CN114410522A - 一种复合微生物菌剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合微生物菌剂及其应用。该复合微生物菌剂由降解木质素的枯草芽孢杆菌‑巨大芽孢杆菌融合子R3及降解纤维素的青霉‑毛霉融合子RZ1复配而成，其中，所述枯草芽孢杆菌‑巨大芽孢杆菌融合子R3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021420，保藏地址为武汉市武昌区珞珈武汉大学保藏中心，邮编为430072；所述青霉‑毛霉融合子RZ1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211163，保藏地址为武汉市武昌区珞珈武汉大学保藏中心，邮编为430072。本发明结合融合子制备技术、最佳混合保护剂配方研发、菌剂应用模式效果探究及菌种复配策略等，最终制备得到一种能高效降解作物秸秆的复合微生物菌剂。
Description
技术领域
本发明属于微生物菌剂降解废弃物技术领域，尤其涉及一种高效降解秸秆的复合微生物菌剂及其应用。
背景技术
木质素和纤维素均为常见的难降解物质，主要存在于农作物废弃秸秆和造纸工业废水中，导致资源的严重浪费和环境污染。与传统物理、化学降解法相比，能耗低、清洁度高和对环境友好的生物法降解农作物秸秆正成为研究热点。
生物法主要运用纤维素降解菌或复合菌株代谢过程中合成的酶对秸秆进行分解及资源利用。作物秸秆的主要结构成分为：纤维素、半纤维素、木质素、果胶等。单菌降解秸秆虽具有高酶活力的优势，但酶系不完整，其对秸秆的降解效果不明显。复合微生物菌剂可从结构上降低秸秆结晶度，加快秸秆降解速度，提高秸秆降解率。然而，受环境条件的影响，复合微生物菌剂在秸秆降解过程中代谢缓慢，导致其降解速度逐渐下降，微生物活性降低或丧失，无法达到预期降解效果。因此，生产中急需研发降解率高、环境耐受性强、生物安全性高的新型微生物菌剂，用于作物秸秆的生物降解。
细胞融合技术是近30多年来迅速发展的一项新兴细胞工程技术，作为细胞工程的核心基础技术之一，已在农业、畜牧业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果，而且应用领域不断扩大。运用细胞融合技术对菌种进行遗传改良、培育，可以为制备高效降解作物秸秆的微生物菌剂提供一种新途径。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种高效降解秸秆的复合微生物菌剂，旨在解决现有农作物秸秆降解率低的问题。
本发明的另一目的在于提供上述复合微生物菌剂的应用。
本发明是这样实现的，一种复合微生物菌剂，该复合微生物菌剂由降解木质素的枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3及降解纤维素的青霉-毛霉融合子RZ1复配而成，其中，所述枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3于2021 年4月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021420，保藏地址为武汉市武昌区珞珈武汉大学保藏中心，邮编为430072；所述青霉-毛霉融合子RZ1于2021年9月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211163，保藏地址为武汉市武昌区珞珈武汉大学保藏中心，邮编为430072。
优选地，所述枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3、青霉-毛霉融合子RZ1 均为冻干粉制品，该冻干粉制品的制备过程为：
(1)对菌株培养液进行离心，收集菌体、无菌水洗涤，得到菌泥；
(2)将保护剂、菌泥混合得到菌悬液，-20℃预冻12h，-50℃冷冻干燥机冻干处理48h，得到冻干粉制品。
优选地，在枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3冻干粉制品中，所述保护剂添加量为5～20g/100mL，且所述保护剂包括12.95g/100mL脱脂奶粉、 10.25g/100mL谷氨酸钠、7.7g/100mL甘露醇。
