CN105357970A - 芽孢杆菌种的生物质和代谢物的生产方法及其用于生物害虫防治的组合物 - Google Patents

芽孢杆菌种的生物质和代谢物的生产方法及其用于生物害虫防治的组合物 Download PDF

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瓦勒斯卡·比列加斯·埃斯科瓦尔
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约翰·杰罗·米拉·卡斯蒂略
杰米·安德烈·古铁雷斯·蒙萨尔韦
胡安·荷西·阿罗亚韦·托罗
路易莎·费尔南达·波萨达·乌里韦
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Abstract

本发明涉及一种用于增加芽孢杆菌种微生物的生物质和代谢物生产的方法。获得的代谢物为丰原素、表面活性肽和伊枯草菌素家族的脂肽化合物，其表现出抗微生物活性。本发明还包括包含枯草芽孢杆菌EA-CB0015、解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959和/或其代谢物的生物杀伤组合物，单独的或是与其它生物杀伤剂一起，以及这些组合物在治疗多种作物中由各种植物致病剂包括斐济球腔菌所引起的疾病中的应用。

Description

芽孢杆菌种的生物质和代谢物的生产方法及其用于生物害虫防治的组合物
技术领域
本发明涉及一种增加包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的芽孢杆菌种的生物质和代谢物的生产的方法。该方法包括适宜的培养基和特定的环境条件，使得能够生产大量的丰原素、表面活性肽和伊枯草菌素家族的生物质和代谢物，其表现出对各种植物致病剂的抗真菌及抗细菌活性。
背景技术
在用于生物防治的微生物中，芽孢杆菌种属的细菌受到广泛关注，因为它们能产生多种多样的抗生素化合物、保存期限长、培养时生长迅速、以及它们能够在叶面大量繁殖[1,2,3,4]。尤其是，特定种类的芽孢杆菌例如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、蕈状芽胞杆菌(Bacillusmycoides)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)及苏云金芽孢杆菌(Bacillusthurigiensis)显示出抗微生物活性[4]。
这些细菌的抗微生物活性源于它们产生表面活性肽、伊枯草菌素和丰原素家族的脂肽的能力，这些脂肽的氨基酸序列及脂肪酸链的分支不同。表面活性肽表现出高的抗细菌活性，而伊枯草菌素和丰原素则因其抗真菌活性为人所知[4]。
现有技术描述了使用枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌在多种作物中控制各种致病微生物，上述作物包括水果和蔬菜作物例如黑莓、葡萄、覆盆子、草莓、西红柿、黄瓜、黑胡椒、橙、哈密瓜、苹果、桃、番荔枝、香蕉、木瓜、芒果和猕猴桃。
EP2311936公开了一种枯草芽孢杆菌菌株KS1(NITEBP-569)作为生物控制剂在藤木植物中抵抗几种植物病原微生物。WO98/21968公开了枯草芽孢杆菌AQ153(ATCC55614)产生的一种抗生素，其能有效对抗细菌和真菌感染，并且也可以作为用于保护植物的方法，其包含这些抗生素化合物的应用。
WO9850422和WO0029426公开了枯草芽孢杆菌菌株AQ713(NRRLB21661)及其突变体产生的其它抗生素化合物，其显示出杀虫、抗真菌和抗细菌活性。WO9909819公开了枯草芽孢杆菌菌株AQ713(NRRLNo.21665)的抗生素，其产生具有杀虫活性的代谢物及一种高分子量的可溶于水的代谢物，其显示出对抗玉米根虫和其它线虫的杀虫及杀线虫活性。
US2011/0318386描述了通过使用芽孢杆菌属的生物控制剂诱导针对各种病原体的系统抗性，特别是分离的摩加夫芽孢杆菌(B.mojavensis)203-7和分离的蕈状芽胞杆菌。接着ES2345969描述了一种用于香蕉和大蕉假茎(plantainpseudostems)的植物强化剂(phytostrengthener)，其包括枯草芽孢杆菌、绿色木霉菌(Trichodermaviride)和巨大芽孢杆菌解磷变种(B.megateriumvarphosphaticum)。
US2012/00031999公开了一种针对各种真菌病害，包括香蕉的黑叶斑病的控制策略，基于应用合成的杀真菌剂和一些生物控制微生物及其代谢物(特别是枯草芽孢杆菌菌株QST713，对应于商用产品的菌株)。
现有技术中公开的芽孢杆菌种的微生物的生产过程中，其生产的生物质的量非常低，因为所获得的细胞密度一般不大于5.0克/升[8,9]。因此，有必要开发新的方法以增加生物质及其活性代谢物的产量。
类似的，有必要从这些微生物和/或其生物活性代谢物中开发出具有更高效力和选择性的生物杀伤组合物，用于在各类作物上控制不同的植物致病剂。
附图说明
图1示出了枯草芽孢杆菌EA-CB0015生产的丰原素C的结构。
图2示出了枯草芽孢杆菌EA-CB0015在不同培养基中的细胞密度。
图3示出了枯草芽孢杆菌EA-CB0015的化合物的HPLC色谱图。
图4示出了枯草芽孢杆菌EA-CB0015的P5纯化的脂肽(m/z1429.9)的MS/MS图谱。
图5示出了枯草芽孢杆菌EA-CB0015的内酯环经碱水解后，P5纯化的脂肽(m/z1447.8)的MS/MS图谱。
