CN112812988B - 一种绿针假单胞菌菌株、生防菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents
一种绿针假单胞菌菌株、生防菌剂及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种绿针假单胞菌菌株，命名为绿针假单胞菌Pc32，保藏日期为2020年11月9日，保藏编号：CGMCC NO.21150；本发明的生防菌剂中含有绿针假单胞菌Pc32，其抑菌效果非常明显，经过试验证明，在温室盆栽条件下，本发明提供的生防菌剂对烟草野火病、烟草赤星病、玉米褐斑病、黄瓜白粉病、大豆疫病的防治效果为分别为77.11％、79.86％、68.81％、78.52％、82.34％，均明显高于对应的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的防效71.86％、68.72％、52.35％、65.19％、63.45％；本发明提供的生防菌剂为微生物防治剂，无公害，不产生环境污染，可以减少甚至不用其他相应化学农药，不仅节省农民开支，还提高作物品质。
Description
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种绿针假单胞菌菌株、生防菌剂及其制备方法与应用。
背景技术
烟草野火病俗称火烧病，是由丁香假单胞烟草致病变种(Pseudomonas syringanpv.Tabaci)侵染引起的病害。主要为害叶片，也为害幼茎、蒴果和萼片等，叶片发病初期产生褐色水渍状小圆点，周围产生很宽的黄色晕圈，以后病斑逐渐扩大，直径可达1-2厘米病斑愈合后形成不规则大斑，上有不规则轮纹。烟草野火病在世界大部分烟区均有分布；中国各烟区均有发生，其中北方烟区发生较重，南方烟区仅晒烟发生较重，烤烟属零星发生。烟草野火病不仅在田间为害烟叶，而且在烟叶采收后至烘干前仍可继续为害：一是病部变成枯焦状，失去使用价值；二是病斑继续扩大。严重地块发病率达70-100％，危害烟草种植的产量和质量。1990年山东省12个县(市)野火病流行，发病面积2667公顷，一般发病率达10-30％，其中重病田667公顷、绝产田200公顷。
烟草赤星病在山东俗称“红斑”，河南、安徽、辽宁俗称“斑病”，云南称“恨虎眼”，贵州称“火炮斑”，是由链格孢菌(Alternaria alternate(Fries)Keisslar)侵染所引起的、发生在烟草上的病害。烟草赤星病是烟叶成熟期的病害，在烟株打顶后，叶片进入成熟阶段开始发病，条件适宜病情会逐渐加重。烟草赤星病主要为害部位是叶片，茎秆、花梗、蒴果也受为害。烟草赤星病在世界各国均有发生。据估测每年烟草赤星病发病面积约占中国植烟面积的30-35％。烟草赤星病不仅使烟叶残缺不全、等级下降，而且由于内在品质不协调，如总氮、蛋白质升高，总糖、还原糖降低，糖碱比值下降，使吃味变差，降低了工业使用价值。
玉米褐斑病是由玉蜀黍节壶菌(Physoderma maydis)侵染所引起的、发生在玉米上的一种常见病害。主要危害果穗以下的叶片、叶鞘，可造成叶片局部或全叶干枯，一般减产10％左右，严重时达30％以上。在中国各玉米产区都有发生，通常在南方高温高湿地区危害较重；黄淮海夏玉米区因主栽品种感病，田间菌源增多，致使玉米褐斑病流行，已成为玉米生长中、后期的重要病害。
大豆疫病(大豆疫霉根腐病)是大豆生产中的一种毁灭性病害，全球范围内皆可发生。病原菌大豆疫霉(Phytophthora sojae)在土壤和病残体中越冬，在大豆整个生育期都可侵染，使得种子、根、茎腐烂，植株枯死，造成严重的经济损失。
白粉病别称白毛病，黄瓜栽培过程中常见病害之一，在全国各地均有发生，尤其北方温室和大棚内最易发生。因白粉病影响叶片的光合作用，对黄瓜生长后期造成很大的产量损失，发病严重时可引起50％的产量损失，甚至造成绝产。黄瓜白粉病是由葫芦科白粉菌(Erysiphecucur bitacearum)或单丝壳白粉菌(Sphacrothecafuliginea)引起的，病原菌主要通过气流传播，具有潜育期短、再侵染频繁、流行性强等特点。随着温室黄瓜栽培面积的逐年增加，黄瓜白粉病的危害也更加广泛。
