JP2008501039A - 病害虫防除剤としての微生物バイオサーファクタント - Google Patents

Abstract

本発明は、天然の微生物バイオサーファクタントに基づく、病害虫防除のための方法および組成物に関する。本発明はさらに、バイオサーファクタント産生微生物を使用して病害虫を防除する方法まで及ぶ。

Description

本発明は、病害虫防除のための方法および組成物に関する。より具体的には、本発明は、病害虫防除剤として使用される微生物バイオサーファクタントおよびバイオサーファクタント産生微生物に関する。

（関連技術）
化学農薬は病害虫防除において有用であるが、その使用は多くの問題を引き起こす。化学農薬は、ヒト、家畜、益虫および野生生物のような標的としていない生物を傷つけやすい。さらにその残留物が、作物に残留する傾向があり、土壌、水あるいは大気に蓄積する場合がある。別の懸念は標的生物が農薬に対する耐性を得ることである。化学農薬に関連した重大な環境問題から、より安全な農薬および代替となる病害虫防除戦略の需要は増加している。

ある種の生きている生物学的防除剤（細菌、ファージ、バクテリオファージ）が病害虫の防除において有用であることが、当技術分野において広く知られるようになっている。これらの生物学的防除剤の成功は、該生物学的防除剤および標的の病害虫の生物学的理解に依存している。従来の技術によるこれらの生物学的防除剤の使用は、いくつかの制限を伴うものである。制限のうちの１つは、生物学的防除剤の一部がヒトまたは動物に対する日和見病原体であるということである。別の制約は、生態系の天然の生物（有益なものまたは病原体）と生物学的防除剤との競合である。多くの場合、生物学的防除剤は環境中での競争力がなく、処理の効果には疑問がある。

特許文献１には、鞭毛菌類の運動性の遊走子ステージに対するラムノリピドの使用について記載されている。ラムノリピドは該病原性真菌のこの運動性のステージに対して非常に有効であるが、商品作物の生産においてうまく処理できるかは施用時期に大きく依存し、また、所望のとおりに防除するには反復的な施用が必要な場合がある。湿気の高い条件下では、葉面散布は実益のない場合があり、反復的施用は生産コストを著しく増加させる。
米国特許第５，７６７，０９０号明細書

本発明の目的は、病害虫防除のための方法および組成物を提供することである。

（発明の概要）
本発明は、天然の微生物バイオサーファクタントに基づく、病害虫防除のための方法および組成物に関する。該生物防除剤で処理される病害虫の例には、アリ、アリマキ、アザミウマ、コナジラミ、カイガラムシ、シラミ、ゴキブリ、シロアリ、イエバエ、蚊などのような昆虫；ダニ（ｍｉｔｅ）、クモ、ダニ（ｔｉｃｋ）のようなクモ形類；線形動物（線虫）；軟体動物；アメーバ；寄生生物；ならびに藻類が挙げられる。本発明の病害虫防除剤は、微生物源由来の天然農薬（バイオ農薬）を含む。バイオ農薬は本質的に従来の農薬ほど有害ではない。バイオ農薬は迅速に生分解することが多く、したがって曝露量は低くなり、従来の農薬によって引き起こされる公害問題を大部分は回避する。

本発明の実施形態は、病害虫防除のための、天然に存在する微生物バイオサーファクタ
ント化合物の使用にまで及ぶ。本発明は、バイオサーファクタント産生微生物を使用して病害虫を防除する方法にも及ぶ。本発明はさらに、該組成物そのもの、ならびに該組成物の製造方法もしくは生産方法および本明細書に示されるような病害虫防除への該組成物の適用をも包含する。本発明の他の目的は、本明細書に記述された発明について知れば当業者には明白となりうる。

本発明の別の実施形態では、病害虫防除のための処方および処理は、油または脂肪酸のような炭素基質または有機基質を（病害虫の侵襲前または侵襲時に）標的領域に加えて、バイオサーファクタント産生生物の増殖を支援するとともに本発明の目的を達成するためその場所で所望のバイオサーファクタントを生産することにより達成される。施用場所（土壌、水系、植物の一部など）における天然のバイオサーファクタント産生生物は、この炭素基質を利用すると同時にバイオサーファクタントを生産することになる。この過程で、生産されたバイオサーファクタントは、標的領域の病害虫を死滅させるか麻痺させることになる。本発明によれば、標的領域あるいは炭素基質混合物にバイオサーファクタント産生生物をあらかじめ接種する必要はない。

微生物バイオサーファクタントは、細菌、真菌および酵母のような種々の微生物によって生産される化合物である。バイオサーファクタントは、シュードモナス属菌群（緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、プチダ菌（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フロレセンス（Ｐ．ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・フラギ（Ｐ．ｆｒａｇｉ）、シュードモナス・シリンゲ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ））；フラボバクテリウム属菌類；バチルス属菌類（枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・パミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｌｕｓ）、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）；カンジダ属菌類（カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・ルゴサ（Ｃ．ｒｕｇｏｓａ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・リポリチカ（Ｃ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ・トルロプシス（Ｃ．ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ））；ロドコッカス属菌類；アルトロバクター属菌類；カンピロバクター属菌類；コリネバクテリウム属菌類などのような多くの微生物において生じる重要な二次代謝産物群を形成する。

バイオサーファクタントは生分解性であり、再生可能な基質上で選択された生物を使用して、容易かつ安価に生産することが可能である。ほとんどのバイオサーファクタント産生生物は、増殖培地中の炭化水素供給源（例えば油、糖、グリセロールなど）の存在に応じてバイオサーファクタントを産生する。他の培地構成成分がバイオサーファクタントの産生に著しく影響する場合もある。例えば、アンモニウムではなく硝酸塩が窒素源として使用されると、緑膿菌によるラムノリピドの産生を増加させることができる。鉄、マグネシウム、ナトリウムおよびカリウムの濃度、炭素：リン比、ならびに撹拌も、ラムノリピド産生に大きく影響する。

