CN110684674A

CN110684674A - 一株贵州木霉菌及其应用

Info

Publication number: CN110684674A
Application number: CN201911082075.8A
Authority: CN
Inventors: 庄文颖; 张意; 陈凯
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2019-11-07
Filing date: 2019-11-07
Publication date: 2020-01-14
Anticipated expiration: 2039-11-07
Also published as: CN110684674B

Abstract

本发明公开一株贵州木霉菌及其应用。本发明的木霉菌株生境适应性强、生长速度快、产分生孢子量丰富，对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)均具有明显的生长抑制作用，平板对峙培养的抑制率分别为78.8％、100％和100％。该菌株能够重寄生于上述3种植物病原菌，通过缠绕和侵入植物病原菌的菌丝，有效地杀死病原菌。该菌株防治立枯丝核菌引起的黄瓜立枯病，防效为52.9％，防治效果高且稳定。贵州木霉菌TC952适用于上述病原菌引起的农作物病害的有效防治。

Description

一株贵州木霉菌及其应用

技术领域

本发明属于植物病害生物防治领域，尤其涉及一株贵州木霉菌及其应用。

背景技术

植物病原菌引起的植物病害对植物健康造成很大的威胁，会引起农作物减产甚至绝收。虽然化学防控一直是防控植物病害的主要措施，但是长期的化学农药使用引起土壤肥力严重下降、重金属超标和破坏生态平衡等问题。因此，采用生物防治，“以菌治菌”的策略被广泛认可，并成为国内外的研究热点。

木霉具有生长快、分布广和环境适应性强等特点，对许多植物病原菌有拮抗作用。自1932年Weindling首次发现木素木霉(Trichoderma lignorum)能够寄生某些植物植病菌以来，相关研究进展加速。目前已有一些木霉成分的微生物菌剂得到应用，且效果显著。木霉商品化制剂的成功应用，促进了利用木霉进行植物真菌病害的研究，结合基因工程等方法，使得木霉在植物病害生物防治中占据重要地位。

发明内容

本发明一个目的是提供为一株贵州木霉。

本发明提供了一株贵州木霉(Trichoderma guizhouense)TC952，其分离自西藏林芝地区米林县的林区土壤，其保藏号为CGMCC NO.18541。

上述的贵州木霉TC952或其发酵产物或其分生孢子或其培养产物或其菌丝体在防治植物病害中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述植物病害为黄瓜立枯病、灰葡萄孢引发的植物病害或禾本科镰孢引发的植物病害。

上述应用中，所述黄瓜立枯病由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引发；

所述植物为农作物。

上述贵州木霉TC952或其分生孢子或其菌丝体或其培养产物或其发酵产物在抑制植物病原菌生长中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述植物病原菌为灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)或立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；

所述植物为农作物。

本发明另一个目的是提供一种生防菌剂。

本发明提供的生防菌剂，其包括上述贵州木霉TC952或其发酵产物或其分生孢子或其培养产物或其菌丝体。

本发明还有一个目的是提供一种防治植物病害的方法。

本发明提供的方法，可以为如下1)或2)：

1)所示的方法包括如下步骤：用上述贵州木霉TC952或其发酵产物或其分生孢子或其培养产物或其菌丝体处理植物，实现防治植物病害；

2)所示的方法包括如下步骤：将植物种子播种在含有上述贵州木霉TC952或其发酵产物或其分生孢子或其培养产物或其菌丝体的体系中，培育，实现防治植物病害。

上述方法中，所述体系为土壤；或，所述植物病害为黄瓜立枯病。

上述方法中，所述黄瓜立枯病由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引发；

所述植物为农作物。

本发明的实验证明，本发明发现一株贵州木霉TC952，该菌株能明显抑制植物病原菌灰葡萄孢菌、禾本科镰孢和立枯丝核菌的生长，在与植物病原菌对峙培养过程中，生长迅速，能有效地覆盖植物病原菌菌落，产生大量的分生孢子，而且该菌株能明显重寄生于病原菌的菌丝上，并将其菌丝体完全降解，是一个具有良好生防潜力的微生物资源。该菌株对黄瓜立枯病防治效果明显，适应于农业生产中减少化学农药的施用。

