PT2716748T - Estirpe pertencendo ao género bacillus, agente microbiológico e método de cultivo de plantas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "ESTIRPE PERTENCENDO AO GÉNERO BACILLUS, AGENTE MICROBIOLÓGICO E MÉTODO DE CULTIVO DE PLANTAS"

CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se a um novo microrganismo útil para o controlo de doenças de plantas e lesões em nemátodos e promoção do crescimento de plantas. Especificamente, a presente invenção refere-se às estirpes AT-332 e AT-79 de Bacillus sp., as quais são um novo microrganismo que apresenta efeitos muito superiores no controlo de doenças de plantas e lesões em nemátodos e promovendo o crescimento de plantas, em comparação com microrganismos pertencendo a um Bacillus amyloliquefaciens estreitamente relacionado divulgado na literatura; e um agente de controlo de doenças de plantas, um agente de controlo de nemátodos e um promotor do crescimento de plantas contendo o corpo fúngico e a cultura dos microrganismos.

TÉCNICA ANTERIOR

Um método principal para o controlo de doenças de plantas e nemátodos, é um método utilizando pesticidas químicos e, até à data, os pesticidas químicos permitiram a produção estável de colheitas. Contudo, recentemente, tornou-se difícil controlar totalmente o impacto no ambiente, devido à utilização contínua de pesticidas químicos e ao surgimento de bactérias resistentes a fármacos pelos pesticidas químicos convencionais; e as doenças, tal como uma doença bacteriana, as quais são difíceis de controlar, estão a desenvolver-se num problema muito importante. Consequentemente, a tecnologia de controlo biológico utilizando um microrganismo isolado da natureza, atrai atenção crescente e alguns dos pesticidas de microrganismos foram produzidos comercialmente. Contudo, os pesticidas microbiológicos convencionais têm um defeito em que o efeito não é estável e as aplicações em doenças são menores, em comparação com os pesticidas químicos. Nestas circunstâncias, tem havido procura crescente para um novo pesticida microbiológico, o qual tenha novas aplicações em doenças e apresente um efeito de controlo estável.

Como um agente de controlo de doenças de plantas que utiliza um microrganismo, um agente de Talaromyces flavus, um agente de Pseudomonas fluorescens, um agente de avilurência de Erwinia carotovora, um agente de Trichoderma atroiviride, um agente de Bacillus Simplex e um agente de Bacillus subtilis, são registados como um pesticida microbiológico e têm sido utilizados.

Como um agente de controlo de nemátodos que utiliza um microrganismo, um agente de Pasteuria penetrans e um agente de Monacrosporium phymatophagum, são registados como um pesticida microbiológico e têm sido utilizados. A descrição da Patente do Japão N° 2955655 (Documento de Patente 1) divulga um agente de controlo de doenças de plantas que utiliza bactérias pertencendo a Bacillus amyloliquefaciens. 0 ingrediente ativo do agente de controlo de doenças de plantas é o produto do microrganismo e as bactérias per se não são utilizadas como um pesticida. Além disso, o alvo de controlo é uma doença causada por bactérias filamentosas e o documento não divulga o controlo da doença bacteriana. A publicação JP-A-2009-247302 (Documento de Patente 2) divulga um pesticida de microrganismo, o qual pode, ao mesmo tempo, controlar a doença atravéz das bactérias filamentosas e a doença bacteriana, em que as células de bactérias viáveis per se são eficazes, mas o documento não descreve o controlo de nemátodos. A descrição da Patente do Japão N° 3471815 (Documento de Patente 3; WO 98/050422) divulga um agente de controlo de doenças de plantas que utiliza bactérias Bacillus, as quais podem ser utilizadas para uma ampla gama de doenças de plantas e eficazes em crisomelideos do sistema radicular do milho, mas o documento não descreve o controlo de nemátodos. A descrição da Patente do Japão N° 4071036 (Documento de Patente 4; US 2004/265292) divulga a estirpe D747 de Bacillus sp. , a qual pode ser utilizada para o controlo doenças de plantas e insetos nocivos, mas o documento não descreve o controlo de nemátodos. A descrição da Patente do Japão N° 3471811 (Documento de Patente 5; WO 96/032840) divulga um agente de controlo de nemátodos que utiliza bactérias do género Bacillus. O ingrediente ativo do agente de controlo de nemátodos é as bactérias ou esporo da estirpe Bacillus firmus tendo uma atividade antinemátodo, mas o documento não descreve o controlo de doenças de plantas. A descrição da Patente do Japão N° 4359653 (Documento de Patente 6; WO 1997/012980) divulga um método para o controlo de nemátodos que utiliza uma toxina produzida por uma nova estirpe Bacillus thuringiensis, mas o documento não descreve o controlo de doenças de plantas.

Na agricultura, os fertilizantes químicos são um importante material agrícola, o qual influencia o rendimento das colheitas. Contudo, 30 a 50% dos componentes fertilizantes químicos utilizados não são utilizados nas colheitas, mas difundidos no ambiente, o que causa eutrofização dos rios e contaminação de água subterrânea. Uma grande quantidade de combustíveis fósseis é utilizada na produção de fertilizantes químicos e o custo de produção dos fertilizantes químicos está a aumentar juntamente com os preços em alta dos combustíveis fósseis. Além disso, diz-se que o óxido de azoto (NOx) , como um produto de decomposição de um fertilizante de azoto, é cerca de 300 vezes mais eficiente em emissões de gases com efeito de estufa do que o carbono e existe uma crescente preocupação com o aquecimento global. No futuro, é esperada escassez de alimentos devido ao crescimento da população global e, deste modo, a utilização de um material de modo a aumentar a produtividade de colheita é inevitável e existe uma necessidade crescente para um material mais amigo do ambiente para substituir os fertilizantes químicos convencionais. À luz dessas circunstâncias, foram realizados estudos, principalmente, numa ampla gama de bactérias de Rhizobium, bactérias de Pseudomonas e bactérias de Bacillus. Contudo, muito poucos estão em utilização prática devido a serem menos eficazes.

Como discutido acima, até à data, não foi conhecida qualquer bactéria de Bacillus, a qual fosse eficaz em doenças de plantas em geral, disponível no controlo de nemátodos e fosse eficaz na promoção do crescimento de plantas. DOCUMENTOS DA TÉCNICA ANTERIOR Documentos de Patente

Documento de Patente 1: Patente do Japão N° 2955655 Documento de Patente 2: documento JP-A-2009-247302 Documento de Patente 3: Patente do Japão N° 3471815

Documento de Patente 4: Patente do Japão N° 4071036

Documento de Patente 5: Patente do Japão N° 3471811

Documento de Patente 6: Patente do Japão N° 4359653

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO

Problema a ser Resolvido pela Invenção

Um objetivo da presente invenção é isolar um novo microrganismo da natureza para proporcionar, cujo microrganismo tem efeitos de controlo de múltiplas doenças de plantas, controlo de nemátodos e/ou promoção do crescimento de plantas.

Outro objetivo da presente invenção é proporcionar um agente de controlo de doenças de plantas, um agente de controlo de nemátodos e um promotor de crescimento de plantas, os quais contêm o microrganismo acima mencionado como bactérias ativas e podem ser utilizados como um pesticida biológico (agente microbiológico).

Meios para Resolver o Problema

Como um resultado de estudos intensivos para resolver o problema, a presente requerente foi bem-sucedida no isolamento de uma nova estirpe pertencendo ao género Bacillus na natureza, cuja estirpe tem efeitos de controlo de múltiplas doenças de plantas, controlo de nemátodos e promoção do crescimento de plantas e concretizou a presente invenção. A presente invenção proporciona o seguinte.

[1] Estirpe AT-332 de Bacillus sp. tendo o número de acesso NITE BP-1095 e contendo ADNr 16S representado pela sequência de base N° 2.

[2] Estirpe AT-79 de Bacillus sp. tendo o número de acesso NITE BP-1094 e contendo ADNr 16S representado pela sequência de base N° 3.

[3] Estirpe como reivindicada em [1] ou [2], em que a estirpe per se e/ou a cultura da estirpe mostram efeitos de controlo de doenças de plantas, controlo de nemátodos e/ou promoção do crescimento de plantas.

[4] Utilização da estirpe e/ou da cultura da estirpe reivindicada em qualquer um de [1] a [3] como um agente de controlo de doenças de plantas, um agente de controlo de nemátodos ou um promotor do crescimento de plantas.

[5] Método para o cultivo de plantas compreendendo o tratamento das plantas com a estirpe e/ou a cultura da estirpe reivindicada em qualquer um de [1] a [3] .

EFEITOS DA INVENÇÃO

As estirpes AT-332 e AT-79 de Bacillus sp. da presente invenção podem controlar uma ampla gama de diversas doenças de plantas e nemátodos, e podem, ainda, promover o crescimento de plantas úteis devido ao cultivo (incluindo células de bactérias viáveis) ou bactérias vivas cultivadas e isoladas das estirpes sendo introduzidas num corpo de planta, tais como raizes, caules, folhas, sementes e frutos, ou no solo de cultivo.

BREVE DESCRIÇÃO DE DESENHOS

[Fig. 1] A Fig. 1 mostra a árvore filogenética molecular que utiliza a sequência de bases de ADNr 16S das estirpes AT-332 e AT-79 de Bacillus sp. Na figura, os números próximos dos ramos são os valores de bootstrap e uma barra de escala é mostrada na parte esquerda inferior.

