質が存在し、これは、約10,000未満の分子量であり、および非極性溶媒において抽出可能である。発明の開示 Bacillus megateriumとして以前に同定された、Bacillus subtilisの新規な抗生物質を生成するおよび代謝物質を生成する株が提供され、この株は、広範な抗真菌および抗殺菌活性を示し、ならびにまたコーンルートワーム活性を示す。また提供されるものは、コーンルートワームに対する活性を有する新規なB.subtil isからの新規な代謝物質である。また提供されるものは、真菌および細菌感染から植物を処理または防御する方法であり、抗生物質を生成するBacillus subtili sの有効量を適用する工程を包含する。抗生物質を生成するBacillus subtilisは、全ブロス培養物における懸濁液として、またはBacillusの抗生物質を生成する株の全ブロス培養物から得られる抗生物質を含有する上清として、提供され得る。また提供されるものは、コーンルートワームの侵襲から植物の根を処理または防御する方法であり、新規な代謝物質を生成するBacillus subtilisの有効量を適用する工程を包含する。新規な代謝物質質を生成するBacillus subtilisは、全ブロス培養物における懸濁液として、または代謝物質を含有する上清もしくは微生物の全ブロス培養物から得られる精製された代謝物質として、提供され得る。また提供されるものは、新規な株AQ713によって生成される新規な化合物のagras tatin類、ならびにinturin A、plipastatin、surfactin、およびagrastatinを含む化合物の新規な組合わせである。図面の簡単な説明図１は、plipastatin抗生物質の構造を示す。図２は、AQ713代謝物質のHPLCクロマトグラムを示す。発明の実施の態様本発明は、Bacillus megateriumとして以前に同定された、Bacillus subtilis の新規な株、AQ713、または広範な抗真菌および抗細菌活性を有するその変異体、ならびに抗真菌および抗コーンルートワーム活性の新規な組合せを提供する。この新規な株は、AQ713と称され、そして承認番号B21661のもと、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づく規則のもとに、19 97年３月７日に、NRRLに寄託された。本発明はまた、このような細菌株またはこのような細菌株から得られる抗生物質を含有する上清もしくは純粋な抗生物質を使用して、植物における真菌および細菌疾病を防止および処理する方法を包含する。本発明はまた、AQ713の細菌懸濁液、またはAQ713の培養物の代謝物質を含有する上清もしくは株AQ713から精製された代謝物質で、コーンルートワーム幼虫を制御するために、植物の根および土壌を処理する方法を含む。本発明はまた、 10,000ダルトン未満の分子量を伴う、コーンルートワームに対する活性を有する溶媒抽出可能な代謝物質を含む。本発明はさらに、新規な微生物によって生成される新規な化合物の、agrastatin類を含む。また含まれるものは、A型iturin、p lipastatin、surfactin、およびagrastatinを含有する新規な組合せである。定義本明細書中で使用されるように、「生物学的制御」は、第２の生物体の使用による病原体または昆虫の制御として規定される。生物学的制御の公知の機構は、根の表面上の空間について、真菌を外部競合する(out-competing）ことによって、根腐れを制御する腸内細菌を含む。細菌トキシン（例えば、抗生物質）は、病原体を制御するために使用されてきた。トキシンは単離され得、そして植物に直接的に適用され得るか、または細菌種は、トキシンをインサイチュで生成するように投与され得る。用語「真菌」は、クロロフィルを欠く、広範に多様な有核胞子を保有する生物を含む。真菌の例としては、酵母、カビ、ウドンコ病菌、サビ菌、およびキノコが挙げられる。用語「細菌」としては、明瞭な核を有しない任意の原核生物が挙げられる。「抗真菌性」は、真菌の死亡率を増加する、または増殖速度を阻害する、物質の能力を意味する。「抗生物質」は、微生物を殺傷または阻害し得る、任意の物質を含む。抗生物質は、微生物によってまたは合成プロセスまたは半合成プロセスによって生成され得る。それゆえ、この用語は、真菌を阻害または殺傷する物質、例えば、zwit termicin-Aまたはkanosamineを含む。「抗真菌剤」は、真菌を殺傷し得る、または真菌の増殖を阻害し得る任意の物質を含む。用語「培養する」は、種々の種類の培地上でのまたは培地中での、生物体の増殖をいう。「全ブロス培養物」は、細胞および培地の両方を含む液体培養物をいう。「上清」は、ブロス中で増殖された細胞が、遠心分離、濾過、沈降、または他の当該分野において公知の手段によって除去される場合に残存する液体ブロスをいう。「有効量」は、有益なまたは所望の結果を達成するのに十分な量である。有効量は、１回以上の投与において投与され得る。処理および防御の用語において、「有効量」は、真菌または細菌病の状態の進行を、軽減、安定化、逆転、緩慢、または遅延するのに十分な量である。本明細書中で使用されるように、「昆虫」は、「昆虫（Insecta）」網における全ての生物体を含む。「成虫前の（pre-adult）」昆虫は、成虫段階の前の生物体の任意の形態（例えば、卵、幼虫、および若虫を含む）をいう。「殺虫性」は、昆虫の死亡率を増加する、または増殖速度を阻害する、物質の能力をいう。「殺線虫性」は、線虫の死亡率を増加する、または増殖速度を阻害する、物質の能力をいう。「農薬性」は、昆虫、線虫、およびダニの、死亡率を増加する、または増殖速度を阻害する、物質の能力をいう。「ポジティブコントロール」は、農薬活性を有することが知られる化合物を意味する。「ポジティブコントロール」としては、市販の化学的な農薬が挙げられるが、これに制限されない。用語「ネガティブコントロール」は、農薬活性を有することが知られていない化合物を意味する。ネガティブコントロールの例としては、水または酢酸エチルが挙げられる。用語「溶媒」は、溶液中に別の物質を保持する任意の液体を含む。「溶媒抽出可能な」は、溶媒中に溶解し、次いで、溶媒から単離され得る任意の化合物をいう。溶媒の例としては、酢酸エチルのような有機溶媒が挙げられるが、これらに制限されない。