保藏说明

菌种名称：TC952

拉丁名：Trichoderma guizhouense

分类命名：贵州木霉

菌株编号：CGMCC NO.18541

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2019年09月02日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18541

附图说明

图1为贵州木霉TC952的形态；

a-c.25℃培养7天的菌落形态(a.CMD,b.PDA,c.SNA)；d.菌丝形态；e-f.分生孢子梗；g.分生孢子，d-g.使用棉兰染色后拍照。标尺：a-c＝20mm；d.50μm；e-f.15μm；g.10μm。

图2为贵州木霉TC952与3种植物病原菌对峙培养(培养皿左边为贵州木霉TC952，右边为植物病原菌)；

A.贵州木霉TC952―灰葡萄孢；B.贵州木霉TC952―禾本科镰孢；C.贵州木霉TC952―立枯丝核菌；a.灰葡萄孢；b.禾本科镰孢；c.立枯丝核菌。

图3为贵州木霉TC952的菌丝缠绕立枯丝核菌的菌丝；

T.贵州木霉TC952；R.立枯丝核菌。

图4为贵州木霉TC952对黄瓜立枯病的防治效果；

A.对照组黄瓜茎基部；B.立枯丝核菌组黄瓜茎基部；C.木霉+立枯丝核菌组黄瓜茎基部。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、木霉菌株的分离、纯化和鉴定

1.木霉菌的分离和纯化

从西藏林芝地区米林县的林区取土壤样品，称1g土壤样品，用无菌水稀释至10^-1、10^-2和10^-3三个浓度梯度，每个浓度梯度取200μl涂布于装有PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000ml，121℃灭菌后在培养基中添加终浓度为300mg/l氯霉素)的9cm直径培养皿表面。将平板倒置在25℃下培养1–3天后，挑取单菌落转移至PDA斜面培养基。

2.木霉菌株的物种鉴定

生物学特征：见图1，在CMD培养基上，25℃培养3天后菌落半径70–73mm，3天长满平板。菌落绿色，放射状，气生菌丝丰富；分生孢子2天后产生于气生菌丝上，产孢簇3天后出现，数量较多，形状不规则，直径<1mm，绿色。分生孢子梗trichoderma型，分枝稀疏，一般单生。瓶梗安瓿瓶形或烧瓶形，(5.8–)8.1–11.4(–14.7)×3.1–4.7μm，长宽比1.8–4.1，基部宽1.7–2.8μm。分生孢子绿色，球形至近球形，表面光滑，2.6–3.9×2.5–3.3μm，长宽比1.0–1.3。在PDA培养基上，25℃培养3天后菌落半径70–73mm，3天长满平板。菌落绿色，具有明显的同心轮纹，气生菌丝非常丰富；分生孢子2天后出现于气生菌丝上，数量丰富。在SNA培养基上，25℃培养3天后菌落半径63–65mm，4天长满平板。菌落绿色，具有不明显同心轮纹，气生菌丝较多；分生孢子2天产生于气生菌丝上，产孢簇3天后出现，分布于若干个同心环内，直径<1mm，绿色。在以上3种培养基上，均未见厚垣孢子，无明显气味和色素产生。

对该菌株的分子生物学鉴定：

(1)采用CTAB法提取真菌基因组。

(2)ITS、rpb2和tef1基因片段的扩增及测序：

PCR扩增引物和测序引物见表1(ITS基因的测序引物与扩增引物相同)，PCR反应体系和反应条件分别见表2。反应结束后取2μl扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统拍照，由测序公司进行双向测序，获得碱基序列。

表1 PCR扩增引物和测序引物

表2 PCR反应体系及反应条件

(3)序列分析

利用Clustal X程序和Bioedit等软件对测序结果进编辑分析。

用引物ITS4、ITS5测序拼接后得到的序列如序列1所示。

用引物RPB2-F、RPB2-R测序拼接后得到的序列如序列2所示。

用引物TEF-1和TEF-2测序拼接后得到的序列如序列3所示。

将序列与GenBank上的序列进行比对。

结合形态学特征和分子生物学鉴定结果，可确定该菌株为贵州木霉，命名为贵州木霉TC952。

3.木霉菌株的保藏

将TC952于2019年09月02日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.18541，分类命名为贵州木霉Trichoderma guizhouense。