[Fig. 2] As fotografias (a) a (d) mostram o efeito de promoção do crescimento de plantas da estirpe AT-332 no teste básico (Exemplo 12 e Exemplos Comparativos 12-13) .

[Fig. 3] A Fig. 3 mostra o efeito de promoção do crescimento de couve Chinesa das estirpes AT-332 e AT-79 num teste em vaso (Exemplo 13).

MODO PARA EXECUTAR A INVENÇÃO A presente requerente realizou o rastreio de microrganismos de diversas plantas e solos para desenvolver um novo pesticida microbiano e/ou fertilizante microbiano seguro e superior, o qual tenha um espetro antibacteriano alargado contra diversas doenças de plantas, mostre atividade antinemátodo e tenha efeito de promoção do crescimento de plantas. Como um resultado, a presente requerente realizou uma verificação útil, na qual a estirpe isolada do solo recolhido na Prefeitura de Ibaraki mostra um espetro antibacteriano alargado contra diversas doenças de plantas, mostra elevada atividade inseticida contra nemátodos e tem efeito de promoção do crescimento de plantas.

Ambas as estirpes assim isoladas de novo (estirpe AT-332 e estirpe AT-79) são um bacilo dotado de motilidade, gram-positivo, como é óbvio a partir das características bacteriológicas, a serem descritas posteriormente, e cresce a partir de esporos num estado aeróbio. Ambas as estirpes deram positivo na reação de catalase e na reação de oxidase. Além disso, como um resultado da identificação baseada na sequência de cerca de 1500 pb bases do lado terminal 5' do ADNr 16S, as estirpes foram confirmadas como sendo uma nova estirpe pertencendo ao género bacillus relacionado com Bacillus amyloliquefaciens. Devido às superiores características de terem efeitos numa ampla gama de doenças de plantas, elevado efeito de controlo em nemátodos e efeito de promoção do crescimento de plantas, as estirpes AT-332 e AT-79 foram identificadas como uma nova estirpe e designadas como as estirpes AT-332 e AT-79 de Bacillus sp. relacionadas com Bacillus amyloliquefaciens. A estirpe AT-332 e a estirpe AT-79 de Bacillus sp. da presente invenção foram depositadas como estirpe AT-332 de Bacillus sp. e AT-79 de Bacillus sp., com a instituição depositária Biological Resource Center, National Institute of Technology and Evaluation (2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba 292-0818 JAPÃO) (data de depósito original (data aceite): 2 de maio de 2011; número de acesso: NITE BP-1095 e NITE BP-1094).

As caracteristicas bacteriológicas de AT-332 de Bacillus sp. (NITE BP-1095) são descritas abaixo. As caracteristicas bacteriológicas foram determinadas em referência aos seguintes documentos. PRIEST (F.G.), GOODFELLOW (M.), SHUTE (L.A.) e BERKELEY (R.C.W.): Bacillus amyloliquefaciens sp. nov., nom. rev. Int. J. Syst. Bacteriol. , 1987, 37, 69-71 e Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Segunda Edição, volume 3. (1) Propriedade morfológica

Forma: bactéria com forma de bastonete

Tamanho: largura de 0,8 a 0,9 ym e comprimento de 1,5 a 2,0 ym

Mobilidade: +

Estado epifito do flagelo: perítrico

Presença ou ausência de esporos: + (quase terminal) (2) Caracteristicas de cultivo

Meio de cultura: meio de ágar nutriente (30 °C)

Forma: circular Protuberância: achatada Periferia: margem integral Estado de superfície: lisa Viscosidade: viscosa Transparência: opaca Tonalidade de cor: cor creme Brilho: sem brilho

Produção de pigmento: não produtivo (3) Caracteristicas fisiológicas Coloração Gram: +

Redução de nitrato: -

Reação de dessorção de azoto: -Teste de MR: -Teste de VP: +

Produção de índole: -

Produção de sulfureto de hidrogénio: -Hidrólise de amido: +

Utilização de ácido cítrico: - (Koser) + (Christensen)

Utilização de fonte de azoto inorgânico: - (nitrato) + (sal de amónio)

Urease: -Oxidase: +

Catalase: +

Gama para crescimento pH 5: + pH 8 : + pH 9: +

Temperatura para crescimento 37 °C: + 45 °C: + 50 °C: + 55 °C: -

Crescimento em estado anaeróbico: -Teste de OF (oxidação/fermentação): -/-

Produção de ácido/produção de gás a partir de açúcares: L-arabinose: +/-D-glucose: +/-D-frutose: +/-Maltose: +/-Lactose: -/-D-sorbitose: +/-Inositol: +/-D-xilose: +/- D-manose: + /-D-galactose: -/-Sacarose: + /-Trealose: +/-D-manitol: +/-Glicerina: +/-

Atividade de β-galactosidase: -Atividade de arginina di-hidrolase: -Atividade de lisina descarboxilase: -Atividade de triptofano desaminase: -Atividade de gelatinase: +

As caracteristicas bacteriológicas de AT-79 de Bacillus sp. (NITE BP-1094) são descritas abaixo. (1) propriedade morfológica

Forma: bactéria com forma de bastonete

Tamanho: largura de 0,8 a 0,9 pm e comprimento de 1,5 a 2,0 pm

Mobilidade: +

Estado epifito do flagelo: perítrico

Presença ou ausência de esporos: + (quase terminal) (2) Caracteristicas de cultivo

Meio de cultura: meio de ágar nutriente (30 °C)

Forma: circular Protuberância: achatada Periferia: margem integral Estado de superfície: lisa Viscosidade: viscosa Transparência: opaca Tonalidade de cor: cor creme

Brilho: sem brilho

Produção de pigmento: não produtivo (3) Caracteristicas fisiológicas Coloração Gram: +

Redução de nitrato: -Reação de dessorção de azoto: -Teste de MR: -Teste de VP: +

Produção de indole: -

Produção de sulfureto de hidrogénio: -Hidrólise de amido: +

Utilização de ácido cítrico: - (Koher) + (Christensen)

Utilização de fonte de azoto inorgânico: - (nitrato) + (sal de amónio)

Urease: -Oxidase: +

Catalase: +

Gama para crescimento pH 5: + pH 8 : + pH 9: +

Temperatura para crescimento 37 °C: + 45 °C: + 50 °C: + 55 °C: -

Crescimento em estado anaeróbico: -Teste de OF (oxidação/fermentação): -/-

Produção de ácido/produção de gás a partir de açúcares: L-arabinose: +/-D-glucose: +/-D-frutose: +/-

Maltose: + /-Lactose: -/-D-sorbitose: + /-Inositol: +/-D-xilose: +/-D-manose: +/-D-galactose: -/-Sacarose: +/-Trealose: +/-D-manitol: +/-Glicerina: +/-

Atividade de β-galactosidase: -Atividade de arginina di-hidrolase: -Atividade de lisina descarboxilase: -Atividade de triptofano desaminase: -Atividade de gelatinase: +

As sequências de base do lado terminal 5' do ADNr 16S da estirpe AT-332 e estirpe AT-79 de Bacillus sp. da presente invenção são representadas pela sequência N° 2 e sequência N° 3, respetivamente. A sequência N° 2 e sequência N° 3 diferem uma da outra em apenas duas bases, na base N° 444 e base N° 1242. A base N° 444 é guanina (g) na sequência N° 2 e adenina (a) na sequência N° 3 e a base N° 1242 é adenina (a) na sequência N° 2 e guanina (g) na sequência N° 3.

Deste modo, o microrganismo da presente invenção é caracterizado por ter a sequência de bases da sequência N° 1, incluindo as sequências acima mencionadas N° 2 e N° 3 (ou seja, a base N° 444 e base N° 1242 são representadas por "r") de ο lado terminal 5' do ADNr 16S.

Na presente invenção, a sequência de bases do ADNr 16S foi analisada como abaixo. 0 InstaGene Matrix (produzido pela BIO RAD Laboratories, Inc., Califórnia (CA), E.U.A.) foi utilizado para extração de ADN; PrimeSTAR HS DNA Polymerase (produzido pela Takara Bio Inc.) foi utilizado para PCR; 0 kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (produzido pela Applied Biosystems, Califórnia (CA) , E.U.A.) foi utilizado para determinar a sequência de ciclo, respetivamente. Os iniciadores utilizados (de acordo com "Método de Análise Genética - método para determinar a sequência de bases do gene de ARNr 16S", Yasuyoshi Nakagawa et ai., editado pela Society for Actinomycetes, Japão, Classificação e identificação de Actinomicetas, pp. 88-117, Business Center for Academic Societies, Japão, 2001) foram 9F, 339F, 785F, 1099F, 536R, 802R, 1242R e 1541R. A sequência foi identificada utilizando o Sistema Analisador Genético ABI PRISM 3100 (produzido pela Applied Biosystems, Califórnia (CA), E.U.A.).

Como um resultado da pesquisa de homologia de acordo com a base de dados internacional de sequências de bases (GenBank/DDBJ/EMBL) utilizando BLAST (ALTSCHUL, (S.F.) et ai., Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acid Res. 1997.25, 3389-3402), a sequência de bases do ADNr 16S da estirpe AT-332 e estirpe AT-79 tinha elevado grau de homologia com o ADNr 16S derivado do género Bacillus e ambas as estirpes tinham a homologia mais elevada de 99,9% com ADNr 16S da estirpe BCRC11601 de Bacillus amyloliguefaciens. Por outro lado, como um resultado da pesquisa de homologia de acordo com a base de dados internacional de sequências de bases (GenBank/DDBJ/EMBL), nenhuma sequência de bases de ADNr 16S das estirpes AT-332 e AT-79 teve correspondência exata à sequência de bases de ADNr 16S derivada do género Bacillus.

