JPH1075796A - エタノールを用いたラムノリピッドの製造方法 - Google Patents
エタノールを用いたラムノリピッドの製造方法Info
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- JPH1075796A JPH1075796A JP8248485A JP24848596A JPH1075796A JP H1075796 A JPH1075796 A JP H1075796A JP 8248485 A JP8248485 A JP 8248485A JP 24848596 A JP24848596 A JP 24848596A JP H1075796 A JPH1075796 A JP H1075796A
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- ethanol
- medium
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- producing
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 生産物の分離精製が容易にできる水溶性炭素
源を用いて、高い生産効率、特に高い蓄積濃度でラムノ
リピッドを発酵生産により製造できる方法を提供するこ
と。 【解決手段】 シュードモナス(Pseudomonas) 属に属す
るラムノリピッド生産菌をエタノールを含有する培地中
で培養し、培養物からラムノリピッドを採取するラムノ
リピッドの製造方法であって、前記培地中のエタノール
濃度が３％以下に維持されるように前記培地にエタノー
ルを添加する前記方法。
源を用いて、高い生産効率、特に高い蓄積濃度でラムノ
リピッドを発酵生産により製造できる方法を提供するこ
と。 【解決手段】 シュードモナス(Pseudomonas) 属に属す
るラムノリピッド生産菌をエタノールを含有する培地中
で培養し、培養物からラムノリピッドを採取するラムノ
リピッドの製造方法であって、前記培地中のエタノール
濃度が３％以下に維持されるように前記培地にエタノー
ルを添加する前記方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、エタノールを炭素
源として含む培地中でラムノリピッド生産菌を培養して
ラムノリピッドを製造する方法に関する。
源として含む培地中でラムノリピッド生産菌を培養して
ラムノリピッドを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】最近、石油系物質の生態に及ぼす影響
や、石油エネルギー源の枯渇が懸念されている。そのた
めに界面活性剤の分野でも、生分解性があり再生可能な
界面活性剤である糖脂質が着目されている。化学合成に
よる界面活性剤に比べ、糖脂質はＣＭＣ(Critical mice
lle concentration)が低く、毒性が少なく、温度、ｐ
Ｈ、塩濃度に対する安定性が高いことなど、優れた特性
を有している。
や、石油エネルギー源の枯渇が懸念されている。そのた
めに界面活性剤の分野でも、生分解性があり再生可能な
界面活性剤である糖脂質が着目されている。化学合成に
よる界面活性剤に比べ、糖脂質はＣＭＣ(Critical mice
lle concentration)が低く、毒性が少なく、温度、ｐ
Ｈ、塩濃度に対する安定性が高いことなど、優れた特性
を有している。
【０００３】ラムノリピッドは、ラムノースとβ−ヒド
ロキシデカン酸から構成される糖脂質で、糖と脂肪酸の
組み合わせにより４種類あることが知られる。シュード
モナス・エルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa)により
発酵生産されるラムノリピッドは、主成分が3-[3'- (α
-L-rhamnopyranopyranosyloxy)decanoyloxy]decanoicac
id (R1)と3-[3'-(2"-O-α-L-rhamnopyranosyl- α-L-rh
amnopyranosyloxy)decanolyloxy]decanoic acid (R2)
である。ラムノリピッドは、優れた界面活性能力を有
し、用途として、油脂類をもとに微生物などを増殖させ
るときの増殖促進剤、重油の粘度低下剤、さらには、油
脂類に汚染された容器の洗浄への使用が考えられてい
る。
ロキシデカン酸から構成される糖脂質で、糖と脂肪酸の
組み合わせにより４種類あることが知られる。シュード
モナス・エルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa)により
発酵生産されるラムノリピッドは、主成分が3-[3'- (α
-L-rhamnopyranopyranosyloxy)decanoyloxy]decanoicac
id (R1)と3-[3'-(2"-O-α-L-rhamnopyranosyl- α-L-rh
amnopyranosyloxy)decanolyloxy]decanoic acid (R2)
である。ラムノリピッドは、優れた界面活性能力を有
し、用途として、油脂類をもとに微生物などを増殖させ
るときの増殖促進剤、重油の粘度低下剤、さらには、油
脂類に汚染された容器の洗浄への使用が考えられてい
る。
【０００４】ラムノリピッドは、グリセリン、グルコー
ス、エタノールなどの炭素源を発酵原料として生産可能
である。しかし、高い生産性を得るためには、n-アルカ
ンや油脂のような水不溶性物質が必須とされている[Jou
rnal of Scientific & Industrial Research, 53, Augu