图6示出了枯草芽孢杆菌EA-CB0015在各种培养基中生产的脂肽的曲线下面积。
图7示出了枯草芽孢杆菌EA-CB0015对各种植物病原性微生物产生的抑制百分比。
图8示出了在不同培养基中获得的枯草芽孢杆菌EA-CB0015CFS所产生的斐济球腔菌(Mycosphaerellafijiensis)的生长抑制百分比。
图9示出了包含在本发明的各种组合物中的枯草芽孢杆菌EA-CB0015的活力。
图10示出了在温室水平用本发明不同组合物处理的香蕉植株的黑叶斑病的严重程度。
图11示出了用本发明不同组合物处理的香蕉叶的黑叶斑病造成的坏死面积百分比。
图12示出了各种辅助紫外线(UV)保护剂对枯草芽孢杆菌EA-CB0015的活力的影响。
图13示出了各种助剂对基于枯草芽孢杆菌EA-CB0015的组合物(MH2O和P2)的粘附的影响。
图14示出了基于枯草芽孢杆菌EA-CB0015的水基的混合物组分在温室水平对香蕉叶的坏死面积百分比的影响。
图15示出了感染黑叶斑病的香蕉叶用各种产品处理后的照片。
图16示出了基于枯草芽孢杆菌EA-CB0015的水基组合物在实地水平对香蕉黑叶斑病严重性的影响。
图17示出了枯草芽孢杆菌EA-CB0015对灰霉病菌(Botrytiscinerea)EAHP-009在绒球菊花中导致的疾病的严重性的影响。
图18示出了枯草芽孢杆菌EA-CB0015在树番茄(木本番茄，Cyphomandrabetacea)中对炭疽菌的效果。
发明内容
本发明允许解决这些或其它的缺点，因为其包含增加芽孢杆菌属微生物的生物质及其生物活性代谢物，例如表面活性肽、伊枯草菌素和丰原素家族的脂肽的生产的方法，芽孢杆菌属微生物包括枯草芽孢杆菌EA-CB0015和解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959。
此外，本发明还包含农用化学品组合物，其包括不同芽孢杆菌种的微生物和/或其活性代谢物，单独的或是与生物杀伤剂一起，用于控制所述植物致病剂，例如斐济球腔菌、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)、灰霉病菌、炭疽病菌、念珠菌属(Moniliasp.)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)和腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)。不同枯草芽孢杆菌种的微生物包括枯草芽孢杆菌EA-CB0015和解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959。
本发明还涉及包括枯草芽孢杆菌EA-CB0015和解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959的芽孢杆菌种的微生物的使用，，和/或其活性代谢物以及含有它们的农用化学品组合物的使用，用于抑制农作物中植物病原微生物例如斐济球腔菌的生长。
具体实施方式
为了增加芽孢杆菌种微生物的生物质及其代谢物(脂肽)的生产，该微生物必须培养于适宜的介质并在增加生物质及其代谢物的生产所必须的环境条件下培养。为此，制备培养基(以下称为培养基D)，包括选自由固体、半固体或液体基质形式的碳水化合物、酵母提取物、硫酸铵、蛋白胨、含镁、硫、锰、氯、钾、磷、钙和钠的盐组成的组的一种或多种组分。
实现本发明的方法所必须的环境条件包括温度、pH、搅拌速度、发酵时间及通气。本发明的方法可以在实验室以小规模进行，或是在生物反应器中以大规模进行。
在一个优选实施方式中，培养基D包括，以质量/体积(w/v)百分比计，3.2％至3.4％的葡萄糖、3.1％至3.3％的酵母提取物、2.5x10-3％至4.5x10-3％的硫酸锰、2x10-3％至4x10-3％的氯化钙、0.08％至0.12％的硫酸铵、0.35％至0.45％的硫酸镁、0.04％至0.12％的磷酸二钠以及0.04％y0.12％的磷酸单钠钾。
在本发明另一个更优选的实施方式中，培养基D包括，以质量/体积(w/v)百分比计，3.34％的葡萄糖、3.25％的酵母提取物、4.2x10-3％的硫酸锰、3.1x10-3％的氯化钙、0.1％的硫酸铵、0.4％的硫酸镁、0.05％的磷酸二钠钾、0.05％的磷酸单钠钾。
在本发明的方法的一个优选实施方式中，微生物的培养周期为24至96小时，伴随搅拌速度为400至600rpm，通气1至5vvm，温度在20℃至40℃之间，pH在5.5至7.5之间。强酸例如硫酸和/或强碱例如氢氧化钠可用于控制和/或调节pH。还可添加表面活性剂和止泡剂以控制泡沫形成。
在上述条件下实施的方法，能够增加芽孢杆菌种微生物的生物质和活性代谢物的生产。通过本发明的方法获得的生物质可使用常规的离心或微量过滤方法从培养基中分离，而活性代谢物可通过溶剂萃取、沉淀、吸附或色谱法获得。
在本发明一个优选实施方式中，获得的芽孢杆菌种微生物的生物质的量的范围在3.0至20.0g/L之间，优选为7.0至18.0g/L之间，而代谢物的浓度的范围在200至1500mg/L之间，优选为500至1000mg/L之间。
在一个优选实施方式中，本发明的方法能够增加枯草芽孢杆菌EA-CB0015和解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959的生物质和活性代谢物的生产。16SrDNA分析鉴定证实枯草芽孢杆菌EA-CB0015对应于SEQIDNO：1序列，其以登录号KC006063储存在GenBank中。