バイオサーファクタントには、低分子量の糖脂質（ＧＬ）、リポペプチド（ＬＰ）、フラボリピド（ＦＬ）、リン脂質、ならびに高分子量のポリマー、例えばリポタンパク質、リポ多糖類とタンパク質との複合体および多糖類とタンパク質と脂肪酸との複合体などが挙げられる。バイオサーファクタントは多くの構造多様性を有する。バイオサーファクタント分子の共通の親油性部分は脂肪酸の炭化水素鎖であり、親水性部分は、中性脂質のエステルあるいはアルコール基によって、脂肪酸またはアミノ酸（またはペプチド）、フラボリピドの場合は有機酸のカルボキシレート基によって、あるいは糖脂質の場合にはその糖類によって形成される。

本発明の実施形態によれば、これらの化合物を標準的な有機合成法によって合成することも可能である。
１つの実施形態では、本明細書に記載の機能を発揮し、かつ結果を達成するために、単一のバイオサーファクタントあるいは異なるバイオサーファクタントの混合物を調合物中に用いることができる。

２００４年８月２３日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６０／６０４，１３９号は、参照により本願に組み込まれるが、強力な浸透力を有するバイオサーファクタント（例えばＧＬ、ＦＬ、ＬＰなど）について記述している。これらのバイオサーファクタントまたはバイオ農薬の重要な特徴は、組織または細胞に浸透可能であることであることが見出されている。これは農薬の有効性に影響を及ぼす非常に重要な要因である。一般に、農薬の有効性は、該農薬が被処理面上で容易に広がって病害虫に（例えば昆虫のクチクラの中に）浸透する場合は、著しく増強されうる。本発明の実施例によれば、本バイオ農薬は病害虫の組織に十分に浸透することが可能であり、助剤を使用せずにより少量で有効となりうる。臨界ミセル濃度よりも高い濃度では、該バイオサーファクタントはより効率良く処理対象内に浸透しうることが分かっている。

本発明では、予想外なことに、ラムノリピドのような天然かつ無毒のある種のバイオサーファクタントが、一部の病害虫および寄生生物に対して独特の作用様式を有し、このスペクトルの広い活性が従来の農薬の作用様式とは異なっていることが発見された。

病害虫防除のために選択された微生物を使用して大量生産することが可能な本発明の天然バイオ農薬の開発は、当技術分野における重要な進歩を表すものである。上述のように、生物防除剤としてバイオサーファクタント産生生物を使用して、あるいはバイオサーファクタント自体によって、病害虫を防除することが可能である。さらに、病害虫防除は、バイオサーファクタント農薬を生産すると同様にバイオサーファクタント産生生物の増殖を支援するために、特定の基質を使用することによって達成することが可能である。従って、本発明によれば、農薬としての微生物バイオサーファクタントの糖脂質、例えばラムノリピド、ソホルリピド（ｓｏｐｈｏｒｌｉｐｉｄ）、トレハロース脂質など；フラボリピド；リポペプチド；などには、合成農薬の必要性および合成農薬の使用を縮小する潜在能力がある。

本発明の上記その他の態様をさらに明確にするために、添付の図面に例証された本発明の具体的実施形態を参照することにより、本発明をより詳細に説明する。当然ながら、これらの図面は本発明の典型的な実施形態のみを示すものであり、したがって、発明の範囲を制限するものとみなされるべきではない。図面は原寸に比例して記載されたものではない。添付の図面の使用を通じてさらに具体的かつ詳細に本発明を記述および説明する。

（発明の実施形態の詳細な説明）
本発明は、病害虫を防除するための組成物および方法に関し、より詳細には、微生物の代謝産物または発酵代謝産物のような天然物質に由来する農薬に関する。本発明の実施形態によれば、微生物バイオサーファクタントを含有している生産された発酵ブロスを、抽出または精製せずに使用してもよい。所望であれば、バイオサーファクタントの抽出および精製は、標準的な抽出法あるいは文献に記述された技術を使用して容易に実施可能である。

本発明の一態様では、発酵ブロスあるいは精製されたバイオサーファクタント（例えばＧＬ、ＦＬ、ＬＰなど）は、有害な病害虫の防除により作物、家、構造物、土壌、水系、池、水族館、ヒトあるいは動物を保護するために使用されてもよい。本明細書において使用されるように、バイオサーファクタントまたはバイオサーファクタント産生生物によって生じる活性に関して使用される用語「防除」は、病害虫を死滅させ、機能を失わせ、ま
たは動けなくする作用、あるいは病害虫が実質的に害を及ぼすことができないようにする作用を示す。

本発明の別の態様では、バイオサーファクタント産生生物、例えば、シュードモナス属菌類は、処理しようとする土壌、植物用の生育培地、植物、水性媒体あるいは任意の領域に加えることができる。該生物はその場所で増殖し、本発明に記述されるように標的の病害虫を防除するためにバイオサーファクタントを産生することができる。それらの増殖および微生物バイオサーファクタント産生を援助するために、培養物を増殖強化物質と混合してもよい。油、グリセロール、糖あるいはその他の栄養素のような物質も使用可能である。