用語「代謝物質」は、農薬活性を有する微生物の発酵の、任意の化合物、物質、または副生成物をいう。上述のように規定される抗生物質は、微生物に対して特異的に活性な代謝物質である。用語「agrastatin類」は、以下の構造を有する新規な化合物の群をいう：ここで、R₁は、C8〜C20の分枝鎖または直鎖の脂肪族側鎖であり；Ｘは、AlaまたはValのいずれかであり、R₂は、酢酸またはエステル誘導体であり；およびGlx は、GlnまたはGluである。これらの化合物は、抗細菌および抗真菌活性、ならびに抗コーンルートワーム活性を有する。本発明者らは、Bacillus megateriumとして以前に同定された、Bacillus subt ilisの新規な、代謝物質および抗生物質を生成する株を記載し、この株は、広範な抗真菌および抗殺菌活性を示し、ならびにまたコーンルートワーム幼虫を殺傷するか、または発育阻止する。別の局面において、本発明は、真菌および細菌感染から、植物を処理または防御する方法を提供し、本発明におけるBacillus sub tilis AQ713の全ブロス培養物から得られる上清の有効量を適用する工程を包含する。上清は、当該分野において周知の方法（遠心分離、濾過、沈降などを含む）によって得られ得る。別の局面において、本発明は、真菌および細菌感染から、植物を処理または防御する方法を含み、新規な株のBacillus subtilisの全ブロスの有効量を適用する工程を包含する。さらなる局面において、本発明は、真菌および細菌疾病から、植物を処理または防御する方法を含み、Bacillus subtilisの新規な株によって生成される抗生物質の有効量を適用する工程を包含する。別の局面において、本発明は、コーンルートワーム侵襲から、植物の根を処理または防御する方法を提供し、本発明におけるBacillus subtilisAQ713の全ブロス培養物から得られる上清の有効量を適用する工程を包含する。上清は、当該分野において周知の方法（遠心分離、濾過、沈降などを含む）によって得られ得る。別の局面において、本発明は、コーンルートワーム侵襲から、植物の根を処理または防御する方法を包含し、Bacillus subtilisの新規な株の全ブロスの有効量を適用する工程を包含する。さらなる局面において、本発明は、コーンルートワーム感染から、植物の根を処理または防御する方法を包含し、Bacillus subtilisの新規な株によって生成される代謝物質の有効量を適用する工程を包含する。本発明における組成物の良好な分散および接着を達成するために、全ブロス培養物、上清、および／または代謝物質／抗生物質を、分散および接着を補助する成分とともに処方することが有利であり得る。適切な処方物は、当業者に公知である。本発明における組成物は、湿潤性粉末、顆粒などとして処方され得るか、または適切な媒体などにマクロカプセル化され得る。他の処方物の例としては、可溶性粉末、湿潤性顆粒、乾燥流動物（flowables）、水性流動物、湿潤性の分散性の顆粒、乳化可能な濃縮物、および水性懸濁物が挙げられるが、これらに制限されない。他の適切な処方物は、当業者に公知である。本発明のなおさらなる局面において、「agrastatin類」と称される化合物の新規な群が提供される。これらの化合物は、抗コーンルートワーム活性に加えて、抗細菌および抗真菌活性を示す。本発明のなおさらなる局面において、A型iturin、plipastatin、surfactin、およびagrastatinを含有する新規な組合せが提供される。本発明の別の局面において、真菌および細菌疾病から、植物を処理または防御する方法が提供され、A型iturin、plipastatin、surfactin、およびagrastatin を含有する化合物の新規な組合せの有効量が、適用される工程を包含する。本明細書中に引用される全ての特許および刊行物は、その全体が本明細書中に参考として援用される。以下の例は、本発明を説明するために提供される。これらの例は、制限するとして解釈されない。実施例実施例１ AQ713株の特徴づけ単離物を、Bochner（1989）Nature 339:157-158において記載されるように、B iolongのマイクロプレートパネル（Biolong，Inc.、Hayward、CA）の利用に基づいて同定した。Biolongマイクロプレートを、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌について利用可能な95個の異なる炭素基質プレートを有する、予め充填および乾燥したパネルから構成される。単離物を、28℃で液体培地中で増殖し、そして24時間後、洗浄した細胞懸濁液（0.85%生理食塩水）を、GP Microplate（Biol ong，Inc.）の各パネルウェルに接種した。28℃で、24時間後、炭素利用反応をを評価した。次いで、基質利用プロフィールを、Biolog Gram-Positive Data Ba se（リリース3.50）と比較し、そして最も類似する種に対して単離した。Biolog の結果は、Bacillus Megateriumに対して0.883の類似性指標を与えた。 AQ713のより広範囲の特徴付けを、アメリカンタイプカルチャーコレクション、 Rockville，Md.によって行った。提出された単離物：未知；AQ713株同定された単離物：利用可能な生理学的および生化学的データを使用して、この株は、Bacillus subtilisに最も類似する。細胞形態学：運動性の細胞が、単一で見出され、１つの内性胞子が、中心または端近くの領域において形成された。細胞は、グラム陽性に均一に染色された。コロニー形態学：コロニーは、凸面高、粗い、鈍い表面、およびでこぼこの縁を伴って、不透明および不規則であった。 AQ713株の特徴づけデータ：注解：利用可能な生理学的および生物学的データを使用して、この株は、Bacill us subtiliｓに最も類似する。重要な特徴づけ結果参考文献： Gordon，R.E.、W.C.HaynesおよびC.H.N.Pang．1973。Bacillus属。ハンドブック 427号。米国農務省、Washington，D.C. 実施例２コーンルートワームに対するAQ713の活性 Bacillusサンプルを、Bacillus培養培地中で増殖した。