CN116731902A - 一种球形节杆菌gcg3、其用途及其抑菌应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种球形节杆菌GCG3、其用途及其抑菌应用。所述的球形节杆菌GCG3保藏编号为CGMCCNo.26629。固氮酶活性为122.5nmol(C2H4)·h‑1·mL‑1，表明其具有固氮能力；菌悬液中IAA的分泌量为19.26μg·mL‑1，表明其能够促进作物的生长；更重要的是对腐皮镰孢菌、瓜亡革菌、茄链格孢、核盘菌、尖孢镰刀菌、大班病菌、辣椒灰霉菌和立枯丝核菌引起的植物病害起到有效的防治作用，具有抑菌谱广、环境友好的优点，有利于农作物的无公害生产，降低农药化肥的使用，不仅为农民节省开支，而且减少化学药剂的残留，有利于有机农业的发展。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种球形节杆菌GCG3、其用途及其抑菌应用。
背景技术
传统农业生产中简单追求高产高效，粗放的种植模式下化肥农药，杀虫剂等化学药品的过量使用，使环境背负了巨大压力，继而引起的水土流失，土壤退化，农产品安全等问题也严重影响到人们的生产和生活。同时随着经济社会的发展，人们对高安全高品质农产品需求的增加，使得在农业生产中高环境亲和力的生物源制剂的需求越趋旺盛，特别是对微生物肥料和微生物源药剂的需求巨大。微生物生长调节剂是介于微生物源农药和肥料间的一种，是利用微生物的生理活性物质等来调节植物的生长发育，有益于植物生长和产量。这类微生物通常是附生于根际中的菌，称为植物根际促生菌(PGPR)。
现有的研究表明，球形节杆菌具有解磷能力(参见中国发明专利CN113106038A)；发酵产生透明质酸酶的能力(参见发明专利CN105567606B)；降解2-羟基吡啶的能力(参见发明专利CN106834171B)以及生产17α-去氢甲基睾丸素的能力(参见发明专利CN101250576B)。但是，目前并没有公开球形节杆菌具有促进植物生长作用以及对病原菌的抑制作用。
发明人在研究过程中意外的分离得到了一种球形节杆菌，所述的球形节杆菌不仅能对农作物生长起到促进作用，还能对相应病原真菌有一定的抑制作用，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)GCG3，所述的球形节杆菌GCG3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.26629。
本发明的第二目的是提供一种菌剂，所述的菌剂包括所述的球形节杆菌GCG3。
本发明的第三目的是提供一种菌株发酵液，所述的发酵液是利用所述的球形节杆菌GCG3制成。
本发明的第四目的是提供所述的球形节杆菌GCG3，或所述的菌剂，或所述的菌株发酵液在促进植物生长的应用。
本发明的第五目的是提供所述的球形节杆菌GCG3，或所述的菌剂，或所述的菌株发酵液在促进土壤固氮中的应用。
本发明的第六目的是提供如所述的球形节杆菌GCG3，或所述的菌剂，或所述的菌株发酵液在抑制植物病原菌中的应用。
优选的，所述的植物病原菌为腐皮镰孢菌、瓜亡革菌、茄链格孢、核盘菌、尖孢镰刀菌、大班病菌、辣椒灰霉菌、立枯丝核菌中的一种或几种。
本发明的有益效果是：综上所述，本发明提供了一种球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)GCG3，所述的球形节杆菌GCG3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26629。所述的球形节杆菌GCG3及其发酵液制备的生防菌剂，固氮酶活性为122.5nmol(C2H4)·h-1·mL-1，表明其具有固氮能力；菌悬液中IAA的分泌量为19.26μg·mL-1，表明其能够促进作物的生长；更重要的是对腐皮镰孢菌、瓜亡革菌、茄链格孢、核盘菌、尖孢镰刀菌、大班病菌、辣椒灰霉菌和立枯丝核菌引起的植物病害起到有效的防治作用，具有抑菌谱广、环境友好的优点，有利于农作物的无公害生产，降低农药化肥的使用，不仅为农民节省开支，而且减少化学药剂的残留，有利于有机农业的发展。
附图说明
图1为本发明的球形节杆菌GCG3菌落照片
图2为本发明的球形节杆菌GCG3拮抗真菌的效果图
图3为本发明的球形节杆菌GCG3拮抗真菌的效果图
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
下述实施例中所使用的Ashby培养基、LB液体培养基、金氏B液体培养基和PDA培养基为现有市售产品。
实施例一、菌株的分离和鉴定
1.菌株的分离