本発明の別の実施形態では、バイオサーファクタント産生生物の増殖を支援するための炭素基質が、病害虫に侵襲された領域、土壌、植物用の生育培地、植物の一部、水性媒体、あるいは処理すべき任意の領域に添加される。バイオサーファクタント産生生物は該基質上で増殖し、その場所でバイオサーファクタントを産生し、かつ本発明に記述されるような標的の病害虫を防除することが可能である。基質に必ずしもバイオサーファクタント産生生物を加える必要はない。施用部位で見出される天然のバイオサーファクタント産生生物が増殖して、バイオサーファクタントを生産することができるであろう。標的の領域に加えることが可能な炭素基質の例には、限定するものではないが、使用済みのフライ油などの天然または合成の油；脂肪；脂質；ろう（天然のものまたはパラフィン）；脂肪酸（例えばラウリン酸、ミリスチン酸など）；ラウリルアルコールのような脂肪酸アルコール；グリセリルモノラウレートのようなグリセロールを備えた脂肪酸の両親媒性エステル：ポリエチレンモノステアリン酸のような脂肪酸のグリコールエステル；ラウリルアミンのような脂肪酸アミン；脂肪酸アミド；ヘキサン；グリセロール；グルコース；などの、有機炭素源が挙げられる。バイオサーファクタントの過剰生産を促進するため、水に不溶性の炭素基質を使用することが好ましい。炭素基質に加えて、ビタミン、無機鉱物のような栄養素を、バイオサーファクタント産生生物の増殖を促進するために基質に加えてもよい。必須ではないが、乳化プロセスを開始させ、バイオサーファクタント産生生物と競合する他の生物の増殖を阻止もしくは低減し、かつ病害虫を防除するために十分な量の特定のバイオサーファクタントで炭素基質を強化または修正することが好ましい。例示であって限定的ではない実施例を挙げれば、最終的な油基質希釈混合物中で６０−１００ｍｇ／Ｌのラムノリピド・バイオサーファクタントの添加であろう。この希釈混合物を、処理すべき領域に施用する。この方法は緑膿菌またはシュードモナス・フロレセンス（ラムノリピド産生生物）集団の増殖確立の助けとなり、前記菌類の競合生物または病原生物である、疫病菌類（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）、線虫、バチルス属菌類の増殖の機会を低減する。シリンゴトキシン（Ｓｙｒｉｎｇｏｔｏｘｉｎ）リポペプチドのバイオサーファクタントの産生が望まれる場合、少量のシリンゴトキシン（数ｍｇ／Ｌ未満）を油‐グリセロールの基質に添加する。シリンゴトキシンは多くの競合生物を排除し、該リポペプチド毒素を産出しながらシュードモナス・シリンゲの増殖を持続させる。シュードモナス・シリンゲと枯草菌は例えば、ポレン（ｐｏｒｅｎ）と呼ばれる一連のリポペプチド・バイオサーファクタントを産生する。これらのリポペプチド・ポレンには、シュードマイシン（ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｉｎ）、シリンゴマイシン（ｓｙｒｉｎｇｏｍｙｃｉｎ）、タブトキシン（ｔａｂｔｏｘｉｎ）、ファセオロトキシン（ｐｈａｓｅｏｌｏｔｏｘｉｎ）およびサーファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）が挙げられる。リポペプチドの中には、細胞膜、細胞および組織に孔をあけることができるものがある。細胞および組織に対するその強力な活性により、これらのバイオサーファクタントは、藻類、線虫、昆虫および他の病害虫を防除するのに非常に有用である。作物の生産において、線虫または昆虫の幼虫を防除するための植物の前処理としてシュードマイシンを施用することが可能である。枯草菌の増殖促進が望まれる場合、少量のサーファクチン・バイオサーファクタントを炭素基質媒体に添加して、枯草菌集団の確立と、その場所でのより大量のサーファクチン産生とを援助す
る。

特に生物学的防除の出発点として微量のバイオサーファクタントが存在する状態で、標的部位においてバイオサーファクタントを生産するために炭素基質を使用すると、処理効率は大きく増強され、多くの病原体に対する生物学的防除スペクトルが広がり、バイオサーファクタントの施用頻度およびコストが低減される。実施例において記述するように、これは土壌処理の用途における本質的要素である。

合成サーファクタント、例えばラウリルベタインなどのアルキルベタイン、ラウリル硫酸またはその塩のような硫酸アルキル、臭化アルキルアンモニウム誘導体、アルキルフェノールエトキシレート、アルキルエチレン（あるいはポリエチレン）エトキシレートが、表面張力を低下させ、かつ天然のバイオサーファクタント産生生物による炭素基質の利用を促進するために使用されてもよいが、競合する生物の増殖を阻止することが可能な天然のバイオサーファクタントを使用し、本発明記載の特定のバイオサーファクタント産生生物の増殖を増強することが好ましい。

これらの微生物バイオ農薬の誘導体あるいは類似の構造または特性を備えた化合物は、本明細書にも開示されるように病害虫を防除する能力を有しており、本発明の実施形態に包含される。

上記に述べた合成サーファクタントの中には一部の病原体に対する阻害効果を有しているものがあり、昆虫、藻類、寄生アメーバ、線虫、雑草または本発明において記載される他の病害虫のような病害虫を防除するための活性物質として使用することもできることが判明している。さらに、それらを天然のバイオサーファクタントと共に使用してもよい。