培地２は、５%ペプトン、５%デキストロース、３%酵母抽出物、３% 麦芽抽出物、1.5% proflo綿種子抽出物（59%タンパク質、4.26% 脂肪、6.73% 灰分、3.19% 繊維、および微量のゴシポール；バランスは水である）、10%ダイズ粉、および0.5% MgSO₄×7H₂O。培地３は、20% ペプトンおよび3.4% KH₂PO₄および4.3% K₂HPO₄以外は、同じ成分を含んだ。１日齢の線条培養物を、250mLのバッフル振とうフラスコを接種するために使用した。フラスコを、200rpmにて、29℃で、５日間、振とうした。殺虫活性をアッセイするために、35mLの培養ブロスを、5,200rpmで、20分間、遠心分離し、そして上清を、以下に記載のマイクロアッセイにおいて使用した。アッセイを、96ウェルのマイクロプレートにおいて行った。各ウェルは、固体寒天基質を含み、試験生物体、およびポジティブコントロール、ネガティブコントロール、または新規なBacillus株から実施例１に記載されるように得られた上清のいずれかを、含んだ。殺虫活性をアッセイするために、寒天基質を、Marroneら（1985）J．Econ．En tomol．78:290-293に従って、マイクロプレートのウェルについて調製した。殺線虫活性をアッセイするために、寒天平板（1.5%）をウェルの代わりに使用した。た。脱イオン水を、ネガティブコントロールとして使用した。試験サンプルまたはコントロールの２つの反復実験を、各アッセイにおいて使用した。培地１、２、３において増殖した40μLの上清サンプルまたは全ブロスを、各サンプルウェルに分配した。次いで、プレートを、寒天溶液が乾燥するまで約２〜３時間、乾燥するために蒸気フード中に置いた。試験生物体は、成虫前のコーンルートワーム（Diabrotica undecimpunctata）、成虫前のGermanゴキブリ（Blatella germanica）、成体前のシロイチモンジョトウガの幼虫（Spodoptera exigua）、成虫前のハエ（Drosophila melanogaster ）、または線虫Caenorhabditis elegansのN2株であった。試験生物体は、0.1%寒天中に、各ウェル中に分配した25μＬの寒天当たり約５生物体の濃度に、希釈した。を、ピン圧で空気を通した。プレートを、27℃で、７日間まで、インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを、新生虫の死亡率または幼虫発育の程度を記録することによってスコアした。全て死亡したまたは発育を妨げられた幼虫を含むサンプルウェルに、１のスコアを与え、いくらか死亡したおよび他の重篤に発育が阻止された幼虫を含むウェルに、２のスコアを与え、生存するが発育阻止された幼虫を含むウェルを、３とスコアし、および死亡する幼虫を含まないサンプルに、４のスコアを与えた。スコアは、各サンプル内の反復実験間で平均した。結果を表２および３にまとめる。表２：昆虫害虫全ブロスに対するAQ713のスコア評価表３：昆虫害虫上清に対するAQ713のスコア評価これらの試験は、AQ713が、全ブロス培養物として両方の培地において活性であり、培地２で最も良好な活性であったことを示す。上清は、AQ713が培地２中で増殖された場合にのみ活性であった。実施例３コーンルートワームに対して活性なAQ713代謝物質の化学特性 50mLのAQ713を、培地２中で増殖した。各培養物に、50mL酢酸エチルを添加し、そして混合物を、別々の漏斗中で、２分間、振とうした。水層を除去し、そして有機層を、硫酸マグネシウムを含有するボトル中に回収した。次いで、有機濾液を、丸底フラスコに濾過し、そして溶媒を回転蒸散器（rotovap）において除去した。バイオアッセイのために、乾燥した有機抽出物を、2.5mLアセトン中に再溶解した。40μLアリコートを回収し、そして70%アセトン/水で、800μLに希釈した。これは、有機抽出物の10倍の濃度である。連続希釈を行い、新生コーンルートワームに対するサンプルを得、７日後に新生幼虫（上述のように調製したように、マイクロタイタープレート中のウェルあたり１）の死亡率パーセントを記録した。結果を、表４において記録する。表４：コーンルートワームに対するAQ713の酢酸エチル抽出物の活性結果は、AQ713が、コーンルートワームを殺傷する溶媒抽出可能な代謝物質を生成することを示す。活性な代謝物質の分子量範囲を決定するために、AQ713の50mL培養物を、培地２において増殖した。１mLを、微量遠心分離管に置き、そして12,000で15分間、スピンした。上清を回収した。500μリットルの上清を、10,000ダルトン分子量セントリコンフィルターの上部に置いた。これらを、製造業者の指示に従って、遠心分離した（12,000rpm、35分間）。濾液を回収し、そして保持物を遠心分離およびフィルターの洗浄によって回収した。上清、濾液、および保持物のサンプルを、新生コーンルートワーム幼虫に対して試験した（昆虫食餌を伴う、96ウェルプレート、Marroneら、前出、上述のように；ウェルあたり40μLのサンプル、および各サンプルについて８ウェル、１幼虫／ウェル）。試験の結果を、表５において示す。表５：AQ713の分子量カットオフ結果は、上清および濾液が活性であったことを示し、従って、代謝物質の分子量は、10,000ダルトン未満である。実施例４植物病原体に対して活性なAQ713代謝物質の化学特性 AQ713の50mLを培地２において増殖した。各培養物に、50mL酢酸エチルを添加し、そして混合物を、別々の漏斗中で、２分間、振とうした。水層を除去し、そして有機層を、硫酸マグネシウムを含有するボトル中に回収した。次いで、有機濾液を、丸底フラスコに濾過し、そして溶媒を回転蒸散器において除去した。バイオアッセイのために、乾燥した有機抽出物を、2.5mLアセトン中に再溶解した。40μLアリコートを回収し、そして70%アセトン/水で800μLに希釈した。これは、有機抽出物の10倍の濃度である。Pythium ultimumおよびBotrytis cine reaを用いる96ウェルプレートアッセイ（以下に記載する）植物病原体アッセイを、有機抽出物の活性を決定するために行った。全ブロスは、100%制御（１のスコア）を与えたが、10倍の有機抽出物は、２つの植物病原体の制御を与えなかった（４のスコア）。このことは、活性な抗生物質が、AQ713によって生成されるコーンルートワーム活性の代謝物質とは異なり、酢酸エチルのような有機溶媒中に抽出可能でないことを示す。