通过本发明的方法获得的枯草芽孢杆菌EA-CB0015和解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959的代谢物包括表面活性肽、伊枯草菌素和丰原素类型的脂肽。通过质谱法和色谱技术的分析鉴定出一种由枯草芽孢杆菌EA-CB0015生产的新的丰原素亚型，称为丰原素C，其氨基酸序列为(Glu1-Orn2-Tyr3-THR4-Glu5-Val6-Pro7-Gln8-Thr9-Ile10)，在位置9不同于丰原素B序列，在位置6和9不同于丰原素A序列。
此外，按照本发明的方法用于枯草芽孢杆菌EA-CB0015，该菌株能生产14种不同的丰原素C同源物，通式为R-Glu1-Orn2-Tyr3-Thr4-Glu5-Val6-Pro7-Gln8-Thr9-Ile10，根据14至18个碳原子的饱和或不饱和烃链(R)的大小而异。图1示出了根据本发明的方法由枯草芽孢杆菌EA-CB0015生产的各种丰原素的结构。
丰原素C的各种同源物，以及表面活性肽和伊枯草菌素，可通过常规技术例如高效液相色谱法(HPLC)进行分离。生产的表面活性肽对应于具有13至16个碳原子烃链长度的不同的同源物；伊枯草菌素对应于具有14和15个碳原子的伊枯草菌素A。
至于解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959，通过本发明的方法生产的代谢物对应于各种表面活性肽同源物(C12至C15)、两种伊枯草菌素A同源物(C14和C15)、以及两种丰原素亚型(A和B)，其具有4种丰原素A同源物(C14、C15、C16和C17)和2种丰原素B同源物(C16和C17)。
在本发明的另一方面，通过本发明的方法获得的枯草芽孢杆菌EA-CB0015的生物质或解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959的生物质能抑制各种植物病原体的生长，植物病原体例如斐济球腔菌、灰霉病菌、立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌以及炭疽病菌。这种抑制可以使用双碟等技术测定，包括比较植物病原体培养于含有和不含待评价活性物质的培养基时的生长情况。测得的体外抑制百分比总是高于50％。
实施本发明的方法后，可以从获得的生物质和/或代谢物中制备不同的组合物或者制剂，以生产理化性质稳定的生物杀伤组合物，保证长时间内组合物中微生物的活力和代谢物的活性。
这些组合物可在适宜的密封容器内制备以避免污染。添加生物质和/或其代谢物、助剂及其它成分以得到均匀的混合物。这样得到的最终产品可在适宜的容器中收集，并储存于室温。
在又一方面，本发明涉及包含枯草芽孢杆菌EA-CB0015、解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959和/或其活性代谢物的生物杀伤组合物，单独的或是与其它活性剂一起，以增强生物活性。本发明的生物杀伤组合物可包含一种或多种助剂及农用化学品可接受的载体。
在一个优选实施方式中，本发明的生物杀伤组合物包括80.0至99.9％w/w的浓度为1x107a1x1011CFU/mL的枯草芽孢杆菌EA-CB0015的水性悬液，以及由2.0％至4.0％w/v的羧甲基纤维素钠(CMC)、1.0％至5.0％v/v3M磷酸盐缓冲液(pH5.0)、1.0％至4.0％v/v的甘油、0.25％至0.75％v/v吐温0.25％至0.5％v/vTriton0.01％至1.0％v/v山梨酸钾、0.05％a0.15％/v的黄原胶、0.2％至1.5％w/v的脱脂奶及0.028％至1.0％w/v的二氧化钛组成的混合物。该组合物为白色，pH为4.0至6.5，且粘度为20至80cp。
在一个进一步优选的实施方式中，本发明的生物杀伤组合物还包括化学杀虫剂，例如苯胺基嘧啶、bitartenol、甾醇、苯醚甲环唑、戊唑醇、氟环唑、代森锰锌、百菌清及其它用于生物防治害虫的药剂，以及一种或多种农用化学品可接受的载体中的助剂。
在又一方面，本发明涉及使用芽孢杆菌种微生物，尤其是使用枯草芽孢杆菌EA-CB0015、解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959和/或其代谢物，及其生物杀伤组合物，以抑制植物病原微生物的生长，植物病原微生物例如农作物中的斐济球腔菌、尖孢镰刀菌、青枯病菌、灰霉病菌、炭疽病菌、念珠菌属、立枯丝核菌和腐皮镰刀菌。
在又一方面，本发明涉及治疗植物抵抗由各种植物病原体导致的感染的方法，包括将有效量的芽孢杆菌种微生物施加给植物，尤其是枯草芽孢杆菌EA-CB0015和解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959和/或其代谢物，或者使用含有它们的生物杀伤组合物，单独的或是与其它生物杀伤剂一起使用。
施药可通过喷洒范围从0.1至10升每公顷(L/ha)的剂量来进行，以含合适载体的混合物或与含一种或多种杀虫剂的其它组合物的混合物的形式进行。
以下实施例将进一步对本发明进行说明，然而本发明的概念并不限于此。
实施例
实施例1、获取芽孢杆菌
芽孢杆菌的菌株从香蕉的cv.Granenano和cv.Valery栽培品种以及大蕉的cv.Harton品种中获得。为每个栽培品种选择一个种植园，并设立五个点，使用不重复随机概率抽样在开花前收集三种植株的混合样品。在每个植株编号为2、5和10的树叶上进行取样，每片树叶被分解以选择顶部区域和底部区域。