本発明によれば、バイオサーファクタント（例えばＧＬ、ＦＬ、ＬＰなど）は、植物に影響を与える多くの病害虫および疾病に対する強力なバイオ農薬活性を有している。これらのバイオサーファクタントはさらに、ヒトおよび動物に影響を与える病害虫および疾病に対する同様のバイオ農薬活性も有している。防除される病害虫には、昆虫とその幼虫および卵；ダニ；藻類（海藻、池藻、および藍藻類のような微小藻類）；病害微生物（線虫、細菌、真菌、寄生生物、アメーバ、原生動物、ウイルスなど）；軟体動物；蠕虫；および雑草が挙げられる。さらに、これらのバイオサーファクタントは卵生寄生生物（ｏｖａ−ｐａｒａｓｉｔｅ）および包嚢のようなヒトの疾病、頭髪の頭垢などを治療するために使用されてもよい。さらに、ラムノリピド・バイオサーファクタントは２５０ｐｐｍの濃度で有効な殺精薬である。動物の疾患の例には、限定するものではないが、イヌ糸条虫；アメーバ様の粘液胞子虫（Ｍｙｘｏｂｏｌｕｓ）によって引き起こされるねじれ病（ｗｈｉｒｌｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）などの魚類の寄生虫および微生物感染、魚類の真菌疾病（水生菌類）あるいは緑藻類；キロドネラ（Ｃｈｉｌｏｄｏｎｅｌｌａ）のような原虫による魚類の疾病；鰓および皮膚の吸虫類のような魚類の寄生虫が挙げられる。さらに、本発明において記述されるようにウシのひづめ病を防除することも可能である。動物の治療は、バイオサーファクタント溶液単独、あるいは銅または亜鉛のような他の化合物の存在下で、該溶液に浸すか該溶液を浴びさせることにより行う。

天然のバイオサーファクタントの活性成分は、単独または、助剤として使用可能であるかもしくは農薬としての活性を有しうる他の許容可能な活性もしくは不活性の（不活）成分と組み合わせて、本発明に従って使用されてもよい。バイオサーファクタントの自然な性状を補足するために天然供給源の助剤あるいは農薬成分を使用することが好ましい。これらの成分は、桂皮油、チョウジ油、綿実油、ニンニク油あるいはローズマリー油などのいずれかのオイル成分でもよいし；イトランまたはキラヤのサポニンのような別の天然サーファクタントでもよいし；あるいは該成分は桂皮アルデヒドのようなアルデヒドであっ
てもよい。農薬成分あるいは助剤として使用されうるその他の油には、アーモンド油、しょうのう油、ヒマシ油、シーダー油、シトロネラ油、柑橘類の油、やし油、トウモロコシ油、ユーカリ油、魚油、ゼラニウム油、レシチン、レモングラス油、あまに油、鉱油、ミント油もしくは薄荷油、オリーブオイル、マツ油、菜種油、サフラワー油、セージ油、ゴマ油、橙花油、チミアン油、植物油およびウインターグリーン油が挙げられる。本発明の調合物に含まれうる他の適切な添加剤は、そのような調製物に慣習的に使用されるあらゆる物質である。そのような添加剤の例には、助剤、サーファクタント、乳化剤、植物栄養素、賦形剤、可塑剤、滑沢剤、流動促進剤、着色剤、色素、苦味剤、緩衝剤、溶解度調整剤、ｐＨ調節剤、保存剤、安定化剤および紫外線耐性剤が含まれる。堅化剤または硬化剤も、調合物を強化し、かつ、該調合物を土壌、根の張り出し部や樹木への注入用タブレットのようなある種の適用において圧力あるいは力に耐えるのに十分な強度にするために組込まれてもよい。

緩衝剤の例には、有機酸およびアミノ酸、あるいはそれらの塩が挙げられる。適切な緩衝剤には、クエン酸塩、グルコン酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、酢酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、アスパラギン酸塩、マロン酸塩、グルコヘプトン酸塩、ピルビン酸塩、ガラクタル酸塩、グルカル酸塩、タルトロン酸塩、グルタミン酸塩、グリシン、リジン、グルタミン、メチオニン、システイン、アルギニンおよびそれらの混合物が含まれる。リン酸および亜リン酸、あるいはそれらの塩も使用可能である。合成緩衝剤を使用するのが適切であるが、上記に列挙した有機酸およびアミノ酸あるいはそれらの塩のような天然の緩衝剤を使用することが好ましい。

活性物質の放出を制御するために調合物中に使用しうる、溶解度調整剤あるいは賦形剤の例には、ろう、キチン、キトサン、Ｃ１２−Ｃ２０脂肪酸（例えばミリスチン酸、ステアリン酸、パルミチン酸など）；Ｃ１２−Ｃ２０アルコール（例えばラウリルアルコール、セチルアルコール、ミリスチルアルコールおよびステアリルアルコールなど）；グリセロールを含んだ脂肪酸の両親媒性エステル、特にグリセリルモノラウレート、グリセリルモノパルミテートのようなＣ１２−Ｃ２０脂肪酸モノエステル；脂肪酸のグリコールエステル（例えば、ポリエチレンモノステアレートまたはポリプロピレンモノパルミテートグリコール）；Ｃ１２−Ｃ２０アミン（例えば、ラウリルアミン、ミリスチルアミン、ステアリルアミン）ならびにＣ１２−Ｃ２０脂肪酸アミドが含まれる。

ｐＨ調節剤の例には、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウムもしくは重炭酸カリウム、塩酸、硝酸、硫酸あるいは混合物が挙げられる。
重炭酸ナトリウムまたは炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、重リン酸ナトリウムなどの多塩基酸としての塩の水性調製物のような追加の成分を、調合物に含めることが可能である。

本発明の実施形態によれば、該微生物バイオ農薬は、液体、固体、顆粒、粉末、あるいは当業者であれば本明細書に開示された発明から理解するであろう手段による徐放性生成物など、様々な方法で製造し調合することが可能である。

該微生物バイオ農薬は、目前の特定の目的に最も適切であるような濃度の活性成分を含んだ、濃縮または希釈された液体、溶液、懸濁物、粉末などの形態で、噴霧、注ぎかけ、浸漬によって施用可能である。そのまま適用されてもよいし、あるいは使用に先立って再構成されてもよい。例えば、該微生物バイオ農薬は樹木あるいは根の張り出し部の中へ直接注入されてもよい。