优选地，在青霉-毛霉融合子RZ1冻干粉制品中，所述保护剂添加量为5～20 g/100mL，且所述保护剂包括18.65g/100mL脱脂奶粉、5.6g/100mL蔗糖、13.55 g/100mL甘露醇。
优选地，所述复合微生物菌剂中，所述枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子 R3与青霉-毛霉融合子RZ1的质量比为6～8:1。
优选地，所述枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3以枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium de Bary)为亲本并通过PEG诱导法进行细胞融合而成；所述青霉-毛霉融合子RZ1由青霉(Penicillium)和毛霉(Mucor)为亲本并通过PEG诱导法进行细胞融合而成。
本发明进一步公开了上述复合微生物菌剂在降解作物秸秆、降解木质素和/ 或纤维素中的应用。
本发明进一步公开了上述复合微生物菌剂在制备降解木质素的关键酶中的应用，所述关键酶包括过氧化物酶、锰过氧化物酶以及漆酶。
发明进一步公开了上述复合微生物菌剂在制备降解纤维素的关键酶中的应用，所述关键酶包括内切纤维素酶、外切纤维素酶以及β-葡萄糖苷酶。
本发明克服现有技术的不足，提供一种高效降解秸秆的复合微生物菌剂及其应用。
本发明从盐城大丰麋鹿自然保护区麋鹿粪便样品中筛得融合子菌株的亲本，在此基础上，本发明利用PEG诱导方法对亲本菌株进行融合，筛选出高效稳定的降解木质素的枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3和降解纤维素的青霉-毛霉融合子RZ1，并优化其产酶条件，其过程包括：菌株的分离纯化及初筛、复筛、PEG法诱导融合、融合子的筛选、融合子遗传稳定性检测、产酶条件优化。本发明枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3于2021年4月21号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021420，保藏地址为武汉市武昌区珞珈武汉大学保藏中心，邮编为430072；青霉-毛霉融合子RZ1 于2021年9月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO： M 20211163，保藏地址为武汉市武昌区珞珈武汉大学保藏中心，邮编为430072。
在此基础上，本发明公开了一种由降解木质素的枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3及降解纤维素的青霉-毛霉融合子RZ1复配而成的复合微生物菌剂，为便于销售和使用，本发明复合微生物菌剂由枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3的冻干粉制品、青霉-毛霉融合子RZ1的冻干粉制品复配而成；冻干粉制品由菌泥和保护剂构成。
本发明结合融合子制备技术、最佳混合保护剂配方研发、菌剂应用模式效果探究及菌种复配策略等，最终制备得到一种能高效降解作物秸秆的复合微生物菌剂。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明中融合子亲本筛选自大丰野生麋鹿粪便，制备出的高效木质素降解融合子R3及纤维降解融合子RZ1，菌种来源安全，遗传稳定性较好。
(2)本发明制备得到的融合子菌株R3及融合子菌株RZ1与亲本相比，3 种木质素降解关键酶(过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)、漆酶(Lac)) 的酶活比值更均衡，协同降解效果更好；3种纤维素降解关键酶(内切纤维素酶、外切纤维素酶以及β-葡萄糖苷酶)酶活比值更均衡，协调降解效果更好。
(3)本发明建立的复合微生物菌系，在最佳复配比条件下，对常见农作物秸秆降解效果较好，降解7d，对水稻秸秆的降解率达到26.47％。
(4)本发明基于最佳混合保护剂配方，制备出高效秸秆降解复合微生物菌剂。菌株R3使用脱脂奶粉，谷氨酸钠，甘露醇组合，冻干存活率提高到87.7％。菌株RZ1使用脱脂奶粉，蔗糖，甘露醇组合，冻干存活率提高到了70.6％。
(5)本发明将制备的融合子菌株R3与融合子菌株RZ1冻干菌粉按照质量比7:1进行复配，应用于水稻秸秆降解7d，秸秆的降解率达到24.1％。