实施例2、木霉的应用

一、与植物病原菌对峙培养

分别从保藏的斜面培养基挑取贵州木霉TC952及灰葡萄孢(赵娟,刘霆,刘伟成,等.番茄灰霉病生防链霉菌筛选及鉴定[J].微生物学通报,2019,46(10):2548-2558)、禾本科镰孢(该菌保存在中国农业微生物菌种保藏中心，保藏号为：ACCC 31053)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani ACCC 36124)3株植物病原菌在PDA培养基上进行活化，然后用直径为5mm打孔器在活化后的菌落边缘切取菌块作为接种物，接种至含PDA的9cm培养皿上，TC952和植物病原菌的接种物在PDA平板上相距5cm，并以一端仅接种植物病原菌的平板作为空白对照，每处理设3个重复，25℃恒温培养，观察菌株的生长情况。分别测量对照的生长量(菌落半径)和各个处理的生长量(接种木霉菌后的抑制生长半径)，计算抑菌率。

抑菌率(％)＝(对照生长量－处理生长量)/对照生长量×100％

逐日观察发现，贵州木霉TC952生长速度快，能迅速抢占有限的生长空间和获取营养，培养3天可观察到TC952可抑制植物病原菌的生长，7天木霉菌菌丝已经覆盖植物病原菌，完全抑制病原菌的生长，并在表面产生大量的分生孢子(如图2所示)。TC952对3种植物病原菌的对峙培养抑菌率见表3。

表3贵州木霉TC952对3种植病菌的抑菌率

从应用的角度考虑，贵州木霉TC952的菌丝迅速缠绕植物病原菌的菌丝，占据病原菌的入侵位点，减少他们侵入植株的机会，从而达到抑菌防病的效果，说明该菌株具有可开发的生防价值。

二、重寄生观察

上述一中的对峙培养中，在贵州木霉TC952的菌落覆盖立枯丝核菌菌落约2cm时，用手术刀切取接触点的培养基进行扫描电镜观察并拍照。

扫描电镜观察显示，贵州木霉TC952对植物病原菌具有明显的重寄生作用，其菌丝能够识别并趋向植物病原菌，并缠绕在病原菌的菌丝上，然后通过分泌各类水解酶及次生代谢产物溶解寄主细胞壁，木霉菌丝穿透细胞壁并在其内生长，最终导致植物病原菌细胞质泄露、菌丝凹陷、崩溃死亡。本例以TC952重寄生立枯丝核菌为例，图3显示了TC952重寄生立枯丝核菌的过程。

三、木霉防治黄瓜立枯病

盆栽试验设置3个处理组，即对照组、立枯丝核菌组、TC952+立枯丝核菌组，每个处理设置20个盆栽重复，将灭菌土壤分装至塑料盆中，每盆约200g土壤。

TC952+立枯丝核菌组：土壤中接种2×10⁸个木霉TC952的分生孢子，搅拌均匀；黄瓜种子(中农20号)用体积百分含量70％乙醇水溶液浸泡2分钟，2％次氯酸钠水溶液浸泡2分钟，无菌水清洗3遍后于25℃黑暗环境中催芽(种子催芽是在铺有湿润无菌滤纸的培养皿中，3天后种子出芽，然后将发芽的种子种到装有接种木霉TC952的分生孢子的土壤的塑料盆中)，种子发芽后，每盆栽种1株黄瓜苗，25℃温室培育，每天14小时光照/10小时黑暗。3个星期后，将液体培养7天的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani ACCC 36124，分离自北京顺义区一株根腐病菠菜根部)菌丝用匀浆机打成匀浆，按照1.5g湿菌体/kg土壤的量接种至TC952+立枯丝核菌组的黄瓜植株根部，观察黄瓜的生长情况，2个星期后调查黄瓜的发病情况。