本発明の固形剤は、円柱、ロッド、ブロック、カプセル、タブレット、ピル、ペレット、ストリップ、スパイクなど種々の形態および形状であってよい。固形剤を粉砕しても、
顆粒状としても、粉末状としてもよい。顆粒状または粉末状の材料をプレスしてタブレットとしてもよいし、あるいはあらかじめ製造されたゼラチンカプセルまたはシェルに詰めて用いてもよい。半固形調合物を、ペースト、ろう、ゲルあるいはクリーム状の調製物に調製することもできる。

ヒトまたは動物への施用については、調合物を、液体、ペースト、軟膏、坐薬、カプセルあるいはタブレットの形態に調製し、医薬品産業で使用される医薬品に類似の方法で使用すればよい。調合物を、医薬品産業で既知の成分を使用してカプセル化することも可能である。カプセル化により望ましくない反応から成分が保護され、成分が環境あるいは処理される対象または体（例えば胃）における悪条件に抵抗する助けとなる。

本発明の組成物は、様々な施用方法を使用して、植物、病害虫あるいは土壌に施用することが可能である。各々の施用方法はある特定の状況下で好ましい場合がある。
本発明の組成物は、活性化合物を土壌へ導入するために使用されてもよい。これらの調製物を植物の根の近くの土壌に組み入れることも考えられる。本発明の組成物は液体、ベイト、粉末、散剤または顆粒剤の形態とすることが考えられるし、あるいは、タブレット、スパイク、ロッドあるいは他の形状の成形物として土壌に挿入される。

本発明の組成物は個々の樹木または植物を治療するために使用することが可能である。例えば、その調合物を種々の形状あるいは形態（固体、ペーストまたはゲル、あるいは液体）に成形し、植物の維管束組織へ導入することが可能である。成形物の形態は、タブレット、カプセル、プラグ、ロッド、スパイク、フィルム、ストリップ、爪状物、またはプレートであってよい。形成された成形品は、植物または根の張り出し部の中に予め空けておいたドリル穴へ導入されてもよいし、形成層内に押し込まれても、打ち込まれてもよい。

本発明の別の施用方法は、樹幹または根の張り出し部内のドリル穴へ半固形調合物（ペースト、ゲル、クリーム）を送達するための、シリンジ、ポンプまたはコーキングガン、ペースト・チューブあるいはプランジャー・チューブなどのような施用デバイスの使用である。

本発明の組成物は、植物の表面上にペースト、ゲル、コーティング、ストリップあるいはプラスター剤の形で施用することが可能である。１つの方法では、プラスター剤またはストリップの、処理中に樹木、叢林もしくはバラと接触することになる側に、半固形調合物（例えば殺虫剤）が配置されていてもよい。同じストリップが、処理される対象物を包むかまたは該対象への貼付のために、一端または両端に接着剤または粘着剤を備えていてもよい。

本発明の組成物は、ペレット、スプレー溶液、顆粒あるいは散剤の形態で葉上にスプレーまたは散布することが可能である。
本発明の固体または半固形組成物を、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ソルビトール、ゴム、糖あるいはポリビニルアルコールのような医薬品工業において使用されるフィルム・コーティング化合物を使用して、コーティングすることが可能である。これは、農薬調合物において使用されるタブレットまたはカプセルにとって特に不可欠である。フィルム・コーティングにより、取扱い者が調合物中の活性成分と直接接触しないように保護することが可能である。さらに、安息香酸デナトリウムまたはカッシンのような苦味剤が農薬の調合物、コーティング剤あるいは両方に組み入れられてもよい。

本発明の組成物を粉末調合物に調製し、あらかじめ製造されたゼラチンカプセル内に詰めてもよい。
該組成物の調合物中の成分の濃度および施用速度は、病害虫、処理される植物または領域、あるいは施用方法によって様々であってよい。より詳細に以下に記述されるように、本発明の組成物および方法は、昆虫および他の無脊椎動物、藻類、病原微生物、ならびに状況によっては雑草または他の植物を含む、様々な病害虫を防除するために使用することが可能である。

ラムノリピドの精製混合物（米国ウィスコンシン州ソークビル（Ｓａｕｋｖｉｌｌｅ）所在のジェネイル・バイオテク（Ｊｅｎｅｉｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ）から供給）およびシュードモナス属菌類の発酵ブロス濾液を、アザミウマ、アリマキ、イエバエ、蚊、トネリコバカエデの害虫、線虫、ハダニおよび藻類のような種々の病害虫に対する活性に関して試験した。該培養物は、一部の病害虫に対しては０．００５％もの低濃度で有効であった。下記は本発明を実施する手順を例証するための実施例である。これらの実施例は例示であり、限定するものとして解釈されるべきでない。

ラムノリピドを含有する発酵ブロスを、イエバエを防除するための殺虫剤としてその有効性に関して試験した。１０匹のイエバエをスクリーンで覆ったペトリ皿に閉じ込め、同スクリーンを通して前記殺虫剤をスプレーした。別の一組のイエバエ１０匹には水をスプレーし、対照とした。表１は試験結果を示す。

別の試験では、濃度２．５％の精製ラムノリピド物質を、ハダニが自然に群棲した領域でハダニに直接スプレーした。処理の内容は、試験として６匹のハダニにスプレーする一方、対照として６匹のハダニに水をスプレーした。ハダニの十分な防除は処理後１５分未満で達成された。

