BR112018007706B1

BR112018007706B1 - Processos para a colheita de biomassa com atividade fungicida e para a colheita de uma lipoproteína e/ou um glicolipídeo, e composição

Info

Publication number: BR112018007706B1
Application number: BR112018007706-2A
Authority: BR
Inventors: Hans Bisgaard-Frantzen; Michelle MADSEN; Line THORSEN; Jakob WORM
Original assignee: Chr. Hansen A/S
Priority date: 2015-11-10
Filing date: 2016-11-10
Publication date: 2022-07-12
Also published as: CN108347940A; CN108347940B; US20180325118A1; AU2016352669A1; BR112018007706A2; EP3373731A1; WO2017081201A1; AU2016352669B2; US10986842B2

Abstract

PROCESSOS PARA A COLHEITA DE BIOMASSA COM ATIVIDADE FUNGICIDA E PARA A COLHEITA DE UMA LIPOPROTEÍNA E/OU UM GLICOLIPÍDEO, E COMPOSIÇÃO. A presente invenção refere-se a um processo para a colheita ("harvesting"; ou cultivo) de biomassa de uma bactéria, e/ou uma lipoproteína produzida por uma bactéria que apresenta atividades antifúngica e antibacteriana contra vários agentes fitopatogênicos.

Description

[001] A presente invenção refere-se a um processo novo e melhorado para a colheita ou cultivo ("harvesting") de biomassa (incluindo esporos, células bacterianas) de uma cepa bacteriana que apresenta atividade antifúngica e antibacteriana contra vários agentes fitopatogê- nicos. Em uma modalidade específica, a invenção fornece um processo para cultivo ou colheita (harvesting") da biomassa de um meio de cultura de Bacillus que envolve tratamento ácido. A biomassa obtida pelo novo processo apresenta atividade antifúngica surpreendentemente alta devido ao teor de lipopeptídeos.

ANTECEDENTES DE INVENÇÃO

[002] Entre os micro-organismos para o controle biológico, as bactérias do gênero Bacillus sp. receberam muita atenção devido à ampla variedade de compostos antibióticos que produzem, sua vida de prateleira longa, seu crescimento rápido em cultura e sua habilidade para colonizar superfícies foliares [1, 2, 3, 4]. Em particular, certas espécies de Bacillus, como Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus mycoides, Bacillus circulans, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus mojavensis e Bacillus thurigiensis apresentam atividade antimicrobiana.

[003] A atividade antimicrobiana dessa bactéria é devido à sua habilidade para produção de lipopeptídeos, por exemplo a partir das famílias de surfactina, iturina e fengicina que diferem na sequência de aminoácidos e na ramificação da cadeia de ácido graxo. As surfactinas exibem atividade antibacteriana alta, enquanto que as iturinas e fengi- cinas são reconhecidas por sua atividade antifúngica [4].

[004] A técnica anterior descreve o uso de B. subtilis e B. amyloli- quefaciens para o controle de vários micro-organismos causadores de doença em uma ampla variedade de plantações, incluindo plantações de frutas e vegetais, como amora-preta, uva, framboesa, morango, tomate, pepino, pimenta-do-reino, laranja, melão, maçã, pêssego, anona, banana, mamão, manga e kiwi. EP2311936 revela uma cepa de B. sub- tilis KS1 (NITE BP-569), como um agente de controle biológico para combater vários micro-organismos fitopatogênicos em plantações de videira. WO 98/21968 revela um antibiótico produzido por B. subtilis AQ153 (ATCC 55614) efetivo contra infecções bacterianas e fúngicas e também como um método para proteger as plantas que compreende a aplicação destes compostos antibióticos.

[005] WO9850422, WO9909819 e WO0029426 revelam compos tos antibióticos produzidos pela cepa B. subtilis AQ713 (equivalente à cepa QST713, depositada como NRRL B-21661) e seus mutantes que apresentam atividade inseticida, nematicida, antifúngica e antibacteri- ana. US2011/0318386 descreve métodos para induzir resistência sistêmica contra vários patógenos através do uso de controladores biológicos do gênero Bacillus, especificamente das espécies isoladas, B. mo- javensis 203-7 e B. mycoides. Por sua vez, ES 2345969 descreve um fitofortalecedor para aplicação em bananeira e pseudocaules da plantação, que inclui B. subtilis, Trichoderma viride e B. megaterium var phos- phaticum.

[006] WO14178032 revela um processo para aumentar a produção de biomassa de micro-organismos do gênero de Bacillus, incluindo Bacillus subtilis EA-CB0015 e Bacillus amyloliquefaciens EA-CB0959. A biomassa obtida pelo processo pode ser separada do meio de cultura usando métodos convencionais de centrifugação ou microfiltração, enquanto que os metabólitos ativos podem ser obtidos através de extração com solventes, precipitação, adsorção ou cromatografia. Em uma modalidade preferida da invenção, a quantidade de biomassa de microorganismos de Bacillus sp. obtida pode variar entre 3,0 e 20,0 g/l.

[007] A atividade fungicida da biomassa isolada (células e esporos) após a colheita do meio de cultura não é satisfatória de uma vista comercial e, portanto, o objetivo da presente invenção é fornecer um processo melhorado para a colheita da biomassa. Os presentes inventores revelaram que modificando as condições durante a colheita da biomassa aumenta, de forma surpreendente, a atividade fungicida da biomassa colhida.

[008] US5470827 revela que a iturina A pode ser colhida do meio de cultura através de extração com um solvente, ou alternativamente, o meio de cultura pode ser filtrado através de uma membrana de filtro ou similar. Se desejado, o meio de cultura pode ser colocado em contato com um carvão ativado, celulose em pó, resina adsorvente ou outros veículos, de modo que a iturina A produzida é adsorvida no veículo e, depois disso, o produto pode ser dele dessorvido através de elução.

[009] Os rendimentos dos metabólitos ativos não são satisfatórios de um ponto de vista comercial e, portanto, um objetivo da presente invenção é fornecer um processo melhorado para a colheita dos metabó- litos, especialmente lipoproteínas e/ou glicolipídeos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] Foi surpreendentemente mostrado que a biomassa melhorada pode ser obtida mediante a colheita a partir de um meio de cultura por um processo novo que envolve tratamento ácido. A biomassa tem atividade antifúngica inesperadamente mais alta que uma a biomassa comparativa obtida sem tratamento ácido do meio de cultura.

[0011] Desse modo, um aspecto da presente invenção refere-se a um processo para a colheita de biomassa de um meio de cultura de bactérias (por exemplo, Bacillus) (meio gasto obtido por crescimento de uma cepa bacteriana em um meio de crescimento), o processo compreende a acidificação do meio de cultura, preferivelmente após a cultura de bactérias ter esporulada.

[0012] A biomassa colhida é enriquecida com biotensoativos, especialmente um fengicina, e preferivelmente contém um número grande de unidades formadoras de colônia (células e/ou esporos viáveis). Na modalidade mais preferida, o processo da invenção é realizado sem o uso de qualquer solvente (orgânico) ou óleo para a extração dos bioten- soativos.

[0013] Se desejado, a biomassa colhida é secada e/ou ressuspensa em um líquido agrícola aceitável.

[0014] Também, os presentes inventores descobriram, surpreendentemente, que os metabólitos podem ser colhidos de um meio de cultura por adsorção, por exemplo, em terra diatomácea (aka kieselguhr). É contemplado que outros geopolímeros (de ocorrência natural ou sintéticos), ou materiais similares, são aplicáveis como adsorvente. O termo geopolímero deve ser interpretado, no contexto presente, de forma ampla, e abrange biominerais e geominerais etc.