对以上这些农作物病害的防治一般采用化学药物处理或选育抗病品种等方法。其中化学药物防治，如利用福美双、多菌灵等拌种来起到杀菌作用，但病原菌对化学药剂抗性较强，通过化学药物很难彻底根治，且有农药残留、环境污染和食品污染等弊端。抗病品种防治的问题是抗病品种较少和抗性容易被克服等。
因此，开发具有防病抗病，绿色无污染的生物防治方法是防控这些病害的良好途径。然而，至今仍没有防治效果达到理想要求的生防菌被开发出来并在生产一线大面积推广。
发明内容
本发明的目的是为了解决以上现有技术的不足，提供一种可以防治烟草野火病、烟草赤星病、玉米褐斑病、大豆疫病和黄瓜白粉病的细菌菌株，还提供了一种包含上述细菌菌株的生防菌剂，可以很好地应用于作物上述病害的防治工作中。
为实现本发明的上述目的，采用了以下技术方案：
一种绿针假单胞菌菌株，命名为绿针假单胞菌Pc32，保藏日期为2020年11月9日，保藏地址：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号：CGMCC NO.21150。
本发明的绿针假单胞菌菌株为2019年在南京市溧水区某农场韭菜根围土壤中分离得到；
分离方法：采用5点取样法取田间土壤后分别装入灭菌的封口塑料袋中，立即带回实验室。将土样5g加入45mL无菌水中，于摇床150r/min振荡培养1h后，使用无菌纱布过滤得悬浮液，采用10倍系列稀释法得到10-6倍稀释液。取100μL稀释液均匀涂布于金氏培养基固体平板上，于28℃恒温培养箱中培养24h后，挑取颜色、光泽度、大小和类型不同的单菌落，划线纯化菌株，统一编号后转入LB斜面培养基中，用80％灭菌甘油保存，置于-70℃保存备用。
通过平板对峙测试和温室试验最终筛选出防治效最好的绿针假单胞菌Pc32。
生物学特性：菌体为杆状，(0.3-0.8)μm×(1.0-1.1)μm，革兰氏染色阴性，无芽孢，单极生鞭毛，能运动；在KMB培养基上培养24h后可形成1.2mm菌落，菌落可产生橙色色素，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，易挑起，边缘整齐；能产生荧光色素，能水解精氨酸双水解酶、脂酶、氧化酶、过氧化氢酶、柠檬酸盐、明胶，不水解淀粉，也不产生H2S，都不能利用聚β-羟基丁酸盐作碳源。
含有所述绿针假单胞菌Pc32的生防菌剂也属于本申请要求保护的范围，制备方法为是将绿针假单胞菌Pc32经菌体活化、种子培养、扩大培养后得到。
具体的制备方法优选包括以下步骤：将绿针假单胞菌Pc32在LB液体培养基中，25～30℃、150～200rpm振荡培养12～24h，获得种子液；将种子液以1％的接种量接种于金氏液体培养基，于25～30℃、150～200rpm振荡培养，获得活菌总浓度为1×109～1×1010CFU/mL的菌剂成品。
本发明还提供了一种上述产碱假单胞菌菌株或生防菌剂在防治烟草野火病、烟草赤星病、玉米褐斑病、大豆疫病和黄瓜白粉病中的应用。
具体方法为：在使用前，将制得的生防菌剂稀释至1×108CFU/mL，在作物叶片喷施或灌根处理，防治作物病害的发生发展。
本发明的有益效果如下：
(1)生防菌剂中含有抑烟草野火病、烟草赤星病、玉米褐斑病、黄瓜白粉病和大豆疫病等植物病害病原菌生长的菌株绿针假单胞菌Pc32，其抑菌效果非常明显，经过试验证明：在温室盆栽条件下，本发明提供的生防菌剂对烟草野火病、烟草赤星病、玉米褐斑病、黄瓜白粉病、大豆疫病的防治效果为分别为77.11％、79.86％、68.81％、78.52％、82.34％，均明显高于对应的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的防效71.86％、68.72％、52.35％、65.19％、63.45％，说明本发明提供的生防菌剂优于常用的现有防治菌剂；并初步证实了该生防菌剂的防效的产生是由于其病原菌孢子萌发的抑制导致的；