自然にハダニが群棲したレモンの木に、１．２５％のラムノリピド溶液をスプレーした。拡大鏡を使用してダニの動きを観察した。１５分未満で死滅が認められた。
自然にコナジラミが群棲したトマト樹に、水で希釈した０．１％のラムノリピド混合物をスプレーした。対照のトマト樹には水のみをスプレーした。ラムノリピドがスプレーされたコナジラミは葉に張り付き、処理後は移動することができなかった。十分な防除は６分未満で達成された。

各１リットルの水の入った容器内へ、０、０．０７５あるいは０．２グラムのラムノリピド（例示）を含有するタブレットを加えた。１０匹の蚊の幼虫を該容器の各々に入れた。幼虫全部の死滅は、０．２グラムのラムノリピドを含んでいる容器中で約２時間４０分で観察された。０．０７５グラムのラムノリピドを含んでいる容器では、実験開始後２４
時間で生きている蚊の幼虫が１匹だけ残っていた。対照の処理では死滅は観察されなかった。この重要な発見は、西ナイルウイルスの媒介生物の防除および蔓延において非常に重要である。別の研究では、濃度１００ｐｐｍのラムノリピドの添加により蚊の卵の孵化が抑制されることが見出された。

アメーバが群棲する５０ｍｌの水の入ったペトリ皿を、２５０ｐｐｍのラムノリピドで処理した。処理前後に顕微鏡でアメーバを検査すると、ラムノリピド添加から５分以内にアメーバが弱って崩壊することが示された。

アカアリ塚の被害については、塚を０．５％のラムノリピド溶液で浸した。この処理は有効であり、塚には２週間超の間アリがなかった。
農薬の調製：
例Ａ：５％のラムノリピド溶液を、ジェネイル・バイオテク（Ｊｅｎｅｉｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ）から供給された２５％の精製ラムノリピド濃縮物を使用して調製した。

例Ｂ：濃縮溶液を、２０グラムのゴマ油、３０グラムのキャノーラ油、１０グラムのグリセロール、および４０グラムの水を混合することにより調製した。該混合物を、使用に先立って水で１０倍、５０倍あるいは１００倍に希釈する。

例Ｃ：濃縮溶液を、５グラムのラムノリピド、２０グラムのゴマ油、３０グラムのキャノーラ油、１０グラムのグリセロール、および３５グラムの水を混合することにより調製した。該混合物を、使用に先立って水で１０倍、５０倍あるいは１００倍に希釈した。

例Ｄ：対照の処理として水を使用した。
例Ｅ：１０％亜リン酸および８％カリウムの濃縮溶液を、７０％の亜リン酸、４５％の水酸化カリウムおよび水を混合することにより調製した。該溶液は、ｐＨ５．８のクエン酸／グルコン酸で緩衝した。該混合物を使用に先立って水で１００倍に希釈した。

例Ｆ：５％ラムノリピド、１０％亜リン酸および８％カリウムの濃縮溶液を、７０％の亜リン酸、４５％の水酸化カリウムおよび水を混合することにより調製した。該溶液は、ｐＨ５．８のクエン酸／グルコン酸で緩衝した。該混合物を使用に先立って水で１００倍に希釈した。

イナゴについての実験：
各処理について、６匹のイナゴに、例Ａ、Ｂ、ＣまたはＤを水で１０倍または１００倍に希釈して調製した溶液をスプレーした。１０倍希釈では、例Ｃの処置が最も有効であり、処理されたイナゴが１０分以内にすべて死滅した。１０倍希釈の例Ａの処理では、即座にイナゴの動きが遅くなったが、処理したものの半分が施用から２０分以内に回復した。１０倍希釈の例Ｂの処理では、ラムノリピド単独の効果と同様の効果があった。１００倍希釈では、例Ａは有効ではなかった。例Ｂの処理は３３％有効であり、例Ｃの処理は８４％有効であった。水による処理はイナゴに対する効果はなかった。

ウドンコ病についての実験：
例Ａ、Ｂ、ＣまたはＤの希釈溶液を、ウドンコ病に極度に感染したカボチャおよびバラにスプレーした。バラの処理結果を表２に示す。興味深いことに、１００倍希釈で例Ｃの調合物をバラにスプレーすると、感染領域が葉から完全になくなった。カボチャの処理結果はバラの処理と同様であったが、カボチャはこのスプレー溶液に対する感受性がより高かった。１０倍希釈では、カボチャの葉はスプレー施用後２４時間以内に組織の壊死を生じ、同植物は３日以内に死滅した。例ＥおよびＦはバラについてのみ試験した。ウドンコ病治療における重要な発見は、ラムノリピド単独でも亜リン酸単独でも使用した濃度では
ウドンコ病に対してあまり有効ではなかったが、ラムノリピド／亜リン酸の組合せはウドンコ病の治療に非常に有効だったということである。ウドンコ病は鞭毛菌類のグループには属さないが、ラムノリピドが、膜という障害を通り抜けて、あるいは菌の保護層への浸透により、亜リン酸の活性および作用様式を増強すると考えられる。

除草効果：
該バイオサーファクタントの、特に油と組み合わせたときの強力な微小乳化活性および浸透活性により、該バイオサーファクタントは有害な雑草を防除するための非選択的除草剤として使用することが可能である。０．５％およびそれ以上のラムノリピド濃度では、一部の植物に壊死が観察された。この結果は、油、特にゴマ油または綿実油の存在下では非常に拡大される。濃度０．０５％のラムノリピドおよび２％の油では、処理された多くの雑草あるいは植物が処理から数日以内に死滅した。