tst, p.619〜629 (1984)] 。また、窒素源として硝酸ナ
トリウムなど無機塩が有効であるが、低い濃度であるこ
とが必要で、リン、Ｋ+ 、Ca++、Mg++、Fe+++ 量を制限
するなどの工夫した培地組成が必要であるとされてい
る。
ス、エタノールなどの炭素源を発酵原料として生産可能
である。しかし、高い生産性を得るためには、n-アルカ
ンや油脂のような水不溶性物質が必須とされている[Jou
rnal of Scientific & Industrial Research, 53, Augu
tst, p.619〜629 (1984)] 。また、窒素源として硝酸ナ
トリウムなど無機塩が有効であるが、低い濃度であるこ
とが必要で、リン、Ｋ+ 、Ca++、Mg++、Fe+++ 量を制限
するなどの工夫した培地組成が必要であるとされてい
る。
【０００５】Robertらは、様々な油脂の検討を行った結
果、オリーブ油が最良であるとし、２％のオリーブ油を
炭素源とする培地でのバッチ発酵により、60時間で7.5g
/lのラムノリピッドを生産している[Biotechnology Let
ters 11, 12, p.871〜874 (1989)] 。また、ラムノリピ
ッドの生産は菌の増殖が終了した停止期に開始すること
から、Syldatk らはシュードモナス・エスピー(Pseudom
onas sp.) の増殖菌体を集め、10％のn-テトラデカンと
0.5 ％のNaClのみを含む培地で休止菌体として反応する
ことにより、10日で15g/l の生産量を得ている[Z. Natu
raforsch. 40C,p.61〜67 (1986)]。水不溶性物質が炭素
源として適している原因として、ラムノリピッドの生産
が、水不溶性物質の乳化、代謝に寄与していることが考
えられている[Microbiological Reviews, 60, 1, p.151
〜166 (1996)] 。
果、オリーブ油が最良であるとし、２％のオリーブ油を
炭素源とする培地でのバッチ発酵により、60時間で7.5g
/lのラムノリピッドを生産している[Biotechnology Let
ters 11, 12, p.871〜874 (1989)] 。また、ラムノリピ
ッドの生産は菌の増殖が終了した停止期に開始すること
から、Syldatk らはシュードモナス・エスピー(Pseudom
onas sp.) の増殖菌体を集め、10％のn-テトラデカンと
0.5 ％のNaClのみを含む培地で休止菌体として反応する
ことにより、10日で15g/l の生産量を得ている[Z. Natu
raforsch. 40C,p.61〜67 (1986)]。水不溶性物質が炭素
源として適している原因として、ラムノリピッドの生産
が、水不溶性物質の乳化、代謝に寄与していることが考
えられている[Microbiological Reviews, 60, 1, p.151
〜166 (1996)] 。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】これらの方法によるラ
ムノリピッドの生産量 (培地への蓄積濃度) は、ロード
コッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)
によるスクシノイルトレハロースリピッドの生産 (10％
のn-アルカン培地から40g/l)、カンジダ・エスピー(Can
dida sp.) によるマンノシルエリスリトールリピッドの
生産 (大豆油から35g/l)、トルロプシス・ボンビコラ(T
orulopsis bomvicola)による糖脂質の生産(グルコース1
0％、ヒマワリ油 9.5％から70g/l)に比べれば相当に低
い。
ムノリピッドの生産量 (培地への蓄積濃度) は、ロード
コッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)
によるスクシノイルトレハロースリピッドの生産 (10％
のn-アルカン培地から40g/l)、カンジダ・エスピー(Can
dida sp.) によるマンノシルエリスリトールリピッドの
生産 (大豆油から35g/l)、トルロプシス・ボンビコラ(T
orulopsis bomvicola)による糖脂質の生産(グルコース1
0％、ヒマワリ油 9.5％から70g/l)に比べれば相当に低
い。
【０００７】糖脂質の発酵生産のフィージビリティース
タディーによれば、固定費が高いため、工場原価も高く
なると言われており (医学出版、バイオコンバージョン
p.146〜149)、水不溶性材料を原料とした糖脂質発酵生
産の工業化の困難さが指摘されている。水不溶性物質を
原料とする場合の不利な点は、 1)増殖と生産速度が遅いこと 2)災害防止上や健康上有害である有機溶媒を生産物の抽
出に使用せざるを得ないこと 3)発酵後に存在する油脂類と、生産物である糖脂質の精
製分離に工程を要すること にある。
タディーによれば、固定費が高いため、工場原価も高く
なると言われており (医学出版、バイオコンバージョン
p.146〜149)、水不溶性材料を原料とした糖脂質発酵生
産の工業化の困難さが指摘されている。水不溶性物質を
原料とする場合の不利な点は、 1)増殖と生産速度が遅いこと 2)災害防止上や健康上有害である有機溶媒を生産物の抽
出に使用せざるを得ないこと 3)発酵後に存在する油脂類と、生産物である糖脂質の精
製分離に工程を要すること にある。
【０００８】水不溶性物質を原料とする糖脂質発酵生産
に代わり、水溶性炭素源を用いた糖脂質発酵生産も検討
されている。例えばLee らが、水溶性炭素源での最適発
酵条件を、グルコースを炭素源とした場合について検討
している。しかし、 1〜2g/l程度の低い生産量しか得ら
れず、効率的な発酵システムとはなっていない[LeeらJ.