立枯丝核菌组：黄瓜种子(中农20号)用体积百分含量70％乙醇水溶液浸泡2分钟，2％次氯酸钠溶液浸泡2分钟，无菌水清洗3遍后于25℃黑暗环境中催芽(种子催芽是在铺有湿润无菌滤纸的培养皿中，3天后种子出芽，然后将发芽的种子种到装有土壤的塑料盆中)，种子发芽后，每盆栽种1株黄瓜苗，25℃温室培育，每天14小时光照/10小时黑暗。3个星期后，将液体培养7天的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani ACCC 36124)菌丝用匀浆机打成匀浆，按照1.5g湿菌体/kg土壤的量接种至立枯丝核菌组的黄瓜植株根部，观察黄瓜的生长情况，2个星期后调查黄瓜的发病情况。

对照组：与立枯丝核菌组相比，不接入立枯丝核菌。

黄瓜立枯病病害分级标准：0级，无可见症状；1级，茎基部有小病斑，占茎围的1/4以下；2级，茎基部的病斑较大，占茎围的1/4—1/2之间；3级，茎基部的病斑占茎围的1/2以上，但尚未破坏整个茎围；4级，茎基的病斑占据全部茎围，植株死亡。

病情指数和防治效果的计算方法如下：

病情指数＝∑(各病级株数×各病级)/(调查总株树×最高病级值)×100

防效＝(对照组病情指数－处理组病情指数)/对照组病情指数×100

结果如下：

对照组的黄瓜植株长势良好，无任何病症；立枯丝核菌组黄瓜萎蔫，叶片发黄脱落，茎基部四周出现黄褐色病斑，黄瓜株高矮小，根稀且短；TC952+立枯丝核菌组接种木霉后，黄瓜立枯病症状明显改善，黄瓜株高和叶片状况与对照组一致，茎基部的病斑与立枯丝核菌组相比较明显变少，见图4。

经计算，贵州木霉TC952对黄瓜立枯病防效为52.9％，表明贵州木霉TC952能够明显防控立枯丝核菌引起的黄瓜立枯病。

本发明仅为较佳实施例，并不用以限制本发明的范围，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院微生物研究所