[0015] Desse modo, um aspecto da presente invenção refere-se a um processo para colher de metabólitos (esp. lipopeptídeos ou glicolipí- deos) de um sobrenadante de cultura bacteriana (por exemplo, Bacillus) ou meio de cultura (obtido através do crescimento/propagação de uma cepa bacteriana em um meio de crescimento), opcionalmente o sobre- nadante é separado da biomassa através de centrifugação e/ou filtração), o processo compreende a adição de um geopolímero, por exemplo kieselguhr, preferivelmente em uma quantidade que corresponda a uma capacidade de carregamento. A concentração de lipopeptídeo/glicolipí- deo (por exemplo, das famílias surfactina, iturina e fengicina) no meio de cultura gasto (ou sobrenadante) varia, dependendo da cepa usada para a fermentação. O versado sabe otimizar a quantidade de geopolí- mero, por exemplo, kieselguhr, a ser adicionada, por exemplo o versado pode calcular a quantidade de lipopeptídeo/glicolipídeo a ser adsorvido por meio de análise de HPLC do meio/sobrenadante. Espera-se que a capacidade de carregamento para kieselguhr seja 0,02 g-0,3 g de kieselguhr por ml de meio de cultura (ou sobrenadante de cultura).

[0016] A mistura de sobrenadante ou meio de cultura com o geopo- límero, por exemplo, kieselguhr, este material é preferivelmente incubado em temperatura ambiente, e/ou por % - 3 h (horas), e/ou @ 25 rpm e/ou a um pH apropriado que varia de pH 4-10. Preferivelmente, o pH é ajustado após a fermentação final, mas o pH pode ser também ajustado durante a fermentação.

[0017] Após a incubação final, o geopolímero, por exemplo, kieselguhr, e qualquer biomassa restante é isolada usando centrifugação e/ou filtração, como filtração de finalização.

[0018] Se desejado, o produto resultante da centrifugação e/ou da filtração (contendo o geopolímero, por exemplo, kieselguhr, com lipo- proteína/glicolipídeo adsorvido e biomassa, opcionalmente) é ressus- penso em um líquido aceitável agrícola.

[0019] Alternativamente - quando a filtração é usada - todo ou uma porção do geopolímero, por exemplo, kieselguhr, pode ser adicionado como a ajuda de filtro, de modo que os metabólitos possam se adsorve- rem durante a etapa de filtração.

[0020] A cepa bacteriana a ser usada em um processo da presente invenção deve ser capaz de produzir metabólitos antifúngicos em quantidades comercialmente relevantes, exemplos dessas cepas adequadas são: cepas de Bacillus amyloliquefaciens HSCC 124 (FERM BP-4758) ou IAM 1523 (cf. US5470827); cepa de Bacillus subtilis KS1 (NITE BP- 569) (cf. EP2311936) e cepa de Bacillus subtilis AQ153 (ATCC55614) (cf. WO9821968). Outras cepas relevantes são conhecidas da literatura, por exemplo a literatura mencionada no presente relatório descritivo. DESCRIÇÃO DETALHADA

[0021] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um processo para a colheita de biomassa (células bacterianas e/ou esporos) de um meio de cultura, o processo envolve a redução do pH do meio, por exemplo para um pH abaixo de 6,0.

[0022] Presentemente, as modalidades preferidas deste primeiro aspecto são:

[0023] Modalidade A: Um processo para a colheita de biomassa (células bacterianas e/ou esporos) com atividade fungicida: a) obter de um meio de cultura através da propagação de uma cepa bacteriana produtora de lipoproteína e/ou glicolipídeo em um meio de crescimento a um pH na faixa 6,5 a 10,0; b) reduzir o pH do meio de cultura para abaixo de 6,5 (como abaixo de 6,4, ou na faixa 2,1 a 6,4, na faixa 2,5 a 5,9, na faixa 3,0 a 5,4, na faixa 3,0 a 5,0, na faixa 3,0 a 4,5 ou na faixa 3,5 a 4,5), por exemplo por adição de um ácido; c) opcionalmente adicionar um geopolímero, ou antes, durante ou após a etapa b); e d) separar a biomassa do meio de cultura, por exemplo por centrifugação de filtração.

[0024] Modalidade B: Um processo para a colheita de biomassa (células bacterianas e/ou esporos) com atividade fungicida: a) obter de um meio de cultura através da propagação de uma cepa bacteriana produtora de lipoproteína e/ou glicolipídeo em um meio de crescimento a um pH na faixa 6,0 a 9,0; b) reduzir o pH do meio de cultura para abaixo de 6,0 (como abaixo 5,9, ou na faixa 2,1 a 5,9, na faixa 2,5 a 5,9, na faixa 3,0 a 5,0, na faixa 3,0 a 4,5 ou na faixa 3,5 a 4,5), por exemplo por adição de um ácido; c) opcionalmente adicionar um geopolímero, ou antes, durante ou após a etapa b); e d) separar a biomassa do meio de cultura, por exemplo por centrifugação de filtração.

[0025] Modalidade C: Um processo para a colheita de biomassa (células bacterianas e/ou esporos) com atividade fungicida: a) obter de um meio de cultura através da propagação de uma cepa bacteriana produtora de lipoproteína e/ou glicolipídeo em um meio de crescimento a um pH na faixa 5,5 a 9,0; b) reduzir o pH do meio de cultura para abaixo de 5,5 (como abaixo 5,4, ou na faixa 2,1 a 5,4, na faixa 2,5 a 5,4, na faixa 3,0 a 5,0, na faixa 3,0 a 4,5 ou na faixa 3,5 a 4,5), por exemplo por adição de um ácido; c) opcionalmente adicionar um geopolímero, ou antes, durante ou após a etapa b); e d) separar a biomassa do meio de cultura, por exemplo por centrifugação de filtração.

[0026] Modalidade D: Um processo para a colheita de biomassa (células bacterianas e/ou esporos) com atividade fungicida: a) obter de um meio de cultura através da propagação de uma cepa bacteriana produtora de lipoproteína e/ou glicolipídeo em um meio de crescimento a um pH na faixa 5,6 a 7,4; b) reduzir o pH do meio de cultura para abaixo de 5,5 (como abaixo 5,4, ou na faixa 2,1 a 5,5, na faixa 2,5 a 5,4, na faixa 3,0 a 5,0, na faixa 3,0 a 4,5 ou na faixa 3,5 a 4,5), por exemplo, por adição de um ácido; c) opcionalmente adicionar um geopolímero, ou antes, durante ou após a etapa b); e d) separar a biomassa do meio de cultura, por exemplo por centrifugação de filtração.

[0027] Modalidade E: Um processo para a colheita de biomassa (células bacterianas e/ou esporos) com atividade fungicida: a) obter de um meio de cultura através da propagação de uma cepa bacteriana produtora de lipoproteína e/ou glicolipídeo em um meio de crescimento a um pH na faixa 5,7 a 9,0; b) assegurar que o pH do meio de cultura está na faixa de 2,5 a 5,5 (como na faixa 3,0 a 5,0, na faixa 3,0 a 4,5 ou na faixa 3,5 a 4,5), por exemplo por adição de um ácido; c) opcionalmente adicionar um geopolímero, ou antes, durante ou após a etapa b); e d) separar a biomassa do meio de cultura, por exemplo por centrifugação de filtração.

[0028] Modalidade F: Um processo para a colheita de biomassa (células bacterianas e/ou esporos) com atividade fungicida: a) obter de um meio de cultura através de propagação de uma cepa bacteriana produtora de lipoproteína e/ou glicolipídeo em um meio de crescimento; b) assegurar que o pH do meio de cultura está na faixa de 2,5 a 5,5 (como na faixa 3,0 a 5,0, na faixa 3,0 a 4,7 ou na faixa 3,5 a 4,5), por exemplo, por adição de um ácido (por assegurar, entende-se a redução do pH para o valor especificado, se necessário); c) opcionalmente adicionar um geopolímero, ou antes, durante ou após a etapa b); d) separar a biomassa do meio de cultura, por exemplo por centrifugação de filtração; e) opcionalmente adicionar um excipiente (como veículo ou um protetor) para a biomassa; e/ou opcionalmente ajustar o pH para um pH na faixa 5,5 a 8,0; e f) opcionalmente secar, por exemplo secagem por atomi- zação, secagem por congelamento ou secagem a vácuo, a biomassa.