选取位于张掖民勤县中科院西北院干旱区盐渍化研究站甘草种植地土壤样品，去除表层土取地下15-20cm甘草根际土，加入100mL无菌水，静置30min后，28℃，转速180r·min-1，振荡30min形成混悬液。吸取5mL混悬液加入到100mLAshby液体培养基中，28℃，转速180r·min-1富集培养72h后，采用常规梯度稀释法，制成10-4、10-5、10-6、10-7稀释梯度的菌悬液后，吸取0.1mL菌悬液在Ashby平板培养基上进行凃布，每个梯度重复3次，置于恒温28℃，培养3d～5d。重复上述分离操作3次。待分离的菌落长出后用平板划线法继续在Ashby培养基上纯化菌株，将分离纯化所得的其中一个菌株命名为GCG3。
2.分子鉴定
常规方法培养上述步骤分离纯化得到的菌株GCG3，提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，以细菌16s rDNA通用引物，引物序列如下：
27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3
1492R：5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3
在PCR扩增仪上进行PCR反应。反应完成后，取2μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，确认PCR扩增片段。PCR产物用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收，具体操作按试剂盒说明书进行。
取各个菌种纯化后的PCR产物，使用测序仪ABI3730-XL进行DNA测序。与NCBIGenBank中的已知序列进行同源性比较后，判定细菌种类，将细菌划分到属或种。
PCR基因扩增得到菌株GCG3的16s rDNA基因片段约1.4kb，其基因序列如SEQ IDNo.1所示，测定序列后与NCBI数据库中已公开的16s rDNA序列进行在线同源性比较，结果显示GCG3与球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)的同源性最高，达到99.39％。
将所述分离得到的菌株命名为球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)GCG3，拉丁名为Arthrobacterglobiformis，并于2023年2越23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.26629，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
以下实施例中，将所述的球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)GCG3简写为球形节杆菌GCG3。
实施例二、球形节杆菌GCG3的固氮酶活性测试
对实施例1分离纯化得到的球形节杆菌GCG3进行固氮酶活性测定，采用乙炔还原法，具体方法如下所述：取一环球形节杆菌GCG3接种于盛有5mL半固体Ashby培养基的血清瓶中，28℃下培养48h。在无菌台中将血清瓶瓶盖换成橡胶塞，并用无菌注射器抽出1mL气体，然后注入1mL乙炔，密封，再在28℃下培养36h。用无菌注射器从血清瓶中抽取混合气体0.2ml注入气相色谱仪，测定乙烯生成量，根据以下公式计算固氮酶活性。以上实验均设三组重复。
N＝hxCV/(24.9hst)
其中N为产生乙烯的浓度nmol(C2H4)·h-1·mL-1即固氮酶活性；hx为样品乙烯峰面积值；C为标准乙烯浓度(nmol·ml-1)；V为培养容器体积(mL)，24.9为常数；hs为标准乙烯峰面积值；t为样品培养时间(h)。
结果显示，球形节杆菌GCG3的固氮酶活性为122.5nmol(C2H4)·h-1·mL-1。表明球形节杆菌GCG3具有固氮能力。
实施例三、球形节杆菌GCG3分泌IAA能力的测定
定性测定：取1环球形节杆菌GCG3单菌落接种于50mL金氏B液体培养基中，28℃，160r/min条件下振荡培养12d。4℃，10000r/min离心10min，取上清液，加入等体积S2比色液，避光静置30min后，用分光光度计530nm波长下测定吸光值。对照标准曲线计算单位体积发酵液中IAA的含量。
结果显示，球形节杆菌GCG3菌悬液中IAA的分泌量为19.26μg·mL-1。
实施例四、制备球形节杆菌GCG3的发酵液
1.菌种活化：在无菌条件下，将保存的球形节杆菌GCG3转接于已灭菌的LB肉汤液体培养基中，置恒温摇床28±1℃，160r/min，培养20h，至OD600值达到1.0，得到活化菌液。