さらなる試験は、新規な化合物、アグラスタチンＡ（agrastatin A）の単離を提供した。ブタノール抽出物を、発酵ブロスから、先ずブロスを２回、等容量の酢酸エチルで抽出し、そして層を分離することによって作製した。次いで、水性画分を、等容量のブタノールで２回抽出した。ブタノール抽出物を合わせ、そして溶媒を回転式エバポレーターで除去した。粉末を、得られた抽出物の凍結乾燥によって得た。粉末を、80%アセトニトリル／水中に溶解し、そして超音波処理した。溶液を、メタノールで活性化し、そして80%アセトニトリル／水で平衡化したC-18固相抽出（SPE）カートリッジにアプライした。SPEカートリッジを、80% ACN/水で溶出し、そしてこの溶出物を回収し、そして溶媒を除去した。溶出物をさらに、HP LCによって精製した。C-18HPLCカラム（１cm×25cm）を、アセトニトリル＋0.05 % TFA／水＋0.05% TFA溶媒勾配とともに、以下のように使用した（210nmでのUV 検出）：０〜20分間、33％ ACN；20〜30分間、40％ ACN；30〜45分間、45〜55% ACN；および45〜63分間、55％ ACN。 AQ713のHPLCクロマトグラムは、イツリン類、イツリン様化合物プリパスタチン（plipastatin）類およびアグラスタチン類）、およびサーファクチン（surfa ctin）類の存在を示す、図１を参照のこと。イツリンA2、A3、A4、A7、およびA6を、NMRのデータおよびLC質量分析データ、および文献値との比較との組み合わせによって同定した。サーファクチン類を、 HPLCによっておよびLC質量分析によって、購入したサーファクチン類の標準に比較することにより同定した。イツリン様化合物を、アミノ酸分析とLC質量分析との組合せによって、プリパスタチン類と新規なアグラスタチン類との混合物であるとして決定した。広範囲のNMRのデータをまた、新規な化合物のうちの１つ（HPLCピーク20）について回収し、アグラスタチンＡと称した。アグラスタチンＡは、以下のアミノ酸を含むことが見出された：Thr；3Glu；Pro；Ala；Val；２Tyr；およびOrn。これは、Va lの存在およびIleの欠損によって、プリパスタチンＡからの差異を生じる。アグラスタチンＡの分子量は、1448であると決定され、これは以下の構造に対応する：脂肪酸部位の直鎖の性質を、¹H NMRによって確認した。環式ペプチドにおけるアミノ酸の部位を、TOCSYおよびROESYデータセットの詳細な分析によって決定した。アグラスタチンＢ（HPLCピーク26）の質量分析およびアミノ酸分析は、この構造がプリパスタチンＢ２に類似し、Ala残基のValへの置換を伴う。構造は以下である：実施例５インビトロ培養（96ウェルプレート）における植物病原体に対するAQ713の活性 AQ713が、真菌、Phytophthora infestans、Pythium ulitimum、Botrytis cine rea、Rhizoctonia solani、Alternaria solaniに対して有効であるか否かを決定するために、以下の実験を行った。96ウェルプレート（平底、400μl/ウェル、N unc商標）を、寒天培地（ポテトデキストロース寒天）（PDA、Difco）で充填した。Phytophthora infestans培養物を、３日間、液体YPG-1培地（0.4g酵母、0.1 % KH₂PO、0.5% MgSO₄×７H₂O、1.5% グルコース）で増殖した。他の真菌について、胞子をペトリディッシュの表面から掻きとり、そして脱イオン水の0.1〜0.2 mLアリコートおよび病原体の胞子懸濁液（濃度約２×10⁶胞子/mL）を寒天上に広げた。 AQ713を、実施例２において記載するように、培地２および３中で、72時間増殖した。上清を得るために、全ブロス培養物を、5,200rpmで20分間、遠心分離した。真菌植物病原体を、96ウェルプレート上にピペットで加えた（８ウェル／病原体）。真菌増殖の存在または不在を、８ウェルそれぞれについて記録した。約 40μLのAQ713上清または20μLの全ブロスを、各ウェルに添加した。「１」のスコアは、真菌増殖の完全な阻害を意味する。「４」のスコアは、真菌増殖の阻害がなかったことを示す。結果を、表６において示す。表６：真菌増殖のインビトロ阻害（96ウェルプレート）結果は、AQ713が、インビトロでの広範な殺真菌スペクトルを有すること、および全ブロスおよび上清の両方が、非常に活性であることを示す。培地３における上清は、Rhizoctonia solaniに対して活性であったが、培地２における上清は活性でなかった。実施例６インビトロ培養における植物病原体に対するAQ713の活性（領域アッセイ）寒天分散（領域）アッセイにおけるAQ713の活性を決定するために、植物病原体の胞子を、10cmペトリディッシュ中のポテトデキストロース寒天の表面上に広げた。7.0mmウェルを、寒天から取り出し、そして培地２中で増殖したAQ713の上清の100μLサンプルをウェル中においた。上清を、4200rpmで40分間遠心分離することによって調製した。次いで、上清を、4200rpmで、さらに40分間、再度スピンした。典型的な結果は、ウェルの周囲の病原体の増殖のないおよび／または減少された増殖の領域からなった。領域のミリメートル（mm）の大きさを測定し、そして記録した。結果を、表７において示す。表７：真菌植物病原体増殖のインビトロ阻害（領域試験）実施例７細菌植物病原体に対するAQ713の活性標準的な寒天分散アッセイを、実施例６のように設定した。各細菌病原体のローンをペトリプレートの表面にわたって広げた。培地２中で増殖したAQ713全ブロスの100μLを、各ウェルにおいた。領域の大きさを、mmで測定した。表８：細菌植物病原体のインビトロ阻害（領域試験） AQ713は、インビトロで試験した細菌植物病原体の全ての種に対して活性であった。実施例８植物試験における植物病原体に対するAQ713の活性 AQ713の活性を、マメおよびゼラニウムの葉において、灰色カビ菌、Botrytisc inerea、トマト苗木におけるAlternaria solani、およびレタスのベト病、Brem ia lactucae、に対して試験した。 A.solaniについて、６パックにおいて植えた２〜３葉期のトマト種子を、AQ71 ３全ブロス（培地２）で、ランオフに噴霧した。噴霧後、苗木を、乾燥させた（約1.5時間）。