细菌的分离通过用磷酸盐缓冲液和吐温洗涤以及超声处理样品而进行。采用连续稀释并铺板于TSA表面(胰蛋白胨大豆琼脂，Merck，10％)。对革兰氏阳性细胞进行纯化，培养于芬利菲尔德培养基(FinleyandField'smedium)(150rpm，4天，30℃)，并使之接受热休克(80℃，20分钟)。所有的AEFB(好氧内生芽孢生成细菌)于-80℃储存在TSB(胰蛋白胨大豆肉汤，Merck)和甘油(20％v/v)中，并于每次试验使用前在50％的TSA中活化。
实施例2、获取枯草芽孢杆菌EA-CB0015和解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959的生物质
枯草芽孢杆菌EA-CB0015菌株在50％的TSA中复制并于30℃培养48小时。该菌株的菌落被接种于培养基D，并于30℃及200rpm下培养12小时。该培养物被用作预接种物。用10mL培养基D在50mL烧瓶中进行发酵，温度为30℃，在定轨振荡器中转速为200rpm。每个锥形瓶用1mL调节至OD600值为1的细菌悬液接种，并于生长12小时后获得。获得的枯草芽孢杆菌EA-CB0015的细胞密度高达13.2±1.7g/L。
为了评价本方法在获取枯草芽孢杆菌EA-CB0015的生物质中的表现，将使用本发明的培养基(培养基D)得到的生物质的量与使用CIB、MOLP、芬利菲尔德(FinleyandField's)和TSB培养基得到的生物质的量进行比较。
在本发明的培养基中得到的细胞密度比在芬利菲尔德培养基中得到的细胞密度(0.6±0.1g/L)高29.3倍，比在TSB培养基中得到的细胞密度(2.95±0.4g/L)高4.5倍，比在CIB培养基中得到的细胞密度(3.65±0.8g/L)高3.6倍，比在MOLP培养基中得到的细胞密度(4.1±0.6g/L)高3.2倍，如图2所示。
按照相同的方法，得到解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959的生物质。对于枯草芽孢杆菌EA-CB0015，使用本发明的培养基(培养基D)得到的生物质的量高于使用MOLP和TSB培养基得到的生物质的量。用本发明的培养基获得的细胞密度范围在8.0至10.0g/L之间。
实施例3、提取及测定枯草芽孢杆菌EA-CB0015和解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959的 活性代谢物
从根据实施例2得到的枯草芽孢杆菌EA-CB0015培养物，使用甲醇进行其活性代谢物的提取。随后，使用甲醇作为有机溶剂进行固相萃取(SPE)，活性组分由带有紫外检测器的反相HPLC在波长为214nm处进行纯化。
图3示出了相应的色谱图。16至19分钟间的洗脱峰对应于伊枯草菌素A(图3A)，峰P1至P14(图3B)对应于丰原素C，以及峰P15至P19(图3B)对应于表面活性肽。一些活性代谢物也通过ESI-MS/MS(电喷雾质谱)鉴定，如图4和5所示。
为了评价本方法在获取枯草芽孢杆菌EA-CB0015的两组活性代谢物中的表现，将使用本发明的培养基(培养基D)得到的代谢物的量与使用CIB、MOLP、芬利菲尔德(FinleyandField's)和TSB培养基得到的代谢物的量进行比较。如图6所示，当在过程中使用本发明的培养基D时，峰面积及得到的代谢物的量更高。
按照与前述相同的提取和HPLC纯化步骤，对解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959生产的代谢物进行鉴定，对应于各种表面活性肽同源物(C12和C15)，两种伊枯草菌素A同源物(C14和C15)，以及两种丰原素亚型(A和B)，其具有4种丰原素A同源物(C14、C15、C16和C17)和2种丰原素B同源物(C16和C17)。
实施例4、评价枯草芽孢杆菌EA-CB0015和解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959对植物病原 微生物的活性
使用环法对抗真菌活性进行评价。简言之，在含马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)的陪替氏培养皿(Petridish)(直径为9cm)中制作枯草芽孢杆菌EA-CB0015的圆形印记(直径为6cm)，然后将真菌(生长了10天)的盘(直径为5mm)置于其中心。仅使用真菌盘接种的陪替氏培养皿作为绝对对照(absolutecontrol)，当真菌的生长达到细菌所形成的圆的直径时，测量径向菌丝生长。
实验具有完全随机的单变量的设计，每个处理重复三次。建立的响应变量为菌丝生长抑制百分比，其根据绝对对照的生长作为100％进行计算。如图7所示，枯草芽孢杆菌EA-CB0015产生的抑制百分比在盘多毛孢属(Pestalotiasp.)上约为20％，在荚腐病菌(Moniliophthoraroreri)上约为80％。
此外，枯草芽孢杆菌EA-CB0015还表现出对各种微生物的抗细菌活性，包括青枯病菌，在BGTA培养基中产生高达6毫米的抑制区。对青枯病菌的定量拮抗试验通过在BGTA琼脂表面接种100μL的青枯病菌悬液进行，青枯病菌悬液调节至106CFU/mL。然后，将枯草芽孢杆菌EA-CB0015的TSA盘(5mm)于30℃培养48小时。最后，在72小时之后测定产生的抑制区。
按照与上述相同的方法，评价解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959对尖孢镰刀菌、斐济球腔菌和青枯病菌的活性，分别为抑制百分比58.5％和76％，及抑制半径10.9mm。