2.发酵培养：在无菌条件下，吸取100μL球形节杆菌GCG3活化菌液，转接到含有100mlLB肉汤液体培养基的250ml锥形瓶内，恒温摇床培养，摇床转速160r/min，温度28±1℃，培养7d，得到球形节杆菌GCG3的发酵液，所得发酵液经冷冻离心机10000r/min 4℃离心10min，去除菌体，所得上清液在无菌条件下，经0.22μm滤膜过滤，即得球形节杆菌GCG3的发酵液。
实施例五、球形节杆菌GCG3发酵液对植物病原真菌的抑制作用
本发明所述的球形节杆菌GCG3的抗植物病原真菌发酵液的抗菌试验如下：
1.植物病原真菌：腐皮镰孢菌(Fs)、瓜亡革菌(Tc)、茄链格孢(As)、核盘菌(Ss)、尖孢镰刀菌(Fo)、大班病菌(Et)、辣椒灰霉菌(Bc)、立枯丝核菌(Rs)；
2.植物病原真菌的培养：用接种环挑取少量植物病原真菌斜面培养物分别接入PDA培养基平板活化，在28±1℃恒温培养箱培养，待菌丝铺满平板备用；
3.球形节杆菌GCG3发酵液对植物病原真菌菌丝生长抑制测定
在无菌条件下，分别取球形节杆菌GCG3的发酵液1ml、1.5ml、2ml，加入灭过菌的处于熔化状态(60℃左右)的9ml、8.5ml、8ml的PDA培养基中，构成总体积10ml混合液，混合均匀后倒在直径9厘米的无菌培养皿内制成平板，每个比例3个重复；另取10ml不含发酵液的PDA平板3个作为对照。冷却后在每个培养基平板平面中央放入一个待测植物病原真菌菌饼(直径为0.8厘米)，菌饼的菌丝面贴在培养基表面，将平板置于28±1℃培养5d-7d。采用十字交叉法测定菌落生长直径，用下述公式计算菌丝生长抑制率：
菌丝生长抑制率＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100％
4.结果
表1球形节杆菌GCG3对植物病原菌的抑制率
如上表所示：耐盐固氮节杆菌发酵液滤液对腐皮镰孢菌(Fs)、瓜亡革菌(Tc)、茄链格孢(As)、核盘菌(Ss)、尖孢镰刀菌(Fo)、大班病菌(Et)、辣椒灰霉菌(Bc)、立枯丝核菌(Rs)生长均具有较好的抑制作用，其中核盘菌、大班病菌、辣椒灰霉菌三株病原菌在三个浓度发酵液均未见明显生长，抑制率可视为100％，其余五株病原菌抑制率均在70％以上。且耐盐固氮节杆菌对病原真菌的抑菌作用还表现出剂量效应，即随着发酵液浓度的升高，抑菌效果也随之增强。因此耐盐固氮节杆菌发酵液滤液可作为抗植物病原真菌微生物农药进一步开发利用，有很好的的应用前景。
综上所述，本发明提供了一种球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)GCG3，所述的球形节杆菌GCG3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.26629。所述的球形节杆菌GCG3及其发酵液制备的生防菌剂，固氮酶活性为122.5nmol(C2H4)·h-1·mL-1，表明其具有固氮能力；菌悬液中IAA的分泌量为19.26μg·mL-1，表明其能够促进作物的生长；更重要的是对腐皮镰孢菌、瓜亡革菌、茄链格孢、核盘菌、尖孢镰刀菌、大班病菌、辣椒灰霉菌和立枯丝核菌引起的植物病害起到有效的防治作用，具有抑菌谱广、环境友好的优点，有利于农作物的无公害生产，降低农药化肥的使用，不仅为农民节省开支，而且减少化学药剂的残留，有利于有机农业的发展。
Claims (7)
1.一种球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)GCG3，其特征在于，所述的球形节杆菌GCG3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.26629。
2.一种菌剂，其特征在于，所述的菌剂包括如权利要求1所述的球形节杆菌GCG3。
3.一种菌株发酵液，其特征在于，所述的发酵液是利用权利要求1所述的球形节杆菌GCG3制成。
4.如权利要求1所述的球形节杆菌GCG3，或如权利要求2所述的菌剂，或如权利要求3所述的菌株发酵液在促进植物生长的应用。
5.如权利要求1所述的球形节杆菌GCG3，或如权利要求2所述的菌剂，或如权利要求3所述的菌株发酵液在促进土壤固氮中的应用。
6.如权利要求1所述的球形节杆菌GCG3，或如权利要求2所述的菌剂，或如权利要求3所述的菌株发酵液在抑制植物病原菌中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的植物病原菌为腐皮镰孢菌、瓜亡革菌、茄链格孢、核盘菌、尖孢镰刀菌、大班病菌、辣椒灰霉菌、立枯丝核菌中的一种或几种。
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