of Korean Ind. & Eng. Chemistry, 4, 1, p.41〜45
(1993)]。
に代わり、水溶性炭素源を用いた糖脂質発酵生産も検討
されている。例えばLee らが、水溶性炭素源での最適発
酵条件を、グルコースを炭素源とした場合について検討
している。しかし、 1〜2g/l程度の低い生産量しか得ら
れず、効率的な発酵システムとはなっていない[LeeらJ.
of Korean Ind. & Eng. Chemistry, 4, 1, p.41〜45
(1993)]。
【０００９】そこで本発明の目的は、生産物の分離精製
が容易にできる水溶性炭素源を用いて、高い生産効率、
特に高い蓄積濃度でラムノリピッドを発酵生産により製
造できる方法を提供することにある。
が容易にできる水溶性炭素源を用いて、高い生産効率、
特に高い蓄積濃度でラムノリピッドを発酵生産により製
造できる方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、シュードモナ
ス(Pseudomonas) 属に属するラムノリピッド生産菌をエ
タノールを含有する培地中で培養し、培養物からラムノ
リピッドを採取するラムノリピッドの製造方法であっ
て、前記培地中のエタノール濃度が３％以下に維持され
るように前記培地にエタノールを添加することを特徴と
する前記方法に関する。さらに本発明の別の態様は、上
記方法において、培地が窒素源として酵母エキスを含有
するか、または培地が窒素源として酵母エキスと大豆粉
を含有する方法である。
ス(Pseudomonas) 属に属するラムノリピッド生産菌をエ
タノールを含有する培地中で培養し、培養物からラムノ
リピッドを採取するラムノリピッドの製造方法であっ
て、前記培地中のエタノール濃度が３％以下に維持され
るように前記培地にエタノールを添加することを特徴と
する前記方法に関する。さらに本発明の別の態様は、上
記方法において、培地が窒素源として酵母エキスを含有
するか、または培地が窒素源として酵母エキスと大豆粉
を含有する方法である。
【００１１】本発明者らは、過去には良好な原料とはさ
れていなかったエタノールを用いた発酵システムを再検
討した。より詳しくは、エタノールのフィード法や窒素
源などの培地組成を検討し、その結果、上記の問題点を
解決できることを見出した。すなわち本発明によれば、 1)エタノールの総計8vol%(63g/l)から25g/l のラムノリ
ピッドが生成され、変換率として約40％が得られるこ
と、 2)精製工程を複雑にする、発酵原料の残分等油脂類の混
入が防げること、 3)油脂培地では大部分の糖脂質が菌体に付着されて生産
されるが、エタノール培地ではその80％以上は水層に存
在することから、危険な有機溶媒抽出を避け、水層の樹
脂処理で精製しうること、 などの有利がある。
れていなかったエタノールを用いた発酵システムを再検
討した。より詳しくは、エタノールのフィード法や窒素
源などの培地組成を検討し、その結果、上記の問題点を
解決できることを見出した。すなわち本発明によれば、 1)エタノールの総計8vol%(63g/l)から25g/l のラムノリ
ピッドが生成され、変換率として約40％が得られるこ
と、 2)精製工程を複雑にする、発酵原料の残分等油脂類の混
入が防げること、 3)油脂培地では大部分の糖脂質が菌体に付着されて生産
されるが、エタノール培地ではその80％以上は水層に存
在することから、危険な有機溶媒抽出を避け、水層の樹
脂処理で精製しうること、 などの有利がある。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下本発明について説明する。本
発明の方法では、シュードモナス(Pseudomonas) 属に属
するラムノリピッド生産菌を用いる。シュードモナス(P
seudomonas) 属に属するラムノリピッド生産菌として
は、例えば、シュードモナス・エルギノーザ(Pseudomon
as aeruginosa)を挙げることができ、シュードモナス・
エルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa)は、IFO 3924株
として入手可能である。
発明の方法では、シュードモナス(Pseudomonas) 属に属
するラムノリピッド生産菌を用いる。シュードモナス(P
seudomonas) 属に属するラムノリピッド生産菌として
は、例えば、シュードモナス・エルギノーザ(Pseudomon
as aeruginosa)を挙げることができ、シュードモナス・
エルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa)は、IFO 3924株
として入手可能である。
【００１３】上記ラムノリピッド生産菌は、エタノール
を含有する培地中で培養される。この際、培地中のエタ
ノール濃度が３％以下に維持される。培地中のエタノー