Na presente invenção, a análise filogenética molecular foi realizada como abaixo. ADNr 16S derivado da estirpe padrão do grupo de estirpes, o qual se pressupôs ser estreitamente relacionado, foi obtido da base de dados internacional de sequências de base (GenBank/DDBJ/EMBL) para se realizar a análise filogenética molecular utilizando 1500 pb da sequência de bases do ADNr 16S obtida no acima. O ADNr 16S utilizado para a análise filogenética molecular derivou das seguintes estirpes. - Bacillus subtilis, IAM12118T (AB042061) - Bacillus subtilis subsp. spizizenii, NBRC101239T (AB325584) - Bacillus mojavensis, IF015718 T (AB021191) - Bacillus vallismortis, DSM11031 T (AB021198) - Bacillus amyloliquefaciens, BCRC11601 T (EF433406) - Bacillus atrophaeus, JCM9070 T (AB021181) - Bacillus aerophilus, 28K T (AJ831844) - Bacillus sonorensis, BCRC17416 T (EF433411) - Bacillus licheniformis, DSM13 T (AE017333) - Bacillus altitudinis, 4lKF2b T (AJ831842)

Bacillus cereus ATCC14579 T (NC_004722)BSL2 "T" no fim do nome de estirpe, significa a estirpe padrão da espécie. BSL significa que a estirpe está num nível de biossegurança (é indicado nível 2 ou superior). Os códigos entre parêntesis indicam o número de acesso. A árvore filogenética molecular obtida é mostrada na Fig. 1.

Os números próximos dos ramos são os valores de bootstrap e uma barra de escala é mostrada na parte esquerda inferior.

Uma vez que a estirpe AT-332 e a estirpe AT-79 têm a propriedade de não efetuarem a redução de nitrato, como mencionado acima, as suas características micológicas não corresponderam com exatidão às do Bacillus amyloliquefaciens descrito no Manual de Bergey. Do mesmo modo, a partir do resultado da análise do ADNr 16S, a estirpe AT-332 e a estirpe AT-79 são consideradas como sendo estreitamente relacionadas com Bacillus amyloliquefaciens, mas não podem ser identificadas como Bacillus amyloliquefaciens e determinou-se que a estirpe AT-332 e a estirpe AT-79 são uma nova estirpe pertencendo ao género Bacillus. A estirpe AT-332 e a estirpe AT-79 de Bacillus sp. da presente invenção são deixadas crescer por meios conhecidos, tais como a cultura estática num meio sólido e a cultura líquida e o tipo do meio disponível e as condições de cultura não estão particularmente limitados, desde que permitam a sobrevivência e crescimento das bactérias. Os exemplos do meio incluem um meio contendo glucose, peptona e extrato de levedura, assim como um meio geral, tal como um extrato de carne. Do mesmo modo, pode ser utilizado outro que não um meio líquido, um meio sólido, tais como um meio de ágar inclinado e um meio de placa que não um meio liquido.

Todas as fontes de carbono que a estirpe AT-332 e a estirpe AT-79 possam utilizar, podem ser utilizadas para o meio. Os exemplos específicos incluem diversas fontes de carbono sintéticas ou naturais, que a estirpe AT-332 e a estirpe AT-79 podem utilizar que não açúcares, tais como glucose, galactose, lactose, sacarose, maltose, extratos de malte, melaços de resíduos, xarope de amido e amido hidrolisado.

De um modo semelhante, diversas substâncias sintéticas e naturais que as estirpes acima mencionadas podem utilizar, tal como uma substância contendo azoto orgânico, incluindo peptona, extrato de carne, extrato de levedura, pó de semente de soja e água de maceração de milho, podem ser utilizadas para a fonte de azoto do meio.

De acordo com um método convencional para o cultivo de microrganismos, sais inorgânicos, tais como sal dietético e sal fosfórico, sais de metal, tais como cálcio, magnésio e ferro, e micronutrientes, tais como vitaminas e aminoácidos, podem ser adicionados conforme necessário. A cultura pode ser realizada num estado aeróbio, tais como a cultura de agitação e cultura de arejamento. A temperatura de cultura é 20 a 40 °C e, de um modo preferido, 25 a 35 °C, o pH é 5 a 8 e, de um modo preferido, 6 a 7 e o período de cultura é um a quatro dias e, de um modo preferido, dois a três dias. A cultura contendo o corpo bacteriano da estirpe AT-332 e estirpe AT-79 de Bacillus sp. da presente invenção tem a propriedade de controlo de diversas doenças de plantas, controlo de nemátodos e promoção do crescimento de plantas úteis.

Diversas doenças de plantas podem ser prevenidas e os nemátodos podem ser controlados, permitindo ao produto processado da cultura contendo o corpo bacteriano da estirpe AT-332 e estirpe AT-79 de Bacillus sp. da presente invenção, mistura da cultura e outros componentes; ao produto processado de células de bactérias cultivadas separadas, obtidas por submissão do produto de cultura a tratamento de separação centrífuga ou por lavagem das células de bactérias, à mistura de células de bactérias cultivadas separadas e outros componentes; a um seu diluente com um liquido ou um sólido existir no corpo de planta, tais como raizes, caules, folhas, sementes e frutos ou no solo do pomar. A estirpe AT-332 e a estirpe AT-79 de Bacillus sp. da presente invenção estão disponíveis como um agente de controlo de doenças de plantas, um agente de controlo de nemátodos e um promotor de doenças de plantas em qualquer estado de células nutritivas, esporos ou a mistura de ambos, desde que as bactérias estejam vivas. Do mesmo modo, as estirpes podem ser utilizadas se os componentes do meio de cultura forem misturados como o são após o cultivo ou se estiverem num estado onde os componentes que não células de bactérias são removidos por lavagem com água destilada. A estirpe AT-332 e a estirpe AT-79 de Bacillus sp. da presente invenção podem controlar a doença de plantas causada por fungos e bactérias pertencendo a Oomicetas, Ascomicetas, Basidiomicetas e Deuteromicetas, dependendo do tipo de aplicação e podem controlar nemátodo fitoparasítico, tais como Ditylenchus dipasaci, Ditylenchus destructor, Pratylenchus sp., Meloidogyne sp., Heterodera sp. e Globodera spp. As estirpes podem promover o crescimento de colheitas, vegetais, frutos, flores e legumes ao mesmo tempo.

Especificamente, as bactérias ofensivas que a estirpe AT-332 e a estirpe AT-79 de Bacillus sp. da presente invenção podem controlar incluem Pyricularia oryzae, Cochliobolus miyabeanus, Rhizoctonia solani e Gibberella fujikuroi, as quais infestam o arroz; Erysiphe graminis f.sp. hordei, Erysiphe graminis f.sp. tritici, Puccinia striiformis, Puccinia graminis, Puccinia recôndita f.sp. tritici, Puccinia hordei, Gibberella zeae, Pyrenophorateres, Typhula incarnata, Typhula ishikariensis, Sclerotiniaborealis, Micronectriella nivalis, Ustilago nuda, Tilletia caries, Tilletia toetida, Tapesia yallundea, Phynchosporium secalis f.sp. hordei, Septoria tritici e Lentosphaeria nodorum, as quais infestam trigos; Diaporthe citri, Elsinoe fawcettii, Phytophthora citrophthora, Penicillium digitatum e Penicillium italicum de plantas citrinas; Monilinia mail, Valsa ceratosperma, Podosphaera leucotricha, patotipo Alternaria alternataapple, Venturia inaequalis, Gymnosporangium yamadae, Botriophaeria berengeriana f.sp. piricola, Zygophiala jamaicensis, Gloeodes pomigena, Mycosphaerella pomi, Glomerella cingulata e Diplocarponmali de maçãs; Venturia nashicola, patotipo de pera Alternaria alternataj apanese, Physalospora piricola e Gymnosporangium asiaticum de pêras; Monilinia fructicola, Cladosporium carpophilum e Phomopsis sp. de pêssegos; Pseudocercospora vitis, Marssonina vitícola, Elsinoe ampelina, Glomerella cingulata, Uncinula necator, Phakopsora ampelopsidis e Phomopsis sp. de uvas; Phyllactinia kakicola, Colletotrichum gloeosporioides, Cercospora kaki e Mycosphaerella nawae de dióspiros; Cladosporium carpophilum de ameixas;

Monilinia fructicola de Prunus avium; Sphaerotheca fuliginea, Didymella bryoniae, Colletotorichum legenarium de abóboras; Alternaria solani, Cladosporium fulvum de tomates; Phomopsis vexans e Erysiphe cichoracearum de beringelas; Alternaria japonica, Alternaria bracicae, Alternaria brassicicola e Cercosporella brassicae de vegetais brássicas; Pucciniaallii de cebolas verdes; Pyrhium ultimum e Pythium zigiberis de gengibres; Sphaerotheca humuli e Glomerella cingulata de morangos; Cercospora kikuchii, Elsinoe glycines e Diaporthe phaseolorum var. sojae de sementes de soja; Cercospora canescens e Uromyces phaseoli var. azukicola de feijões-Adzuki; Colletotrichum lindemuthianum de feijões castanhos; Cercosporidium personatum, Cercospora arachidicola e Shaceloma arachidis de amendoins; Erysiphe pisi de ervilhas; Alternaria solani de batatas; Exobasidium reticulatum, Elsinoe leucospila, Pestalotiopsis theae e Pestalotiopsis longiseta de chás; Alternaria longipes, Erysiphe cichoracearum e Colletotrichum gloeosporioides de tabacos; Cercospora beticola de beterrabas-sacarinas; Curvularia geniculata e Ceratobasidium spp. das relvas; Diplocarpon rosae e Shaerotheca pannosa de rosas; Septoria obesa e Puccinia horiana de crisântemos; e Botrytis cinerea e Sclerotinia sclerotiorum de diversas plantas de cultivo. 0 agente de controlo de doenças de plantas da presente invenção, inclui um agente de controlo de doença pós-colheita para as colheitas armazenadas após a colheita, particularmente, de modo a prevenir a decomposição dos frutos. Não existe limite aos tipos de colheitas às quais o agente de controlo de doença pós-colheita da presente pode ser aplicado e os exemplos incluem frutos, tais como morango, uva, figo, citrino, pêssego, melão, melancia, maçã, pera, banana e ananás e vegetais, tais como um pepino, tomate, couve Chinesa, couve, cebola Galesa, cebola, cenoura, rabanete Japonês, gengibre, pimento verde, beringela, abóbora-menina e rebento de feijão. Não existe limite aos tipos de fungos os quais causam a doença pós-colheita e os exemplos incluem Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides e Alternaria alternata.

