CN111635892A

CN111635892A - 一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN111635892A
Application number: CN202010603648.3A
Authority: CN
Inventors: 吴丹丹; 纪春; 张晶; 郑凯丽; 许敏敏; 陈彩霞
Original assignee: Hefei Jiangu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hefei Jiangu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-06-29
Filing date: 2020-06-29
Publication date: 2020-09-08
Anticipated expiration: 2040-06-29
Also published as: CN111635892B

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用。所述GS突变型基因编码蛋白的氨基酸序列存在如下突变：其对应于野生型水稻GS的氨基酸序列的第295位发生突变。利用CRISPR介导的单碱基编辑途径，使野生型水稻GS基因编码序列第884位点核苷酸发生突变，由G变成A，导致其相应编码的氨基酸序列的第295位点由精氨酸变为赖氨酸，从而获得GS突变型蛋白。将该GS突变型基因导入水稻基因组并使其表达，受体植物可以具有对草铵膦(Phosphinothricin，PPT，商品名Basta)除草剂抗性。

Description

一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用。

背景技术

随着中国产业结构的调整，大量农村青壮年劳动力向非农产业转移，传统的人工锄草越来越不现实，草害问题越来越突出。化学除草已成为现代农业中不可缺少的管理手段和我国广大农业生产者所依赖的除草方式。

草铵膦(Phosphinothricin，PPT，商品名Basta)是继草甘膦之后又一性能优良的灭生性除草剂，其在土壤中的半衰期为3～7天，具有活性高、毒性低、易分解、残留低和环境兼容性好等特点，可防治对草甘膦和百草枯有抗性的顽固杂草，且长期使用的环境安全也得到了肯定，具有良好的应用前景。在植物体内，PPT与GS结合后占据其反应中心，抑制了谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)活性，导致毒性积累和氨基酸代谢失衡，快速引起植株死亡。草铵膦的抗性基因Bar来自土壤吸水链霉菌，它编码膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinothricin acetyltransferase，PAT)，PAT使膦丝菌素(phosphinothricin，PPT)的自由氨基乙酰化从而对PPT解毒，使之不能抑制的活性。目前培育抗草铵膦品种的主要方法是应用基因工程手段将来自细菌的抗草铵膦基因导入农作物中，从而培育出转基因抗草铵膦作物新品种，但转基因作物在全世界的接受程度仍然较低。

一些植物在自然条件下出现PPT耐受能力提升，这种自发产生的PPT天然抗性往往与GS活性相关。自然产生的抗PPT意大利黑麦草群体中研究同样发现，抗性植株的主效GS基因中均具有由一个G-to-A的单碱基替换，引起的D171N突变，而PPT造成GS酶活下降在抗性株中可缓解数百倍。但遗憾的是自然界中能够抗除草剂的作物类型很少。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，编码所述氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述氨基酸序列由野生型水稻日本晴GS的氨基酸序列在第295位发生突变、由精氨酸变为赖氨酸而得。

一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体，其特征在于：由野生型水稻日本晴GS的氨基酸序列在第295位发生突变、由精氨酸突变为缬氨酸、甘氨酸、精氨酸、丝氨酸、酪氨酸、脯氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸中的任一种而得。

进一步地，由野生型水稻日本晴GS基因编码区的第884位核苷酸由G突变为T、C、A中的任一种。

如上述的一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体在制备具有抗草铵膦抗性的植物中的应用。

进一步地，所述植物包括水稻。

进一步地，所述应用包括将所述突变体的基因通过转基因、杂交或回交的方法导入受体植物细胞。

进一步地，所述转基因的方法包括利用CRISPR介导的CBE单碱基编辑途径实现定点突变。

一种载体或表达盒，包含如上述的核苷酸序列。

本发明还提供了获得具有除草剂抗性的植物的方法。进一步地，本发明提供了用于增强植物、植物组织、植物细胞对于至少一种除草剂的耐受性的方法，所述除草剂干扰GS酶的活性。因此，本发明中除草剂抗性指的是草铵膦类除草剂。