線虫の処理：
線虫についての予備試験を下記の手順に従って実施した。この試験で使用した土は、自然に線虫が群棲したジャガイモ畑から分離した。７５グラムの土（最初の水分含量１５％
）を、二重に折り重ねられたチーズクロスで包み、ストレーナーに取り付けた。土が入っているこのストレーナーを、４５０ｍｌの水（対照）または０．７５％のラムノリピド混合物を含んでいるプラスチック漏斗中で穏やかに懸濁させた。土が入ったストレーナーの底面が実験の間中処理溶液に接しているように維持した。様々な時点で、漏斗の脚部にクランプで接続されたチューブを通して２５ｍｌの試料を採取した。上清の溶液を、顕微鏡を使用して検査するためにペトリ皿に直接移した。生き残っている有害線虫の数を、２４時間間隔で７日間記録した。個々の線虫が運動不能で、針に固定したまつ毛で邪魔をしても反応しない場合、死んでいるものと判断した。試験は３連で実施した。結果を表３に示す。

種々の調合物および濃度について、じゃがいも、トマトおよび甜菜の線虫その他の病害虫に対する活性に関して試験した。
線虫の実験が終了した後、プラスチック漏斗の中にある線虫処理溶液において意外な発見が観察された。日の当たる場所にわずか数週間放置された後、対照（水のみ）の溶液では藻類の増殖が生じたことが観察された。これに対して、ラムノリピド処理では、藻類の増殖のない透明な溶液が維持された。この結果を検証するために、０（対照としての水）、０．００５、０．０１、０．１および１％のラムノリピド濃度で処理する別のセットについて実施した。この実験で使用した水は、藻類が群棲した池から採取した。ラムノリピド処理ではいずれも藻類の増殖は生じなかった。しかしながら、最低濃度のラムノリピドでは、実験開始の６週間後に藻類の増殖が再発した。他の処理では３か月の実験期間中藻類のない状態であった。対照の処理（池の水）は、変色して緑がかり、藻類が水中で繁茂した。

根瘤線虫の卵についての実験：
線虫の瘤が蔓延しているトマト樹の根から得られた１組の線虫卵を、水２５ｍｌまたは２５０ｐｐｍのラムノリピドを含む水２５ｍｌのいずれかが入ったペトリ皿へ移した。この卵を顕微鏡で定期的に検査した。ラムノリピドで処理された卵の色は実験する間に褐色を帯びた色に変化し、７日後には卵は弱って崩壊した。水で処理した場合は卵の色または形状の変化は観察されなかった。

ゲルの調製：５％のラムノリピド・ゲル調合物は、１．０％のゴムまたはカルボキシビニル・カーボポールポリマーに、水に溶解した精製ラムノリピドを含浸させることにより調製する。この材料を３０分未満ボルテックスミキサーで混合してペーストを得る。この処理は、ダニの治療用に動物に塗りこむために使用することが可能である。

図１は、病害虫を防除するための本発明の方法の例を示す流れ図である。該方法は、微
生物バイオサーファクタントを得る工程（１０２）から始まる。本明細書に記述されるように、バイオサーファクタントは、バイオサーファクタントを施用する前の製造工程または培養工程（１０４）により得ることが可能である。別例として、バイオサーファクタントは、病害虫の環境に炭素基質を施用する工程（１０６）、ならびに天然に存在する微生物が該基質上で成長し、その結果バイオサーファクタントの生産が可能となる工程（１０８）により得ることが可能である。いずれの場合も、バイオサーファクタントは、病害虫が実質的に防除されるように、病害虫あるいは病害虫の環境に施用される（１１０）。

図２は、病害虫を防除するために使用可能なバイオサーファクタントを生産するための本発明の方法の例を示す流れ図である。該方法は、バイオサーファクタントを含んだ発酵ブロスを生産することなど、バイオサーファクタント産生微生物を培養する工程（２０２）から始まる。その後、発酵ブロスから、病害虫あるいは病害虫のいる環境に、病害虫が本質的に防除される量で施用することが可能な濃度のバイオサーファクタントを得る（２０４）。発酵ブロスからバイオサーファクタントを得る工程は、図２に例証された様々な方法のうちの１つで実施することができる。例えば、ある実施形態では、発酵ブロスを精製または抽出を行わなくても適切な濃度のバイオサーファクタントを含んでいる（２０６）。別例として、発酵ブロスを精製してもよいし（２０８）、あるいは、発酵ブロスからバイオサーファクタントを抽出してもよい（２１０）。図２に例証したこれらの典型的な方法がバイオサーファクタントを得るのに好適であるが、本明細書に開示された病害虫防除方法は、バイオサーファクタントを得るために使用される方法にかかわらず行なうことが可能である。

本発明は、本発明の思想または本質的特質から逸脱することなく他の特定形態で具体化される場合がある。記載された実施形態は、すべての点において単なる例示であって限定的ではないものとみなされるべきである。

本発明において列挙された処理工程、使用方法および構成成分の例は、例示であって包括的なものではない。本発明は、本発明の思想または本質的特質から逸脱することなく他の特定形態で具体化される場合がある。記載された実施形態は、すべての点において単なる例示であって限定的ではないものとみなされるべきである。添付の特許請求の範囲は本明細書に開示された発明の実施形態を明らかにするために示される。

本発明の実施形態に従って病害虫を防除するために微生物バイオサーファクタントを施用する方法を例証する流れ図。 病害虫を防除するために使用するのに十分な濃度でバイオサーファクタントを得る方法を例証する流れ図。

Claims (24)