次いで、苗木を、5.0×10⁴胞子/mLで噴霧した。苗木を、プラスチックの円蓋で覆い、そして28℃で、Percivalインキュベーター中に放置した。病原体の胞子を含有するかまたは含有しない、AQ713を含有しない水を、ネガティブコントロールおよびポジティブ病原体コントロールとして使用した。４日後、試験を読み取った。水A.solaniコントロールにおいて、葉面一面に均一の病変が存在し、子葉は剥離され、そして重篤に感染された（５の評価＝完全な感染、制御なし）。AQ713処理した植物は、本葉において分散する数個の軽度の病変を有した。子葉は付着されたが、いくつかの小さな病変を伴った（１の評価）。ネガティブコントロールは感染されなかった。二次試験を、円蓋下に置き、上述のように保存した、水で充填されたメーゾンジャー中に配置された分離したトマト苗木（圃場レベルで茎を折った）を使用してセットアップした。植物を、上述のように噴霧し、そしてA.solaniの症状を、その後４日間に記録した。ネガティブコントロールにおいて症状はなかった。ポジティブコントロールにおいて、苗木一面に均一の病変が存在した。AQ713処置を、１と評価した（病変がほとんどないかまたは病変なし）。２日後、ポジティブコントロールにおける植物は破壊されたが、AQ713処理した苗木は、実質的に無傷であり、ネガティブコントロール（水を噴霧した植物）と同じように見えた。 Botrytis cinereaに対する試験について、マメ植物の第１の本葉を、13×100 培養チューブの口を、各葉上に押し付けることによって傷つけた。各葉は、葉あたり２つの傷を受けた。葉を、AQ713全ブロス（培地２）または水単独もしくは病原体単独で、噴霧した。乾燥した時に、これらを再度、B.cinerea胞子（0.8× 10⁶胞子/mL）で噴霧した。葉を、プラスチックの円蓋で覆った平面に置き、そしてPercivalインキュベーター中で18〜20℃で保存した。５日後、ポジティブコントロール（病原体単独）は、約25mmの直径の面積において腐敗した。ネガティブコントロール（水単独）は、腐敗を有しなかった。AQ713は、葉が傷つけられた８つの円のうちの７つにおいて感染を示さなかった。感染された１つは、円のまわりの２つの位置で、軽度の感染を有した。 Bremia試験について、レタス種子を、約８cm高および幅の小さな透明なプラスチックの植物飼育容器において、ピート、パーライト、およびバーミキュライトを含有する、滅菌した鉢植え混合土の層に植えた。レタスが発芽した後（１週）、レタス苗木を、AQ713ブロスまたは上清サンプルで噴霧した。植物を乾燥させ、次いで、感染されたレタス苗木からのベト病胞子懸濁液を、苗木上に噴霧した。プラスチック覆いを、植物上に置き、そしてPercivalインキュベーターにおいて18〜20℃で、インキュベートした。１週間後、試験を評価した。AQ713は、レタス苗木において、Bremiaから、ベト病を防止しなかった。実施例９植物疾病に対するAQ713の効力（温室試験）ブドウベト病 AQ713を、400リットル発酵器において、48時間、ダイズベースの培地中で増殖した。ブドウ植物（品種Chardonnay）を、手持ち噴霧器を用いて、滅菌水で0.5 ×および0.25×濃度に希釈された400リットル発酵物からの全ブロスで、ランオフに噴霧した。葉が乾燥した場合、植物に、二回の噴霧をした。乾燥後、植物を、ブドウベト病を引き起こす病原体、Plasmopara viticolaで接種した。３つの植物を、各用量について試験した。各植物を、０〜100％制御の規模に基づいて、疾病制御のパーセントを見積ることによって、評価した。100％制御は、植物が可視的な病変を有さない。化学殺真菌剤の、メタラキシル（metalaxyl）を、比較のために使用した。結果は、以下のようであった： AQ713 0.5×全ブロス 97.7%制御 AQ713 0.25×全ブロス 100%制御メタラキシル30ppm 100%制御メタラキシル10ppm 98.3%制御メタラキシル１ppm 80%制御結果は、AQ713が、化学殺真菌剤と同様に、ブドウベト病の制御を達成したことを実証する。実施例１０カボチャウドンコ病に対するAQ713の効力 AQ713を、400リットル発酵器において、48時間、ダイズベースの培地中で増殖した。カボチャ植物（CrookneckおよびAcorn）を、手持ち噴霧器を用いて、400 リットル発酵物からの全ブロスおよび滅菌水で0.5×濃度に希釈されたサンプルで、ランオフに噴霧した。乾燥後、植物を、カボチャウドンコ病菌、Spheaeroth eca fuligineaで接種した。２つの植物を、各用量について処置した。全ブロスの噴霧乾燥した粉末をまた試験した。400リットル発酵ブロスを、噴霧乾燥して、水を除去した。10%および2.5%噴霧乾燥した粉末溶液を、上述のように、ランオフに植物において噴霧した。ウドンコ病の発病を、０から５のスコアに評価した。５評価は、100%疾病であり、一方０評価は、疾病なしである。結果を、以下の表９において示す。表９ AQ713全ブロスおよび噴霧乾燥した粉末は、カボチャウドンコ病のほぼ完全な制御を提供した。実施例11 温室における疫病、灰色カビ病、ブドウウドンコ病、穀類ウドンコ病、葉鞘枯れ病、およびイネ葉枯れ病に対するAQ713の効力 AQ173を、72時間、250mL振とうフラスコにおいて、ダイズベースの培地中で増殖した。疾病、原因となる病原体、および宿主を、以下の表10において列挙する。この全ブロス培養物を、以下の表11に示されるように、植物に対して試験した。表１０各ブロスを、手持ち噴霧器を使用して、試験植物に対して、１×濃度で、ランオフに噴霧し、乾燥させ、次いで、二回目の噴霧を行った。３つの植物を、各疾患および処理について試験した。乾燥後、植物を、病原体で接種した。各植物を、０〜100%制御の規模に基づいて、疾患制御のパーセントを見積ることによって評価した。100％コントロールとは、可視的病変部を有さない植物をいう。化学的な殺真菌剤を、比較のために使用した。疾病の指標は、未処置コントロールに対する疾病の重篤度である。表１１AQ713は、試験した全ての病原体に対して、化学殺真菌剤に等しい活性を示した。実施例12 アブラナ属植物ベト病に対するAQ173の効力 Bacillus株AQ713を、10リットルの発酵器において、ダイズベースの培地中で、48時間、増殖した。