CN103788186A - 一种Fengycin的工业级制备液相色谱精制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于天然产物提取领域，从枯草芽孢杆菌的发酵液中，酸沉后得到抗菌粗提物，通过HPLC优化条件得到合适的流动相和柱分离条件，进一步放大到工业制备级液相色谱分离系统，精制得到高纯度的Fengycin。本发明的优点是，粗提物使用工业制备级液相色谱分离制备所需物质，可达到较好的分离提纯效果，所需溶剂成本低，操作简单，周期短，效率高，纯度可达99%以上。
Description
技术领域
本发明属于天然产物提取领域，具体涉及一种Fengycin的制备方法。
背景技术
枯草芽孢杆菌代谢产物中的活性物质主要是抗菌肽和活性蛋白类物质，其分离纯化方法很多。吕树娟等人采用阴离子交换柱DEAE-Sepharose FF、疏水柱SOURCE 15 PHE、分子筛柱Sephacry1 S-200HR和反相C18柱对Bacillus subtilis JA-206粗提液多步分离纯化后得到三种抗菌肽。易有金等人采用了硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose FF柱层析、FPLC Phenyl FF疏水色谱柱、HPLC C18反相色谱柱的方法，从枯草芽孢杆菌B-001的代谢产物中分离得到一种抗菌蛋白，该纯化的抑菌蛋白对青枯病菌有强烈的抑制作用。别小妹等人采用了SephadexLH-20柱层析、HPLC等方法，从枯草芽孢杆菌fmbJ的代谢产物中分离得到具有广谱抑菌活性的脂肽类物质Surfatin和Fengycin。虽然国内对枯草芽孢杆菌发酵液的研究较多，但从中分离中单一高纯度的抗菌物质Fengycin，并实现工业化生产，还存在很大的技术和工艺上的问题。
发明内容
本发明的目的在于针对目前在制备高纯度Fengycin过程中所存在的时间长以及纯度不高的问题，提供一种采用工业制备级液相色谱分离系统制备高纯度Fengycin新方法，该方法包括以下步骤：
a. 将枯草芽孢杆菌发酵液用HCl调节pH 至2，静止于4℃环境下，离心收集沉淀，加甲醇溶解得抗菌粗提物；
b.采用HPLC优化Fengycin的最佳分离洗脱条件，将其等比例放大，应用在填充十八烷基反相硅胶填料的动态轴向压缩柱上进行分离，在线收集Fengycin对应谱带的馏分；
c.将步骤b中收集的对应谱带洗脱液减压干燥，即可得到色谱纯为99%的Fengycin。
本发明的有益效果是直接采用枯草芽孢杆菌发酵液提取后的抗菌粗提物来制备Fengycin，不需要大量的前处理过程，简单、易控制，工艺技术简化，适用于大规模制备。高效液相色谱测定中，总杂质峰小于1.0%，纯度大于99%，完全可用于食品和药物的开发。
具体实施方式
实施例1
1. 将枯草芽孢杆菌发酵液用HCl调节pH 至2，静止于4℃环境下12 h， 5000 rpm离心收集沉淀，加入5~10ml甲醇溶解得抗菌粗提物；
2.将抗菌粗提物溶液注入动态轴向压缩柱制备色谱系统，动态轴向压缩柱尺寸为Φ50×250mm，十八烷基反相硅胶填料粒径为10μm，上样量5ml，流动相流速为80ml/min。分离初期，流动相甲醇与水体积比范围为30/70~80/20，洗脱40min后，流动相甲醇与水的体积比切换为95/5，洗脱至65min，使后端杂质冲洗出来，一个分离周期结束。采用的紫外光度检测器的检测波长为230nm，收集保留时间在25~36min的馏分，经HPLC分析纯度≥99.2%。
实施例2
1. 将枯草芽孢杆菌发酵液用HCl调节pH 至2，静止于4℃环境下24 h， 10000 rpm离心收集沉淀，加入5~10ml甲醇溶解得抗菌粗提物；
2.将抗菌粗提物溶液注入动态轴向压缩柱制备色谱系统，动态轴向压缩柱尺寸为Φ50×250mm，十八烷基反相硅胶填料粒径为10μm，上样量8ml，流动相流速为80ml/min。分离初期，流动相甲醇与水体积比范围为30/70~70/30，洗脱45min后，流动相甲醇与水的体积比切换为95/5，洗脱至70min，使后端杂质冲洗出来，一个分离周期结束。采用的紫外光度检测器的检测波长为230nm，收集保留时间在25.5~41min的馏分，经HPLC分析纯度≥99.4%。
实施例3
1. 将枯草芽孢杆菌发酵液用HCl调节pH 至2，静止于4℃环境下24 h， 10000 rpm离心收集沉淀，加入5~10ml甲醇溶解得抗菌粗提物；
2.将抗菌粗提物溶液注入动态轴向压缩柱制备色谱系统，动态轴向压缩柱尺寸为Φ50×250mm，十八烷基反相硅胶填料粒径为10μm，上样量10ml，流动相流速为80ml/min。分离初期，流动相甲醇与水体积比范围为30/70~70/30，洗脱45min后，流动相甲醇与水的体积比切换为95/5，洗脱至70min，使后端杂质冲洗出来，一个分离周期结束。采用的紫外光度检测器的检测波长为230nm，收集保留时间在26 ~43.5min的馏分，经HPLC分析纯度≥99%。
Claims (3)
1.一种Fengycin的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将枯草芽孢杆菌发酵液用HCl调节pH 至2，静止于4℃环境下12~24h， 5000~10000rpm离心收集沉淀，加甲醇溶解得抗菌粗提物；
（2）将抗菌粗提物通过进样泵或者进样阀注入动态轴向压缩制备色谱系统；
（3）采用甲醇和水做流动相，梯度洗脱，将色谱峰对应的流出液进行减压干燥，即可得到高纯度的Fengycin。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述步骤（2）中，在制备色谱系统中，采用动态轴向压缩柱，规格为Φ50×250mm~Φ150×250mm，且所填充固定相为十八烷基反相硅胶填料，粒径为10μm~45μm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述步骤（3）中，梯度洗脱时，流动相甲醇与水的体积比（V/V）范围为3:7~4:1。
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| WO2017081201A1 (en) * | 2015-11-10 | 2017-05-18 | Chr. Hansen A/S | Microbial pesticidal composition and production thereof |
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