[0029] Modalidade G: Um processo para a colheita de biomassa (células bacterianas e/ou esporos) com atividade fungicida: a) fornecer um meio de cultura obtido através de propagação de uma cepa bacteriana produtora de lipoproteína e/ou glicolipídeo em um meio de crescimento, sendo que o dito meio tem um pH acima de 5,7; b) reduzir o pH do meio de cultura para um pH na faixa de 2,5 a 5,5 (como na faixa 3,0 a 5,0, na faixa 3,0 a 4,7 ou na faixa 3,5 a 4,5), por exemplo, por adição de um ácido; c) opcionalmente adicionar um geopolímero, ou antes, durante ou após a etapa b) d) separar a biomassa do meio de cultura, por exemplo por centrifugação de filtração; e) opcionalmente adicionar um excipiente (como veículo ou um protetor) à biomassa; e/ou opcionalmente ajustar o pH para um pH na faixa de 5,5 a 8,0; e f) opcionalmente secar, por exemplo secagem por atomi- zação, secagem por congelamento ou secagem a vácuo, a biomassa.

[0030] Modalidade H: Um processo para obter biomassa (células bacterianas e/ou esporos) com atividade fungicida: a) fornecer um meio de cultura obtido através de propagação de uma cepa bacteriana produtora de lipoproteína e/ou glicolipídeo em um meio de crescimento, sendo que o dito meio tem um pH na faixa de 2,5 a 6,5 (como na faixa 4,0 a 6,0, na faixa 4,5 a 6,0, na faixa 3,0 a 5,0, na faixa 3,0 a 4,7 ou na faixa 3,5 a 4,5); b) opcionalmente adicionar um geopolímero, ou antes, durante ou após a etapa b) c) separar a biomassa do meio de cultura, por exemplo por centrifugação de filtração; d) opcionalmente adicionar um excipiente (como veículo ou um protetor) à biomassa; e/ou opcionalmente ajustar o pH para um pH na faixa de 5,5 a 8,0; e e) opcionalmente secar, por exemplo secagem por atomi- zação, secagem por congelamento ou secagem a vácuo, a biomassa.

[0031] As modalidades mais preferidas de qualquer um dos processos acima (modalidades A a H), de acordo com a invenção, são: f) Um processo onde o pH do meio de cultura em a) é acima de 5,7, como na faixa 5,7 a 9, na faixa 6,0 a 9,0 ou na faixa 6,5 a 8. É presentemente preferido que o pH seja mantido dentro da faixa especificada por pelo menos 1 hora, como pelo menos 2 horas, pelo menos 4 horas, pelo menos 10 horas ou pelo menos 24 horas. g) Um processo em que o meio de cultura em a) compreende pelo menos 5 g de biomassa por litro meio de cultura, como pelo menos 7 g/l ou pelo menos 10 g/l. h) Um processo em que o meio de cultura em a) compreende pelo menos 200 mg de metabólitos por litro meio de cultura, como pelo menos 400 mg/L ou pelo menos 600 mg/L. i) Um processo para a colheita de biomassa (células bac- terianas e/ou esporos) com atividade fungicida: a) obter de um meio de cultura que contém pelo menos 5 g/l de biomassa de bactérias Bacillus e pelo menos 200 mg/L de meta- bólitos das famílias surfactina, iturina, plipastatina, artrofactina, serrave- tina ou fengicina, preferivelmente tendo um pH na faixa de 5,6 a 7,4; b) redução (se necessário) do pH do meio de cultura para abaixo de 5,5 (como abaixo 5,4, ou na faixa 2,1 a 5,5, na faixa 2,5 a 5,4, na faixa 3,0 a 5,0, na faixa 3,0 a 4,5 ou na faixa 3,5 a 4,5), por exemplo por adição de um ácido; c) opcionalmente adicionar um geopolímero, ou antes, durante ou após a etapa b); e d) separar a biomassa do meio de cultura, por exemplo por centrifugação de filtração. - Um processo onde o pH na etapa b) é abaixo de 5,7, como na faixa 2,0 a 5,6, na faixa 3,0 a 5,5, na faixa 3,5 a 5,5, na faixa 4,0 a 5,3, na faixa 4,0 a 5,0 ou na faixa 4,5 a 5,0. É presentemente preferido que o valor de pH seja mantido dentro da faixa especificada por pelo menos 10 minutos, como pelo menos 20 minutos, pelo menos 30 minutos ou pelo menos 60 minutos. - Um processo onde o pH na etapa b) é na faixa de 4,0 a 5,0, ou na faixa de 4,5 a 5,0. É presentemente preferido que o valor de pH seja mantido dentro da faixa especificada por pelo menos 10 minutos, como pelo menos 20 minutos, pelo menos 30 minutos ou pelo menos 60 minutos. - Um processo em que o geopolímero é selecionado do grupo que consiste em: diatomita, kieselguhr, caulim, argila chinesa, bentonita, talco, cinza vulcânica, rocha vulcânica, argila, lignina, lama de perfuração, terra diatomácea, sílica sintética, terra diatomácea tratada na superfície e silicato de metal. O geopolímero interessante é terra diatomácea ou terra diatomácea tratada na superfície. Preferivelmente, o geopolímero é usado em uma quantidade de 0,02g a 0,3 g por ml de suspensão ou solução líquida de lipoproteína e/ou glicolipídeo. - Um processo em que a cepa bacteriana pertence a uma espécie de Bacillus, como Bacillus subtilis ou Bacillus amyloliquefaci- ens, como uma cepa selecionada do grupo que consiste em cepas de Bacillus amyloliquefaciens HSCC 124 (FERM BP-4758) ou IAM 1523, cepas de Bacillus subtilis KS1 (NITE BP-569) e AQ153 (ATCC55614). Cepas bacterianas interessantes são uma cepa selecionada do grupo que consiste em cepas de Bacillus amyloliquefaciens HSCC 124 (FERM BP-4758) ou IAM 1523, cepas de Bacillus subtilis KS1 (NITE BP-569) e AQ153 (ATCC55614). - Um processo em que a lipoproteína e/ou o glicolipídeo são selecionados do grupo que consiste em surfactina, iturina, plipasta- tina, artrofactina, serravetina e fengicina ou derivados de qualquer um destes.

[0032] Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a um processo para a colheita de uma lipoproteína e/ou um glicolipídeo de uma suspensão ou solução líquida (a dita suspensão ou solução contém a lipoproteína ou glicolipídeo), um método compreendendo: a) colocar um geopolímero em contato com a suspensão ou solução líquida; e b) permitir o geopolímero adsorver (ou ligar) a lipoproteína ou glicolipídeo; e c) separar o geopolímero do líquido; e d) opcionalmente separar a lipoproteína ou o glicolipídeo do geopolímero, por exemplo, por dessorção da lipoproteína e/ou do glico- lipídeo.

[0033] Uma modalidade do segundo aspecto refere-se a um processo para a colheita de uma lipoproteína e/ou um glicolipídeo de um líquido (o dito líquido contém a lipoproteína ou o glicolipídeo), um método compreendendo: a) colocar em contato um geopolímero com o líquido; e b) permitir o geopolímero adsorver (ou ligar) a lipoproteína ou o glicolipídeo; e c) separar o geopolímero do líquido; e d) opcionalmente separar a lipoproteína ou o glicolipídeo do geopolímero, por exemplo, por dessorção da lipoproteína e/ou do glico- lipídeo.

