ES2616911T3 - Cepa que pertenece al género Bacillus, agente microbiológico, y procedimiento de cultivo de plantas - Google Patents

Cepa que pertenece al género Bacillus, agente microbiológico, y procedimiento de cultivo de plantas Download PDF

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Abstract

Cepa AT-332 de Bacillus sp. que presenta el número de acceso NITE BP-1095 y que contiene ADNr 16S representado por la secuencia de bases nº 2.

Description

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D-fructosa: +/-Maltosa: +/-Lactosa: -/D-sorbitosa: +/-Inositol: +/D-xilosa: +/D-manosa: +/D-galactosa: -/-Sacarosa: +/-Trehalosa: +/D-manitol: +/-Glicerina: +/-
Actividad de β-galactosidasa: -Actividad de arginina dihidrolasa: -Actividad de lisina descarboxilasa: -Actividad de triptófano desaminasa: -Actividad de gelatinasa: +
Las secuencias de bases desde el lado del extremo 5' de ADNr 16S de la cepa AT-332 y la cepa AT-79 de Bacillus sp. de la presente invención están representadas por la secuencia nº 2 y la secuencia nº 3, respectivamente.
La secuencia nº 2 y la secuencia nº 3 difieren entre sí sólo en dos bases, en la base nº 444 y la base nº 1242. La base nº 444 es guanina (g) en la secuencia nº 2 y adenina (a) en la secuencia nº 3, y la base nº 1242 es adenina (a) en la secuencia nº 2 y guanina (g) en la secuencia nº 3.
Por lo tanto, el microorganismo de la presente invención está caracterizado por que presenta la secuencia de bases de la secuencia nº 1, incluyendo las secuencias mencionadas anteriormente nº 2 y nº 3 (es decir, la base nº 444 y la base nº 1242 están representadas por "r") a partir del lado del extremo 5' de ADNr 16S.
En la presente invención, la secuencia de bases de ADNr 16S es analizada como se indica a continuación.
InstaGene Matrix (producido por BIO RAD Laboratories, Inc., California (CA), U.S.A.) fue utilizado para la extracción de ADN; ADN polimerasa PrimeSTAR HS (producida por Takara Bio Inc.) fue utilizada para la PCR; el kit de secuenciación de ciclo BigDye Terminator v3.1 (producido por Applied Biosystems, California (CA), U.S.A.) fue utilizado para determinar la secuencia de ciclo, respectivamente. Los cebadores utilizados (según "Gene Analysis Method -method for determining the base sequence of 16S rRNA gene", Yasuyoshi Nakagawa et al., editado por Society for Actinomycetes Japan, Classification and identification of Actinomycetes, pp. 88-117, Business Center for Academic Societies Japan, 2001) fueron 9F, 339F, 785F, 1099F, 536R, 802R, 1242R y 1541R. La secuencia fue identificada usando el sistema analizador ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer System (producido por Applied Biosystems, California (CA), U.S.A.).
Como resultado de la búsqueda de homología basada en la base de datos internacional de secuencias de bases (GenBank/DDBJ/EMBL) usando BLAST (ALTSCHUL, (S.F.) et al., Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acid Res. 1997.25, 3389-3402), las secuencias de bases de ADNr 16S de la cepa AT-332 y la cepa AT-79 presentan un alto grado de homología con el ADNr 16S derivado del género Bacillus, y ambas cepas presentan la máxima homología, de 99,9%, con ADNr 16S de la cepa BCRC11601 de Bacillus amyloliquefaciens. Por otra parte, como resultado de la búsqueda de homología basada en la base de datos internacional de secuencias de bases (GenBank/DDBJ/EMBL), ninguna secuencia de bases de ADNr 16S de las cepas AT-332 y AT-79 es exactamente igual a la secuencia de bases de ADNr 16S derivada del género Bacillus.
En la presente invención, el análisis filogenético molecular se realiza como se expone a continuación.
El ADNr 16S derivado de la cepa estándar del grupo de cepas que se suponía que estaban estrechamente relacionadas, fue obtenido a partir de la base de datos internacional de secuencias de bases (GenBank/DDBJ/EMBL) para efectuar el análisis filogenético molecular usando 1.500 bp de la secuencia de bases de ADNr 16S obtenida como se expone anteriormente.
El ADNr 16S usado para el análisis filogenético molecular es obtenido a partir de las siguientes cepas.
-Bacillus subtilis, IAM12118T (AB042061) -Bacillus subtilis subsp. spizizenii, NBRC101239T (AB325584) -Bacillus mojavensis, IFO15718 T (AB021191) -Bacillus vallismortis, DSM11031 T (AB021198) -Bacillus amyloliquefaciens, BCRC11601 T (EF433406)