本发明所述的增强植物、植物组织或者植物细胞对除草剂的抗性方法可以通过转化或者杂交、自交和无性繁殖的方法实施，也可通过基因定点突变的方式获得，使改变的植株包括本发明的核苷酸序列SEQ ID No:2。

本发明所述的增强植物、植物组织或者植物细胞对除草剂的抗性方法可以通过转化或者杂交、自交和无性繁殖的方法实施，也可通过基因定点突变的方式获得，使改变的植株表达本发明的氨基酸序列SEQ ID No:1。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明利用CRISPR介导的G:C突变成A:T定点替换的胞嘧啶碱基编辑器(cytosinebase editor，CBE)的单碱基编辑途径产生内源抗除草剂水稻的位点，该基因所编码的蛋白的氨基酸序列对应于野生型水稻的第295位点由精氨酸变为赖氨酸。发明人发现，通过在该基因编码序列的884位点进行突变，可以赋予植物抗(耐)草铵膦除草剂抗性。

附图说明

图1是在含有潮霉素和15mg/L的Basta双重抗性的生根培养基上，非基因水稻(左)、及含有GS突变位点的转基因水稻(右)的生长情况；

图2是突变型GS基因水稻的GS突变位点的测图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明披露了一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用，具体如下各实施例所示。

实施例

(1)水稻GS突变位点获得和植物表达载体的构建

选择水稻GS基因中的核苷酸序列ccggctcaccggcaggcacgaga(下划线部分为反向互补的5’NGG-3’结构的PAM序列)，作为打靶位点。按所选择靶位点合成(华大基因公司)正向寡核苷酸链(GS-CBE FP)和可与之互补的反向寡核苷酸链(GS-CBE RP)，

具体序列为：

GS-CBE FP:GGCAtctcgtgcctgccggtgagC，SEQ ID NO.3；

GS-CBE RP:AAACGctcaccggcaggcacgaga，SEQ ID NO.4；

经过退火程序(将上下游引物混合后，37℃温浴1h，加2.5μL1M氯化钠，95℃，5s,自然退火2h～3h。)，将GS-CBE FP和GS-CBE RP两链退火形成具有粘性末端的双链DNA，作为构建重组载体的插入片段。

本实施例中利用CRISPR介导的单碱基编辑系统，采用SpCas9蛋白介导的CBE编辑系统pHUN411-eBE3载体进行基因编辑，该系统可使靶位点的C·G变成T·A，下面将对该过程进行展开说明。

用BsaI内切酶(NEB公司)在37℃酶切pHUN411-eBE3载体2小时，65℃失活酶切体系10分钟，作为构建重组载体的骨架片段。用T4连接酶(NEB公司)将重组载体骨架片段和插入片段相连(4℃，过夜连接)，转入大肠杆菌中。通过选择具有卡那霉素抗性且不具壮观霉素抗性的菌斑，获得阳性转化子。经测序验证后，提取阳性质粒，构成用于水稻GS基因CRISPR/Cas9打靶的重组载体质粒，命名为pHUN411-eBE3-GS，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(上海唯地公司)，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，获得含有pHUN411-eBE3-GS的农杆菌。

具体上下游引物为：

Bar-FP:TGCCAGAAACCCACGTCAT

Bar-RP:CTGCACCATCGTCAACCACTA

其中PCR反应体系为：

DNA模板1ul，上游引物1ul，下游引物1ul，Taq Mix 12.5ul，ddH₂O 9.5ul。

PCR反应条件：

94℃5min预变性，94℃3sec，57℃30sec，72℃1min(第二步至第四步29个循环)，72℃5min(终止延伸)。

(2)阳性转基因植株获得

成熟水稻种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀种子的沿糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。