实施例5、评价枯草芽孢杆菌EA-CB0015和解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959对斐济球腔 菌的活性
为了选择拮抗细菌，使用Peláez2006[10]的改良方法的微孔板技术进行初步筛选。快速确定了当在液体培养基中培养时，哪种分离的AEFB的无细胞上清液(CFS)能对斐济球腔菌产生菌丝生长抑制。
为了评价，使用了斐济球腔菌EASGK09、斐济球腔菌EASGK10、斐济球腔菌EASGK11和斐济球腔菌EASGK14菌株，按照Dupont，1982[11]的方法分离自cv.Granenano香蕉叶。枯草芽孢杆菌UA321的CFS(无细胞上清液)被用作阳性对照，新鲜无菌肉汤被用作绝对对照。
使用Riveros[12]的改进方法进行双碟试验。真菌菌落的生长抑制百分比在PDA(Merck，补充氯霉素：200ppm和氨苄青霉素：250ppm)上进行评价。抑制试验使用Talavera[13]描述的改良涂膜技术在芽管上进行。
生长抑制的评价在释放于cv.Granenano香蕉的叶盘上的真菌子囊孢子的芽管上进行，cv.Granenano香蕉的叶盘预先浸没在CFS中。对芽管的抑制百分比以绝对对照的孢子萌发作为100％进行测定。
选为拮抗细菌的是那些CFS表现出比枯草芽孢杆菌UA321阳性对照的CFS更高的斐济球腔菌生长抑制百分比的细菌。这个初步选择过程使用了648种AEFB。选为斐济球腔菌的拮抗物的AEFB再次使用微孔板技术进行试验，并使用从MOLP培养基中发酵得到的CFS进行双碟试验和子囊孢子抑制试验[14]。这些试验使用了斐济球腔菌EASGK14菌株以及与初步筛选相同的对照。
最后，选为斐济球腔菌的拮抗物的AEFB接受三种额外的抗真菌测试：MOLP培养基的微孔板、双碟和子囊孢子抑制。然后，计算这三种测试的加权平均值，对子囊孢子、双碟和微孔板分别得到60％、20％和20％的数值。
与子囊孢子测试相关的更高的权重涉及到在真菌进入叶片气孔前对其进行攻击的重要性。由枯草芽孢杆菌EA-CB0015和解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959在体外产生的对斐济球腔菌的菌丝生长和子囊孢子萌发的抑制百分比，示于表1。
表1、芽孢杆菌种对斐济球腔菌产生的抑制百分比
a斐济球腔菌的菌丝生长抑制，使用有MOLP肉汤的微孔板技术；该试验的每次处理有2个重复样品，进行4次重复，随着时间的推移该试验进行2次。
b斐济球腔菌的菌丝生长抑制，使用PDA中的双碟技术；该试验的每次处理有2个重复样品，进行30次重复，随着时间的推移该试验进行2次。
c斐济球腔菌子囊孢子的萌发抑制，有两个重复样用于处理。
d三种拮抗试验的平均值：子囊孢子(60％)，微孔板(20％)和双碟(20％)。
在培养基D中的枯草芽孢杆菌EA-CB0015的CFS获得的对斐济球腔菌的生长抑制百分比较之其在CIB培养基(53.0±4.0％)中获得的高1.5倍，较之其在芬利菲尔德培养基(FinleyandField'smedium)(1.0±1.6％)中获得的高80.9倍(图7)。使用在MOLP和TBS培养基中的CFS获得的对斐济球腔菌的生长抑制百分比在统计学上近似于在培养基D中的CFS获得的对斐济球腔菌的生长抑制百分比。
分离的AEFB的CFS对斐济球腔菌的体外生长抑制表明，它们对真菌的细胞结构具有影响。有鉴于此，通过光学显微镜对斐济球腔菌的菌丝和子囊孢子存在的形态变化进行评价。
观察到所有拮抗细菌的CFS都会引起形态变化，表现为与绝对对照相比时，菌丝体菌丝上的团块以及对子囊孢子管的萌发的抑制。
实施例6、包括枯草芽孢杆菌EA-CB0015的生物杀伤组合物
为了开发本发明的生物杀伤组合物，对助剂进行预选，通过评价例如发生多相以及出现沉淀等方面，建立能产生最稳定混合物的组合，以及混合物中每个组分的比例。所选的助剂及其作用如图2所示。
表2、各种组合物的助剂
a混合物所需的助剂组。
b选择的用于评价的助剂。
c其构成的组合物。EM：乳剂，OB：油基组合物，MH2O：水基混合物。
d混合物中每种助剂的作用。
对于乳剂形式的组合物，表面活性剂和油的最佳组合使用阶乘3×2设计确定(因素：油的种类和乳剂的种类，各三个水平)。使用固定比值对组分进行评价：20mL油，1μmol表面活性剂及80mL水。
选择了油和表面活性剂的种类之后，进行三元混合物的中心点设计以确定向日葵油、表面活性剂和分散剂(黄原胶)的比例，使之加入后能够得到高度稳定的乳剂。
对黄原胶、油和表面活性剂的评价范围分别为0.3至1.0％、0.0至5.0％以及14.0至19.6％。根据Burges(1998)和Brar等(2006)[15,16]的报道选择比例。除了已评价的组分，将pH5.0的3M磷酸盐缓冲液(3％)加入混合物，以抵消添加助剂、作为抗微生物剂的丙酸(0.5％)和适量水至100％时pH的剧烈变化。
对于水基混合物，分散剂、表面活性剂和粘附剂的最稳定组合使用部分因子设计确定，得到八种混合物。然后用部分设计评价这些混合物以选择表3所示的水基混合物助剂。剩余部分用水补足。
表3、使用部分设计选择水基混合物助剂(MH 2 O)评价的混合物
a用于各因素评价的最低水平。
b用于各因素评价的最高水平。
*+y-号表示用于混合物中各因素评价的水平。
混合物3被选为最稳定的混合物，并接受三元混合物的中心点设计以确定CMC、吐温和的比例。测试的三种组分的评价范围为0.5％至3.5％。这些范围是根据Burges(1998)和Brar等(2006)[16,15]的报道确定的。