Os exemplos de nemátodos, os quais a estirpe AT-332 e a estirpe AT-79 de Bacillus sp. da presente invenção, podem controlar incluem Meloidogyne sp., tais como espécies de Meloidogyne hapla, Meloidogyne incognita, Meloidogyne javanica e Meloidogyne; Globodera spp., tais como Globodera rostochiensis e outras espécies de Globodera; Heterodera sp., tais como Heterodera avenae, Heterodera glycines, Heterodera schachtii, Heterodera trifolii e outras espécies de Heterodera; espécies de Anguiana pertencendo a Anguina funesta; espécies de Aphelenchoides; Belonolaimus longicaudatus e outras espécies pertencendo a Belonolaimus; Bursaphelenchus xylophilus pertencendo a Bursaphelenchus xylophilus e outras espécies de Bursaphelenchus; espécies de Criconema, espécies de Criconemella, espécies de Criconemoides e espécies de Mesocriconema pertencendo a Criconemoides; Ditylenchus destructor, Ditylenchus dipsaci e outras espécies pertencendo a Ditylenchus; espécies de Dolichodorus pertencendo a nemátodos de sovela; Heliocotylenchus multicinctus pertencendo a Helicotylenchus e outras espécies de Helicotylenchus; espécies de Hemicycliophora e espécies de Hemicriconemoides pertencendo a nemátodos da vagem e em forma de vagem; espécies de Hirshmanniella; espécies de Hoploaimus pertencendo a Hoplolaimus; espécies de Nacobbus pertencendo a Nacobbus; Longidorus elongatus pertencendo a Longidorus e outras espécies de Longidorus; Pratylenchus neglectus, Pratylenchus penetrans,

Pratylenchus curvitatus, Pratylenchus goodeyi e outras espécies de Pratylenchus pertencendo a PratyLenchus sp. ; Radopholus similis e outras espécies pertencendo a Radopholus; Rotylenchus robustus e outras espécies de Rotylenchus pertencendo a Rotylenchulus reniformis; espécies de Scutellonema; Trichodorus primitivus e outras espécies de Trichodorus pertencendo a nemátodos de raiz atrofiada; espécies de Paratrichodorus; Tylenchorhynchus claytoni, Tylenchorhynchus dubius e outras espécies pertencendo a Tylenchorhynchus; espécies de Tylenchulus pertencendo a Tylenchulus semipenetrans; e espécies de Xiphinema pertencendo a Xiphinema americanum. A estirpe AT-332 e a estirpe AT-79 de Bacillus sp. da presente invenção são especialmente úteis para o controlo de espécies de Meloidogyne, espécies de Globodera, espécies de Heterodera, espécies de Pratylenchus, espécies de Radopholus, espécies de Rotylenchus e espécies de Tylenchulus e, em particular, podem ser utilizadas de um modo adequado para a exterminação de espécies de Meloidogyne, espécies de Pratylenchus, espécies de Globodera e espécies de Heterodera.

Os exemplos de colheitas que a estirpe AT-332 e a estirpe AT-79 de Bacillus sp. da presente invenção podem promover o crescimento incluem colheitas de cereais, tais como arroz, trigo e milho; vegetais, tais como cenoura, pepino, rabanete Japonês, abóbora-menina, alface, beringela, tomate, couve, batata, couve Chinesa, Glebionis coronaria, mostarda Japonesa, espinafre, pimento verde, cebola Galesa, cebola, gengibre, alho, morango; cogumelos, tal como o cogumelo shiitake; árvores de fruto, tais como diospireiro, pereira, laranjeira, videira, macieira e pessegueiro; flores e plantas ornamentais, tais como crisântemo, tulipa e rosa; e legumes, tais como soja, sésamo e amendoim. 0 agente de controlo de doenças de plantas, agente de controlo de nemátodos e promotor do crescimento de plantas da presente invenção contêm a estirpe AT-332 e a estirpe AT-79 de Bacillus sp. que podem controlar as doenças e nemátodos de plantas e têm um efeito de promoção do crescimento de plantas, como mencionado acima como um microrganismo indicado.

No agente de controlo de doenças de plantas, agente de controlo de nemátodos e promotor do crescimento de plantas da presente invenção, a estirpe AT-332 ou a estirpe AT-79 podem ser utilizados isoladamente ou em combinação. Do mesmo modo, pode ser utilizado o mutante de cada das estirpes. 0 mutante é aquele que possui a propriedade bacteriológica acima mencionada da estirpe AT-332 e AT-79 e uma atividade de controlo das doenças de plantas, controlo de nemátodos e promoção do crescimento de plantas. Podem ser utilizadas uma estirpe mutante natural, uma estirpe mutante causada por raio ultravioleta ou um agente de mutagénese química, uma estirpe de fusão celular e uma estirpe geneticamente modificada.

Quando as bactérias vivas da estirpe AT-332 e estirpe AT-79 são utilizadas no agente de controlo de doenças de plantas, agente de controlo de nemátodos e promotor do crescimento de plantas da presente invenção, é preferido adicionar as bactérias ao corpo de planta a uma concentração de 105 a IO10 unidades/mL.

Quando é utilizado o produto de cultivo da estirpe AT-332 e/ou estirpe AT-79, a dosagem pode ser apropriadamente determinada em casos individuais das bactérias viáveis acima mencionadas.

Como o agente microbiológico (agente de controlo de doenças de plantas, agente de controlo de nemátodos e promotor do crescimento de plantas) da presente invenção, as células de bactérias e/ou produto de cultura da estirpe AT-332 e estirpe AT-79 pode ser utilizado isoladamente. Ou o agente microbiológico pode ser diluído com um líquido inerte ou um veículo sólido a ser utilizado como um agente farmacológico com adição do tensioativo, agente dispersante e outro adjuvante, conforme necessário. Os exemplos de formulação específica incluem formulação granular, formulação de pó, pó molhável, agente de suspensão e formulação de emulsão.

Os exemplos do veículo incluem talco, bentonite, caulino, argila, terra de diatomáceas, carbono branco, vermiculite, hidrato de cal, sulfato de amónio, areia de sílica, ureia, um veículo sólido poroso e veículos líquidos, tais como água, álcool isopropílico, metilnaftaleno, xileno, ciclo-hexanona e alquilenoglicol. Os exemplos do tensioativo e agente de dispersão incluem sais de ácido dinaftilmetanossulfónico, sais de éster de álcool e ácido sulfúrico, sais de lenhina e ácido sulfónico, sais de ácido alquilarilsulfónico, éteres de polioxietilenoglicol, monoalquilato de polioxietileno sorbitano e éteres de polioxietileno de alquilarilo. Os exemplos do adjuvante incluem carboximetilcelulose, polietilenoglicol, propilenoglicol, goma-Arábica e goma de xantana; e os exemplos do agente crioprotetor incluem leite desnatado e agente tamponante de pH. A quantidade das bactérias vivas e/ou produto de cultura da estirpe AT-332 e estirpe AT-79, o tempo de aplicação e a quantidade de aplicação podem ser, apropriadamente, determinados dependendo de cada caso das bactérias viáveis acima. 0 agente microbiológico (agente de controlo de doenças de plantas, agente de controlo de nemátodos e promotor do crescimento de plantas) da presente invenção pode conter ingredientes ativos que não os da presente invenção: i. e., inseticidas, outros agentes bactericidas, herbicidas, reguladores do crescimento de plantas e fertilizantes. Do mesmo modo, o agente de controlo de doenças de plantas, o agente de controlo de nemátodos, um promotor do crescimento de plantas da presente invenção, podem conter a estirpe de outra espécie em combinação com a estirpe AT-332 e/ou estirpe AT-79.