[0034] Uma modalidade interessante do segundo aspecto refere-se ao processo em que a suspensão ou solução líquida é obtida: i) cultivando uma cepa bacteriana (que é capaz de produzir a lipoproteína e/ou o glicolipídeo) em um meio de crescimento líquido adequado, obtendo, assim, uma suspensão ou solução líquida de lipo- proteína e/ou glicolipídeo; e ii) opcionalmente remover as células bacterianas da suspensão ou solução; e iii) opcionalmente romper as células bacterianas.

[0035] Outra modalidade interessante do segundo aspecto é um processo para a preparação de uma composição seca que compreende uma lipoproteína e/ou um glicolipídeo, um método compreendendo: i) cultivar uma cepa bacteriana (que é capaz de produzir a lipoproteína e/ou o glicolipídeo) em um meio de crescimento líquido adequado, obtendo, assim, uma suspensão ou solução líquida de lipopro- teína e/ou glicolipídeo; e ii) opcionalmente remover as células bacterianas da suspensão ou solução; e iii) opcionalmente romper as células bacterianas; e a) colocar um geopolímero em contato com a suspensão ou solução; e b) permitir o geopolímero adsorver a lipoproteína ou glicoli- pídeo; e c) separar o geopolímero da suspensão ou solução líquida; e d) opcionalmente separar a lipoproteína e/ou o glicolipídeo do geopolímero, por exemplo por dessorção da lipoproteína e/ou do gli- colipídeo; e e) opcionalmente adicionar um excipiente (como veículo ou um protetor) à fração contendo lipoproteína/glicolipídeo; e f) secar, por exemplo secagem por atomização, secagem por congelamento ou secagem a vácuo, a fração contendo lipoproteína e/ou glicolipídeo.

[0036] Como adsorvente, é presentemente preferido um geopolí- mero selecionado do grupo que consiste em: um biomineral, um geomineral, diatomita, kieselguhr, caulim, argila chinesa, bentonita, talco, cinza vulcânica, rocha vulcânica, argila, lignina, lama de perfuração, terra diatomácea, terra diatomácea tratada na superfície, sílica sintética e silicato de metal. Presentemente, os adsorventes preferidos são bio- minerais. Presentemente, o geopolímero mais preferido é terra diatomá- cea (por exemplo tratada na superfície ou ativada, por exemplo através de tratamento térmico).

[0037] O geopolímero é normalmente usado em uma quantidade de 0,02g a 0,3 g por ml de suspensão ou solução líquida de lipoproteína e/ou glicolipídeo, mas é contemplado que podem ser usadas outras quantidades, por exemplo de 0,005 a 0,02 g/ml, ou mais alto que 0,3 g/ml, dependendo da quantidade de metabólito na solução ou suspensão, e no geopolímero. É presentemente preferido usar um biomineral como adsorvente, e mais preferivelmente terra diatomácea. Se o biomineral é usado, a quantidade presentemente preferida é na faixa de 0,020,2 g/ml, ou mais preferivelmente na faixa de 0,04 a 0,1 g/ml.

[0038] As etapas de processo a, b, c e d podem ser executadas em uma temperatura na faixa de 0 a 50°C, como nas faixas de 5 a 30°C ou 15 a 25°C, mas é presentemente preferido que o processo seja executado à temperatura ambiente (ao redor de 20°C). Afi m de acelerar o processo, a etapa que permite o geopolímero adsorver a lipoproteína ou o glicolipídeo (isto é, a etapa de incubação) preferivelmente inclui agitação do líquido, por exemplo a 25 rpm ou mais rapidamente. O pH pode ser otimizado pelo versado, é presentemente preferido que o pH do líquido seja ajustado antes ou durante o contato com o geopolímero, como para um pH na faixa de 4 a 10.

[0039] Outras modalidades interessantes do segundo aspecto são: - um processo em que a etapa de adsorção b) é realizada a um pH na faixa de 3 a 10, como na faixa de 3,5 a 7 ou preferivelmente na faixa de 4 a 5,5. - Um processo em que a etapa de adsorção b) é realizada em uma temperatura na faixa de 0 a 50°C, como na fa ixa de 5 a 40°C ou preferivelmente na faixa de 10 a 30°C. - Um processo em que a etapa de adsorção b) é realizada durante um período de tempo na faixa de 0,1 a 24h, como na faixa de 0,5 a 10h ou preferivelmente na faixa de 1 a 4h. - Um processo em que a etapa d), se presente, é realizada a um pH na faixa de 3 a 10, como na faixa de 3,5 a 7 ou preferivelmente na faixa de 4 a 5,5. - Um processo em que a etapa d), se presente, é realizada em uma temperatura na faixa de 0 a 50°C, como na fa ixa de 5 a 40°C ou preferivelmente na faixa de 10 a 30°C. - Um processo em que a etapa d) é realizada durante um período de tempo na faixa de 0,1 a 24h, como na faixa de 0,5 a 10h ou preferivelmente na faixa de 1 a 4h. - Um processo em que o geopolímero é um biomineral, como kieselguhr. - Um processo em que o geopolímero é um geomineral, como perlita. - Um processo em que o geopolímero é sob a forma de pó. - Um processo é/são um lipopeptídeo. - Um processo é/são uma surfactina. onde onde lipoproteína lipoproteína e/ou e/ou um um glicolipídeo glicolipídeo - Um processo é/são uma iturina. onde lipoproteína e/ou um glicolipídeo - Um processo é/são uma fengicina. - Um processo onde onde lipoproteína lipoproteína e/ou e/ou um um glicolipídeo glicolipídeo é/são uma mistura que compreende lipopeptídeos das famílias surfac- tina, iturina e fengicina.

[0040] O processo pode ser usado para colher lipopeptídeos/glico- lipídeos de qualquer líquido, mas é preferido que o líquido seja um fermentado ou sobrenadante obtidos por meio de fermentação de um meio de crescimento com um micro-organismo, como uma cepa de uma bactéria. É presentemente preferido que a cepa bacteriana pertença a uma espécie Bacillus, como Bacillus subtilis ou Bacillus amyloliquefaciens. Exemplos dessas cepas são cepas selecionadas do grupo que consiste em cepas de Bacillus amyloliquefaciens HSCC 124 (FERM BP-4758) ou IAM 1523, ou cepas de Bacillus subtilis KS1 (NITE BP-569) ou AQ153 (ATCC55614). Uma cepa interessante é QST713 (NRRL B-21661).

[0041] Em uma modalidade específica do processo, a lipoproteína e/ou o glicolipídeo é/são selecionado(s) do grupo que consiste em sur- factina, iturina, plipastatina, artrofactina, serravetina, gageotetrina (A, B ou C), gageostatina (A, B ou C), e fengicina ou derivados de qualquer um destes. Presentemente, as lipoproteínas mais interessantes são das famílias surfactina, iturina e fengicina. Se a lipoproteína e/ou o glicolipí- deo é/são encontrado(s) intracelularmente, as células podem ser rompidas, por exemplo mecânica, ultrassônica, química ou enzimatica- mente.

[0042] O segundo aspecto compreende as modalidades seguintes:

[0043] Modalidade 1: Um processo para a colheita de um lipopeptí- deo das famílias surfactina, iturina e fengicina de uma suspensão ou solução líquida, um método compreendendo: a) colocar em contato um biomineral (como terra diatomá- cea) com a suspensão ou solução líquida, como um meio de cultura de Bacillus; e b) permitir o biomineal adsorver (ou ligar) o lipopeptídeo; e c) separar o biomineral do líquido; e d) opcionalmente separar o lipopeptídeo do biomineral, por exemplo por dessorção do lipopeptídeo.

[0044] Neste processo a etapa de adsorção b) é preferivelmente realizada a um pH na faixa de 3 a 10, como na faixa de 3,5 a 7, na faixa de 4 a 9, na faixa de 5 a 8 ou na faixa de 4 a 5,5. É presentemente mais preferido adsorver sob o pH do meio de cultura, que normalmente é na faixa de 5,5 a 7.