采用上述步骤中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等过程参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughput protocol forAgrobacterium mediated transformation based on phosphomannose isomerasepositive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI 10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。为得到含有除草剂抗性水稻愈伤组织和幼苗，在筛选阶段，使用含有潮霉素70mg/L和15mg/L的Basta双重抗性的培养基，待抗性愈伤组织长出后，再转入含有潮霉素和15mg/L的Basta抗除草剂双重抗性的分化培养基中，使其分化成苗。经过大量的筛选和分化，最终得到1株含有潮霉素和Basta抗除草剂抗性的水稻植株。图1示出了在含有潮霉素70mg/L和15mg/L的Basta双重抗性的生根培养基上，非基因水稻(左)、及含有GS突变位点的转基因水稻(右)的生长情况。

(3)水稻抗Basta类除草剂突变体295突变位点分析

从获得的1株抗除草剂水稻突变植株选取叶片并提取基因组DNA，使用一对引物对靶标序列上下游序列进行扩增，FP：ttccgtgttgggtggtctgatg，RP：aactgcatgtgggagctgtaca。扩增产物送Invitrogen公司进行基因组测序。测序结果与野生型日本晴GS基因比较，发现在这1株抗除草剂水稻突变植株中的GS基因上发生了1个位点的突变，即编码区第884位点碱基发生突变，由G变成A，导致其相应编码的氨基酸序列的第295位点由精氨酸变为赖氨酸，即抗除草剂突变体的GS基因的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其编码的GS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。图2示出了突变型GS基因水稻的GS突变位点的测图。

从上面的实验可以证实：利用SpCas9蛋白介导的ACE编辑系统可以对GS基因进行基因编辑，使其基因上一个碱基发生替换，从而改变了GS的蛋白序列，赋予了含有GS突变蛋白的植株具有除草剂抗性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 合肥戬谷生物科技有限公司

<120> 一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 356

<212> PRT

<213> 氨基酸序列(GS-R295K)

<400> 1

Met Ala Ser Leu Thr Asp Leu Val Asn Leu Asn Leu Ser Asp Thr Thr

1 5 10 15

Glu Lys Ile Ile Ala Glu Tyr Ile Trp Ile Gly Gly Ser Gly Met Asp

20 25 30

Leu Arg Ser Lys Ala Arg Thr Leu Ser Gly Pro Val Thr Asp Pro Ser

35 40 45

Lys Leu Pro Lys Trp Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Gly Gln Ala Pro

