CN112708572B - 一种提高党参产量和品质的微生物复合菌剂及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高党参产量和品质的微生物复合菌剂及制备方法和应用，属于微生物农业应用领域，具体涉及微生物复合菌剂领域，以解决现有的微生物菌剂不能在正常生长条件下很好的促进党参生长和增强抗逆性的缺陷，所述复合微生物菌剂包括荧光假单胞菌，菌种保藏编号为CGMCC NO：20094，地芽孢杆菌，菌种保藏编号为CGMCC NO：20095和细胞复苏促进因子Rpf蛋白，本申请的复合微生物菌剂能够显著促进党参的生长代谢能力，在协同作用下显著增加了党参可溶性糖、叶绿素含量，增加了党参幼苗的鲜重和苗高，尤其提高了党参根系活力及合成SOD和PPO的能力，明显改善了党参生长状况，提高了党参产量及品质。
Description
技术领域
一种提高党参产量和品质的微生物复合菌剂及制备方法和应用，本发明属于微生物农业应用技术领域，具体涉及微生物复合菌剂技术领域。
背景技术
随着社会经济的发展和人民生活水平的提高，保健养生已成为人们提升幸福指数的重要内容。党参是桔梗科党参属的多年生草本植物，富含炔苷、多糖、蛋白质、必需氨基酸和矿物质等多种成分，具有补中益气、健脾益肺，养血生津等功效，2018年卫健委将其纳入药食同源名单。近年来，随着党参需求量的日益增加，野生党参已无法满足市场需求，由于地理环境及气候影响，不同地区人工栽培党参的产量和质量存在着较大差异。植物促生菌可通过固氮、溶解矿物质、产植物激素等多种途径促进植物生长发育，因此已被广泛用作生物菌肥来提高土壤肥力与党参产量。尽管各类微生物菌剂的研究与应用技术已相继被报道，但目前市售微生物菌剂大多只是简单地将几种有益微生物以一定比例混合调配或单纯的用一种微生物。
申请号CN201810430556.2，专利名称一种产酸克雷伯氏菌及其在促进潞党参生长中的应用，一种产酸克雷伯氏菌，其分类命名为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)，菌株号LDS17，已保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CGMCC NO：M 2017583，保藏日为 2017年10月16日。结果表明，干旱胁迫下接种菌株LDS17有效促进潞党参的生长及其抗旱性。
然而接种了上述产酸克雷伯氏菌后的潞党参在干旱处理下，能显著提高潞党参的抗逆性，但在正常生长条件下接种产酸克雷伯氏菌后对潞党参的生长及抗逆性方面的效果不显著。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种提高党参产量和品质的微生物复合菌剂及制备方法和应用，以解决现有的微生物菌剂不能在正常生长条件下很好的促进党参生长和增强抗逆性的缺陷。
本发明采用的技术方案如下：
一种提高党参产量和品质的微生物复合菌剂，所述复合微生物菌剂包括荧光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens)，菌种保藏编号为CGMCC NO:20094，地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)，菌种保藏编号为CGMCC NO:20095和细胞复苏促进因子Rpf蛋白。
本申请的技术方案中，复合微生物菌剂通过添加细胞复苏促进因子Rpf蛋白增强了荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)的活力，该蛋白一个高度保守的70个氨基酸残基组成的结构域，能促进荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens) 和地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)细胞的增殖，而且还与党参宿主免疫系统识别的靶抗原相关。本申请的复合微生物菌剂能够显著促进党参的生长代谢能力，在协同作用下显著增加了党参可溶性糖、叶绿素含量，增加了党参幼苗的鲜重和苗高，尤其提高了党参根系活力及合成 SOD和PPO的能力，明显改善了党参生长状况，提高了党参产量及品质。
优选的，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)与地芽孢杆菌(Geobacillussp.)的活菌比例为1-5:1-5。
优选的，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)与地芽孢杆菌(Geobacillussp.)的活菌比例为1:1。
优选的，细胞复苏促进因子Rpf蛋白的量为0.01-0.03mg/mL。
更为优选的，细胞复苏促进因子Rpf蛋白的量为0.02mg/mL。
一种提高党参产量和品质的微生物复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、将荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和地芽孢杆菌(Geobacillussp.) 分别在LB液体培养基中培养至活菌数为1.5-2.0×109cfu/mL；
步骤2、将荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和地芽孢杆菌(Geobacillussp.)按活菌比例为1-5:1-5混合得混合菌液，调整混合菌液的活菌数至1.8-3.0×109cfu/mL；
步骤3、向混合菌液中按0.01-0.03mg/mL加入细胞复苏促进因子Rpf蛋白，制得微生物复合菌剂。
一种提高党参产量和品质的微生物复合菌剂在促进党参生长中的应用。
一种提高党参产量和品质的微生物复合菌剂在增强党参抗逆性中的应用
本申请的技术方案中，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的原始编号为RHBA17；地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)的原始编号为RHBA19；
党参种子来源于甘肃省定西市岷县；
活菌数用LB液体培养基调浓度；
LB固体培养基：1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、1％～2％琼脂，余量为无菌水；