ル濃度が３％を超えると、ラムノリピッド生産菌の発酵
能が低下して、培地中のラムノリピッド蓄積濃度は高く
ならない。また、エタノールは、炭素源となるため、培
養の進行とともに上記生産菌により消費される。そこ
で、培養中、培地にエタノールを断続的又は連続的に添
加することでエタノール濃度を３％以下となるように維
持する。エタノール濃度は、低すぎてもラムノリピッド
の生産速度が低下するので、例えば、１％以上とするこ
とが適当である。
を含有する培地中で培養される。この際、培地中のエタ
ノール濃度が３％以下に維持される。培地中のエタノー
ル濃度が３％を超えると、ラムノリピッド生産菌の発酵
能が低下して、培地中のラムノリピッド蓄積濃度は高く
ならない。また、エタノールは、炭素源となるため、培
養の進行とともに上記生産菌により消費される。そこ
で、培養中、培地にエタノールを断続的又は連続的に添
加することでエタノール濃度を３％以下となるように維
持する。エタノール濃度は、低すぎてもラムノリピッド
の生産速度が低下するので、例えば、１％以上とするこ
とが適当である。
【００１４】培地には、上記エタノール以外の栄養源を
適宜添加することができる。例えば、炭素源として、グ
ルコース、グリセリン、菜種油等を添加できる。また、
窒素源として、酵母エキス、大豆粉、ポリペプトン、コ
ーンスティープリカー (ＣＳＬ) 等を含有することがで
きる。培地に窒素源として酵母エキスを添加すると、ラ
ムノリピッド生産能が高まるという観点から好ましく、
例えば、0.5 〜1.0%の酵母エキスを用いることができ
る。
適宜添加することができる。例えば、炭素源として、グ
ルコース、グリセリン、菜種油等を添加できる。また、
窒素源として、酵母エキス、大豆粉、ポリペプトン、コ
ーンスティープリカー (ＣＳＬ) 等を含有することがで
きる。培地に窒素源として酵母エキスを添加すると、ラ
ムノリピッド生産能が高まるという観点から好ましく、
例えば、0.5 〜1.0%の酵母エキスを用いることができ
る。
【００１５】さらに、酵母エキスに加えて大豆粉 (エス
サンミート、味の素 (株) 製) を添加するとラムノリピ
ッド生産能の点でさらに好ましく、 0.5〜1.0 ％の大豆
粉を用いることが好ましい。尚、２種以上の窒素源を用
いる場合、その合計が 0.4〜1.2 ％の範囲であることが
適当である。窒素源の量が多すぎるとラムノリピッドの
生産能が低下するので好ましくない。
サンミート、味の素 (株) 製) を添加するとラムノリピ
ッド生産能の点でさらに好ましく、 0.5〜1.0 ％の大豆
粉を用いることが好ましい。尚、２種以上の窒素源を用
いる場合、その合計が 0.4〜1.2 ％の範囲であることが
適当である。窒素源の量が多すぎるとラムノリピッドの
生産能が低下するので好ましくない。
【００１６】培養温度及び時間等の培養条件は、使用す
るラムノリピッド生産菌の種類に応じて適宜決定でき
る。例えば、前述のラムノリピッド生産菌としてシュー
ドモナス・エルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa) IFO
3924 株を用いる場合、室温 (例えば、20〜30℃) で、
例えば、100 〜250 時間培養することにより、ラムノリ
ピッドが培地に蓄積される。
るラムノリピッド生産菌の種類に応じて適宜決定でき
る。例えば、前述のラムノリピッド生産菌としてシュー
ドモナス・エルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa) IFO
3924 株を用いる場合、室温 (例えば、20〜30℃) で、
例えば、100 〜250 時間培養することにより、ラムノリ
ピッドが培地に蓄積される。
【００１７】ラムノリピッドが蓄積した培養物から、常
法によりラムノリピッドを採取することができる。培養
物からのラムノリピッドの採取及び精製には、例えば、
吸着クロマトグラフィーが有効である。また、ラムノリ
ピッドはカルボキシル基を有することから、陰イオン交
換樹脂を使用して採取及び精製をすることもできる。
法によりラムノリピッドを採取することができる。培養
物からのラムノリピッドの採取及び精製には、例えば、
吸着クロマトグラフィーが有効である。また、ラムノリ
ピッドはカルボキシル基を有することから、陰イオン交
換樹脂を使用して採取及び精製をすることもできる。
【００１８】本発明の方法により得られるラムノリピッ
ドは、使用するラムノリピッド生産菌の種類により異な
るが、例えば、シュードモナス・エルギノーザ(Pseudom
onasaeruginosa)を用いた場合、3-[3'- (α-L-rhamnopy
ranopyranosyloxy)decanoyloxy]decanoic acid (R1)及
び3-[3'-(2"-O-α-L-rhamnopyranosyl- α-L-rhamnopyr
anosyloxy)decanolyloxy]decanoic acid (R2) を主成分