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obtuvieron unos efectos de control significativamente altos. Tabla 2
Tasa de área con enfermedad
Valor de control (%)
Región tratada (Ejemplo de formulación 1)
7 82,5
Región tratada (Ejemplo de formulación 3)
8 80,0
Región comparativa (polvo humectable Impression)
25 37,5
Región sin tratamiento
40 0,0
5
Ejemplo 3 y ejemplo comparativo 3: Prueba para los efectos sobre Phytophthora infestans del tomate
Se pulverizaron unas dosis suficientes de los polvos humectables de los ejemplos de formulación 1 y 3 con una tasa de dilución de 250 veces, con una pistola pulverizadora sobre los tomates (variedad: Sugar lump) cultivados en un 10 invernadero hasta la etapa del despliegue de la quinta hoja, en una maceta de plástico de 6 cm de diámetro. Como un ejemplo comparativo, una dilución del polvo humectable Impression (producido por SDS Biotech K.K.) con una tasa de dilución de 250 veces, también fue sometida a la prueba de la misma manera. Al día siguiente, una suspensión de zoosporas de Phytophthora infestans del tomate fue pulverizada e inoculada. Después de mantener las macetas en una habitación húmeda a 22°C durante 16 horas, las macetas se dejaron reposar en el invernadero 15 durante tres días y se examinó visualmente la tasa de área con enfermedad en las tercera, cuarta y quinta hojas, para así determinar el valor de control. El valor de control (%) se calculó basándose en la tasa de área con enfermedad en la región sin tratamiento. Como puede apreciarse a partir de los resultados en la Tabla 3, mediante el tratamiento con el agente microbiológico de la presente invención, la incidencia del Phytophthora infestans del tomate se redujo mucho en comparación con la región no tratada, y se obtuvieron unos efectos de control
20 significativamente altos.
Tabla 3
Tasa de área con enfermedad
Valor de control (%)
Región tratada (Ejemplo de formulación 1)
7 84,4
Región tratada (Ejemplo de formulación 3)
6 86,7
Región comparativa (polvo humectable Impression)
40 11,1
Región sin tratamiento
45 0,0
25 Ejemplo 4 y ejemplo comparativo 4: Prueba para los efectos sobre Pseudoperonospora cubensis del pepino
Se pulverizaron unas dosis suficientes de los polvos humectables de los ejemplos de formulación 1 y 3 con una tasa de dilución de 250 veces, con una pistola pulverizadora sobre los pepinos (variedad: Hikari nº 3 de tipo p) cultivados en un invernadero hasta la etapa del despliegue de la tercera hoja, en una maceta de plástico de 6 cm de diámetro. 30 Como un ejemplo comparativo, una dilución del polvo humectable Impression (producido por SDS Biotech K.K.) con una tasa de dilución de 250 veces, también fue sometida a la prueba de la misma manera. Al día siguiente, una suspensión de zoosporas de Pseudoperonospora cubensis del pepino fue pulverizada e inoculada. Después de mantener las macetas en una habitación húmeda a 22°C durante 18 horas, las macetas se dejaron reposar en el invernadero durante tres días y se examinó visualmente la tasa de área con enfermedad en las primera y segunda
35 hojas, para así determinar el valor de control. El valor de control (%) se calculó basándose en la tasa de área con enfermedad en la región sin tratamiento. Como puede apreciarse a partir de los resultados en la tabla 4, mediante el tratamiento con el agente microbiológico de la presente invención, la incidencia del Pseudoperonospora cubensis del pepino se redujo mucho en comparación con la región no tratada, y se obtuvieron unos efectos de control significativamente altos.
40 Tabla 4
Tasa de área con enfermedad
Valor de control (%)
Región tratada (Ejemplo de formulación 1)
4 88,6
Región tratada (Ejemplo de formulación 3)
3 91,4
Región comparativa (polvo humectable Impression)
25 28,6
Región sin tratamiento
35 0,0
Ejemplo 5 y ejemplo comparativo 5: Prueba para los efectos sobre Altenaria Alternaria mali del manzano
Se recolectaron unas hojas de manzana (variedad: Orin) y se pulverizaron unas dosis suficientes de los polvos humectables de los ejemplos de formulación 1 y 3, con una tasa de dilución de 250 veces, con una pistola
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  1. imagen1
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