(6)本发明采用还田模式及堆肥模式进行模拟实验，20d时还田深度5cm 秸秆净降解率达4.06％。堆肥模式下，复合微生物菌剂加快堆肥腐热，缩短发酵周期。复合微生物菌剂受环境影响较大，本发明复合微生物菌剂在堆肥模式下对水稻秸秆降解效果最佳。
(7)本发明复合微生物菌剂生物安全性较高，其对水稻和青菜种子萌发及早期幼苗生长均有一定程度的促进作用。
附图说明
图1是枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3菌落形态图；
图2是青霉-毛霉融合子RZ1的菌落形态图；
图3是复配菌种与单菌株关键酶活的比较；
图4是培养条件优化前后复合微生物菌种对水稻秸秆的降解率的比较；
图5是不同类型单一保护剂对枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3存活率的影响；
图6是不同类型单一保护剂对青霉-毛霉融合子RZ1存活率的影响；
图7是组合冻干保护剂对枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3的 Box-Behnken实验结果；
图8是组合冻干保护剂对青霉-毛霉融合子RZ1的Box-Behnken实验结果；
图9是本发明复合微生物菌剂对水稻秸秆降解效果结果；
图10是本发明复合微生物菌剂在堆肥模式下对堆肥C/N比数值的影响；
图11是本发明复合微生物菌剂在还田模式下对水稻秸秆降解率的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、亲本菌株的初筛及复筛
1、菌株纯化及初筛
将在大丰麋鹿自然保护区内采集到的麋鹿便样装入无菌玻璃瓶后，带回实验室进行处理。取其样液进行粗过滤，离心取上层微浑浊液体，进行梯度稀释。
通过LB/PDA培养基对菌株进行富集培养，划线纯化直至获得纯菌株。将纯化后的细菌/真菌菌株分别接种到木质素初筛培养基和纤维素粗筛培养基上，恒温培养，观察其生长情况。挑取单一菌落划线于分离平板上，并通过反复平板划线进行分离，纯化直至获得纯菌株。
2、菌株的复筛
木质素降解细菌复筛：将能在初筛培养基上生长的菌株涂于苯胺蓝平板上，观察其脱色情况，根据菌落周围脱色圈的大小，挑选出脱色效果较好的菌株作为亲本。
纤维素降解真菌复筛：用刚果红染色法观察初筛培养基上产纤维素酶菌落周围的透明圈。根据透明圈直径(H)与菌落直径(c)的比值(Hc)的大小确定复筛菌株。
二、PEG法诱导融合
初筛出对底物降解效果较好的菌株进行纯化培养，取其菌液，在4000r/min 条件下离心10min，取沉淀，向离心管中滴加4mL磷酸缓冲液，不断震荡摇匀，使菌株悬浮于该液中。处理好的菌悬液，加入1％蜗牛酶(真菌)或2％溶菌酶(细菌)作为破壁酶，摇匀后于37℃恒温水浴锅中水浴保温处理，酶解2h，7000r/min离心5min，取上清液，用稳渗剂洗涤7000r/min离心10min，离心后用稳渗剂洗涤，得到原生质体，用配制好的蔗糖溶液洗涤除酶，将原生质体悬浮于稳渗剂中(0.6mol/L蔗糖溶液)，待用。
分别取制备好的两亲本的原生质体溶液，混匀后静置5～10min，加入1.8mL 40％的PEG 6000和0.2mL 0.1mol/LCaCl2混匀，置37℃恒温水浴锅中促融30 min后，2500r/min离心10min，向沉淀中加入2mL稳渗剂，充分混合摇匀。
三、融合子的筛选
取制备好的融合液，分别均匀涂布在木质素固体筛选培养基和纤维素固体筛选培养基上，恒温培养2～3d，检出融合子。其中，筛选出枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3通过苯胺蓝固体培养基褪色情况分析木质素降解能力，并进行相关酶活测定。筛选出的青霉-毛霉融合子RZ1通过刚果红固体培养基褪色情况分析纤维素降解能力，并进行相关酶活测定。
四、产酶条件优化
1、枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3的活化与传代培养
将-20℃、40％甘油冻存的枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3于4℃下自然解冻后，接种于灭菌的LB固体培养基中，观察并分析其遗传稳定性，然后接种到LB液体培养基中进行传代培养。37℃、200r/min培养3～4d，连续传代，并于40％甘油中冻存备用。经过连续传代培养，枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3遗传性状稳定(见图1)。
将枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021420，保藏地址为武汉市武昌区珞珈武汉大学保藏中心，邮编为430072。
2、青霉-毛霉融合子RZ1的活化与传代培养
将-20℃、40％甘油冻存的青霉-毛霉融合子RZ1于4℃下自然解冻后，接种于灭菌的LB固体培养基中，观察并分析其遗传稳定性，然后接种到LB液体培养基中进行传代培养。37℃，200r/min培养3～4d，连续传代，并于40％甘油中冻存备用。经过连续传代培养，青霉-毛霉融合子RZ1遗传性状稳定(见图2)。
将青霉-毛霉融合子RZ1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO：M 20211163，保藏地址为武汉市武昌区珞珈武汉大学保藏中心，邮编为430072。
3、产酶条件优化
本发明研究培养基初始pH、温度、碳源和氮源等4因素对菌株产酶条件的影响，采用四因素四水平试验设计对枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3 (如下表1所示)和青霉-毛霉融合子RZ1(如下表2所示)培养条件进行优化，拟提高菌株产酶能力。
表1细胞融合子菌株R3正交试验设计表
表2青霉-毛霉融合子RZ1正交试验设计表
五、菌种的复配及培养条件优化
1、复合菌种的构建
本发明按照各菌种的水平高低对菌种进行复配设计，枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3和融合子菌株RZ1最低水平为0，最高水平为1。将枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3按0、12.5％、25％、37.5％、50％、62.5％、75％、 87.5％和1，青霉-毛霉融合子RZ1分别按照1、87.5％、75％、62.5％、50％、37.5％、 25％、12.5％和0进行菌种复配，平行重复三次。
2、复配菌种作用条件优化设计
复配菌种对秸秆降解率的影响主要因素为：培养温度、初始pH、接种量、碳源和氮源等5种。本发明设计5因素4水平正交，在最佳复配菌种基础上，接种量分别为：1％、2％、3％、4％；初始pH值分别为4、5、6、7；培养温度分别为：25℃、30℃、35℃、40℃；碳源分别为：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉；氮源分别为蛋白胨、尿素、硫酸铵、氯化铵，200r/min摇床培养。分别于接种后2d、4d和7d取样，测定复配菌种对水稻秸秆的降解率。本发明发现复配菌种对水稻秸秆降解的最佳培养条件为：培养温度40℃、培养基初始 pH值6、接种量为3％、以葡萄糖为碳源，以NH4Cl为氮源(如图4所示)。培养条件优化后复配菌种对水稻秸秆的降解率在2d、4d、7d分别为20.62％、 24.9％、26.47％。较未优化对水稻秸秆的降解率分别提高了2.04倍、1.95倍、 1.91倍。
六、最佳冻干保护剂配方
1、菌种冻干方法
菌种在冷冻干燥过程中，细胞会因为抽真空快速失水，同时低温会使细胞质基质内水变为晶体，使细胞失活，加入适合的冻干保护剂，能显著的提高菌种存活率。吸取3mL菌悬液，菌株R3以7000r/min，离心10min，收集菌体。菌株RZ1以7000r/min，离心20min，收集菌体。菌沉淀以无菌水洗涤后，离心去上清，获得菌体沉淀。将保护剂与菌体按照不同配比进行混合，制备成不同条件的菌悬液。将制备好的菌悬液置于-20℃预冻，冻结完全后将其转移至 -50℃冷冻干燥机中处理48h，制备冻干粉。
2、单一冻干保护剂
采用单一冻干保护剂筛选法，以蔗糖、脱脂奶粉、甘露醇、谷氨酸钠4种物质作为保护剂，以无菌水作为对照，每组实验重复3次。
单一保护剂对枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3冻干存活率影响，如图5所示，其中脱脂奶粉、甘露醇、谷氨酸钠均在15g/100mL含量时对枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3有保护作用，蔗糖对枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3保护作用不明显。