とするラムノリピッドが得られる。これらのラムノリピ
ッドは、優れた界面活性能力を有し、油脂類をもとに微
生物などを増殖させるときの増殖促進剤、重油の粘度低
下剤、さらには、油脂類に汚染された容器の洗浄へ使用
等の用途がある。
ドは、使用するラムノリピッド生産菌の種類により異な
るが、例えば、シュードモナス・エルギノーザ(Pseudom
onasaeruginosa)を用いた場合、3-[3'- (α-L-rhamnopy
ranopyranosyloxy)decanoyloxy]decanoic acid (R1)及
び3-[3'-(2"-O-α-L-rhamnopyranosyl- α-L-rhamnopyr
anosyloxy)decanolyloxy]decanoic acid (R2) を主成分
とするラムノリピッドが得られる。これらのラムノリピ
ッドは、優れた界面活性能力を有し、油脂類をもとに微
生物などを増殖させるときの増殖促進剤、重油の粘度低
下剤、さらには、油脂類に汚染された容器の洗浄へ使用
等の用途がある。
【００１９】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明について詳細
に説明する。 実施例１ フラスコ培養 30mlの種母培地 [グルコース 1％、酵母エキス(Difco社
製) 0.3 ％、麦芽エキス(Difco社製) 0.3 ％、ポリペプ
トン 0.5％、pH 7.0] を含む250ml 三角フラスコを用意
し、シュードモナス・エルギノーザ(Pseudomonas aerug
inosa) IFO 3924 株の凍結乾燥粉末を植菌し、28℃、23
0rpmで振とう培養した。30mlの生産培地[エタノール 3v
ol%、酵母エキス(Difco社製)0.5％、大豆粉 (エスサン
ミート、味の素 (株) 製)0.5％、 KH2PO4 0.05％、 MgS
O4・7H2O 0.05 ％、pH 7.0] を含む250ml 三角フラスコ
を用意し、種母培養液を２％添加し、28℃、230rpmで振
とう培養した。24、48、72、168 時間後にエタノールを
1vol% ずつ添加した。
に説明する。 実施例１ フラスコ培養 30mlの種母培地 [グルコース 1％、酵母エキス(Difco社
製) 0.3 ％、麦芽エキス(Difco社製) 0.3 ％、ポリペプ
トン 0.5％、pH 7.0] を含む250ml 三角フラスコを用意
し、シュードモナス・エルギノーザ(Pseudomonas aerug
inosa) IFO 3924 株の凍結乾燥粉末を植菌し、28℃、23
0rpmで振とう培養した。30mlの生産培地[エタノール 3v
ol%、酵母エキス(Difco社製)0.5％、大豆粉 (エスサン
ミート、味の素 (株) 製)0.5％、 KH2PO4 0.05％、 MgS
O4・7H2O 0.05 ％、pH 7.0] を含む250ml 三角フラスコ
を用意し、種母培養液を２％添加し、28℃、230rpmで振
とう培養した。24、48、72、168 時間後にエタノールを
1vol% ずつ添加した。
【００２０】継時的にサンプリングし、下記のTLC 法に
よりラムノリピッド生産量を定量した。培養液200 μl
をクロロホルム：メタノール＝１：１液１mlと激しく攪
拌した。遠心により２層に分け、有機溶媒層をシリカゲ
ルTLC (Merck 5715 メルク社製) に5 μl スポットし
た。グルコース１、３、５μg を定量標準物質とした。
クロロホルム：メタノール：水＝65：25：4 で展開し、
オルシノール硫酸溶液を噴霧し、110 ℃、10分乾燥し
た。TLC スキャナー((株) 島津製作所製、CS-9000)を用
いて550nm の反射光量測定を行ない、グルコースをスタ
ンダードとしてラムノリピッド量を測定した。別の試験
により、グルコース換算量と、ラムノリピッドの実量と
の比率は4.65と求めたので、この係数を掛けることによ
りラムノリピッド量とした。その結果、50時間頃からラ
ムノリピッドの生産は本格的に始まり、図１のようにR1
〔3-[3'- (α-L-rhamnopyranopyranosyloxy)decanoylox
y]decanoic acid 〕とR2〔3-[3'-(2"-O-α-L-rhamnopyr
anosyl- α-L-rhamnopyranosyloxy)decanolyloxy]decan
oic acid〕を併せて、７日で25g/l の生産量を示した。
よりラムノリピッド生産量を定量した。培養液200 μl
をクロロホルム：メタノール＝１：１液１mlと激しく攪
拌した。遠心により２層に分け、有機溶媒層をシリカゲ
ルTLC (Merck 5715 メルク社製) に5 μl スポットし
た。グルコース１、３、５μg を定量標準物質とした。
クロロホルム：メタノール：水＝65：25：4 で展開し、
オルシノール硫酸溶液を噴霧し、110 ℃、10分乾燥し
た。TLC スキャナー((株) 島津製作所製、CS-9000)を用