1. 病害虫を防除する方法であって、
   微生物バイオサーファクタントを得る工程と、
   病害虫に、あるいは病害虫のいる環境に、該病害虫が実質的に防除される量の前記微生物バイオサーファクタントを施用する工程と
   からなる方法。
2. バイオサーファクタントを得る工程が、バイオサーファクタントを産生する微生物を培養する工程からなる、請求項１に記載の方法。
3. 微生物を培養する工程が、バイオサーファクタントを含有する発酵ブロスを生産する工程からなる、請求項２に記載の方法。
4. 発酵ブロスの精製または発酵ブロスからのバイオサーファクタントの抽出を行わずにバイオサーファクタントを得る、請求項３に記載の方法。
5. 微生物を培養する工程が、発酵ブロスからバイオサーファクタントを抽出することからさらになる、請求項３に記載の方法。
6. 微生物を培養する工程が、発酵ブロスを精製することからさらになる、請求項３に記載の方法。
7. 前記病害虫は、昆虫、クモ形類、線虫、軟体動物、アメーバ、寄生生物および藻類から成る群に含まれる、請求項１に記載の方法。
8. 微生物バイオサーファクタントは、
   緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、プチダ菌（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フロレセンス（Ｐ．ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・フラギ（Ｐ．ｆｒａｇｉ）、シュードモナス・シリンゲ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）などのシュードモナス属菌群、
   フラボバクテリウム属菌類、
   枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・パミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｌｕｓ）、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）などのバチルス属菌類、
   カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・ルゴサ（Ｃ．ｒｕｇｏｓａ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・リポリチカ（Ｃ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、およびカンジダ・トルロプシス（Ｃ．ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）などのカンジダ属菌類、
   ロドコッカス属菌類、
   アルトロバクター属菌類、
   カンピロバクター属菌類、ならびに
   コリネバクテリウム属菌類
   からなる群に含まれる微生物により産生されたものである、請求項１に記載の方法。
9. 微生物バイオサーファクタントが、
   ラムノリピド、ソホルリピド、およびトレハロース脂質などの低分子量の糖脂質、
   リポペプチド、
   フラボリピド、
   リン脂質、ならびに
   リポタンパク質、リポ多糖類とタンパク質との複合体、および多糖類とタンパク質と脂肪酸との複合体などの高分子量のポリマー
   からなる群に含まれる活性成分を含む、請求項１に記載の方法。
10. 微生物バイオサーファクタントは、別個の助剤を使用せずに病害虫に浸透する浸透剤である、請求項１に記載の方法。
11. 病害虫を防除する方法であって、
    バイオサーファクタント産生微生物を得る工程と、
    病害虫に、あるいは病害虫のいる環境に、該微生物がバイオサーファクタントを産生することによって該病害虫が実質的に防除される量の該微生物を施用する工程と
    からなる方法。
12. バイオサーファクタントが、糖脂質、フラボリピド、およびリポペプチドから成る群に含まれる活性成分を含む、請求項１１に記載の方法。
13. バイオサーファクタントが、リポタンパク質、リポ多糖類とタンパク質との複合体、リン脂質、および多糖類とタンパク質と脂肪酸との複合体から成る群に含まれる活性成分を含む、請求項１１に記載の方法。
14. 病害虫を防除する方法であって、
    バイオサーファクタント産生微生物を発生させうる炭素基質を得る工程と、
    病害虫に、あるいは病害虫のいる環境に、天然に存在するバイオサーファクタント産生微生物がバイオサーファクタントを産生することによって該病害虫が実質的に防除される量の該炭素基質を施用する工程と
    からなる方法。
15. 炭素基質を施用する工程は、その中またはその上に病害虫が存在している土壌、水系、および植物の一部のうちの１つに炭素基質を施用することを含む、請求項１４に記載の方法。
16. 炭素基質は、
    油、
    脂肪、
    脂質、
    天然のろうまたはパラフィンろう、
    脂肪酸、
    ラウリルアルコールあるいは他の脂肪酸アルコール、
    グリセロールを備えた脂肪酸の両親媒性エステル、例えばグリセリルモノラウレート、
    脂肪酸のグリコールエステル類、例えばポリエチレンモノステアリン酸、
    脂肪酸アミン、例えばラウリルアミン、
    脂肪酸アミド、
    ヘキサン、
    グリセロール、および
    グルコース
    から成る群に含まれる、請求項１４に記載の方法。
17. 炭素基質を施用する工程は、表面張力を低下させて、天然に存在するバイオサーファクタント産生微生物による炭素基質の利用を促進する合成サーファクタントを施用することからなる、請求項１４に記載の方法。
18. 合成サーファクタントは、
    アルキルベタイン、
    硫酸アルキル、
    臭化アルキルアンモニウム誘導体、
    アルキルフェノールエトキシレート、および
    アルキルエチレンあるいはポリエチレンエトキシレート
    から成る群から選択される、請求項１７に記載の方法。
19. バイオサーファクタントは、糖脂質、フラボリピド、およびリポペプチドから成る群に含まれる活性成分を含む、請求項１４に記載の方法。
20. バイオサーファクタントは、リポタンパク質、リポ多糖類とタンパク質との複合体、リン脂質、および多糖類とタンパク質と脂肪酸との複合体から成る群に含まれる活性成分を含む、請求項１４に記載の方法。
21. 病害虫の防除に使用することが可能なバイオサーファクタントを生産する方法であって、
    バイオサーファクタントを含有する発酵ブロスを生産する工程を含む、バイオサーファクタント産生微生物の培養工程と、
    病害虫に、あるいは病害虫がいる環境に、該病害虫が実質的に防除される量を施用することのできる濃度のバイオサーファクタントを該発酵ブロスから得る工程と
    からなる方法。
22. 発酵ブロスの精製または発酵ブロスからのバイオサーファクタントの抽出を行わずにバイオサーファクタントを得る、請求項２１に記載の方法。
23. バイオサーファクタントを得る工程が、発酵ブロスからバイオサーファクタントを抽出する工程からなる、請求項２１に記載の方法。
24. バイオサーファクタントを得る工程が、発酵ブロスを精製する工程からなる、請求項２１に記載の方法。

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