１×強度での全ブロス培養物を、圧縮空気によって供給される画家のエアブラシを使用して、３つの１週齢のカリフラワーおよび完全子葉期での芽キャベツ植物上に、噴霧した。15〜25個の苗木／ポットの３反復実験物を、処置当たり噴霧した。Quadris^TM（Zenecaからのアゾキシストロビン（azoxy strobin）殺真菌剤）をまた、250ppmおよび125ppmの比率で、植物（処置あたり３個体）に対して噴霧した。AQ713およびQuadris噴霧が乾燥した後に、１〜５× 10⁴胞子/mLで、ベト病菌、Peronospora parasiticaの胞子懸濁液を、アブラナ属植物上に噴霧した。植物を、15〜17℃に、24時間、感染のために保持し、次いで、苗木を、20〜24℃で、６日間、インキュベートした。ポットを、15〜17℃に、一晩戻して、試験が評価されるまで病原体を胞子形成させた。各植物を、０〜10 0%制御の規模に基づいて、疾病制御のパーセントを見積ることによって、評価した。100%コントロールは、胞子形成病変を伴わない植物である。反復実験のポットで平均される結果を、以下の表12において示す。表１２ AQ713は、３週間持続して、効果的にベト病を制御した。実施例13 AQ713および市販の殺真菌剤の相乗効果 AQ713を、10リットルの発酵器において、ダイズベースの培地中で、72時間、増殖した。細菌培養物を、滅菌水で、0.5×および0.25×濃度に希釈した。１× 、0.5×、および0.25×濃度で、培養物を、圧縮空気によって供給される画家のエアブラシを使用して、３つの１週齢のトウガラシ植物上に、噴霧した。３個体の植物を、処置当たり噴霧した。Quadris^TM（Zenecaからのアゾキシストロビン殺真菌剤）をまた、500ppm、250ppmおよび150ppmの濃度で、植物（処置あたり３個体）に対して噴霧した。さらに、１：１の比率におけるQuadris＋AQ713の全ブロス培養物の組合せを、トウガラシ植物上に噴霧した（処置あたり３個体）。Qu adrisを伴うおよび伴わない処理を、以下の表13において概説する。１×10⁶胞子 /mLでの、Botrytis cinerea、灰色カビ菌の胞子懸濁液を、AQ713およびQuadris 噴霧が乾燥した後に、トウガラシ植物上に噴霧した。植物を、20〜22℃で、３日間、試験が評価されるまで保持した。灰色カビ病の発病を、０〜５のスコアに対して評価した。５評価は、100%疾病を示し、一方０評価は、疾患なしを示す。結果を、以下の表13において示す。表１３結果は明らかに、QuadrisとAQ713との組合わせが、QuadrisまたはAQ713単独のいずれかよりも有意に良好に、灰色カビ病を制御することを示す。

【手続補正書】【提出日】平成１２年６月５日（２０００．６．５）【補正内容】請求の範囲１．Bacillus subtilis株AQ713、NRRLアクセス番号B-21661および該株の全ての同定された特徴を有するそれらの変異体の、生物学的に純粋な培養物。２．請求項１に記載のBacillus subtilis株によって生成される代謝物質であって、コーンルートワームに対して活性を示し、溶媒抽出可能であり、および10,0 00ダルトン未満の分子量を有する、代謝物質。３．請求項１に記載のBacillus subtilis株AQ713の培養物から得られる上清であって、抗真菌および抗細菌活性、ならびにコーンルートワームに対する活性を示す、上清。４．請求項１に記載のBacillus subtilis株AQ713の全ブロス培養物、および化学的な抗真菌剤を含有する、組成物。５．請求項１に記載のBacillus subtilis株AQ713の全ブロス培養物、および生物学的または化学的な農薬を含有する、組成物。６．化学的な抗真菌剤をさらに含有する、請求項５に記載の組成物。７．請求項２に記載の代謝物質、および化学的な抗真菌剤を含有する、組成物。８．請求項２に記載の代謝物質、および生物学的または化学的な農薬を含有する、組成物。９．化学的な抗真菌剤をさらに含有する、請求項８に記載の組成物。１０．請求項３に記載の上清、および化学的な真菌剤を含有する、組成物。１１．請求項３に記載の上清、および生物学的または化学的な農薬を含有する、組成物。１２．化学的な農薬をさらに含有する、請求項１１に記載の組成物。１３．真菌および細菌感染、ならびにコーンルートワームの感染から、植物および果実を防御または処理するための方法であって、請求項１に記載のBacillus s ubtilis株の有効量を適用する工程を包含する、方法。１４．真菌および細菌感染、ならびにコーンルートワームの感染から、植物および果実を防御または処理するための方法であって、請求項２に記載の代謝物質の有効量を適用する工程を包含する、方法。１５．真菌および細菌感染、ならびにコーンルートワームの感染から、植物および果実を防御または処理するための方法であって、請求項３に記載の上清の有効量を適用する工程を包含する、方法。１６．真菌および細菌感染、ならびにコーンルートワームの感染から、植物および果実を防御または処理するための方法であって、請求項４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２に記載の組成物の有効量を適用する工程を包含する、方法。１７．請求項１３、１４、または１５に記載の方法であって、前記感染が、Phyt ophthora infestans、Rhizoctonia solani、Pythium ultimum、Botrytis ciner ea、Alternaria solani、Colletotrichum cocodes、Alternaria brassicicola、 Cladosporium cucumerinum、Monilinia fructicola、Venturia pyrina、Acidovo rax avenae、Pseudomonas syringae、Xanthomonas campestris、Erwinia caroto vora、Clavibacter michiganense、Plasmopara viticola、Sphaerotheca fuligi n ea、Uncinula necator、およびPeronospora parasiticaからなる群より選択される少なくとも１つの微生物によって引き起こされる、方法。１８．