一保护剂对青霉-毛霉融合子RZ1冻干存活率影响，如图6所示，脱脂奶粉、甘露醇、蔗糖分别在5g/100mL、15g/100mL、10g/100mL时对青霉-毛霉融合子RZ1有保护作用，而低浓度谷氨酸钠对其保护作用不明显。
3、组合冻干保护剂
通过Design expert软件探究冻干保护剂的最佳配比组合。枯草芽孢杆菌- 巨大芽孢杆菌融合子R3冻干保护剂最佳复配比为脱脂奶粉12.95g/100mL，谷氨酸钠10.25g/100mL，甘露醇7.7g/100mL(如图7所示)。青霉-毛霉融合子RZ1冻干保护剂最佳复配比为脱脂奶粉18.65g/100mL，蔗糖5.6g/100mL，甘露醇13.55g/100mL(如图8所示)。
七、复合菌系的构建及效果分析
1、复合菌剂的构建
本发明将R3与RZ1冻干菌粉按照质量7:1进行复配制备出高效的复合微生物菌剂。
枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3菌体浓度与青霉-毛霉融合子RZ1菌体浓度分别为1.42×104cfu/mL和9.94×104cfu/mL时降解作物秸秆的效果较好，对2％Ca(OH)2处理24h的水稻秸秆降解7d时，秸秆的降解率达到24.14％。
2、水稻秸秆降解率测定
本发明将水稻秸秆切成1～2cm的小块，60℃烘烤24h。取出后，用质量分数为2％的Ca(OH)2浸泡24h，然后用2层纱布过滤，纯净水洗涤，60℃继续处理24h。预处理过的秸秆粉碎成沫以获得处理过的样品。选取5cm*5cm，孔径为300目，三边用细涤纶线缝合的尼龙袋。称取0.5g秸秆装入尼龙袋中，用细线系紧，贴好标签，用电子天平称取秸秆和尼龙袋的总质量，记为m1。将每个装好秸秆的尼龙袋放到产酶培养基中，并以1％的接种量，在产酶培养基中分别接入不同组号的复配菌种，每个样品做三个平行。在25℃、120r/min 的摇床中培养。于接种后2d、4d和7d后取样，将取出的尼龙袋用纯净水反复清洗，放入60℃的烘箱中烘干，称取秸秆和尼龙袋的总质量，记为m2，如图 9所示。通过以下公式计算降解率：
降解率＝(m1-m2)/m1*100计算降解率。
八、复合微生物菌剂的最佳应用模式
1、秸秆堆肥模式方法
本发明以秸秆调节C/N，加入复合微生物菌剂加速秸秆的降解，从而加速肥料的腐熟速度。将复合微生物菌剂复溶至与菌体来源完全相等的无菌水中，摇匀使其充分溶解，30℃水浴30min，然后接种于肥堆。将动物干粪便与秸秆调节质量比至30:1之间后混合。
设置试验组和对照组，每组物料初始质量均为5kg；试验组接种4％物料质量的复合微生物菌剂并混合均匀；对照组为相同质量的无菌水。菌剂和物料充分混匀后分别放置于泡沫箱中，每3d翻堆1次，试验周期20d，每隔5d 取样一次，取样时选取肥堆中心区域取样，取完样立刻将覆盖平整，将所取的样置于恒温干燥箱105℃中干燥24h。
C/N比能直接反应堆肥腐熟程度，通过测定C/N比就能直接反应微生物对有机质的降解情况。如图10所示，实验组C/N比值由最初的50.53，下降到15.77，有机质达到稳定，对照组C/N比值由最初的54.13，下降到23.20，肥料C/N比值未低于20，有机质未达到稳定状态。
2、秸秆还田模式实验
本发明将水稻秸秆切成4cm的小段，60℃烘烤24h。取出后用纯净水洗涤，并用2层纱布过滤去除杂质，60℃烘烤24h。将处理过的水稻秸秆与复合微生物菌剂混合均匀，处理12h后，装入尼龙袋中，精确称取0.5g的秸秆装入尼龙袋中，深埋地下5cm、10cm、15cm、20cm。试验期为20d，每隔5d 取样测定，每组做三个平行。分别于接种后5d、10d、15d、20d和25d后取样，将取出的尼龙袋用纯净水清洗，60℃烘干，分析在还田模式下，复合微生物菌剂对秸秆的降解率(如图11所示)。
九、生物安全性测定
将水稻和青菜种子在75％乙醇中浸泡，连续匀速搅拌1min，重复两次。用蒸馏水冲洗3次，无菌水冲洗4次，晒干，备用。4个稀释梯度的菌液和无菌水中分别浸泡水稻100粒种子、青菜100粒种子。在种子分别浸种24h，36h， 48h后，无菌条件下用镊子夹取各浓度下的水稻种子和青菜种子各30粒，移至带有湿润滤纸的培养皿中，重复三次，室温下培养。青菜种子每隔24h观察记录数据并补充水分，水稻种子每隔48h观察记录数据并补充水分，保持整个体系在培养过程中始终质量守恒。