Os exemplos dos componentes bactericidas incluem bitertanol, bromuconazol, ciproconazol, difenoconazol, diniconazol, enilconazol, epoxiconazol, fluquinconazol, fenbuconazole, flusilazol, flutriafol, hexaconazol, imibenconazol, ipconazol, metconazol, myclobutanil, penconazol, propiconazol, protioconazol, simeconazol, triadimefão, triadimenol, tebuconazol, tetraconazol, triticonazol, procloraz, pefurazoato, imazalil, triflumizol, ciazofamid, benomil, carbendazim, tiabendazol, fuberidazol, etaboxam, etridiazol, oxipoconazol, ácido fumárico, himexazol, azoxistrobina, dimoxistrobina, enestroburina, fluoxastrobina, cresoxim-metilo, metominostrobina, orizastrobina, picoxistrobina, piraclostrobina, trifloxistrobina, carboxina, benalaxil, boscalid, bixafena, fenhexamid, flutolanil, furametpir, mepronil, metalaxil, mefenoxam, ofurace, oxadixil, oxicarboxin, pentiopirad, tifluzamida, tianidil, dimetomorfe, flumorfe, flumetover, fluopicolida, carpropamida, diclocimet, mandipropamida, fluazinam, pirifenox, bupirimato, ciprodinil, fenarimol, ferimzona, mepanipirim, nuarimol, pirimetanil, triforina, fenpiclonil, fludioxonil, aldimorfe, dodemorfe, fenpropimorfe, tridemorfe, fenpropidin, iprodiona, procimidona, vinclozolin, famoxadona, fenamidona, octilinona, probenazol, anilazina, diclomezina, piroquilon, proquinazid, triciclazol, captafol, captan, dazomet, folpet, fenoxanil, quinoxifena, amisulbrom, manzeb, maneb, metam, metiram, ferbam, propineb, tiourama, zineb, zirame, dietofencarb, iprovalicarb, bentiavalicarb-isopropilo, cloridrato de propamocarb, tiofanato de metilo, piribencarb, mistura Bordeaux, cloreto de cobre básico, sulfureto de cobre básico, hidróxido cúprico, 8-hidroxiquinolina de cobre, dodina, iminoctadina albesilato, iminoctadina acetato, guazatina, casugamicina, estreptomicina, polioxina, oxitetraciclina, validamicina A, binapacril, dinocap, dinobuton, ditianon, isoprotiolano, edifenfos, iprobenfos, fosetilo, fosetilo de alumínio, pirasofos, tolclofos-metilo, clorotalonil, diclofluanida, flusulfamida, hexiaclorobenzeno, ftalida, pencicurão, quintozeno, ciflufenamid, cimoxanil, dimetirimol, etirimol, furalaxil, metrafenona, espiroxamina, amobam, enxofre, enxofre de cal, eclomezol, bicarbonato de potássio, bicarbonato de cálcio, tiadiazina, tecloftalam, triazina, sulfonato de nonilfenol de cobre, hidroxi isoxazol, fluoroimida, policarbamato, metassulfocarb, EDDP, IBP, tolfenpirad, fluopiram, isotianil e isopirazam.

Os exemplos dos componentes inseticidas incluem acetamiprida, pimetrozina, fenitrotião, acefato, carbaril, metomil, cartap, cialotrina, etofenprox, teflubenzurão, flubendiamida, flufenoxurão, tebufenozida, fenpiroximato, piridaben, imidacloprida, buprofezina, BPMC, MIPC, malatião, metidatião, fentião, daiazinon, oxideprofos, vamidotião, etiofencarb, pirimicarb, permetrina, cipermetrina, bifentrina, halfenprox, silafluofena, nitenpiram, clorofluazurão, metoxifenozida, tebufenpirad, pirimidifeno, celtano, propargite, hexitiazox, clofentezina, espinosad, milbemectina, BT (Bacillus thuringiensis) , indoxacarb, metaflumizona, clorfenapir, fipronil, etoxazol, acequinocil, pirimifos-metilo, acrinatrina, quinometionato, clorpirifos, abamectina, benzoato de emamectina, óxido de fenbutatina, terbufos, etoprofos, cadusafos, fenamifos, fensulfotião, DSP, diclofentião, fostiazat, oxamil, isoamidofos, fostietano, isazofos, tionazina, benfuracarb, espirodiclofena, etiofencarb, azinfos-metilo, dissulfotão, metiocarb, oxidemetão_metilo, paratião, ciflutrina, beta-ciflutrina, tebupirimfos, espiromesifena, endossulfano, amitraz, tralometrina, acetoprol, etiprol, etião, triclorfão, metamidofos, diclorvos, mevinfos, monocrotofos, dimetoato, formetanato, formotião, mecarbam, tiometão, naled, metilparatião, cianofos, diamidafos, albendazol, oxibendazol, fenbendazol, oxfendazol, propafos, sulprofos, protiofos, profenofos, isofenfos, temefos, fentoato, dimetilvinfos, clorfenvinfos, tetraclorvinfos, foxima, isoxatião, piraclofos, clorpirifos, piridafentião, fosalona, fosmet, dioxabenzofos, quinalfos, piretrina, aletrina, praletrina, resmetrina, permetrina, teflutrina, fenpropatrina, alfa-cipermetrina, lambda-cialotrina, delta-metrina, fenvalerato, esfenvalerato, flucitrinato, fluvalinato, cicloprotrina, tiodicarb, aldicarb, alanicarb, metolcarb, xililcarb, propoxur, fenoxicarb, fenotiocarb, bifenazato, carbofurão, carbossulfano, enxofre, pirifluquinazon, furatiocarb, diafentiurão, diflubenzurão, hexaflumurão, novalurão, lufenurão, clorofluazurão, hidróxido de triciclo-hexiltina, oleato de sódio, oleato de potássio, metopreno, hidropreno, binapacril, clorobenzilato, fenissobromolato, tetradifão, bensultap, benzomato, cromafenozida, halofenozida, endossulfano, diofenolana, triazamato, sulfato de nicotina, tiacloprida, tiametoxam, clotianidin, dinotefurão, fluazinam, piriproxifena, fluacripirim, hidrametilnona, ciromazina, TPIC, tiociclam, fenazaquin, complexo de polinactina, azadiractina, rotenona, hidroxipropilamido, mesulfenfos, fosfocarb, aldoxicarb, metam sódico, tartarato de morantel, dazomet, cloridrato de levamisol, triclamida, tolfenpirad, piridalil, clorantraniliprol, cienopirafeno e ciflumetofeno. 0 agente de controlo de doenças de plantas, agente de controlo de nemátodos e promotor do crescimento de plantas da presente invenção podem ser diretamente aplicados como estão ou aplicados como uma solução diluída com água. 0 método de aplicação do agente de controlo de doenças de plantas, agente de controlo de nemátodos e promotor do crescimento de plantas da presente invenção não está particularmente limitado e os seus exemplos incluem um método de pulverização do agente diretamente em plantas e pragas de inseto, um método de pulverização do agente no solo, um método de adição do agente à água e fertilizante a ser aplicado em plantas e ao solo e um método de revestimento das sementes com o agente. Além disso, é desejável ajustar apropriadamente a quantidade de aplicação do produto farmacológico, dado que a quantidade de aplicação varia, dependendo da doença e da praga de inseto a ser controlada, das colheitas como o motivo da aplicação, do método de aplicação, tendência de ocorrência de doenças, grau da lesão, condições ambientais e das formulações a serem utilizadas.

Como discutido acima, a estirpe AT-332 e a estirpe AT-79 da presente invenção têm um amplo espetro de doença e nematicida e podem controlar diversos tipos de doenças de plantas e nemátodos e podem promover o crescimento de plantas. Uma vez que o agente de controlo de doenças de plantas, agente de controlo de nemátodos e promotor do crescimento de plantas da presente invenção compreendendo estas estirpes são altamente seguros para o ambiente e têm efeitos de controlo em diversos tipos de doenças e nemátodos, o agente de controlo da doença de planta pode prevenir uma ampla gama de doenças e nemátodos sem a utilização de outros meios em combinação e podem ser utilizados como um pesticida biológico e/ou fertilizante biológico que também pode promover o crescimento de plantas úteis.

EXEMPLOS A presente invenção vai ser descrita em mais detalhe com Exemplo de Produção, Exemplos de Formulação, Exemplos e Exemplos Comparativos.

Cultivo da estirpe AT-332 e estirpe AT-79 A estirpe AT-332 e a estirpe AT-79 foram isoladas do solo contendo raizes de planta.

Em detalhe, 1 g de um solo seco obtido por recolha do solo na cidade de Moriya na Prefeitura de Ibaraki, Japão, em agosto de 2009 e submetendo-o a tratamento térmico (80 °C, durante 10 minutos) foi suspenso na água esterilizada. A suspensão foi diluída com a taxa de diluição de 102 a 104 vezes e a cultura separada da suspensão foi efetuada no meio de caldo nutriente (Eiken Chemical Co., Ltd.) (28 °C, durante três dias) e as colónias formadas foram isoladas. As colónias isoladas foram cultivadas num meio de ágar de dextrose de batata e as estirpes eficazes contra patogenos de diversas doenças de plantas foram identificadas. As estirpes foram ainda submetidas a cultura de agitação num meio líquido de dextrose de batata e a estirpe AT-332 e a estirpe AT-79 de Bacillus sp. foram isoladas como uma estirpe tendo uma atividade contra a larva de segunda fase da batata doce Meloidogyne sp. 0 método para identificação de cada das estirpes, os diversos métodos de análise e seus resultados e propriedades bacteriológicas são aqueles como descritos no "Modo para Executar a Invenção".

Exemplo de Produção 1: Cultivo e preparação da estirpe AT-332

Como uma pré-cultura, uma ansada das bactérias conservadas da presente invenção (estirpe AT-332) foi inoculada em 60 mL por frasco de um meio de caldo nutriente (disponível a partir de Eiken Chemical Co., Ltd.) num frasco cónico de 500 mL com defletores e submetida a cultura de agitação utilizando um agitador rotativo, a 180 rpm e 28 °C, durante um dia.