請求項１６に記載の方法であって、前記感染が、Phytophthora infestans 、Rhizoctonia solani、Pythium ultimum、Botrytis cinerea、Alternaria sola ni、Colletotrichum cocodes、Alternaria brassicicola、Cladosporium cucume rinum、Monilinia fructicola、Venturia pyrina、Acidovorax avenae、Pseudom onassyringae、Xanthomonas campestris、Erwinia carotovora、Clavibacter mi chiganense、Plasmopara viticola、Sphaerotheca fuliginea、Uncinula necato r、およびPeronospora parasiticaからなる群より選択される少なくとも１つの微生物によって引き起こされる、方法。１９．請求項１３に記載の方法であって、前記Bacillus subtilis株AQ713が、全ブロス培養物として適用される、方法。２０．請求項１３に記載の方法であって、前記Bacillus subtilis株AQ713が、上清として適用される、方法。２１．請求項１９に記載の方法であって、前記Bacillus subtilis株AQ713が、湿潤性粉末、顆粒、流動物、またはマイクロカプセル化物として適用される、方法。２２．請求項２０に記載の方法であって、前記Bacillus subtilis株AQ713が、湿潤性粉末、顆粒、流動物、またはマイクロカプセル化物として適用される、方法。２３．請求項１３、１４、または１５に記載の方法であって、植物の根または該根の周囲の土壌が処理される、方法。２４．請求項１６に記載の方法であって、植物の根または該根の周囲の土壌が処理される、方法。２５．Ａ型iturin、plipastatin、およびsurfactin を含有する、組成物。２６．さらにagrastatinを含有する、請求項２５に記載の組成物。２７．殺虫性の活性を有する株AQ713から単離された、surfactinリポペプチド。２８．真菌および細菌感染ならびにコーンルートワーム感染から、植物および果実を防御または処理するための方法であって、該方法は、以下の式：を有する化合物の有効量を適用する工程を包含し、ここでR₁は、C₈〜C₂₀の分枝鎖または直鎖の脂肪族側鎖であり；R₂は、アセテートまたはエステル誘導体であり；Ｘは、AlaまたはValであり、そしてGlxは、Gln またはGluである、方法。２９．真菌および細菌感染ならびにコーンルートワーム感染から、植物および果実を防御または処理するための方法であって、以下の式：を有する化合物の有効量を適用する工程を包含する、方法。３０．真菌および細菌感染ならびにコーンルートワーム感染から、植物および果実を防御または処理するための方法であって、Ａ型iturin、plipastatin、およびsurfactinを含有する組成物の有効量を適用する工程を包含する、方法。３１．さらにagrastatinの有効量を適用する工程を包含する、請求項３０に記載の方法。３２．殺虫性の活性を有する株AQ713から単離された、リポペプチド抽出物。３３．昆虫の感染から、植物または果実を処理または防御するための方法であって、請求項２７に記載の抽出物を含む組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。３４．昆虫の感染から、植物または果実を処理または防御するための方法であって、請求項３３に記載のsurfactinを含む組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。３５．請求項３３に記載の方法であって、前記組成物を、植物の根または該根の周囲の土壌に適用する方法。３６．請求項３４に記載の方法であって、前記組成物を、植物の根または該根の周囲の土壌に適用する、方法。３７．以下の式：の化合物であって、ここでR₁は、C₈〜C₂₀の分枝鎖または直鎖の脂肪族側鎖であり；R₂は、アセテートまたはエステル誘導体であり；そしてGlxは、GlnまたはGluである、化合物。３８．以下の式を有する化合物：３９．真菌および細菌感染ならびにコーンルートワーム感染に対して活性を有する上清を単離する方法であって、請求項１に記載の培養物を増殖する工程および該培養物から上清を単離する工程を包含する、方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:125） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＡＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ジメネズ，デスモンドリトアメリカ合衆国カリフォルニア 95695, ウッドランド，ペンダーガストストリート９ (72)発明者マッコイ，ランディージャイアメリカ合衆国カリフォルニア 95616, デイビス，ブレトンアベニュー 3212 (72)発明者オージャラ，ジミーエンショアメリカ合衆国カリフォルニア 95616, デイビス，ロラードドライブ 2905 (72)発明者マローネ，パメラジィー. アメリカ合衆国カリフォルニア 95616, デイビス，ビクトリア 3333

Claims

【特許請求の範囲】１．Bacillus subtilis株AQ713、NRRLアクセス番号B21661およびその変異体の、単離された、純粋な培養物。２．請求項１に記載のBacillus subtilisによって生成される代謝物質であって、コーンルートワームに対して活性を示し、溶媒抽出可能であり、および10,000 ダルトン未満の分子量を有する、代謝物質。３．請求項１に記載のBacillus subtilis株AQ713の培養物から得られる上清であって、抗真菌および抗細菌活性、ならびにコーンルートワームに対する活性を示す、上清。４．請求項１に記載のBacillus subtilis株AQ713の全ブロス培養物、および化学的な抗真菌剤を含有する、組成物。５．請求項１に記載のBacillus subtilis株AQ7l3の全ブロス培養物、および生物学的または化学的な農薬を含有する、組成物。６．化学的な抗真菌剤をさらに含有する、請求項５に記載の組成物。７．請求項２に記載の代謝物質、および化学的な抗真菌剤を含有する、組成物。