本发明融合制备出的枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3和青霉-毛霉融合子RZ1对处理后的水稻种子和青菜种子的发芽率无显著影响，但发芽指数却明显提高，同时还增强了植物细胞的保水能力，提高了水稻和青菜的抗逆性，且能检测出POD酶活性，有一定的生物安全性。
效果实施例
本发明测定秸秆降解中滤纸酶、木质素过氧化酶、漆酶、锰过氧化物酶四种酶，木质素过氧化物酶活对降解率影响最大。复配菌种的滤纸酶活力、漆酶活力较其单枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3分别提高了1.53倍和332倍，而较单青霉-毛霉融合子RZ1分别提高了1.57倍和20.18倍，复配菌种的木质素过氧化酶活力较细胞融合子菌株R3提高了1.08倍，复配菌种锰过氧化物酶活力较单青霉-毛霉融合子RZ1提高了3.51倍。即复配菌种的关键酶活均显著高于单细胞融合子菌株R3和青霉-毛霉融合子RZ1(见图3)。
上述实施例中，复配菌种对水稻秸秆的降解条件优化见图3，由图3可知，培养基初始pH值为6、培养温度40℃、以葡萄糖为碳源，以NH4Cl为氮源的培养基中，复配菌种对水稻秸秆的降解率最大。优化后的复配菌种降解率较优化前在2d、4d、7d分别提高了2.04倍、1.95倍、1.91倍。降解7d，复配菌种对水稻秸秆的降解率达到26.47％。
本发明枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3选择脱脂奶粉、甘露醇、谷氨酸钠等3种保护剂进行配比制成混合保护剂，冻干存活率提高到了87.7％，青霉-毛霉融合子RZ1选择脱脂奶粉、甘露醇、蔗糖三种保护剂进行配比制作混合保护剂，冻干存活率提高到了70.6％。组合冻干保护剂效果比单一冻干保护剂好(见图7，8)。
上述实施例中，细胞融合子菌株R3与青霉-毛霉融合子RZ1按照质量7:1 进行复配，建立复合微生物菌剂，在优化后的培养条件下进行培养，作物秸秆处理7d后，复配微生物菌剂对水稻秸秆的降解率达到24.14％。枯草芽孢杆菌 -巨大芽孢杆菌融合子R3菌体浓度与青霉-毛霉融合子RZ1菌体浓度分别为1.42 ×104cfu/mL和9.94×104cfu/mL时降解作物秸秆的效果较好(见图9)。
上述实施例中，复合微生物菌剂在还田模式下，处理深度5cm作用20d 时，秸秆净降解率达到最大，达4.06％。在堆肥模式下，C/N比值是不断变化的，最适合微生物生长的C/N比值为15，肥料C/N比值低于20表明肥料已经腐熟。随着堆肥的进行，实验组C/N比值由最初的50.53，下降到15.77，有机质达到稳定。对照组C/N比值由最初的54.13，下降到23.20，肥料C/N比值未低于20，有机质未达到稳定状态。堆肥模式下，复合微生物菌剂加快堆肥腐热，缩短发酵周期。复合微生物菌剂受环境影响较大，本发明复合微生物菌剂对水稻秸秆堆肥模式更适应。
本发明中使用的枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3及青霉-毛霉融合子RZ1，遗传性能稳定，环境耐受性强，在不同稀释倍数和不同浸种时间浸种时间的处理下，水稻幼苗的平均株高和平均根长均有显著性差异(P<0.05)，在农作物秸秆降解方面具有很好的开发利用价值，可为后续的工业化生产提供可靠的菌种资源支撑。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种复合微生物菌剂，其特征在于，该复合微生物菌剂由降解木质素的枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3及降解纤维素的青霉-毛霉融合子RZ1复配而成；其中，所述枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3于2021年4月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021420，保藏地址为武汉市武昌区珞珈武汉大学保藏中心，邮编为430072；所述青霉-毛霉融合子RZ1于2021年9月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211163，保藏地址为武汉市武昌区珞珈武汉大学保藏中心，邮编为430072。