LB液体培养基：1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，余量为无菌水。
将甘油法保藏的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)RHBA17和地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)RHBA19分别划线接种到LB固体培养基上，待长出单菌落后进行LB液体培养。
细胞复苏促进因子Rpf蛋白中Rpf:Resuscitation promoting factor，是复苏促进因子；
细胞复苏促进因子Rpf蛋白来自兰州理工大学陈吉祥教授团队实验室；
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)分离自纹党参的根部，纹党参采自甘肃会川镇、漳县、岷县、渭源县、临洮县及陇西县。
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，菌种保藏编号为CGMCC NO:20094，保藏日期：2020年6月16日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)，菌种保藏编号为CGMCC NO:20095，保藏日期：2020年6月16日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本申请的技术方案中，P.fluorescens表示Pseudomonas fluorescens。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明中，复合微生物菌剂能够显著促进党参的生长代谢能力，在协同作用下显著增加了党参可溶性糖、叶绿素含量，增加了党参幼苗的鲜重和苗高，尤其提高了党参根系活力及合成SOD和PPO的能力，明显改善了党参生长状况，提高了党参产量及品质；
2、本发明中，复合微生物菌剂处理后党参种子的发芽率较对照提高了21.72％，显著提高了党参种子的发芽率；
3、本发明中，复合微生物菌剂处理后对党参主根长的增加作用最大，较对照增加了 65.45％；
4、本发明中，复合微生物菌剂处理后对党参苗高的提升作用最强；
5、本发明中，复合微生物菌剂处理对党参根、茎、叶中可溶性糖含量的提高最显著，分别较对照增加了126.92％、24.66％和61.54％，而根部影响尤为显著(P<0.05)；
6、本发明中，复合微生物菌剂处理后显著降低了党参根、茎、叶中MDA含量；
7、本发明中，复合微生物菌剂处理后党参叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量，与对照组相比分别提高了55.56％、37.21％、49.30％，影响最显著；
8、本发明中，复合微生物菌剂处理后党参根和叶中SOD含量分别较对照提高了89.94％和45.34％，使SOD的提高作用更强；
9、本发明中，复合微生物菌剂处理使党参根、茎、叶中PPO活性最高，添加了复苏促进因子的复合菌2中两种菌在一定程度上协同诱导党参幼苗防御活性的提高，增强党参抗病性；
10、本发明中，复合微生物菌剂能最显著增强党参幼苗根系活力。
附图说明
图1为本发明不同处理对党参种子萌发的影响；
图2为本发明不同处理对党参幼苗形态的影响；
图3为本发明不同处理对党参可溶性糖含量的影响；
图4为本发明不同处理对党参丙二醛(MDA)含量的影响；
图5为本发明不同处理对党参叶绿素含量的影响；
图6为本发明不同处理对党参超氧化物歧化酶(SOD)和多酚氧化酶(PPO)活性的影响；
图7为本发明不同处理对党参根系活力的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种提高党参产量和品质的微生物复合菌剂，所述复合微生物菌剂包括荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，菌种保藏编号为CGMCC NO:20094，地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)，菌种保藏编号为CGMCC NO:20095和细胞复苏促进因子Rpf蛋白；荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)与地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)的活菌比例为2:3；细胞复苏促进因子Rpf蛋白的量为0.03mg/mL。
本申请的技术方案中，复合微生物菌剂通过添加细胞复苏促进因子Rpf蛋白增强了荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)的活力，该蛋白一个高度保守的70个氨基酸残基组成的结构域，能促进荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens) 和地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)细胞的增殖，而且还与党参宿主免疫系统识别的靶抗原相关。本申请的复合微生物菌剂能够显著促进党参的生长代谢能力，在协同作用下显著增加了党参可溶性糖、叶绿素含量，增加了党参幼苗的鲜重和苗高，尤其提高了党参根系活力及合成 SOD和PPO的能力，明显改善了党参生长状况，提高了党参产量及品质。
一种提高党参产量和品质的微生物复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、将荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和地芽孢杆菌(Geobacillussp.) 分别在LB液体培养基中培养至活菌数为1.5-2.0×109cfu/mL；
步骤2、将荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和地芽孢杆菌(Geobacillussp.)按活菌比例为1-5:1-5混合得混合菌液，调整混合菌液的活菌数至1.8-3.0×109cfu/mL；
步骤3、向混合菌液中按0.01-0.03mg/mL加入细胞复苏促进因子Rpf蛋白，制得微生物复合菌剂。
一种提高党参产量和品质的微生物复合菌剂在促进党参生长中的应用。
一种提高党参产量和品质的微生物复合菌剂在增强党参抗逆性中的应用。
实施例2