黄原胶的浓度在部分因子设计的评价的最低水平(0.1％)保持不变，因为所有稳定的混合物均含有这一浓度的该添加物。除了已评价的组分，将pH5.0的3M磷酸盐缓冲液(3％)加入设计的混合物，以抵消添加助剂、作为抗微生物剂的丙酸(0.5％)和适量水至100％时pH的剧烈变化。
选择了对于乳剂和水基混合物随时间具有更高稳定性的混合物。用枯草芽孢杆菌EA-CB0015的细菌培养物代替水，其最终细菌浓度调节至2±x108CFU/mL。
除了上述两种组合物，还评价了细菌悬液(SB)，该细菌悬液仅含发酵72小时后得到的并用pH5的3M磷酸盐缓冲液(3MK2HPO4，3MKH2PO4)(3％)和丙酸(0.5％)调节的细菌培养物。表4示出了与枯草芽孢杆菌EA-CB0015一起评价的各种制剂的组成。
表4、基于枯草芽孢杆菌EA-CB0015的各种制剂的组成
实施例7、本发明生物杀伤组合物的评价
实施例6中得到的组合物被用于评价其对斐济球腔菌子囊孢子的拮抗能力，以及在给定的储存时间内(180天)枯草芽孢杆菌EA-CB0015在制剂中的活力。
关于细菌随时间的活力的评价，图9示出了对所有处理，CFU均随时间逐渐降低，从第三个月开始乳剂有更明显的降低。水基混合物和细菌悬液表现出非常相似的降低，尽管前者表现出最低值。
由上可知，涉及到评价期间制剂中枯草芽孢杆菌EA-CB0015的活力，最佳的组合物是水基的或是和细菌悬液一起的。
为了评价组合物对香蕉植株的黑叶斑病发展的影响，进行试验以评价枯草芽孢杆菌EA-CB0015的乳剂、水基混合物及细菌悬液。组合物被稀释至浓度1.0x108CFU/mL，将其以30滴/cm2喷洒到旗叶后面完全展开的第一片叶子上(第一叶)，评价在此叶片上进行。
将20mL生长了10天的斐济球腔菌的菌丝悬液加到第一叶上，通过这种人工接种的方式进行病原体的接种。病原体的接种在施加AEFB组合物之前24小时完成。疾病的严重程度在施加组合物30天之后使用Fouré标度(1982)[17]进行测定，坏死的叶面积百分比通过叶子的照片和Assess1.0分析软件进行测定。
对于这两种测量，施加无菌水的结果被用作阴性对照，根据供方的推荐采用的化学杀真菌剂和生物杀真菌剂其报道的数据被用作阳性对照。结果如图10和11所示，其示出了各种处理在严重程度以及坏死面积百分比上的差异，通过方差分析进行评价(p＜0.05)。
值得注意的是，对于两个分析的响应变量来说，水基混合物组合物是唯一显示出等同于化学对照的具有显著疾病控制的生物处理。该生物制剂将严重程度降低至97.1％，并报道了2.3％的坏死面积，该百分比接近于化学对照得到的百分比(1.0％)。阴性对照的严重程度和坏死面积的百分比分别为4.2和16.3％。
其它评价的处理未显示出对疾病的控制，即当与阴性对照的两个分析的变量的任意一个进行比较时，它们未显示出显著性差异。
实施例8、评价本发明组合物的理化性质、粘附性、耐紫外辐射性及特性。
实施例6的组合物与市场上的其它化学品相比，其粘附性和耐紫外辐射性较低。为了提高这些性质，对助剂进行初步选择。表5示出了用于提高粘附性和紫外线保护的助剂，以及用于评价的使用范围。
表5、为提高本发明组合物的粘附性和紫外线保护而评价的助剂
以成本、市场可获得性和与本发明组合物的相容性作为标准对助剂进行评估。然后，使用多因素实验设计对预选的助剂进行评价，在特定浓度范围内为每个评价标准确定表现最佳者(图12和13)。
根据图12，本发明的水基细菌组合物(MH2O)，添加0.5％w/v的助剂TiO2后提高了耐紫外性，暴露于紫外辐射120分钟后枯草芽孢杆菌EA-CB0015的细胞死亡从55％降低至21.5％。根据这个发现开发了一种新的水基组合物在组合物中加入0.5％的TiO2，并用山梨酸钾代替丙酸，称为P2。
图13显示添加酪蛋白酸钠和脱脂奶显著提高产品对疏水表面的粘附性。因此，将脱脂奶加到水基组合物P2中形成新的组合物，命名为P3。
为了判断枯草芽孢杆菌EA-CB0015的组合物是否能够与化学杀真菌混合物联合发挥作用，在将组合物用于桶混物之前和之后，测定枯草芽孢杆菌EA-CB0015的活力，
该桶混物用于在商业化种植园中控制黑叶斑病。为了这一目的，将10mL组合物的样
品取出并用于表6所示的各种桶混物。
表6、基于枯草芽孢杆菌EA-CB005的水基组合物与各种化学杀真菌剂的混合物
对于该评价，使用了8x8多因素设计，其中评价的第一因素是具有8个水平的桶混物种类，第二因素是暴露于混合物或活力评价的时间，具有八个水平(0.0、0.5、1.5、3.0、6.0、12.0和25.0小时)。将结果与生物对照进行比较，每个处理使用两个重复样品。
评价的响应变量为各评价时间内的CFU/mL数量。此外，测定了td50，其对应于当50％的枯草芽孢杆菌EA-CB0015的生物质因暴露于各混合物而丧失活力的时间。使用单变量设计进行数据分析，其中因素为细胞死亡百分比(％)。
还测定了3小时和25小时后的细胞死亡百分比，(3小时是制备好组合物后施用所需的平均时间，25小时是施用前组合物停留在混合罐中的最长时间)。
表7示出了td50(当50％的枯草芽孢杆菌EA-CB0015的孢子丧失活力的时间)，以及各杀真菌剂中的枯草芽孢杆菌EA-CB0015组合物在3小时和25小时后的细胞死亡百分比。为此将培养物加入搅拌罐并与各组合物助剂混合。M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7和M8表示制剂所处的各种杀真菌混合物。
表7、枯草芽孢杆菌EA-CB0015与各种化学杀真菌混合物混合后的细胞死亡百分比和