2.如权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3、青霉-毛霉融合子RZ1均为冻干粉制品，该冻干粉制品的制备过程为：
(1)对菌株培养液进行离心，收集菌体、无菌水洗涤，得到菌泥；
(2)将保护剂、菌泥混合得到菌悬液，-20℃预冻12h，-50℃冷冻干燥机冻干处理48h，得到冻干粉制品。
3.如权利要求2所述的复合微生物菌剂，其特征在于，在枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3冻干粉制品中，所述保护剂添加量为5～20g/100mL，且所述保护剂包括12.95g/100mL脱脂奶粉、10.25g/100mL谷氨酸钠、7.7g/100mL甘露醇。
4.如权利要求2所述的复合微生物菌剂，其特征在于，在青霉-毛霉融合子RZ1冻干粉制品中，所述保护剂添加量为5～20g/100mL，且所述保护剂包括18.65g/100mL脱脂奶粉、5.6g/100mL蔗糖、13.55g/100mL甘露醇。
5.如权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂中，所述枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3与青霉-毛霉融合子RZ1的质量比为6～8:1。
6.如权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌-巨大芽孢杆菌融合子R3以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megateriumde Bary)为亲本并通过PEG诱导法进行细胞融合而成；所述青霉-毛霉融合子RZ1由青霉(Penicillium)和毛霉(Mucor)为亲本并通过PEG诱导法进行细胞融合而成。
7.权利要求1～6任一项所述的复合微生物菌剂在降解作物秸秆、降解木质素和/或纤维素中的应用。
8.权利要求1～6任一项所述的复合微生物菌剂在制备降解木质素的关键酶中的应用，所述关键酶包括过氧化物酶、锰过氧化物酶以及漆酶。
9.权利要求1～6任一项所述的复合微生物菌剂在制备降解纤维素的关键酶中的应用，所述关键酶包括内切纤维素酶、外切纤维素酶以及β-葡萄糖苷酶。
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| CN106754530A (zh) * | 2016-12-29 | 2017-05-31 | 山东宝来利来生物工程股份有限公司 | 一株具有降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌及其应用 |
| CN109082393A (zh) * | 2018-08-15 | 2018-12-25 | 南宁市黄陈生猪养殖场 | 一种可用于处理城市污水微生物菌剂及其制备方法 |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014178032A1 (en) * | 2013-05-03 | 2014-11-06 | Universidad Eafit | Production process for biomass and fengycin metabolites of bacillus species and compositions thereof for biological pest control |
| CN106754530A (zh) * | 2016-12-29 | 2017-05-31 | 山东宝来利来生物工程股份有限公司 | 一株具有降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌及其应用 |
| CN109082393A (zh) * | 2018-08-15 | 2018-12-25 | 南宁市黄陈生猪养殖场 | 一种可用于处理城市污水微生物菌剂及其制备方法 |
| CN110734876A (zh) * | 2019-11-04 | 2020-01-31 | 华中农业大学 | 一种巨大芽胞杆菌fjw1生防制剂及其制备方法和应用 |
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