在实施例1的基础上，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)与地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)的活菌比例为1:1；细胞复苏促进因子Rpf蛋白的量为0.02mg/mL，其余均同实施例1。
实施例3
在实施例1的基础上，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)与地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)的活菌比例为4:1；细胞复苏促进因子Rpf蛋白的量为0.01mg/mL，其余均同实施例1。
试验例
挑选颗粒饱满的党参种子，用自来水将表面灰尘清洗干净，后用2％NaClO溶液浸泡 10min消毒，消毒后用无菌水冲洗5-10次备用。
试验分组：
空白对照组(CK)：无菌水；
荧光假单胞菌RHBA17组：活菌数1.5-2.0×109cfu/mL；
地芽孢杆菌RHBA19组：活菌数1.5-2.0×109cfu/mL
复合菌1组：荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)RHBA17，地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)RHBA19混合，两种菌体积比为1:1，混合菌液用LB液体培养基调至处理浓度 1.5-2.0×109cfu/mL；
复合菌2组：：荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)RHBA17，地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)RHBA19和细胞复苏促进因子Rpf蛋白混合，两种菌体积比为1:1，混合菌液用LB液体培养基调至处理浓度1.5-2.0×109cfu/mL，再加入0.02mg/mL的Rpf蛋白。
党参生长试验中：将党参种子分别用等体积的上述处理浸泡种子，浸泡时间为12小时。
种子萌发试验，每天加一次无菌水，每次以无菌培养皿内的无菌滤纸浸透为宜，五天后测定种子萌发情况。
将上述浸泡了12小时的党参种子盆栽播种，播种后每月浇灌2次LB营养液，每盆每次浇灌100mL LB营养液，其他水肥及管理均相同，生长60天，采样，测定幼苗形态、根系活力、可溶性糖、丙二醛、叶绿素、超氧化物歧化酶和多酚氧化酶。不同处理对党参各项生长指标的影响如表1，图1-7所示。表1不同处理对党参各项生长指标的影响
注：同一行标记的不同小写字母表示处理间显著性水平P<0.05。
对种子萌发的影响：由表1和图1知，不同处理对党参种子萌发有不同程度的提高，其中荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)RHBA17、地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)RHBA19、复合菌1和复合菌2的发芽率发别较对照提高了15.44％、6.51％、15.96％和21.72％，不同处理对党参种子萌发的影响表现为复合菌2>复合菌1>荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)RHBA17>地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)RHBA19>空白对照组(CK)，图1中， A～E依次表示：对照、荧光假单胞菌、地芽孢杆菌、复合菌1、复合菌2；
对党参幼苗形态的影响：由表1和图2知，不同处理对党参幼苗的主根长、苗高和鲜重均较对照组有不同程度的提高。荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)RHBA17、地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)RHBA19、复合菌1和复合菌2处理后党参主根分别较对照增长了4.57cm、2.14cm、4.90cm和5.91cm，其中复合菌2对党参主根长的增加作用最大，较对照增加了65.45％。不同菌剂处理对党参主根长的影响表现为复合菌2>复合菌1>荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)RHBA17>地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)RHBA19>CK；对照组相比，各处理均显著提升了党参苗高水平，但处理组间差异并不显著，总体来看复合菌2和地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)RHBA19对党参苗高的提升作用最强，不同菌剂处理后党参鲜重均有所增加，表现为地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)RHBA19>复合菌1>复合菌2>荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)RHBA17>CK，较对照分别增加了1.09g、0.95g、0.24g、0.12g。
对党参可溶性糖含量的影响：由表1和图3知，不同处理对党参根、茎、叶中可溶性糖含量均有不同程度的提高，其中复合菌2处理最为显著，分别较对照增加了126.92％、24.66％和61.54％，而根部影响尤为显著(P<0.05)，不同处理对党参中可溶性糖含量的影响表现为：根：复合菌2>复合菌1>荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)RHBA17>地芽孢杆菌 (Geobacillus sp.)RHBA19>CK；茎：复合菌2>荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens) RHBA17＝地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)RHBA19>复合菌1>CK；叶：复合菌2>复合菌1>地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)RHBA19>荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens) RHBA17>CK。