(2)本发明的绿针假单胞菌Pc32，生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可以通过简单、快捷低成本的制备方法获得防治烟草、玉米、黄瓜和大豆病害的生防菌剂；
(3)本发明提供的生防菌剂为微生物防治剂，无公害，不产生环境污染，可以减少甚至不用其他相应化学农药，不仅节省农民开支，还提高作物品质；
(4)经过试验证明，本发明提供的生防制剂，具有抗病作用，进而大幅度促进农民增收。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
实施例1：绿针假单胞菌Pc32的分离纯化和鉴定
本发明所涉及的防治烟草、大豆、玉米、黄瓜等作物病害的绿针假单胞菌Pc32，为2019年在南京市溧水区某农场韭菜根围土壤中分离得到；
分离方法：采用5点取样法取田间土壤后分别装入灭菌的封口塑料袋中，立即带回实验室。将土样5g加入45mL无菌水中，于摇床150r/min振荡培养1h后，使用无菌纱布过滤得悬浮液，采用10倍系列稀释法得到10-6倍稀释液。取100μL稀释液均匀涂布于金氏培养基固体平板上，于28℃恒温培养箱中培养24h后，挑取颜色、光泽度、大小和类型不同的单菌落，划线纯化菌株，统一编号后转入LB斜面培养基中，用80％灭菌甘油保存，置于-70℃保存备用。
通过平板对峙测试和温室试验最终筛选出防治效最好的绿针假单胞菌Pc32。
生物学特性：菌体为杆状，(0.3-0.8)μm×(1.0-1.1)μm，革兰氏染色阴性，无芽孢，单极生鞭毛，能运动；在KMB培养基上培养24h后可形成1.2mm菌落，菌落可产生橙色色素，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，易挑起，边缘整齐。能产生荧光色素，能水解精氨酸双水解酶、脂酶、氧化酶、过氧化氢酶、柠檬酸盐、明胶，不水解淀粉，也不产生H2S，都不能利用聚β-羟基丁酸盐作碳源。
参照《细菌鉴定手册》，根据生物学特性鉴定为绿针假单胞菌Pc32(Pseudomonaschlororaphis)，于2020年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌种保藏号为CGMCC NO.21150。
实施例2：生防菌剂的制备
用分离得到的绿针假单胞菌Pc32制备生防菌剂，具体包括以下步骤：将绿针假单胞菌Pc32在LB液体培养基中，25～30℃、150～200rpm振荡培养12～24h，获得种子液；将种子液以1％的接种量接种于金氏培养基，于25～30℃、150～200rpm振荡培养，获得活菌总浓度为1×109～1×1010CFU/mL的菌剂成品。
LB液体培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g，去离子水定容至1L，调节pH至7.0并于1×105Pa灭菌30min。
LB固体培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂15g，去离子水定容至1L，调节pH至7.0并于1×105Pa灭菌30min。
金氏培养基：蛋白胨20g、甘油15g、磷酸氢二钾0.392g、无水硫酸镁0.732g、琼脂16g、定容至1L，调节pH至7.5并于1×105Pa灭菌30min。
实施例3：生防菌剂抑菌效果测定
将实施例2制得的生防菌剂稀释得到活菌总浓度为2×108CFU/mL的生防菌剂，采用菌丝生长速率法，将烟草野火病菌、烟草赤星病菌、玉米褐斑病菌、大豆疫霉菌分别在10％V8培养基平板中活化96h，然后在近菌落边缘用打孔器制取直径为5mm的菌饼，并分别转接到含有0.1mL，活菌总浓度为2×108CFU/mL生防菌剂的10％V8平板中作为处理组，对照组为直接将上述病原菌分别转接到10％V8平板中，处理组、对照组均在25℃培养，待对照组菌落长至约平板直径的4/5时，采用十字交叉法量取菌落直径，计算菌落直径均值，表1示出了生防菌剂对四种病菌菌丝生长的抑制效果，按照下列公式计算菌丝生长平均抑制率。
菌丝生长平均抑制率＝[(对照组菌落直径均值-处理组菌落直径均值)/(对照组菌落直径均值-接种菌饼直径)]×100％。