[0045] Modalidade 2: Um processo para a colheita de um lipopeptí- deo das famílias surfactina, iturina e fengicina de uma suspensão ou solução líquida, um método compreendendo: a) colocar em contato um geomineral (como perlita) com a suspensão ou solução líquida, como um meio de cultura de Bacillus; e b) permitir o geomineal adsorver (ou ligar) o lipopeptídeo; e c) separar o geomineral do líquido; e d) opcionalmente separar o lipopeptídeo do geomineral, por exemplo por dessorção do lipopeptídeo.

[0046] Neste processo a etapa de adsorção b) é preferivelmente realizada a um pH na faixa de 3 a 10, como na faixa de 3,5 a 7, na faixa de 4 a 7, na faixa de 5 a 7 ou na faixa de 4 a 5,5,

[0047] É presentemente mais preferido adsorver sob o pH do meio de cultura, que normalmente é na faixa de 5,5 a 7.

[0048] Deveria ser entendido que os primeiro e segundo aspectos da invenção podem ser combinados, por exemplo, o processo do segundo aspecto pode ser executado em qualquer suspensão ou solução que surja durante o processo do primeiro aspecto, como o sobrenadante após a colheita do material de biomassa/esporo.

[0049] Um terceiro aspecto da presente invenção refere-se a uma composição obtenível por um processo do segundo aspecto da invenção. Uma tal composição poderia consistir substancialmente em um ge- opolímero em combinação com uma lipoproteína e/ou um glicolipídeo.

[0050] Uma modalidade interessante é uma composição que compreende um geopolímero; e uma lipoproteína e/ou glicolipídeo, em que pelo menos 10%, como pelo menos 30% ou pelo menos 50% (p/p) da lipoproteína e/ou glicolipídeo são adsorvidos (ou ligados) na superfície do geopolímero.

[0051] Composições especialmente interessantes, conforme o aspecto acima são: - uma composição em que o geopolímero é um biomineral, como kieselguhr. - Uma composição em que o geopolímero é um geomine- ral, como perlita. - Uma composição em que o geopolímero está na forma de pó. - Uma composição onde a lipoproteína e/ou um glicolipí- deo é/são um lipopeptídeo. - Uma composição onde a lipoproteína e/ou um glicolipí- deo é/são uma surfactina. Uma composição onde a lipoproteína e/ou um deo é/são uma iturina. - Uma composição onde a lipoproteína e/ou um glicolipí- deo é/são uma fengicina. Uma composição onde a lipoproteína e/ou deo é/são uma mistura que compreende lipopeptídeos das famílias sur- factina, iturina e fengicina.

[0052] Se uma faixa de pH é especificada de acordo com um processo desta invenção, é presentemente preferido que o valor de pH seja mantido dentro da faixa especificada por pelo menos 10 minutos, como pelo menos 20 minutos, pelo menos 30 minutos ou pelo menos 60 minutos.

[0053] Um quarto aspecto da presente invenção refere-se ao uso de um geopolímero como adsorvente para uma lipoproteína ou um glicolipídeo, ou o uso de um geopolímero para a colheita de uma lipo- proteína ou um glicolipídeo de um meio de cultura.

[0054] Um quinto aspecto da presente invenção refere-se ao uso de um geopolímero como para auxiliar na colheita da biomassa, por exemplo em um processo para a colheita de esporos após o ajuste de ácido do meio de cultura.

[0055] Modalidades interessantes de qualquer aspecto de uso são: - um uso em que o geopolímero é um biomineral, como Um uso em que o geopolímero é um geomineral, como Um uso em que o geopolímero é na forma de pó. - Um uso em que o meio contém uma lipoproteína e/ou gli- colipídeo. - Um uso onde a lipoproteína e/ou um glicolipídeo é/são um lipopeptídeo. - Um uso onde a lipoproteína e/ou um glicolipídeo é/são uma surfactina. - Um uso onde a lipoproteína e/ou um glicolipídeo é/são uma iturina. - Um uso onde a lipoproteína e/ou um glicolipídeo é/são uma fengicina. - Um uso onde a lipoproteína e/ou um glicolipídeo é/são uma mistura que compreende lipopeptídeos das famílias surfactina, itu- rina e fengicina.

[0056] Um sexto aspecto da presente invenção refere-se a uma composição obtenível por um processo do primeiro aspecto da invenção, uma tal composição compreendendo esporos de Bacillus subtilis, uma composição compreendendo esporos de Bacillus amyloliquefaci- ens e/ou um geopolímero e esporos de Bacillus. A composição poderia ser aplicada às plantas como uma suspensão líquida ou como um pó. As composições da invenção poderiam compreender um excipiente, como um geopolímero.

DEFINIÇÕES

[0057] No contexto presente, o termo geopolímero inclui geomine- rais, biominerais, minerais de origem geológica ou biológica, material de pedra sedimentar (por exemplo pó) e polímero à base de silício. Exemplos sobre geopolímeros são dados em WO2015024672A1. Presentemente, os geopolímeros preferidos são kieselguhr, diatomita, terra dia- tomácea, caulim (argila chinesa), bentonita, talco, cinza vulcânica, rocha vulcânica, argila, perlita, lignina, lama de perfuração, terra diatomácea, sílica sintética etc., o dito material sendo opcionalmente modificado, por exemplo tratado com agentes químicos ou calor. O termo abrange tanto material seco como material molhado. O geopolímero é preferivelmente usado como um pó. Se necessário, o geopolímero pode ser moído para obter partículas (ou um pó). O tamanho das partículas de geopolímero pode variar, dependendo do geopolímero e/ou do método selecionado para a separação das partículas do meio de cultura gasto ou sobrena- dante e/ou o uso intencionado do produto resultante. É presentemente preferido que o tamanho de partícula seja na faixa de 3 micrômetros a mais de 1 milímetro, 10 a 200 micrômetros sendo mais preferido.

[0058] No contexto presente, o termo lipoproteína inclui lipopeptí- deos. Os termos podem ser usados alternadamente com biotensoativo. O lipopeptídeo pode se originar de uma cepa produtora de lipopeptídeo, por exemplo de Bacillus subtilis ou Bacillus amyloliquefaciens. Pode ser um composto do tipo iturina, um composto do tipo surfactina, um composto do tipo fengicina ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o lipopeptídeo é uma combinação de um composto do tipo iturina, um composto do tipo surfactina e um composto do tipo fengicina. Em outras modalidades, o lipopeptídeo é uma combinação de um com-posto do tipo iturina e um composto do tipo surfactina; uma combinação de um composto do tipo iturina e um composto do tipo fengicina; ou uma combinação de um composto do tipo surfactina e um composto do tipo fengicina. Em algumas modalidades, a concentração total do lipopeptí- deo descrito acima é pelo menos 1 mg/g, pelo menos 2 mg/g, pelo menos 3 mg/g, pelo menos 4 mg/g, pelo menos 5 mg/g, pelo menos 6 mg/g, pelo menos 7 mg/g, pelo menos 8 mg/g, pelo menos 9 mg/g, pelo menos 10 mg/g, pelo menos 11 mg/g, pelo menos 12 mg/g, pelo menos 13 mg/g, pelo menos 14 mg/g ou pelo menos 15 mg/g na biomassa da cepa de, por exemplo, Bacillus subtilis ou Bacillus amyloliquefaciens. Em uma modalidade, o lipopeptídeo é um composto do tipo iturina. O composto do tipo iturina pode ser bacilomicina D, bacilomicina F, bacilomicina L, bacilomicina LC (bacilopeptina), micossubtilina, iturina A, iturina AL ou Iturina C. Em outra modalidade, o lipopeptídeo é um composto do tipo fengicina. O composto do tipo fengicina pode ser fengicina A, fengicina B, plipastatina A, plipastatina B ou um agrastatina. Em ainda outra mo-dalidade, o lipopeptídeo é um composto do tipo surfactina. O composto do tipo surfactina pode ser esperina, liquenisina, pumilacidina ou surfac- tina.