８．請求項２に記載の代謝物質、および生物学的または化学的な農薬を含有する、組成物。９．化学的な抗真菌剤をさらに含有する、請求項８に記載の組成物。１０．請求項３に記載の上清、および化学的な真菌剤を含有する、組成物。１１．請求項３に記載の上清、および生物学的または化学的な農薬を含有する、組成物。１２．化学的な農薬をさらに含有する、請求項１１に記載の組成物。１３．真菌および細菌感染、ならびにコーンルートワームの感染から、植物および果実を防御または処理するための方法であって、請求項１に記載のBacillus s ubtilis株の有効量を適用する工程を包含する、方法。１４．真菌および細菌感染、ならびにコーンルートワームの感染から、植物および果実を防御または処理するための方法であって、請求項２に記載の代謝物質の有効量を適用する工程を包含する、方法。１５．真菌および細菌感染、ならびにコーンルートワームの感染から、植物および果実を防御または処理するための方法であって、請求項３に記載の上清の有効量を適用する工程を包含する、方法。１６．真菌および細菌感染、ならびにコーンルートワームの感染から、植物および果実を防御または処理するための方法であって、請求項４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２に記載の組成物の有効量を適用する工程を包含する、方法。１７．請求項１３、１４、または１５に記載の方法であって、前記感染が、Phyt ophthora infestans、Rhizoctonia solani、Phythium ultimum、Botrytis cine rea、Alternaria solani、Colletotrichum cocodes、Alternaria brassicicola 、Cladosporium cucumerinum、Monilinia fructicola、Ventruria pyrina、Acid ovorax avenae、Pseudomonas syringae、Xanthomonas campestris、Erwinia car otovora、Clavibacter michiganense、Plasmopara viticola、Sphaerotheca ful ig inea、Uncinula necator、およびPeronospora parasiticaからなる群より選択される少なくとも１つの微生物によって引き起こされる、方法。１８．請求項１６に記載の方法であって、前記感染が、Phytophthora infestans 、Rhizoctonia solani、Phythium ultimum、Botrytis cinerea、Alternaria sol ani、Colletotrichum cocodes、Alternaria brassicicola、Cladosporium cucum erinum、Monilinia fructicola、Ventruria Pyrina、Acidovorax avenae、Pseudo monas syringae、Xanthomonas campestris、Erwinia carotovora、Clavibacter michiganense、Plasmopara viticola、Sphaerotheca fuliginea、Uncinula neca tor、およびPeronospora parasiticaからなる群より選択される少なくとも１つの微生物によって引き起こされる、方法。１９．請求項１３に記載の方法であって、前記Bacillus subtilis株AQ713が、全ブロス培養物として適用される、方法。２０．請求項１３に記載の方法であって、前記Bacillus subtllis株AQ713が、上清として適用される、方法。２１．請求項１９に記載の方法であって、前記Bacillus subtilis株AQ713が、湿潤性粉末、顆粒、流動物、またはマイクロカプセル化物として適用される、方法。２２．請求項２０に記載の方法であって、前記Bacillus subtilis株AQ713が、湿潤性粉末、顆粒、流動物、またはマイクロカプセル化物として適用される、方法。２３．請求項１３、１４、または１５に記載の方法であって、植物の根または該根の周囲の土壌が処理される、方法。２４．請求項１６に記載の方法であって、植物の根または該根の周囲の土壌が処理される、方法。２５．以下の式：を含有する化合物であって、ここでR₁は、C8〜C20の分枝鎖または直鎖の脂肪族側鎖であり；Ｘは、Valであり、R₂は、酢酸またはエステル誘導体であり、およびGlxは、GlnまたはGluである、化合物。２６．以下の式：を含有する、化合物。２７．以下の式：を含有する、化合物。２８．Ａ型iturin、plipastatin、surfactantおよびagrastatinを含有する、組成物。２９．真菌および細菌およびコーンルートワーム感染から、植物および果実を防御または処理するための方法であって、請求項２５、２６、２７、または２８に記載の組成物の有効量を適用する工程を包含する、方法。３０．請求項２９に記載の方法であって、前記感染が、Phytophthora infestans 、Rhizoctonia solani、Phythium ultimum、Botrytis cinerea、Alternaria sol ani、Colletotrichum cocodes、Alternaria brassicicola、Cladosporium cucum erinum、Monilinia fructicola、Ventruria pyrina、Acidovorax avenae、Pseud om onas syringae、Xanthomonas campestris、Erwinia carotovora、Clavibacter m ichiganense、Plasmopara viticala、Sphaerotheca fuliginea、Uncinula necat or、およびPeronospora parasiticaからなる群より選択される、少なくとも１つの微生物によって引き起こされる、方法。３１．植物を、コーンルートワーム感染から防御または処理するための方法であって、請求項２５、２６、２７、または２８に記載の組成物の有効量を、植物の根または該根の周囲の土壌に適用する工程を包含する、方法。