Foram inoculados 60 mL da cultura obtida pela pré-cultura acima num fermentador de garrafa com um volume de 5000 mL contendo 2000 mL de meio LB (20 g de peptona, 10 g de extrato de levedura, 20 g de cloreto de sódio e água para o restante) e cultivados como a cultura principal, a 500 rpm, taxa de arejamento de 1 L/hora e 35 °C, durante três dias.

Cerca de 1800 g de cultura foram obtidos pela cultura principal acima. A concentração da célula de bactérias foi cerca de 8,0 x 109 CFU/mL.

Cerca de 140 g de pó seco foram obtidos por congelação de 1800 g do produto de cultura obtido a -80 °C, seguido de secagem

por congelação sob pressão reduzida e pulverização. A concentração da célula de bactérias do pó foi cerca de 1, 0 x 1011 CFU/g.

Exemplo de Produção 2: Cultivo e preparação da estirpe AT-7 9

Como uma pré-cultura, uma ansada das bactérias conservadas da presente invenção (estirpe AT-79) foi inoculada em 60 mL por frasco de um meio de caldo nutriente (disponível a partir de Eiken Chemical Co., Ltd.) num frasco cónico de 500 mL com defletores e submetida a cultura de agitação utilizando um agitador rotativo, a 180 rpm e 28 °C, durante um dia. 60 mL da cultura obtida pela pré-cultura acima foram inoculados num fermentador de garrafa com um volume de 5000 mL contendo 2000 mL de meio LB (20 g de triptona, 10 g de extrato de levedura, 20 g de cloreto de sódio e água para o restante) e cultivados como a cultura principal, a 500 rpm, taxa de arejamento de 1 L/hora e 35 °C, durante três dias.

Cerca de 1700 g de cultura foram obtidos pela cultura principal acima. A concentração da célula de bactérias do pó foi cerca de 9,0 x 109 CFU/g.

Cerca de 130 g de pó seco foram obtidos por congelação de 1700 g do produto de cultura obtido a -80 °C, seguido de secagem por congelação sob pressão reduzida e pulverização. A concentração da célula de bactérias do pó foi cerca de 1, 0 x 1011 CFU/g.

Os Exemplos de Formulação são dados abaixo. Aqui, a palavra "parte(s)" significa uma parte(s) em massa. Exemplo de

Formulação 1: Pó Molhável

Foram misturadas e pulverizadas 60 partes de pó seco obtido pelo Exemplo de Formulação 1, 25 partes de terra de diatomáceas, 5 partes de carbono branco, 8 partes de sulfonato de lenhina e 2 partes de sulfonato de alquilnaftaleno para, desse modo, obter-se pó molhável.

Exemplo de Formulação 2: Formulação granular 5 partes de pó seco obtido pelo Exemplo de Formulação 1, 25 partes de bentonite, 66 partes de talco, 2 partes de sulfonato de dodecilbenzeno e 2 partes de sulfonato de lenhina foram misturadas e pulverizadas. Após lhe adicionar cerca de 20 partes de água e amassar a mistura por uma máquina de amassar, o resultante foi triturado por um granulador e seco e, depois, o tamanho dos grânulos foi regulado para se obter uma formulação granular.

Exemplo de Formulação 3: Pó Molhável

Foram misturadas e pulverizadas 60 partes de pó seco obtido pelo Exemplo de Formulação 2, 25 partes de terra de diatomáceas, 5 partes de carbono branco, 8 partes de sulfonato de lenhina e 2 partes de sulfonato de alquilnaftaleno para, desse modo, obter-se pó molhável.

Exemplo de Formulação 4: Formulação granular

Foram misturadas e pulverizadas 5 partes de pó seco obtido pelo Exemplo de Formulação 2, 25 partes de bentonite, 66 partes de talco, 2 partes de sulfonato de dodecilbenzeno e 2 partes de sulfonato de lenhina. Após lhe adicionar cerca de 20 partes de água e amassar a mistura por uma máquina de amassar, o resultante foi granulado por um granulador e seco e, depois, o tamanho dos grânulos foi regulado para obter-se uma formulação granular.

De seguida, são descritos abaixo os Exemplos e Exemplos Comparativos para testar os efeitos do agente de controlo de doenças de plantas, agente de controlo de nemátodos e promotor do crescimento de plantas da presente invenção.

Exemplo 1 e Exemplo Comparativo 1: Teste para os efeitos contra a piriculariose

Doses suficientes dos pós molháveis diluídos, nos Exemplos de Formulação 1 e 3, com a taxa de diluição de 250 vezes foram pulverizadas com uma pistola de pulverização no arroz (variedade: Koshihikari, 15 plantas por encosta) cultivado numa estufa de vidro até à fase de desenrolamento da terceira folha num vaso de plástico de 6 cm em diâmetro. Como um exemplo comparativo, o pó molhável Impression (produzido pela SDS Biotech K.K.), com a taxa de diluição de 250 vezes, também foi submetido ao teste no mesmo modo. No dia seguinte, a suspensão dos esporos do patogeno da piriculariose (Pyricularia oryzae) foi pulverizada e inoculada. Após retenção dos vasos numa sala de humidade a 22 °C, durante 24 horas, os vasos foram deixados ficar na estufa durante sete dias e o número de lesões nas folhas inoculadas foi investigado para, desse modo, determinar o titulo de controlo. 0 titulo de controlo (%) foi calculado com base no número de lesões das folhas na região não tratada. Como pode ser observado a partir dos resultados mostrados na Tabela 1, pelo tratamento com o agente microbiológico da presente invenção, a incidência de piriculariose foi grandemente reduzida em comparação com a região não tratada e foram obtidos efeitos de controlo significativamente elevados.

[Tabela 1]

Exemplo 2 e Exemplo Comparativo 2: Teste para os efeitos em antracnose do pepino

Doses suficientes dos pós molháveis nos Exemplos de Formulação 1 e 3 com a taxa de diluição de 250 vezes, foram pulverizadas por uma pistola de pulverização na primeira e segunda folhas de pepinos (variedade: Tokiwa Hikari N° 3, tipo p) cultivados numa estufa de vidro até à fase de desenrolamento da terceira folha num vaso de plástico de 6 cm em diâmetro. Como um exemplo comparativo, o diluente do pó molhável Impression (produzido pela SDS Biotech K.K.), com a taxa de diluição de 250 vezes, também foi submetido ao teste no mesmo modo. No dia seguinte, a suspensão dos esporos de pepino Colletorichum lagenarium foi pulverizada e inoculada. Após retenção dos vasos numa sala de humidade a 22 °C, durante 24 horas, os vasos foram deixados ficar na estufa durante sete dias e a taxa de área com doença na primeira e segunda folhas foi investigada com a visão para, desse modo, determinar o titulo de controlo. O titulo de controlo (%) foi calculado com base na taxa de área com doença na região sem tratamento. Como pode ser observado a partir dos resultados na Tabela 2, pelo tratamento com o agente microbiológico da presente invenção, a incidência de Colletorichum lagenarium do pepino foi muito reduzida em comparação com a região não tratada e foram obtidos efeitos de controlo significativamente elevados.

Tabela 2

Exemplo 3 e Exemplo Comparativo 3: Teste para os efeitos em Phytophthora infestans de tomate

Doses suficientes dos pós molháveis nos Exemplos de Formulação 1 e 3 com a taxa de diluição de 250 vezes, foram pulverizadas por uma pistola de pulverização nos tomates (variedade: Sugar lump), cultivados numa estufa de vidro até à fase de desenrolamento da quinta folha num vaso de plástico de 6 cm em diâmetro. Como um exemplo comparativo, o diluente do pó molhável Impression (produzido pela SDS Biotech K.K.), com a taxa de diluição de 250 vezes, também foi submetido ao teste no mesmo modo. No dia seguinte, a suspensão dos zoósporos de Phytophthora infestans do tomate foi pulverizada e inoculada. Após retenção dos vasos numa sala de humidade a 22 °C, durante 16 horas, os vasos foram deixados ficar na estufa durante três dias e a taxa de área com doença na terceira, quarta e quinta folhas foi investigada com a visão para, assim, determinar o título de controlo. O título de controlo (%) foi calculado com base na taxa de área com doença na região sem tratamento. Como pode ser observado a partir dos resultados na Tabela 3, através do tratamento com o agente microbiológico da presente invenção, a incidência de Phytophthora infestans do tomate foi muito reduzida em comparação com a região não tratada e foram obtidos efeitos de controlo significativamente elevados.

Tabela 3

Exemplo 4 e Exemplo Comparativo 4: Teste para os efeitos em Pseudoperonospora cubensis do pepino

Doses suficientes dos pós molháveis nos Exemplos de Formulação 1 e 3 com a taxa de diluição de 250 vezes foram pulverizadas por uma pistola de pulverização nos pepinos (variedade: Hikari N° 3, tipo p) cultivados numa estufa de vidro até à fase de desenrolamento da terceira folha num vaso de plástico de 6 cm em diâmetro. Como um exemplo comparativo, o diluente do pó molhável Impression (produzido pela SDS Biotech K.K.), com a taxa de diluição de 250 vezes, também foi submetido ao teste no mesmo modo. No dia seguinte, a suspensão dos zoósporos de Pseudoperonospora cubensis do pepino foi pulverizada e inoculada. Após retenção dos vasos numa sala de humidade a 22 °C, durante 18 horas, os vasos foram deixados ficar na estufa durante três dias e a taxa de área com doença na primeira e segunda folhas foi investigada com a visão para, desse modo, determinar o título de controlo. O título de controlo (%) foi calculado com base na taxa de área com doença na região sem tratamento. Como pode ser observado a partir dos resultados na Tabela 4, pelo tratamento com o agente microbiológico da presente invenção, a incidência de

Pseudoperonospora cubensis do pepino foi grandemente reduzida em comparação com a região não tratada e foram obtidos efeitos de controlo significativamente elevados.