50 55 60

Gly Glu Asp Ser Glu Val Ile Leu Tyr Pro Gln Ala Ile Phe Lys Asp

65 70 75 80

Pro Phe Arg Lys Gly Asn Asn Ile Leu Val Met Cys Asp Cys Tyr Thr

85 90 95

Pro Ala Gly Glu Pro Ile Pro Thr Asn Lys Arg His Asn Ala Ala Lys

100 105 110

Ile Phe Ser Ser Pro Glu Val Ala Ser Glu Glu Pro Trp Tyr Gly Ile

115 120 125

Glu Gln Glu Tyr Thr Leu Leu Gln Lys Asp Ile Asn Trp Pro Leu Gly

130 135 140

Trp Pro Val Gly Gly Phe Pro Gly Pro Gln Gly Pro Tyr Tyr Cys Gly

145 150 155 160

Ile Gly Ala Asp Lys Ser Phe Gly Arg Asp Ile Val Asp Ser His Tyr

165 170 175

Lys Ala Cys Leu Tyr Ala Gly Ile Asn Ile Ser Gly Ile Asn Gly Glu

180 185 190

Val Met Pro Gly Gln Trp Glu Phe Gln Val Gly Pro Ser Val Gly Ile

195 200 205

Ser Ala Gly Asp Gln Val Trp Val Ala Arg Tyr Ile Leu Glu Arg Ile

210 215 220

Thr Glu Ile Ala Gly Val Val Val Ser Phe Asp Pro Lys Pro Ile Pro

225 230 235 240

Gly Asp Trp Asn Gly Ala Gly Ala His Thr Asn Tyr Ser Thr Lys Ser

245 250 255

Met Arg Asn Asp Gly Gly Tyr Glu Ile Ile Lys Ser Ala Ile Glu Lys

260 265 270

Leu Lys Leu Arg His Lys Glu His Ile Ser Ala Tyr Gly Glu Gly Asn

275 280 285

Glu Arg Arg Leu Thr Gly Lys His Glu Thr Ala Asp Ile Asn Thr Phe

290 295 300

Ser Trp Gly Val Ala Asn Arg Gly Ala Ser Val Arg Val Gly Arg Glu

305 310 315 320

Thr Glu Gln Asn Gly Lys Gly Tyr Phe Glu Asp Arg Arg Pro Ala Ser

325 330 335

Asn Met Asp Pro Tyr Ile Val Thr Ser Met Ile Ala Glu Thr Thr Ile

340 345 350

Ile Trp Lys Pro

355

<210> 2

<211> 1071

<212> DNA

<213> 核苷酸序列(GS-R295K)

<400> 2

atggcttctc tcaccgatct cgtcaacctc aacctctccg acaccacgga gaagatcatc 60

gccgagtaca tatggatcgg tggatctggc atggatctca ggagcaaggc taggactctc 120

tccggccctg tgactgatcc cagcaagctg cccaagtgga actacgatgg ctccagcacc 180

ggccaggccc ccggcgagga cagtgaggtc atcctgtacc cacaggctat cttcaaggac 240

ccattcagga agggaaacaa catccttgtc atgtgcgatt gctacacgcc agccggagaa 300

ccgatcccca ccaacaagag gcacaatgct gccaagatct tcagctcccc tgaggttgct 360

tctgaggagc cctggtacgg tattgagcaa gagtacaccc tcctccagaa ggacatcaac 420

tggccccttg gctggcctgt tggtggcttc cctggtcctc agggtcctta ctactgtggt 480

atcggtgctg acaagtcttt tgggcgtgat attgttgact cccactacaa ggcttgcctc 540

tatgccggca tcaacatcag tggaatcaac ggcgaggtca tgccaggaca gtgggagttc 600

caagttggcc cgtctgtcgg catttctgcc ggtgatcagg tgtgggttgc tcgctacatt 660

cttgagagga tcaccgagat cgccggagtc gtcgtctcat ttgaccccaa gcccatcccg 720

ggagactgga acggtgctgg tgctcacacc aactacagca ccaagtcgat gaggaacgat 780

ggtggctacg agatcatcaa gtccgccatt gagaagctca agctcaggca caaggagcac 840

atctccgcct acggcgaggg caacgagcgc cggctcaccg gcaagcacga gaccgccgac 900

atcaacacct tcagctgggg agttgccaac cgcggcgcct cggtccgcgt cggccgggag 960

acggagcaga acggcaaggg ctacttcgag gatcgccggc cggcgtccaa catggaccct 1020

tacatcgtca cctccatgat cgccgagacc accatcatct ggaagccctg a 1071

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(GS-CBE FP)

<400> 3

ggcatctcgt gcctgccggt gagc 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(GS-CBE RP)

<400> 4

aaacgctcac cggcaggcac gaga 24

Claims

1.一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体，其特征在于：所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体，其特征在于：编码所述氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体，其特征在于：所述氨基酸序列由野生型水稻日本晴GS的氨基酸序列在第295位发生突变、由精氨酸变为赖氨酸而得。

4.一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体，其特征在于：由野生型水稻日本晴GS的氨基酸序列在第295位发生突变、由精氨酸突变为缬氨酸、甘氨酸、精氨酸、丝氨酸、酪氨酸、脯氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸中的任一种而得。

5.根据权利要求4所述的一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体，其特征在于：由野生型水稻日本晴GS基因编码区的第884位核苷酸由G突变为T、C、A中的任一种。

6.如权利要求1-5任一所述的一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体在制备具有抗草铵膦抗性的植物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述植物包括水稻。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述应用包括将所述突变体的基因通过转基因、杂交或回交的方法导入受体植物细胞。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述转基因的方法包括利用CRISPR介导的CBE单碱基编辑途径实现定点突变。

10.一种载体或表达盒，其特征在于：包含如权利要求2所述的核苷酸序列。