<120>一株贵州木霉菌及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 616

<212> DNA

<213> Trichoderma guizhouense

<400> 1

ccgattggga cgcggaggac attaccgagt ttacaactcc caaacccaat gtgaacgtta 60

ccaaactgtt gcctcggcgg gatctctgcc ccgggtgcgt cgcagccccg gaccaaggcg 120

cccgccggag gaccaaccaa aactcttttt gtataccccc tcgcgggttt ttttataatc 180

tgagccttct cggcgcctct cgtaggcgtt tcgaaaatga atcaaaactt tcaacaacgg 240

atctcttggt tctggcatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc 300

agaattcagt gaatcatcga atctttgaac gcacattgcg cccgccagta ttctggcggg 360

catgcctgtc cgagcgtcat ttcaaccctc gaacccctcc ggggggtcgg cgttggggat 420

cggccctgcc tttggcggtg gccgtctccg aaatacagtg gcggtctcgc cgcagcctct 480

cctgcgcagt agtttgcaca ctcgcatcgg gagcgcggcg cgtccacagc cgttaaacac 540

ccaacttctg aaatgttgac ctcggatcag gtaggaatac ccgctgaact taagcatatc 600

aataggccgg aggaaa 616

<210> 2

<211> 1101

<212> DNA

<213> Trichoderma guizhouense

<400> 2

gatctggcag gtcccctact ggccaagctg ttccgtggta tcatgcgaag gatgaacact 60

gagttggcca actacctgag acgatgcgtt gagggcaacc ggcacttcaa ccttgctgtt 120

ggtatcaagc ccggtacgct ttcaaacgga ttgaagtatt ctcttgccac aggaaactgg 180

ggtgatcaga agaaggccat gagctcaact gcaggtgtgt cccaggtgct taaccgttac 240

acgtttgctt cgaccctgtc acatttgcgt cgtaccaaca cgcctattgg aagagatggt 300

aagctggcga agcctcgaca gcttcacaac acgcattggg gtttggtctg cccagccgag 360

acacccgaag gacaggcttg tggtctggtc aagaacttgt ctttgatgtg ttacgtcagt 420

gtcggttctc cctctgaacc tctgattgag ttcatgatca acagaggtat ggaggtcgtc 480

gaagagtatg agcctctgcg gtatcctcat gctacaaaga tttttgtgaa cggtgtctgg 540

gttggagttc accaagaccc taagcacttg gtgaaccagg tcctggatac tcgtcgcaag 600

tcctatctgc agtacgaagt ctctctcgtg agagaaattc gagaccagga attcaaaatc 660

ttttccgacg caggccgtgt catgcgacca gtctttaccg ttcagcagga agatgacccg 720

gaaacgggca tcaacaaggg ccacctggta ttgaccaaag agctcgtcaa tagattggcc 780

caggagcagg ctgaacctcc ggaagacccc agcatgaaga ttggatggga gggattgatt 840

agggctggtg cggttgaata tctcgacgcc gaggaagagg agacgtccat gatctgcatg 900

acgccagagg atctcgagct gtatcgtctt cagaaggccg gtattaacac tgaggaagac 960

atgggagatg atccgaacaa gcgactgaag accaagacga acccgacaac tcatatgtac 1020

acccattgcg agattcaccc aagtatgatc ttaggtatct gtgccagtat cattcctttc 1080

cccgatcaca accagggtat g 1101

<210> 3

<211> 1317

<212> DNA

<213> Trichoderma guizhouense

<400> 3

gagaaggtaa gcttcaactg attttcgcct cgattcctct tctttcatat tcaattgtac 60

ccgacaattc agagaatttt cgtgtcgaca attttttatc accccgcttt ccattacccc 120

tcctttgcag cgacgcaaat tttttttgct gccgtttgat ttttagtggg gttctctgtg 180

caaccccact agctcactgc tttttttgtg cttcactcac ttcccagtca tcattcaacg 240

tgctctgtgt ctttggtcat tcaacgatgc taaccacttt tccatcaata ggaagccgcc 300

gaactcggca agggttcctt caagtacgct tgggttcttg acaagctcaa ggccgagcgt 360

gagcgtggta tcaccatcga cattgctctg tggaagttcg agactcccaa gtactatgtc 420

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gtttcaacgt caagaacgtt tccgttaagg aaattcgccg tggtaacgtt gccggtgact 1200

ccaagaacga cccccccatg ggtgccgctt ctttcaccgc tcaggtcatc gtcatgaacc 1260

accctggcca ggtcggtgcc ggctacgccc ccgttcttga ctgccacact gcccaca 1317

Claims

1.贵州木霉(Trichoderma guizhouense)TC952，其保藏号为CGMCC NO.18541。

2.权利要求1所述的贵州木霉TC952或其发酵产物或其分生孢子或其培养产物或其菌丝体在防治植物病害中的应用。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于：所述植物病害为黄瓜立枯病、灰葡萄孢引发的植物病害或禾本科镰孢引发的植物病害。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于：所述黄瓜立枯病由立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)引发；

或，所述植物为农作物。

5.权利要求1所述的贵州木霉TC952或其分生孢子或其菌丝体或其培养产物或其发酵产物在抑制植物病原菌生长中的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于：所述植物病原菌为灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)或立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；

或，所述植物为农作物。

7.一种生防菌剂，其包括权利要求1所述的贵州木霉TC952或其发酵产物或其分生孢子或其培养产物或其菌丝体。

8.一种防治植物病害的方法，为如下1)或2)：

1)所示的方法包括如下步骤：用权利要求1所述的贵州木霉TC952或其发酵产物或其分生孢子或其培养产物或其菌丝体处理植物，实现防治植物病害；

2)所示的方法包括如下步骤：将植物种子播种在含有权利要求1所述的贵州木霉TC952或其发酵产物或其分生孢子或其培养产物或其菌丝体的体系中，培育，实现防治植物病害。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：

所述体系为土壤；

或，所述植物病害为黄瓜立枯病。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述黄瓜立枯病由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引发；

或，所述植物为农作物。