いて550nm の反射光量測定を行ない、グルコースをスタ
ンダードとしてラムノリピッド量を測定した。別の試験
により、グルコース換算量と、ラムノリピッドの実量と
の比率は4.65と求めたので、この係数を掛けることによ
りラムノリピッド量とした。その結果、50時間頃からラ
ムノリピッドの生産は本格的に始まり、図１のようにR1
〔3-[3'- (α-L-rhamnopyranopyranosyloxy)decanoylox
y]decanoic acid 〕とR2〔3-[3'-(2"-O-α-L-rhamnopyr
anosyl- α-L-rhamnopyranosyloxy)decanolyloxy]decan
oic acid〕を併せて、７日で25g/l の生産量を示した。
【００２１】実施例２ ミニジャー培養 30mlの種母培地 [グルコース 1％、酵母エキス(Difco社
製) 0.3 ％、麦芽エキス(Difco社製) 0.3 ％、ポリペプ
トン 0.5％、pH 7.0] を含む250ml 三角フラスコを用意
し、シュードモナス・エルギノーザ(Pseudomonas aerug
inosa) IFO 3924 株の凍結乾燥粉末を植菌し、28℃、23
0rpmで振とう培養した。1.5lの生産培地[エタノール 3v
ol%、酵母エキス(Difco社製) 0.5 ％、大豆粉 (エスサ
ンミート、味の素 (株) 製) 0.5 ％、 KH2PO4 0.05％、
MgSO4・7H2O 0.05 ％、pH 7.0]を含む31のミニジャー
を用意し、種母培養液を２％添加し、28℃、500rpmで通
気量 1vvm で攪拌培養した。24, 48, 72, 168 時間後に
エタノールを1vol% ずつ添加した。継時的にサンプリン
グし、ＴＬＣ法によりラムノリピッド生産量を定量し
た。その結果、50時間からラムノリピッドの生産は本格
的に始まり、図２のようにR1とR2を併せて、７日で25g/
l の生産量を示した。
製) 0.3 ％、麦芽エキス(Difco社製) 0.3 ％、ポリペプ
トン 0.5％、pH 7.0] を含む250ml 三角フラスコを用意
し、シュードモナス・エルギノーザ(Pseudomonas aerug
inosa) IFO 3924 株の凍結乾燥粉末を植菌し、28℃、23
0rpmで振とう培養した。1.5lの生産培地[エタノール 3v
ol%、酵母エキス(Difco社製) 0.5 ％、大豆粉 (エスサ
ンミート、味の素 (株) 製) 0.5 ％、 KH2PO4 0.05％、
MgSO4・7H2O 0.05 ％、pH 7.0]を含む31のミニジャー
を用意し、種母培養液を２％添加し、28℃、500rpmで通
気量 1vvm で攪拌培養した。24, 48, 72, 168 時間後に
エタノールを1vol% ずつ添加した。継時的にサンプリン
グし、ＴＬＣ法によりラムノリピッド生産量を定量し
た。その結果、50時間からラムノリピッドの生産は本格
的に始まり、図２のようにR1とR2を併せて、７日で25g/
l の生産量を示した。
【００２２】実施例３ 培養液上清に含まれるラムノリ
ピッド定量 実施例２の培養液を遠心し、上清に含まれるラムノリピ
ッド量を測定したところ、培養液のクロロホルムとメタ
ノールの抽出により取得可能な量の80％以上が含まれて
いた。対照として、菜種油を原料としてラムノリピッド
生産を行った場合は、いずれも10％以下であった。
ピッド定量 実施例２の培養液を遠心し、上清に含まれるラムノリピ
ッド量を測定したところ、培養液のクロロホルムとメタ
ノールの抽出により取得可能な量の80％以上が含まれて
いた。対照として、菜種油を原料としてラムノリピッド
生産を行った場合は、いずれも10％以下であった。
【００２３】実施例４ ラムノリピッドの吸着クロマト
グラフィーによる精製 実施例２の培養液を遠心し、20g/l のラムノリピッドを
含む上清液1 リットルを調製し、吸着クロマトグラフィ
ーによるラムノリピッド精製を検討した。オクチルセフ
ァロース、ないしはODS 樹脂100ml のカラムに吸着さ
せ、前者では60％メタノール、後者では80％メタノール
で溶出した。糖脂質画分を液体クロマトグラフィーで分
析したところ、いすれも95％の相対純度を有する標品1
8.8g を得た。分析条件はカラム；Shodex GS-310 7E 7.
6mm×250mm 、移動層；30％メタノール、検出；203nm
。
グラフィーによる精製 実施例２の培養液を遠心し、20g/l のラムノリピッドを
含む上清液1 リットルを調製し、吸着クロマトグラフィ
ーによるラムノリピッド精製を検討した。オクチルセフ
ァロース、ないしはODS 樹脂100ml のカラムに吸着さ
せ、前者では60％メタノール、後者では80％メタノール
で溶出した。糖脂質画分を液体クロマトグラフィーで分
析したところ、いすれも95％の相対純度を有する標品1
8.8g を得た。分析条件はカラム；Shodex GS-310 7E 7.