[0059] O uso dos termos "um", "uma, "o" e "a" e referências similares no contexto de descrever a invenção (especialmente no contexto das reivindicações a seguir) será interpretado para abranger tanto singular como o plural, a menos que do contrário indicado aqui ou claramente contradito pelo contexto. Os termos "compreendendo", "tendo", "incluindo" e "contendo" serão interpretados como termos em aberto (isto é, significando "incluindo, mas não limitado a") a menos que do contrário observado. A citação de faixas de valores aqui é meramente intencionada para servir como um método de abreviação ao referir-se, individualmente, a cada valor separado que se enquadre na faixa, a menos que do contrário indicado aqui, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se fosse citado individualmente aqui. Todos os métodos descritos aqui podem ser executados em qualquer ordem adequada, a menos que do contrário indicado aqui ou do contrário cla-ramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer um e todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, "como") fornecidos aqui, é intencionado meramente para melhor elucidar a invenção e não acarreta uma limitação do escopo da invenção, a menos que do contrário reivindicado. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser in-terpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Obtenção da biomassa de Bacillus subtilis e Bacillus amylo- liquefaciens

[0060] As cepas de Bacillus foram essencialmente cultivadas como revelado em [6]. Mais especificamente, uma cepa de Bacillus subtilis foi inoculada em um meio de crescimento típico (compreendendo, em por-centagens de p/v, 4% glicose, 4% extrato de levedura, 0,004% sulfato de manganês, 0,003% cloreto de cálcio, 0,1% sulfato de amônio, 0,4% sulfato de magnésio, 0,05% fosfato de dissódio e 0,05% fosfato de di- potássio). Fermentação foi realizada em frascos de 500 ml com 100 ml de meio em uma temperatura de 30 graus centígrados e 200 rpm em um agitador orbital. Cada Erlenmeyer foi inoculado com 10 ml de uma suspensão bacteriana. A cultura de B. subtilis foi fermentada a pH 7,5.

Exemplo 2. Colheita da biomassa ativa alta de cepa de Bacillus

[0061] Após fermentação final, o pH do meio de cultura obtido no exemplo 1 foi ajustado de pH 7,5 para pH 5,5. O meio de cultura foi agitado suave (aprox. 50 rpm) em temperatura ambiente por 1 h. Após agitação final, a biomassa foi isolada através de filtração. A biomassa isolada foi colhida em um béquer apropriado e o pH ajustado para pH 7,2. A biomassa com pH ajustado foi agitada suavemente por 1 h a 50 rpm antes da secagem por congelação.

Exemplo 3. Colheita da biomassa ativa alta de cepa de Bacillus

[0062] Após fermentação final, o pH do meio de cultura obtido no exemplo 1 foi ajustado de pH 7,5 para pH 4,5. O meio de cultura foi agitado suavemente (aprox. 50 rpm) em temperatura ambiente por 1 h. Após agitação final, a biomassa foi isolada através de filtração. A biomassa isolada foi colhida em um béquer apropriado e o pH ajustado para 7,2. A biomassa com pH ajustado foi agitada suavemente por 1 h a 50 rpm antes da secagem por congelação.

Exemplo 4. Colheita da biomassa ativa alta de cepa de Bacillus

[0063] Após fermentação final (EOF), o pH do meio de cultura obtido no exemplo 1 é ajustado de pH 7,5 para pH 4,5. Terra diatomácea é adicionada. O meio de cultura é agitado suavemente à temperatura ambiente por 1 h. Após agitação final, a biomassa foi isolada através de filtração. A biomassa isolada é colhida em um béquer apropriado e o pH é ajustado para 7,2. A biomassa com pH ajustado é agitada por 1 h a 50 rpm e secada por congelação.

Exemplo 5. Colheita da biomassa ativa alta do meio de cultura de cepa de Bacillus

[0064] Três amostras do meio de cultura obtidas no exemplo 1 foram ajustadas para os seguintes valores de pH: 6,0, 5,0 e 4,5, respecti-vamente. Uma quarta amostra do meio de cultura (pH 7,5) foi usada como controle. As amostras foram agitadas suavemente (aprox. 50 rpm) em temperatura ambiente. Após agitação final, a biomassa das amostras foi isolada através de filtração. A biomassa isolada foi colhida em béquer apropriado e o pH ajustado para 7,2 e o teor de metabólitos an- tifúngicos (fengicina, iturina e surfactina) foi medido por HPLC e SRA. Veja tabela 1 abaixo.

Exemplo 6. Adsorção de Fengicina, Iturina e Surfactina em suporte sólido de origem geo e biominerais - colheita de metabólitos ativos de cepas de Bacillus.

[0065] O meio de cultivo de B. subtilis obtido de acordo com o Exemplo 1 foi, após fermentação final, dividido em 3 frações e ajustado para pH 5, pH 7 e pH 8,7 respectivamente. 3,5 g geopolímero (geomineral ou biomineral) foram misturados com 45 ml meio de cultura ajustado para os valores de pH diferentes (0,08 g geo ou biomineral por ml de meio de cultura gasto l. O meio com geo ou biomineral foi incubado à temperatura ambiente por 3 h @25 rpm. Após incubação final, as soluções geo ou biominerais foram isoladas juntamente com a biomassa através de centrifugação. As amostras para análise de lipopeptídeos foram tiradas do meio de cultura com pH ajustado antes da incubação e o sobrenadante isolado usando centrifugação após a incubação. A % de lipopeptídeos adsorvidos no geo/biomineral foi calculada a partir das diferenças em concentrações de lipopeptídeo.

[0066] O material de geo/biominerais testado incluiu:

[001] Referência - apenas esporos (biomassa).

[002] Harborlite 300 (Perlita/Rocha vulcânica).

[003] Harborlite 635 (Perlita/Rocha vulcânica).

[004] Harborlite 900 (Perlita/Rocha vulcânica).

[005] Europerl (Perlita/Rocha vulcânica).

[006] Hyflo Supercel (Celite/terra diatomácea).

[007] Celite 545 (Celite/terra diatomácea).

[008] Filtercel (Terra diatomácea).

[009] Kaoline Supreme (argila chinesa).

[0010] Kaoline Optigloss (argila chinesa).

[0011] Sipernat 50 S - Sílica (sílica Sintética Aerosil/Evonike).

[0012] Aerosil 380 F - Sílica (sílica Sintética Aerosil/Evonike).

[0067] As amostras colhidas foram armazenadas a -20°C/-50°C até análise adicional do teor de lipopeptídeo por HPLC e SRA. Os resultados para adsorção de metabólitos Fengicina, Iturina e Surfactina para os diferentes geo/biominerais estão resumidos na tabela 2 abaixo:

[0068] O meio de cultura com pH ajustado utiliza como material de partida para os experimentos de adsorção por batelada lipopeptídeos com uma concentração de aprox. 421 μg/ml (micrograma/ml) para Fen- gicina, 357 μg/ml Iturina e 1141 μg/ml Surfactina.

[0069] Remoção dos metabólitos junto com a biomassa depende fortemente dos valores de pH do meio de cultura. A maioria dos meta- bólitos está associada com a biomassa em pH baixo (pH 5,0). O meta- bólito é liberado da biomassa ao aumentar o pH para o pH 8,7 medido - desse modo, as concentrações de metabólito aumentam no sobrena- dante com o aumento de pH. Iturina parece ser o mais sensível ao pH dos 3 lipopeptídeos investigados. Em pH 8,7, apenas 60% da Iturina oferecida são associados junto com os esporos. O restante pode ser encontrado no sobrenadante.