表1生防菌剂对四种病菌菌丝生长的抑制效果
结果表明，生防菌剂对烟草野火病菌、烟草赤星病菌、玉米褐斑病菌、大豆疫霉菌菌丝生长的抑制效果均达到了75％以上，最高达到了90.45％。
实施例4：温室盆栽试验中生防菌剂对五种作物病害的防效
在温室条件下，挑选饱满的烟草、玉米、大豆、黄瓜种子分别播种到小花盆里，保湿，置于25℃室温下光照培养，待长出2张真叶时，挑选长势一致的幼苗，将实施例2得到的生防菌剂浓度调至108CFU/mL，喷洒于幼苗叶片上，待药液晾干后接种孢子浓度大概为10万/mL左右的悬浮液，用接种喷雾器在幼苗上均匀喷雾接种，大概接种2h后自然风干，然后移至恒温(24℃左右)室灯光下，培养期间每天保温、保湿，于2周后按各病害的常规分级标准及方法计算病情指数和防治效果，每个处理重复3次。对照药剂为枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，以清水作为空白对照，表2示出了温室中生防菌剂对5种作物病害的生防效果数据。
病情指数＝∑(病级株数×该病级数)/(总植株数×最高病级数)
防效＝(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100％
表2温室中生防菌剂对5种作物病害的生防效果
在温室盆栽条件下，与对照相比，生防菌剂和枯草芽孢杆菌明显减轻了病害的发生。第14d时，生防菌剂对烟草野火病、烟草赤星病、玉米褐斑病、黄瓜白粉病、大豆疫病的防治效果分别为77.11％、79.86％、68.81％、78.52％、82.34％，均明显高于对应的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的防效71.86％、68.72％、52.35％、65.19％、63.45％，说明由绿针假单胞菌Pc32制备的生防菌剂优于常用的现有防治菌剂。
实施例5：生防菌剂对大豆疫霉游动孢子萌发的抑制
将大豆疫霉菌株在25℃黑暗培养5d，在菌落边缘使用刀片切取10×10mm的菌丝块，放入含15ml的10％V8培养液中，每皿10块菌丝块，25℃黑暗培养72h后，倾去培养液，加入15ml无菌水，置于25℃光照培养箱中，每隔3h后换一次无菌水，12h后将产生大量孢子囊。将培养皿放置于4℃冰箱中15min，再放置于室温下30min，孢子囊开始大量释放游动孢子，吸取少量悬浮液于载玻片上，在显微镜下观察游动孢子的数目，收集液体加入0.05％的吐温80，充分混匀后，配制成孢子囊悬浮液。
洋葱表皮处理：选取新鲜洋葱内表皮，使用灭菌手术刀片切成20×20mm的小块，置于氯仿中浸泡10min，使用灭菌水清洗3～5次，除去氯仿和叶肉细胞，将表皮疏水面朝上放置于载玻片上，放置于铺有灭菌滤纸的培养皿中，使用灭菌水湿润滤纸保湿；将实施例2中制得的浓度为1×109的生防菌剂与大豆疫霉菌游动孢子悬浮液按1:1和1:2混匀，保持游动孢子浓度至104个/m L。将混合液喷雾接种于洋葱表皮，置于25℃黑暗培养12h，使用显微镜观察孢子萌发情况，随机选取3个视野，记录孢子总数及萌发孢子数目，计算游动孢子萌发率，试验重复3次，表3记录了生防菌剂对大豆疫霉游动孢子萌发的抑制数据。
表3生防菌剂对大豆疫霉游动孢子萌发的抑制
由表3数据可知，不同浓度的生防菌剂对大豆疫病菌孢子萌发的抑制率均远高于对照，说明绿针假单胞菌Pc32对大豆疫病的防效可能是由其对大豆疫霉菌孢子萌发的抑制导致的。
实施例6：生防菌剂对大豆疫霉卵孢子的影响
将实施例2中制备的生防菌剂与培养基按1:10(V/V)匀倒板，在平板中央接种大豆疫霉病原菌，置于25℃黑暗条件下培养30d，以接种点为中心，切取30×30mm的菌块，用均浆机将其均浆打碎后，使用孢子筛过滤收集孢子，稀释至5mL，吸取10μL置于载破片，使用显微镜观察卵孢子个数，测量藏卵器及卵孢子的大小；试验以未处理的大豆疫霉病原菌为阴性对照，试验重复3次；表4示出了生防菌剂对大豆疫霉卵孢子的影响
表4生防菌剂对大豆疫霉卵孢子的影响