6mm×250mm 、移動層；30％メタノール、検出；203nm
。
【００２４】実施例５ ラムノリピッドの陰イオン交換
クロマトグラフィーによる精製 20g/l のラムノリピッドを含む同様の上清液1 リットル
を調製し、陰イオン交換クロマトグラフィーによるラム
ノリピッド精製を検討した。DEAEセファロースCL 6B樹
脂100ml のカラムに吸着させ、100mM NaCl, 10％エタノ
ールで溶出した。糖脂質画分を液体クロマトグラフィー
で分析したところ、93％の相対純度を有する標品15.3g
を得た。
クロマトグラフィーによる精製 20g/l のラムノリピッドを含む同様の上清液1 リットル
を調製し、陰イオン交換クロマトグラフィーによるラム
ノリピッド精製を検討した。DEAEセファロースCL 6B樹
脂100ml のカラムに吸着させ、100mM NaCl, 10％エタノ
ールで溶出した。糖脂質画分を液体クロマトグラフィー
で分析したところ、93％の相対純度を有する標品15.3g
を得た。
【００２５】実施例６ アルコールフィードによるラム
ノリピッドの生産 30mlの種母培地 [グルコース 1％、酵母エキス(Difco社
製) 0.3 ％、麦芽エキス(Difco社製) 0.3 ％、ポリペプ
トン 0.5％、pH 7.0] を含む250ml 三角フラスコを用意
し、シュードモナス・エルギノーザ(Pseudomonas aerug
inosa) IFO 3924 株の凍結乾燥粉末を植菌し、28℃、23
0rpmで振とう培養した。30mlの生産培地[エタノール 3v
ol%、酵母エキス(Difco社製)0.5％、大豆粉 (エスサン
ミート、味の素 (株) 製)0.5％、 KH2PO4 0.05％、 MgS
O4・7H2O 0.05 ％、pH 7.0] を含む250ml 三角フラスコ
を用意し、種母培養液を１％添加し、28℃、230rpmで振
とう培養した。
ノリピッドの生産 30mlの種母培地 [グルコース 1％、酵母エキス(Difco社
製) 0.3 ％、麦芽エキス(Difco社製) 0.3 ％、ポリペプ
トン 0.5％、pH 7.0] を含む250ml 三角フラスコを用意
し、シュードモナス・エルギノーザ(Pseudomonas aerug
inosa) IFO 3924 株の凍結乾燥粉末を植菌し、28℃、23
0rpmで振とう培養した。30mlの生産培地[エタノール 3v
ol%、酵母エキス(Difco社製)0.5％、大豆粉 (エスサン
ミート、味の素 (株) 製)0.5％、 KH2PO4 0.05％、 MgS
O4・7H2O 0.05 ％、pH 7.0] を含む250ml 三角フラスコ
を用意し、種母培養液を１％添加し、28℃、230rpmで振
とう培養した。
【００２６】以下の表１に示すスケジュールで、表２に
示す濃度のエタノールを添加するとともに、経時的にサ
ンプリングし、TLC 法によりラムノリピッドの定量及び
HPLCによるエタノールの定量を行った。結果 (炭酸カル
シウム未添加及び炭酸カルシウム添加) を表３に示す。
示す濃度のエタノールを添加するとともに、経時的にサ
ンプリングし、TLC 法によりラムノリピッドの定量及び
HPLCによるエタノールの定量を行った。結果 (炭酸カル
シウム未添加及び炭酸カルシウム添加) を表３に示す。
【００２７】
【表１】 ○: アルコールの添加を示す。1/2volはそれぞれの濃度の半分量を添加。
【００２８】
【表２】 フラスコNo1 〜10: 炭酸カルシウム未添加 フラスコNo11〜20: 炭酸カルシウム添加
【００２９】
【表３】
【００３０】実施例７ 窒素源の検討 30mlの種母培地 [グルコース 1％、酵母エキス(Difco社
製) 0.3 ％、麦芽エキス(Difco社製) 0.3 ％、ポリペプ
トン 0.5％、pH 7.0] を含む250ml 三角フラスコを用意
し、シュードモナス・エルギノーザ(Pseudomonas aerug
inosa) IFO 3924 株の凍結乾燥粉末を植菌し、28℃、23
0rpmで振とう培養した。0.2% KH2PO4, 0.05% MgSO4・7H
2O, 0.2% CaCO3, 3% アルコールを含む生産培地30mlに
窒素源として大豆粉 (エスサンミート、味の素 (株)
製) 、コーンスティプリカー(CSL)、ポリペプトンを表
４に示す各種濃度で添加した。種母培養液を１％添加
し、28℃、230rpmで振とう培養した。経時的にサンプリ
ングし、TLC 法によりラムノリピッドの定量を行った。
結果を表５に示す。
製) 0.3 ％、麦芽エキス(Difco社製) 0.3 ％、ポリペプ
トン 0.5％、pH 7.0] を含む250ml 三角フラスコを用意
し、シュードモナス・エルギノーザ(Pseudomonas aerug
inosa) IFO 3924 株の凍結乾燥粉末を植菌し、28℃、23
0rpmで振とう培養した。0.2% KH2PO4, 0.05% MgSO4・7H
2O, 0.2% CaCO3, 3% アルコールを含む生産培地30mlに
窒素源として大豆粉 (エスサンミート、味の素 (株)
製) 、コーンスティプリカー(CSL)、ポリペプトンを表
４に示す各種濃度で添加した。種母培養液を１％添加
し、28℃、230rpmで振とう培養した。経時的にサンプリ
ングし、TLC 法によりラムノリピッドの定量を行った。
結果を表５に示す。
【００３１】
【表４】
【００３２】
【表５】
【図１】 実施例１ (フラスコ培養) におけるラムノリ
ピッドR1、R2、R1＋R2の生産量の経時変化を示す。
ピッドR1、R2、R1＋R2の生産量の経時変化を示す。
【図２】 実施例２ (ミニジャー培養) におけるラムノ
リピッドR1、R2、R1＋R2の生産量の経時変化を示す。
リピッドR1、R2、R1＋R2の生産量の経時変化を示す。
Claims (4)
- 【請求項１】 シュードモナス(Pseudomonas) 属に属す
るラムノリピッド生産菌をエタノールを含有する培地中
で培養し、培養物からラムノリピッドを採取するラムノ
リピッドの製造方法であって、前記培地中のエタノール
濃度が３％以下に維持されるように前記培地にエタノー