Tabela 4

Exemplo 5 e Exemplo Comparativo 5: Teste para os efeitos em Altenaria Alternaria Mali da maçã

As folhas das maçãs (variedade: Orin) foram recolhidas e doses suficientes dos pós molháveis nos Exemplos de Formulação 1 e 3 com a taxa de diluição de 250 vezes foram pulverizadas por uma pistola de pulverização no verso das folhas. Como um exemplo comparativo, o diluente do pó molhável Impression (produzido pela SDS Biotech K.K.), com a taxa de diluição de 250 vezes, também foi submetido ao teste no mesmo modo. Após pulverização, as folhas foram secas ao ar e a suspensão dos esporos de

Alternaria Alternaria mali da maçã foi-lhes pulverizada e inoculada. Depois das folhas terem sido deixadas ficar a 20 °C em estado húmido durante quatro dias, a taxa de área com doença foi investigada com a visão, para, desse modo, determinar o titulo de controlo. O titulo de controlo (%) foi calculado com base na taxa de área com doença na região sem tratamento. Como pode ser observado a partir dos resultados na Tabela 5, pelo tratamento com o agente microbiológico da presente invenção, a incidência de Altenaria Alternaria mall da maçã foi muito reduzida em comparação com a região não tratada e foram obtidos efeitos de controlo significativamente elevados.

Tabela 5

Exemplo 6 e Exemplo Comparativo 6: Teste para os efeitos em Sphaerotherca fuliginea do pepino (Teste de campo) O teste foi realizado na estufa detida pela empresa, utilizando pepinos (região de teste: 4 m2/região; 10 plantas/região; em triplicado). A doença foi deixada ocorrer naturalmente. Os pós molháveis nos Exemplos de Formulação 1 e 3 com a taxa de diluição de 500 vezes, 1000 vezes e 2000 vezes foram pulverizados quatro vezes, a intervalos de sete dias, e o titulo de controlo (%) foi calculado a partir da taxa de área de doença nas folhas. O pó molhável Impression (SDS Biotech K.K.) com a taxa de diluição de 500 vezes e 1000 vezes, pó molhável Botokiller (Idemitsu Kosan Co., Ltd.) com a taxa de diluição de 1000 vezes, pó molhável Botopika (Idemitsu Kosan Co., Ltd.) com a taxa de diluição de 2000 vezes, pó molhável em grânulo Ecoshot (Kumiai Chemical Industry Co., Ltd.) com a taxa de diluição de 1000 vezes e pó molhável Morestan (Agro-Kanesho Co. , Ltd.) com a taxa de diluição de 3000 vezes foram utilizados como um agente comparativo. A incidência da doença na região não tratada foi 47,4%. O titulo de controlo (%) foi calculado com base na incidência na região sem tratamento. Como pode ser observado a partir dos resultados na Tabela 6, através tratamento com o agente microbiológico da presente invenção, a incidência de Sphaerotherca fuliginea do pepino foi muito reduzida em comparação com a região não tratada e foram obtidos efeitos de controlo significativamente elevados. Um efeito notavelmente mais elevado foi confirmado no campo, assim como em comparação com agentes de Bacillus subtilis comercialmente disponíveis convencionais (pó molhável Impression (Documento de Patente 3) , pó molhável Botokiller, pó molhável Botopica, pó molhável Ecoshot (Documento de Patente 4)) utilizados como um agente comparativo. O agente microbiológico da presente invenção com a taxa de diluição de 500 vezes mostrou um efeito muito elevado equivalente ao do pó molhável Morestan, o qual é um agente químico.

Tabela 6

Exemplo 7 e Exemplo Comparativo 7: Teste para os efeitos em Botrytis cinerea da beringela (Teste de campo) 0 teste foi realizado na estufa detida pela empresa utilizando beringelas (região de teste: 5,6 m2/região; 7 plantas/região; em triplicado). A doença foi deixada ocorrer naturalmente. Os pós molháveis nos Exemplos de Formulação 1 e 3 com a taxa de diluição de 500 vezes e 1000 vezes foram pulverizados quatro vezes, a intervalos de sete dias, e o título de controlo (%) foi calculado a partir da incidência nos frutos. O pó molhável Impression (SDS Biotech K.K.) com a taxa de diluição de 500 vezes e 1000 vezes, pó molhável Botokiller (Idemitsu Kosan Co., Ltd.) com a taxa de diluição de 1000 vezes, pó molhável Botopika (Idemitsu Kosan Co., Ltd.) com a taxa de diluição de 2000 vezes, pó molhável em grânulo Ecoshot (Kumiai Chemical Industry Co., Ltd.) com a taxa de diluição de 1000 vezes e Savior Flowable 20 (Syngenta Japan K.K.) com a taxa de diluição de 1500 vezes foram utilizados como um agente comparativo. A incidência da doença na região não tratada foi 15%. O título de controlo (%) foi calculado com base na incidência na região sem tratamento. Como pode ser observado a partir dos resultados na Tabela 7, pelo tratamento com o agente microbiológico da presente invenção, a incidência de Botrytis cinerea foi muito reduzida em comparação com a região não tratada e foram obtidos efeitos de controlo significativamente elevados. Um efeito notavelmente mais elevado foi confirmado no campo, assim como em comparação com agentes de Bacillus subtilis comercialmente disponíveis convencionais (pó molhável Impression, pó molhável Botokiller, pó molhável Botopica, pó molhável Ecoshot) utilizados como um agente comparativo. O agente microbiológico da presente invenção com a taxa de diluição de 500 vezes mostrou um efeito muito elevado equivalente ao de Savior Flowable 20, o qual é um agente químico.

Tabela 7

Exemplo 8 e Exemplo Comparativo 8: Teste para os efeitos em Burkholderia plantarii A semente de arroz (variedade: Koshihikari) foi imersa para ser inoculada na suspensão de Burkholderia plantarii (1 x 108 CFU/mL) , a qual foi obtida pela cultura de agitação no meio líquido PD, a 27 °C, durante 52 horas, durante uma hora sob pressão reduzida para, desse modo, preparar as sementes infetadas com Burkholderia plantarii. As sementes infetadas com Burkholderia plantarii foram imersas na solução do pó molhável do Exemplo de Formulação 1 e Exemplo de Formulação 3 com a taxa de diluição de 100 vezes. Depois da solução ser removida, as sementes foram retidas numa sala de humidade, a 32 °C, durante um dia, para estimular a germinação. Como um exemplo comparativo, a solução de Impression (SDS Biotech K.K.), com a taxa de diluição de 100 vezes, também foi submetida ao teste no mesmo modo. As sementes estimuladas pela germinação foram semeadas num vaso de plástico, tendo um diâmetro de 6 cm, cheio com solo de cultivo. As plântulas foram retidas numa sala para crescimento das plântulas, a 30 °C, durante três dias após a sementeira e numa sala de humidade, a 25 °C, durante 15 dias. Depois, todas as plântulas foram investigadas para a presença da doença, para determinar a taxa de plântulas com doença. O título de controlo (%) foi calculado com base na taxa de plântulas com doença na região não tratada. A quantidade de extração de sementes por copo foi 3 g de semente de arroz seca (90 a 110 grãos) . Como pode ser observado a partir dos resultados na Tabela 8, pelo tratamento com o agente microbiológico da presente invenção, a taxa de plântulas com doença de Burkholderia plantarii foi muito reduzida em comparação com a região não tratada e foram obtidos efeitos de controlo significativamente elevados.

Tabela 8

Exemplo 9 e Exemplo Comparativo 9: Teste para o efeito em Rhizoctonia solani) 3 g do produto de cultura de Rhizoctonia solani num meio de casca foram misturados em 500 mL de solo esterilizado para serem introduzidos num vaso de plástico e 1 g da formulação granular do Exemplo de Formulação 2 e Exemplo de Formulação 4 foi misturado no solo, respetivamente. Como um agente comparativo, 84 mg de pó molhável Impression também foram submetidos ao teste no mesmo modo. Os pepinos (variedade: Sagami-hanjiro) foram semeados e, após o cultivo dos pepinos, a 23 °C, durante uma semana, a taxa de germinação foi investigada. O efeito de controlo (% do título de controlo) foi calculado com base na taxa de plântulas com doença na região não tratada. Como pode ser observado a partir dos resultados na Tabela 9, pelo tratamento com o agente microbiológico da presente invenção, a taxa de plântulas com doença de Rhizoctonia solani foi muito reduzida em comparação com a região não tratada e foram obtidos efeitos de controlo significativamente elevados.