由表4数据可知，生防菌剂对大豆疫霉卵孢子的形成具有抑制作用，生防菌剂处理过后，大豆疫霉卵孢子产量严重下降，产量为58个/10μL，仅为对照组的30.85％。经测量，代谢液处理过后藏卵器和卵孢子的大小也都明显减小。
实施例7：生防菌剂对黄瓜白粉病菌孢子萌发的抑制
采用孢子萌发抑制法。将直径为0.5cm灭菌的琼脂培养基放入预先制备好的浓度为108CFU/mL的生防菌剂和枯草芽孢杆菌可湿性粉剂悬浮液中浸泡24h，然后置于载玻片之上，以无菌水浸泡的培养基作为对照；将待测的黄瓜白粉病菌孢子悬浮液(1×107孢子/mL)20μL加入到该琼脂培养基，放入培养皿中保湿，置于25℃和16h光照、相对湿度为80％的人工气候箱中培养48h，镜检并计算孢子萌发抑制率。试验每个处理和对照均重复5次。
表5生防菌剂对黄瓜白粉病菌孢子萌发的抑制
表5显示，生防菌剂和枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对黄瓜白粉病菌孢子萌发的抑制率均远高于对照，且生防菌剂对黄瓜白粉病菌孢子萌发的抑制率明显高于枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，说明由绿针假单胞菌Pc32制备的生防菌剂对黄瓜白粉病的防效可能是由其对白粉病菌孢子萌发的抑制导致的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种绿针假单胞菌菌株，其特征在于，命名为绿针假单胞菌（Pseudomonaschlororaphis），保藏日期为2020年11月9日，保藏编号：CGMCC NO. 21150。
2.含有权利要求1所述绿针假单胞菌菌株的生防菌剂。
3.根据权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于，生防菌剂中活菌总浓度为1×109～1×1010 CFU/mL。
4.根据权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于，所述的生防菌剂由权利要求1所述的绿针假单胞菌菌株经菌体活化、种子培养、扩大培养后得到。
5.一种如权利要求4所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将绿针假单胞菌Pc32在LB液体培养基中，25～30℃、150～200 rpm振荡培养12～24 h，获得种子液；将种子液以1%的接种量接种于金氏液体培养基，于25～30℃、150～200 rpm振荡培养，获得活菌总浓度为1×109～1×1010 CFU/mL的菌剂成品。
6.如权利要求1所述的绿针假单胞菌菌株或权利要求2所述的生防菌剂在防治烟草野火病、烟草赤星病、玉米褐斑病、大豆疫病和黄瓜白粉病中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，在使用前，将制得的生防菌剂稀释至1×108CFU/mL，在作物叶片喷施或灌根处理，防治作物病害的发生发展。
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Address after: Building 10, No. 78 Keling Road, Science and Technology City, High tech Zone, Suzhou City, Jiangsu Province, 215163, 202-5 Patentee after: Suzhou Lvzheng Biotechnology Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: No.50, Zhongling street, Xuanwu District, Nanjing, Jiangsu 210002 Patentee before: Nanjing lvzheng Biotechnology Co.,Ltd. Country or region before: China |
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