ルを添加することを特徴とする前記方法。 - 【請求項２】 培地にエタノールを断続的又は連続的に
添加することでエタノール濃度を１〜３％に維持する請
求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 培地が窒素源として酵母エキス、大豆
粉、コーンスティプリカー及びポリペプトンからなる群
から選ばれる少なくとも１種を含有する請求項１または
２に記載の方法。 - 【請求項４】 培地が窒素源として酵母エキスと大豆粉
を含有する請求項１または２に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8248485A JP2923756B2 (ja) | 1996-09-02 | 1996-09-02 | エタノールを用いたラムノリピッドの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8248485A JP2923756B2 (ja) | 1996-09-02 | 1996-09-02 | エタノールを用いたラムノリピッドの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1075796A true JPH1075796A (ja) | 1998-03-24 |
| JP2923756B2 JP2923756B2 (ja) | 1999-07-26 |
Family
ID=17178869
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8248485A Expired - Lifetime JP2923756B2 (ja) | 1996-09-02 | 1996-09-02 | エタノールを用いたラムノリピッドの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2923756B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008501039A (ja) * | 2004-06-01 | 2008-01-17 | エム． アワダ、サラム | 病害虫防除剤としての微生物バイオサーファクタント |
| WO2008047658A1 (fr) | 2006-10-17 | 2008-04-24 | Idemitsu Kosan Co., Ltd. | Additif pour aliments pour animaux et aliments pour animaux |
| US9884883B2 (en) | 2015-01-12 | 2018-02-06 | Logos Technologies, Llc | Production of rhamnolipid compositions |
| JP2018514222A (ja) * | 2015-05-05 | 2018-06-07 | ロゴス テクノロジーズ， エルエルシー．Ｌｏｇｏｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｌｌｃ． | 高収量および高力価でラムノリピッドを生産するための半連続方法 |
| US10829507B2 (en) | 2017-02-06 | 2020-11-10 | Stepan Company | Decolorization of concentrated rhamnolipid composition |
-
1996
- 1996-09-02 JP JP8248485A patent/JP2923756B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008501039A (ja) * | 2004-06-01 | 2008-01-17 | エム． アワダ、サラム | 病害虫防除剤としての微生物バイオサーファクタント |
| US7994138B2 (en) | 2004-06-01 | 2011-08-09 | Agscitech Inc. | Microbial biosurfactants as agents for controlling pests |
| US8680060B2 (en) | 2004-06-01 | 2014-03-25 | Agscitech Inc. | Compositions and methods for controlling pests with glycolipids |
| WO2008047658A1 (fr) | 2006-10-17 | 2008-04-24 | Idemitsu Kosan Co., Ltd. | Additif pour aliments pour animaux et aliments pour animaux |
| US9884883B2 (en) | 2015-01-12 | 2018-02-06 | Logos Technologies, Llc | Production of rhamnolipid compositions |
| JP2018514222A (ja) * | 2015-05-05 | 2018-06-07 | ロゴス テクノロジーズ， エルエルシー．Ｌｏｇｏｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｌｌｃ． | 高収量および高力価でラムノリピッドを生産するための半連続方法 |
| US10829507B2 (en) | 2017-02-06 | 2020-11-10 | Stepan Company | Decolorization of concentrated rhamnolipid composition |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2923756B2 (ja) | 1999-07-26 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
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