Tabela 9

Exemplo 10 e Exemplo Comparativo 10: Atividade contra a larva de segunda fase larva de Meloidogyne sp. da batata doce. A atividade nematicida contra a larva de segunda fase de Meloidogyne sp. da batata doce chocou no espaço de 24 horas a partir da cápsula de ovo recolhida das raizes de beringelas (variedade: Juryo). Cada das soluções da Formulação 1 e

Formulação 3 com a taxa de diluição de 100 vezes (uma solução de Tween 20 com a taxa de diluição de 5000 vezes) e uma quantidade equivalente da larva de segunda fase de Meloidogyne sp. da batata doce (cerca de 50 vermes) foi adicionada a uma microplaca de 24 orifícios. Como um exemplo comparativo, a solução Impression (SDS Biotech K.K.), com a taxa de diluição de 100 vezes, também foi submetida ao teste no mesmo modo. A placa foi selada e colocada numa incubadora, a 28 °C e humidade relativa de cerca de 50%. Após 72 horas, a taxa de morte foi investigada por uma observação por um microscópio estereoscópico. Nesse momento, os nemátodos imóveis foram considerados como estando mortos. A taxa nematicida foi calculada de acordo com a expressão descrita abaixo. Como pode ser observado a partir dos resultados na Tabela 10, através tratamento com o agente microbiológico da presente invenção, foi obtida uma atividade nematicida extremamente elevada contra a larva de segunda fase de Meloidogyne sp. da batata doce.

[Expressão 1]

Taxa nematicida = (número de nemátodos mortos / número de nemátodos testados) x 100

Tabela 10

Exemplo 11 e Exemplo Comparativo 11 (Teste para o efeito de controlo contra Meloidogyne sp. da batata doce.

Num vaso Wagner 1/10000 a, cada da formulação granular no Exemplo de Formulação 2 e Exemplo de Formulação 4 foi uniformemente misturada no solo infetado com Meloidogyne sp. da batata doce, à taxa de 40 kg/10 a, e tomates de pequeno tamanho (variedade: Sugar lump) foram aí plantados. Como um agente comparativo, o pó molhável Impression (SDS Biotech K.K.) também foi submetido ao teste no mesmo modo, à taxa de 3,3 kg/10 a. Um mês após o estabelecimento da plantação, o grau de lesão às raízes (grau de nódulo de raiz) foi classificado e avaliado de acordo com os critérios descritos abaixo. O índice de nódulo de raiz foi determinado de acordo com a expressão como abaixo, para calcular o título de controlo. Como pode ser observado a partir dos resultados na Tabela 11, pelo tratamento com o agente microbiológico da presente invenção, as lesões da raiz causadas pela Meloidogyne sp. da batata doce foram grandemente reduzidas em comparação com a região não tratada e foram obtidos efeitos de controlo significativamente elevados.

Grau de lesão 0: Não foi observado nódulo de raiz. 1: os nódulos de raiz são dificilmente percetíveis à vista, mas podem encontrar-se alguns. 2: São observados alguns dos nódulos de raiz. 3: É observada uma quantidade moderada de nódulos de raiz. 4: É observado um número de nódulos de raiz por toda a rizosfera.

[Expressão 2] índice de nódulo de raiz = (Σ (grau de lesão x número de unidades)/toda a população investigada x 4) x 100

Titulo de controlo = (1 - índice de nódulo de raiz na região tratada/índice de nódulo de raiz na região não tratada) x 100

Tabela 11

Exemplo 12 e Exemplos Comparativos 12 a 13: Efeito da promoção do crescimento de plantas da estirpe AT-332 (teste básico)

Um teste básico em placa de petri foi efetuado com respeito a Arabidopsis thaliana para medir o efeito da promoção do crescimento de plantas da estirpe AT-332. Após imersão das sementes de Arabidopsis thaliana em hipoclorito de sódio a 1%, durante 20 minutos, as sementes são imersas em solução de etanol a 70%, durante dois minutos, para esterilizar a superfície das sementes. Depois disso, as sementes foram lavadas com água destilada estéril para serem utilizadas para o teste. Um meio salino de Murashige e Skoog (pH 5,7) contendo ágar a 0,8% foi vertido para dentro de uma placa de petri estéril dividida em dois compartimentos e utilizado para um teste depois de ser arrefecido. A AT-332 (Exemplo 12), GB03 de Bacillus subtilis (Exemplo Comparativo 12) e MBI600 de Bacillus subtilis (Exemplo

Comparativo 13) foram inoculadas respetivamente num disco de papel estéril colocado em uma das partes divididas da placa de petri acima e as sementes germinadas de Arabidopsis thaliana foram inoculadas na outra parte da placa de petri. A placa inoculada com as bactérias e Arabidopsis thaliana foi retida a 22 °C (12 horas à luz/12 horas sem luz), durante dez dias, e o estado do crescimento das plantas foi observado. Os resultados são mostrados nas fotografias (a) a (d) na Fig. 2, incluindo os resultados do controlo (Fig. 2 (a)), onde as bactérias não foram inoculadas. Um notável efeito de promoção do crescimento de plantas foi confirmado com a AT-332 (Exemplo 12; (b)), em comparação com GB03 de Bacillus subtilis (Exemplo Comparativo 12; fotografia (c)) e MBI600 de Bacillus subtilis (Exemplo Comparativo 13; fotografia (d)), as quais são na realidade comercializadas e utilizadas no mercado dos Estados Unidos.

Exemplo 13: Efeito da promoção do crescimento de plantas das estirpes AT-332 e AT-79 (teste em vaso)

Um teste em vaso foi realizado em relação a plântulas de couve Chinesa para medir o efeito de promoção do crescimento de plantas das estirpes AT-332 e AT-79. Após cultivo das estirpes AT-332 e AT-79 num meio de LB liquido, durante 24 horas, as células de bactérias foram recolhidas por centrifugação. As células de bactérias recolhidas foram suspensas numa solução aquosa de cloreto de sódio a 0,85%, de modo a serem contidas a uma concentração de 1 x 109 CFU/mL. Foram misturados 40 mL da suspensão por 1 kg do solo de cultivo anteriormente esterilizado para servir como o solo tratado. Por outro lado, 40 mL da solução aquosa de cloreto de sódio a 0,85% foram misturados por 1 kg do solo de cultivo anteriormente esterilizado para servirem como o solo não tratado. Foram colocados 100 g de cada do solo tratado e solo não tratado num vaso de plástico (70 mm em diâmetro x 68 mm em altura), respetivamente, e as sementes da couve Chinesa (variedade: Couve Chinesa Nozaki N° 2) foram semeadas no vaso. Subsequentemente, os vasos foram colocados em estufa, regulada a 22 °C e o peso fresco da couve Chinesa cultivada foi medido após 30 dias. Os resultados são mostrados na Fig. 3. Foi confirmado um efeito explicito da promoção do crescimento da colheita das estirpes AT-332 e AT-79. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> SDS Biotech K. K. <120> Estirpes pertencendo ao género Bacillus, formulação microbiana e método de cultivo de planta

<130> BOF-7708PCT <150> PCT/JP2011/062109 <151> 2011-05-26 <160> 3

<170> Patentln versão 3.1 <210> 1 <211> 1472 <212> ADN <213> AT-332 / AT-79 de Bacillus sp. <4 0 0> 1 gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc 60 cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat 120 aactccggga aaccggggct aataccggat gcttgtttga accgcatggt tcagacataa 180 aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt 240 aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300 ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga 360 aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 420 ttagggaaga acaagtgccg ttcraatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag 480 ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa 540 ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc 600 aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc 660 acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct 720 ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg 780 tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc 840 agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa 900 ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 960 cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag 1020 agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1080 caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg 1140 ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg 1200 ggctacacac gtgctacaat gggcagaaca aagggcagcg araccgcgag gttaagccaa 1260 tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa 1320 tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1380 gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct ttttggagcc 1440 agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tg 1472

<210> 2 <211> 1472 <212> ADN <213> AT-332 de Bacillus sp. <400> 2 gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc 60 cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat 120 aactccggga aaccggggct aataccggat gcttgtttga accgcatggt tcagacataa 180 aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt 240 aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300 ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga 360 aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 420 ttagggaaga acaagtgccg ttcgaatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag 480 ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa 540 ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc 600 aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc 660 acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct 720 ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg 780 tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc 840 agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa 900 ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 960 cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag 1020 agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1080 caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg 1140 ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg 1200 ggctacacac gtgctacaat gggcagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa 1260 tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa 1320 tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1380 gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct ttttggagcc 1440 agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tg 1472

<210> 3 <211> 1472 <212> ADN <213> AT-79 de Bacillus sp. <400> 3 gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc 60 cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat 120 aactccggga aaccggggct aataccggat gcttgtttga accgcatggt tcagacataa 180 aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt 240 aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300 ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga 360 aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 420 ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag 480 ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa 540 ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc 600 aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc 660 acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct 720 ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg 780 tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc 840 agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa 900 ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 960 cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag 1020 agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1080 caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg 1140 ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg 1200 ggctacacac gtgctacaat gggcagaaca aagggcagcg agaccgcgag gttaagccaa 1260 tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa 1320 tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1380 gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct ttttggagcc 1440 agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tg 1472

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Estirpe AT-332 de Bacillus sp. tendo o número de acesso NITE BP-1095 e contendo ADNr 16S representado pela sequência de base N° 2.
2. 2. Estirpe AT-79 de Bacillus sp. tendo o número de acesso NITE BP-1094 e contendo ADNr 16S representado pela sequência de base N° 3.
3. 3. Estirpe como reivindicada na reivindicação 1 ou 2, em que a estirpe per se e/ou a cultura da estirpe mostram efeitos de controlo de doenças de plantas, controlo de nemátodos e/ou promoção do crescimento de plantas.
4. 4. Utilização da estirpe e/ou da cultura da estirpe reivindicada em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 como um aqente de controlo de doenças de plantas, um aqente de controlo de nemátodos ou um promotor do crescimento de plantas.
5. 5. Método para o cultivo de plantas compreendendo o tratamento das plantas com a estirpe e/ou a cultura da estirpe reivindicada em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.