[0070] Os resultados também revelam que a presença de geo/bio- minerais - aqui classificados como terra diatomácea, pedra vulcânica, caulim ou sílica - no meio de cultura é necessária para capturar os lipo- peptídeos para valores de pH > 5. Todos os minerais testados são ca-pazes para ainda reduzir a quantidade de lipopeptídeos no sobrena- dante em comparação à referência. É evidente que 95% da Fengicina, Iturina e Surfactina disponíveis foram removidos do meio de cultura adicionando os geo/biominerais testados. As propriedades de adsorção dos bio e geominerais testados também revelam que os lipopeptídeos Fengicina, Iturina e Surfactina têm afinidade diferente aos minerais testados. Para maior parte dos minerais testados, o perfil de adsorção dos lipopeptídeos é constante e, desse modo, independente de pH - por exemplo Hyflo Supercel e Celite 545. Para alguns dos geo/biominerais testados, por exemplo Harbolite 635 e Filtercel, ainda é vista uma porcentagem mais alta de remoção dos lipopeptídeos no meio de cultura (em comparação à referência), mas a remoção dos lipopeptídeos no meio de cultura diminuiu ligeiramente com o aumento do pH na faixa de pH 5,0 para pH 8,7.

Exemplo 7. Adsorção de Fengicina, Iturina e Surfactina em suporte sólido de origem de geopolímero - colheita de metabólitos ativos de cepas de Bacillus usando grau de carregamento diferente de Hyflo Supercel.

[0071] O meio de cultivo de B. subtilis (50 L) obtido de acordo com o Exemplo 1 foi dividido, após fermentação final, em 5 frações de 10 L. 4 frações foram ajustadas para pH 5,0 e a última fração foi mantida em pH 7,5.

[0072] A fração de pH 7,5 foi incubada à temperatura ambiente por 2 h @ 25 rpm. Após incubação final, as suspensões de biomassa foram isoladas através de centrifugação. As amostras foram tiradas para análise de lipopeptídeos do meio de cultura antes e após a incubação. A % de lipopeptídeos recuperados nas suspensões de biomassa foi comparada com a dos lipopeptídeos disponíveis no material de partida.

[0073] Para as frações restantes de pH 4 ajustado, 0 kg, 0,2 kg, 0,4 kg e 0,6 kg de HyfloSupercel, correspondendo a um grau de carregamento de 0-0,06 g Hyflo Supercel por ml de meio de cultura gasto, foram acrescentados a cada um do meio de cultura de 10 L. O meio com a quantidade diferente de Hyflo Supercel foi incubado em temperatura ambiente por 2 h @ 25 rpm. Após incubação final, as suspensões de Hyflo Supercel/biomassa foram isoladas através de centrifugação. As amostras para análise de lipopeptídeos foram tiradas, o meio de cultura com pH ajustado antes da incubação e as suspensões de Hyflo Super- cel/biomassa isolados usando centrifugação. A % de lipopeptídeos re-cuperados nas suspensões de Hyflo Supercel/biomassa foi comparada à dos lipopeptídeos disponíveis no material de partida. A manipulação da amostra e análise dos lipopeptídeos foram conforme descritas no exemplo 6.

[0074] O meio de cultura com pH ajustado utiliza como, material de partida para os experimentos de carregamento, lipopeptídeos com uma concentração de aprox. 343 μg/ml para Fengicina, 311 μg/ml para Iturina e 1245 μg/ml para Surfactina.

[0075] A partir da Figura 1 (descrevendo a Recuperação de Fengi- cina, Iturina e Surfactina com graus de carregamento diferentes de Hyflo Supercel) foi demonstrado que o ajuste de pH 7,5 para pH 5,0 tem um efeito significativo na remoção dos lipopeptídeos do meio de cultura. Os resultados da recuperação na Figura 1 também sugerem que a presença de Hyflo Supercel no meio de cultura é necessária para capturar os lipopeptídeos restantes no meio de cultura.

[0076] A recuperação máxima dos lipopeptídeos (65% Fengicina, 92% Iturina e 66% Surfactina) parece desnivelada com um grau de car-regamento mínimo em 0,04 g de Hyflo Supercel/ml de meio de cultura. Exemplo 8. Colheita da biomassa ativa alta de cepa de Bacillus reduzindo o pH do meio de cultura.

[0077] 4 L de meio de cultura de B. subtilis obtido de acordo com o Exemplo 1 foram divididos, após a fermentação final, em 4 frações de 1 L. As 4 frações foram ajustadas para pH 4,5, 5,0, 6,0 e 7,5, respectivamente.

[0078] O meio de cultura com pH ajustado utiliza, como material de partida para os experimentos de adsorção de batelada, lipopeptídeos com uma concentração de aprox. 200 μg/ml para Fengicina, 150 μg/ml para Iturina e 400 μg/ml para Surfactina.

[0079] Para cada uma das frações com pH ajustado - 0,5 ml de meio de cultura foi transferido para um tubo de teste Eppendorf e incubado à temperatura ambiente por 2 h @ 35 rpm em um misturador de sangue. As amostras em triplicata foram preparadas para cada valor de pH exa-minado.

[0080] Após a incubação final, os concentrados de biomassa (pé- lete) foram isolados através de centrifugação durante 10 minutos. O so- brenadante foi removido e transferido para um novo tubo de teste Ep- pendorf.

[0081] A % de distribuição dos lipopeptídeos nos sobrenadantes e pélete isolados, respectivamente, foi medida tirando as amostras do pé- lete e dos sobrenadantes isolados. Os resultados para distribuição de porcentagem de Fengicina, Iturina e Surfactina estão resumidos na tabela 3, dando as concentrações medidas atuais (μg/ml) para os lipopep- tídeos no sobrenadante e no pélete.

Continuação

[0082] É evidente que reduzindo o pH 7,5 para pH 4,5 tem um efeito significativo na remoção dos lipopeptídeos no meio de cultura. Os lipo- peptídeos seguem os pélete isolados com valores de pH decrescentes. O efeito parece desnivelar-se quando o valor de pH do meio de cultura fica abaixo de pH 5. Abaixo de pH 5, todas as concentrações de lipo- peptídeos alcançam valores constantes tanto no sobrenadante (perto de zero) como no pélete (perto de 100%). A concentração total calculada da Fengicina, Iturina e Surfactina é, conforme esperado, mais constante.

Exemplo 9. Colheita da biomassa ativa alta de cepa de Bacillus reduzindo o pH do meio de cultura combinado com o uso de um floculante.

[0083] 3 L de meio de cultura de B. subtilis obtido de acordo com o Exemplo 1, foi dividido, após fermentação final, em 3 frações de 1 L. As 3 frações foram ajustadas para pH 4,5, 5,0 e 7,5, respectivamente.

[0084] Cada fração com pH ajustado foi dividida em 4 amostras de 250 ml. 5 M de solução de matéria-prima de CaCl2 foram usados para ajustar as amostras para 0 M, 50 mM, 100 mM e 200 mM de CaCl2, respectivamente. Cada uma das frações de CaCl2 ajustadas foram in-cubadas à temperatura ambiente por 1 h @ 35 rpm em um misturador de sangue. 0,5 ml de solução foi transferida para um tubo de teste Ep- pendorf e os concentrados de biomassa (pélete) foram isolados através de centrifugação durante 10 minutos. A concentração de Fengicina, Itu- rina e Surfactina foi medida tirando as amostras do pélete e sobrena- dantes isolados. As tabelas abaixo fornecem as concentrações medidas atuais (μg/ml) para os lipopeptídeos no sobrenadante (tabela 5) e no pélete (tabela 4) para as diferentes concentrações de CaCl2 testadas e valores de pH.