对党参丙二醛(MDA)含量的影响：丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的重要产物之一，其含量可间接反映膜系统的受损程度，由表1和图4知，不同处理对党参根茎、叶中MDA 含量的影响总体表现为：复合菌2>复合菌1>地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)RHBA19>荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)RHBA17>CK，无论施加单一菌种还是复合菌剂均可降低党参根、茎、叶中的MDA含量，且均能达到显著水平(P<0.05)，但复合菌1和复合菌2 的作用效果最佳，说明复合菌剂更能显著降低党参细胞膜脂的过氧化程度，保护细胞膜免受损害并增强其抗性。
对党参叶绿素含量的影响：叶绿素是植物叶片进行光合作用必需的一类色素，由表1和图5知，所有处理均可提高党参叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量，单一菌株处理虽可显著增加叶绿素a和总叶绿素含量，但对叶绿素b的影响并不显著(P>0.05)，而复合菌剂明显提高了党参叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量，且均达到显著水平(P<0.05)，与对照组相比分别提高了48.48％、23.26％、40.85％(复合菌1)和55.56％、37.21％、49.30％(复合菌2)。不同菌剂处理对党参叶绿素含量的影响总体表现为：复合菌剂2>复合菌剂1>单一菌种>对照。
对党参超氧化物歧化酶(SOD)和多酚氧化酶(PPO)活性的影响：超氧化物歧化酶(SOD) 可以清除代谢产生的自由基，防止细胞损伤，是生物体内重要的抗氧化酶，由表1和图6A 知，不同处理均可在一定程度上提高党参根、茎、叶中的SOD活性，与单一菌株相比，复合菌剂处理使SOD的提高作用更强，尤其是党参根和叶中的复合菌2处理，分别较对照提高了89.94％和45.34％；多酚氧化酶(PPO)是植物呼吸链的末端氧化酶，能够催化酚类化合物氧化，在植物抗病中发挥重要作用，由表1和图6B知，不同处理使党参根、茎、叶中 PPO活性变化总体表现为：复合菌2>复合菌1>地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)RHBA19>荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)RHBA17>CK，说明复合菌1及添加了复苏促进因子的复合菌2中两种菌在一定程度上协同诱导党参幼苗防御活性的提高，增强党参抗病性。
对党参根系活力的影响：由表1和图7知，荧光假单胞菌RHBA17、地芽孢杆菌RHBA19、复合菌1和复合菌2处理均可显著增强党参幼苗根系活力，与对照相比分别增加了74.32％、 93.24％、150.00％和177.70％，总体表现为复合菌2>复合菌1>地芽孢杆菌(Geobacillus sp.) RHBA19>荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)RHBA17>CK。
综上，不同菌剂处理对党参生长的影响不同，总体表现为复合菌2>复合菌1>地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)RHBA19>荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)RHBA17>对照组 CK，结果表明，与单一菌株相比，复合菌1(荧光假单胞菌+地芽孢杆菌)对党参生长过程中各项指标的影响更大，而添加了细菌复苏促进因子Rpf蛋白的复合菌2对党参提质增产、增强抗性的影响最为显著。
本试验例中，种子萌发幼苗形态、根系活力、可溶性糖、丙二醛、叶绿素、超氧化物歧化酶和多酚氧化酶均采用本领域常规的试验方法测定。
实验地点：兰州理工大学人工气候植物组培间。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种提高党参产量和品质的微生物复合菌剂，其特征在于：所述微生物复合菌剂由菌种保藏编号为CGMCCNO:20094的荧光假单胞菌(P.fluorescens)RHBA17、菌种保藏编号为CGMCCNO:20095的地芽孢杆菌(Geobacillussp.) RHBA19和细胞复苏促进因子Rpf蛋白组成；荧光假单胞菌RHBA17 与地芽孢杆菌RHBA19的活菌比例为1-5:1-5，所述微生物复合菌剂的活菌数为1.8-3.0×109cfu/mL，所述细胞复苏促进因子Rpf蛋白的量为0.01-0.03mg/mL。
2.根据权利要求1所述的一种提高党参产量和品质的微生物复合菌剂，其特征在于：所述荧光假单胞菌RHBA17与地芽孢杆菌RHBA19的活菌比例为1:1。
3.根据权利要求1所述的一种提高党参产量和品质的微生物复合菌剂，其特征在于：所述细胞复苏促进因子Rpf蛋白的量为0.02mg/mL。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的提高党参产量和品质的微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、将所述荧光假单胞菌RHBA17和所述地芽孢杆菌RHBA19分别在LB液体培养基中培养至活菌数为1.5-2.0×109cfu/mL；
步骤2、将荧光假单胞菌RHBA17和地芽孢杆菌RHBA19按活菌比例为1-5:1-5混合得混合菌液，调整混合菌液的活菌数至1.8-3.0×109cfu/mL；
步骤3、向混合菌液中按0.01-0.03mg/mL加入细胞复苏促进因子Rpf蛋白，制得微生物复合菌剂。
5.一种如权利要求1-3任一项所述的提高党参产量和品质的微生物复合菌剂在促进党参生长中的应用。
6.一种如权利要求1-3任一项所述的提高党参产量和品质的微生物复合菌剂在增强党参抗逆性中的应用。
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Legal Events
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| GR01 | Patent grant | ||
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