t d50
上表显示枯草芽孢杆菌EA-CB0015的组合物对所有混合物都表现出高于25小时的td50，达到仅为20.1％的平均活力降低值。此外，考虑到组合物的活力降低值低于50％，本发明的组合物最有可能提供对枯草芽孢杆菌EA-CB0015的额外保护，使之暴露于杀真菌混合物时能在长时间内保持活力。
关于活力降低的百分比，观察到在通常情况下(3小时)，M2M3和M4的混合物对组合物表现出最高的细菌活力降低率，而在特别情况下(25小时)，M1M3M5和M6表现出最高的降低率。
实施例9、温室和实地试验评价本发明的组合物对黑叶斑病严重性的影响
评价了枯草芽孢杆菌EA-CB0015的细菌水基组合物在温室条件下对黑叶斑病的影响。为此，使用了4个月大的c.v.Williams香蕉植株，并人工将斐济球腔菌真菌菌丝的悬液施加到植株的第一叶上进行病原体接种。Cenibanano使用的子囊孢子释放法被用于获取斐济球腔菌的菌丝，以接种植株[11]。
在用病原体接种植株之后一天施加组合物。将组合物稀释至浓度为1.0x108±0.1CFU/mL，使用带杯小型喷枪(MiniSpraygunwithcup)喷雾器施药，其风扇喷雾器连接至30-psi压缩机，校正其在30cm距离喷洒50滴/cm2。受感染树叶的表面和底面在距离30cm处仅消毒一次，确保最低浓度为50滴/cm2。
该实验使用单因素设计以评价水基组合物(MH2OyP3)，化学对照：于水中，生物对照：(1x108±0.1CFU/mL)，无菌水作为绝对对照。
感染植株一个月后测定疾病的发展。使用Fouré标度(1982)[17]测定感染程度，坏死面积的测定使用8百万像素的三星照相机和蔡司的Axio4.2图像处理软件。
方差分析(ANOVA)表明，各处理之间有统计学上的显著性差异。为确定这些差异，运用Turkey法进行多范围检验。各种处理的坏死面积百分比示于图14中。
如图14所示，根据本发明的枯草芽孢杆菌EA-CB0015的水基混合物组分(MH2O和P3)和Bravonil阳性对照显著地降低了香蕉树叶的坏死面积百分比，分别为1.67％和1.26％。图15包括接受每种处理的树叶的照片，直观地显示了处理后的树叶在外观上的差异。照片选自中等树叶的部分。
为了测定枯草芽孢杆菌EA-CB0015的水基混合物组分的有效性，在1.5公顷的土地上以实地水平对产品进行评价，每种处理有三个地块。每个220m2的地块含42株植株；每个地块取六株中间的植株以评价疾病。每11天用机动喷雾器进行处理，喷雾器容量为15L，每片树叶喷洒60滴/cm2。
对黑叶斑病的评价通过两种方法进行：Stover的生物预警和严重程度。图16示出了在评价的14周内获得的用于黑叶斑病严重程度的曲线下面积(AUC)。该图显示枯草芽孢杆菌EA-CB0015的两种水基组合物(MH2OyP3)均能降低疾病的严重程度，与化学对照和生物对照相比无显著性差异。
实施例10、枯草芽孢杆菌EA-CB0015在绒球菊花中对灰霉病菌的作用
评价了枯草芽孢杆菌EA-CB0015在绒球菊花中对灰霉病菌的作用。将绒球菊花在1％的次氯酸钠中消毒1分钟，用无菌蒸馏水洗涤，最后使其干燥。然后，将每朵花置于一次性杯中，用喷雾器喷洒每一种处理。施药24小时后，使用雾化器(2mL)施加浓度为5x103孢子/mL的病原体(灰霉病菌)，并于平均温度20℃和相对湿度高于90％的条件下培养。
根据受感染花瓣的百分比和严重程度，于7天之后进行疾病的测量。图17显示枯草芽孢杆菌EA-CB0015(T1)的孢子悬液减轻了疾病的严重程度，与未处理的对照(C)相比减轻了84％。
实施例11、枯草芽孢杆菌EA-CB0015在树番茄(Cyphomandrabetacea)中对炭疽菌 的作用
评价了枯草芽孢杆菌EA-CB0015在树番茄中对炭疽菌的作用。为此，将番茄在70％的乙醇中消毒2分钟，用无菌蒸馏水洗涤，最后使其干燥。
然后，在果实一半的区域以小于2mm的深度穿刺，施加25μL的水(C)或枯草芽孢杆菌EA-CB0015的孢子(T1，浓度为1x107CFU/mL)。24小时后，在穿刺处接种15μL浓度为400,000孢子/mL的炭疽菌EAHP-007。
图18示出了枯草芽孢杆菌EA-CB0015孢子悬液对炭疽菌EAHP-007在果实中形成的穿刺的直径的效果，获得了对该疾病的有效控制。
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应当理解的是，本发明不局限于在此描述的实施方式。因为对于本领域技术人员来说，不偏离本发明主旨的可能的变化和修改是显而易见的。本发明的主旨仅由权利要求限定。

Claims (28)

1.一种用于增加芽孢杆菌种微生物的生物质和代谢物生产的方法，包括在特定的环境条件下在适宜的培养基中培养所述微生物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物选自由枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌组成的组。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物为枯草芽孢杆菌EA-CB0015或者解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述适宜的培养基包括选自由固体、半固体或液体基质形式的碳水化合物、酵母提取物、硫酸铵、蛋白胨、含镁、硫、锰、氯、钾、磷、钙和钠的盐组成的组的一种或多种组分。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述适宜的培养基具有以下组成：