[0085] Os resultados do teste revelam que a conc. de CaCl2 e o pH aplicados do meio de cultura de B. subtilis ambos têm uma influência na remoção dos lipopeptídeos Fengicina, Iturina e Surfactina. Com a redução do próprio pH de 7,5 para pH 4,5 (conc. de CaCl2, igual a 0 mM) tem um efeito positivo sobre a remoção dos lipopeptídeos no meio de cultura. Os lipopeptídeos seguem os péletes isolados com valores de pH decrescentes. O efeito parece desnivelar-se quando o valor de pH da cultura alcança o pH médio de 5. Os lipopeptídeos adicionais restantes no meio de cultura podem ser subsequentemente removidos aumentando a concentração de CaCl2 no meio de cultura. É evidente que os lipopeptídeos são isolados junto com a biomassa com o aumento da concentração de CaCl2 e que a concentração dos lipopeptídeos no so- brenadante é ao mesmo tempo reduzida.

[0086] Modalidades preferidas desta invenção são aqui descritas, incluindo o melhor modo conhecido aos inventores para realizar a invenção. Variações dessas modalidades preferidas podem ficar evidentes àqueles de habilidade usual na técnica ao ler a descrição anterior. Os inventores esperam que os versados empreguem tais variações conforme apropriado, e os inventores têm por objetivo que a invenção seja praticada de outro modo que especificamente aqui descrita. Consequentemente, esta invenção inclui todas as modificações e equivalentes do assunto referido nas reivindicações anexadas conforme permitido por lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elementos acima descritos em todas suas possíveis variações é abrangida pela invenção, a menos que do contrário indicado aqui ou do contrário claramente contradito pelo texto. REFERÊNCIAS [1] M. Shoda: Bacterial Control of Plant Disease, Journal of Bioscience and Bioengineering, pp. 515-521, 200. [2] H. P. Bais, R. Fall and J. M. Vivanco: Biocontrol of Bacillus sub- tilis against infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production, Plant Physiology, vol. 134, pp. 307-319, 2004. [3] T. Stein: Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specific functions, Molecular Microbiology, vol. 56, pp. 854-857, 2005. [4] M. Ongena and P. Jacques: Bacillus lipopeptides: versatile weapons for plant disease biocontrol, Applied Microbiology and Biotech-nology, vol. 16, No. 3, pp. 115-125, 2008. [5] US 20150147303 [6] WO14178032A [7] D V Petrovic et al: On the particles size distributions of Diatoma-ceous earth and perlite granulations, J Mechanical Engineering 57, 84350, 2011 [8] CN103478146A, adsorption on macroporous resin [9] WO15024672A1 [10] US5470827

[0087] Todas as referências citadas neste documento de patente são aqui incorporadas, em sua totalidade, a título de referência.

Claims

1. Processo para a colheita de biomassa (células bacterianas e/ou esporos) com atividade fungicida, caracterizado pelo fato de que compreende: a) obter de um meio de cultura através de propagação de uma cepa bacteriana produtora de lipoproteína e/ou glicolipídeo em um meio de crescimento; b) assegurar que o pH do meio de cultura está na faixa de 2,5 a 5,5, por exemplo, por adição de um ácido; c) opcionalmente adicionar um geopolímero, ou antes, du-rante ou após a etapa b); d) separar a biomassa do meio de cultura, por exemplo, por centrifugação ou filtração; e) opcionalmente adicionar um excipiente (como veículo ou um protetor) à biomassa; e/ou opcionalmente ajustar o pH para um pH na faixa de 5,5 a 8,0; e f) opcionalmente secar, por exemplo, secagem por atomi- zação, secagem por congelamento ou secagem a vácuo, a biomassa.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pH na etapa b) é abaixo de 5,7, tal como na faixa de 3,0 a 5,5, na faixa de 3,5 a 5,5, na faixa de 4,0 a 5,3, na faixa de 4,0 a 5,0 ou preferivelmente na faixa de 4,5 a 5,0.

3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que o geopolímero é selecionado do grupo que consiste em: diatomita, kieselguhr, caulim, argila chinesa, bentonita, talco, cinza vulcânica, rocha vulcânica, argila, lignina, lama de perfuração, terra diatomácea, sílica sintética, terra diatomácea tratada na superfície e silicato de metal, preferencialmente, o geopolímero é terra diatomácea ou terra diatomácea tratada na superfície.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o geopolímero é usado em uma quantidade de 0,02g a 0,3 g por ml de suspensão ou solução líquida de lipoproteína e/ou glicolipídeo.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a cepa bacteriana pertence a uma espécie de Bacillus, como Bacillus subtilis ou Bacillus amyloliquefaci- ens, como uma cepa selecionada do grupo que consiste em cepas de Bacillus amyloliquefaciens HSCC 124 (FERM BP-4758) ou IAM 1523, cepas de Bacillus subtilis KS1 (NITE BP-569) e AQ153 (ATCC55614).

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a lipoproteína e/ou o glicolipídeo é/são selecionado(s) do grupo que consiste em surfactina, iturina, pli- pastatina, artrofactina, serravetina e fengicina ou derivados de qualquer um destes.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que um floculante (por exemplo CaCl2) é acrescentado ao meio de cultura antes da separação da biomassa.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o pH é mantido na faixa de 4,5 a 7,5 durante a floculação, por exemplo ao redor pH 5.

9. Processo para a colheita de uma lipoproteína e/ou um gli- colipídeo a partir de uma suspensão ou solução líquida, caracterizado pelo fato de que compreende: a) colocar um geopolímero em contato com a suspensão ou solução líquida; e b) permitir o geopolímero adsorver (ou ligar) a lipoproteína ou glicolipídeo; e c) opcionalmente, adicionar um floculante (por exemplo CaCl2) ao meio de cultura; e d) separar o geopolímero do líquido para obter uma composição compreendendo o geopolímero e lipoproteína e/ou glicoli- pídeo absorvido; e e) opcionalmente separar a lipoproteína ou glicolipídeo do geopolímero, por exemplo, por dessorção da lipoproteína e/ou do glico- lipídeo, em que a etapa de absorção b) é realizada a um pH na faixa de 3,0 a 10, tal como na faixa de 3,5 a 7, ou na faixa de 4,0 a 5,5.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o geopolímero é selecionado do grupo que consiste em: um biomineral, um geomineral, caulim, argila chinesa, bentonita, talco, cinza vulcânica, rocha vulcânica, argila, lig- nina, lama de perfuração, terra diatomácea (incl. terra diatomácea tratada na superfície), sílica sintética e silicato de metal, preferencialmente, o geopolímero é terra diatomácea ou terra diatomácea tratada na super-fície.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o geopolímero é usado em uma quantidade de 0,02g a 0,3 g por ml de suspensão ou solução líquida de lipoproteína e/ou glicolipídeo.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a cepa bacteriana pertence a uma espécie de Bacillus, como Bacillus subtilis ou Bacillus amyloli- quefaciens, por exemplo uma cepa selecionada do grupo que consiste em cepas de Bacillus amyloliquefaciens HSCC 124 (FERM BP-4758) ou IAM 1523, cepas de Bacillus subtilis KS1 (NITE BP-569), QST713 (NRRL B-21661) e AQ153 (ATCC55614), ou mutantes ou variantes de qualquer uma destas.

13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a lipoproteína e/ou o glicoli- pídeo é/são selecionado(s) do grupo que consiste em surfactina, iturina, plipastatina, artrofactina, serravetina, gageotetrina (A, B ou C), gageos- tatina (A, B ou C) e fengicina, e derivados de qualquer um destes.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado pelo fato de que é para a colheita de uma lipoproteína e/ou um glicolipídeo de uma suspensão ou solução líquida, através de um método que compreende: a) colocar um floculante em contato com a suspensão ou solução líquida; e b) separar a lipoproteína e/ou o glicolipídeo do líquido.