组分 浓度(g/L) 葡萄糖 30,0-35,0 酵母提取物 30,0-35,0 MnSO4 0,025-0,05 氯化钙 0,02-0,04 硫酸铵 0,80-1,20 MgSO4 3,50-5,00 HPO4 0.40-0.60 KH2PO4 0.40-0.60
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述特定的环境条件包括pH、温度、搅拌速度、发酵时间以及通气。
7.根据权利要求6所述的方法，其中培养的所述特定的环境条件为：
搅拌速度 400-600rpm 通气 1-5vvm pH 5,5-7,5 温度 20-40℃ 发酵时间 10-100小时
8.根据权利要求1所述的方法，其中所得的生物质另外通过离心和/或微量过滤分离。
9.根据权利要求1所述的方法，其中代谢物另外通过溶剂萃取、沉淀、吸附或色谱法提取。
10.根据权利要求1至8所述的方法获得的枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的生物质。
11.根据权利要求1至8所述的方法获得的枯草芽孢杆菌EA-CB0015的生物质。
12.根据权利要求1至8所述的方法获得的解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959的生物质。
13.根据权利要求1至9所述的方法获得的枯草芽孢杆菌的代谢物和/或解淀粉芽孢杆菌的代谢物。
14.根据权利要求1至9所述的方法获得的枯草芽孢杆菌EA-CB0015的代谢物和/或解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959的代谢物。
15.根据权利要求14所述的枯草芽孢杆菌EA-CB0015和/或解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959的代谢物，其特征在于所述代谢物为表面活性肽、伊枯草菌素和丰原素家族的脂肽。
16.根据权利要求15所述的枯草芽孢杆菌EA-CB0015的代谢物，其中所述丰原素家族的脂肽对应于具有以下通式的丰原素C：
R-Glu1-Orn2-Tyr3-Thr4-Glu5-Val6-Pro7-Gln8-Thr9-Ile10
其中R对应于14至18个碳原子的饱和或不饱和烃链。
17.根据权利要求13至16所述的枯草芽孢杆菌EA-CB0015的代谢物和/或解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959的代谢物，具有抗微生物活性。
18.一种组合物，包括根据权利要求11所述的枯草芽孢杆菌EA-CB0015的生物质和/或其代谢物，以及农用化学品可接受的载体。
19.一种组合物，包括根据权利要求12所述的解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959的生物质和/或其代谢物，以及农用化学品可接受的载体。
20.一种组合物，包括根据权利要求14所述的枯草芽孢杆菌EA-CB0015的代谢物和/或解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959的代谢物，以及农用化学品可接受的载体。
21.根据权利要求18至20任何一项所述的组合物，还包括选自由苯胺基嘧啶、百他特诺(bitartenols)、甾醇、苯醚甲环唑、戊唑醇、氟环唑、代森锰锌和科罗拉妥乐尼(cloratolonil)组成的组中的一种或多种生物杀伤剂。
22.根据权利要求18至21任何一项所述的组合物，包括：
23.根据权利要求11和12所述的枯草芽孢杆菌EA-CB0015的生物质和/或解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959的生物质用于控制植物病原体的应用，所述植物病原体例如斐济球腔菌、尖孢镰刀菌、青枯病菌、灰霉病菌、炭疽病菌、念珠菌属、立枯丝核菌和腐皮镰刀菌。
24.根据权利要求14所述的枯草芽孢杆菌EA-CB0015和/或解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959的生物质用于控制植物病原体的应用，所述植物病原体例如斐济球腔菌、尖孢镰刀菌、青枯病菌、灰霉病菌、炭疽病菌、念珠菌属、立枯丝核菌和腐皮镰刀菌。
25.根据权利要求18至22所述的组合物用于控制植物病原体的应用，所述植物病原体例如斐济球腔菌、尖孢镰刀菌、青枯病菌、灰霉病菌、炭疽病菌、念珠菌属、立枯丝核菌和腐皮镰刀菌。
26.一种用于治疗作物抗植物致病剂的方法，包括施用有效生物质量的根据权利要求11和12所述的枯草芽孢杆菌EA-CB0015的生物质和/或解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959的生物质。
27.一种用于治疗作物抗植物致病剂的方法，包括施用有效量的根据权利要求14所述的枯草芽孢杆菌EA-CB0015和/或解淀粉芽孢杆菌EA-CB0959的代谢物。
28.一种用于治疗作物抗植物致病剂的方法，所述植物致病剂例如斐济球腔菌、尖孢镰刀菌、青枯病菌、灰霉病菌、炭疽病菌、念珠菌属、立枯丝核菌和腐皮镰刀菌，包括施用有效量的根据权利要求18至22所述的组合物。
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