CN111154787B

CN111154787B - 一种水稻epsp合成酶突变基因、突变体及其应用

Info

Publication number: CN111154787B
Application number: CN202010174117.7A
Authority: CN
Inventors: 谢之耀; 赵超越; 吴鑫; 陈耀栋; 潘刚
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-03-21
Filing date: 2020-03-13
Publication date: 2020-10-13
Anticipated expiration: 2040-03-13
Also published as: CN111154787A; CN109943578A

Abstract

本发明公开了一种水稻EPSP合成酶突变基因、突变体及其应用。该水稻EPSP合成酶突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过人工突变技术将野生型水稻EPSP合成酶基因中编码第102位氨基酸、第106位氨基酸和第381位氨基酸的密码子进行突变得到，使得第102位氨基酸残基由苏氨酸突变成异亮氨酸、第106位氨基酸残基由脯氨酸突变成丝氨酸、第381位氨基酸残基由脯氨酸突变成亮氨酸，得到水稻EPSP合成酶突变基因；将水稻EPSP合成酶突变基因转入受体后获得的转基因作物具有较好的草甘膦抗性，对筛选和培育抗草甘膦作物新品种具有重要意义。

Description

一种水稻EPSP合成酶突变基因、突变体及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种水稻EPSP合成酶突变基因、突变体及其应用。

背景技术

草甘膦，学名N-(膦酸甲基)甘氨酸，其异丙胺盐的商品名叫农达(Roundup)，是一种高效低毒的非选择性内吸传导型茎叶处理的有机磷除草剂。

自上世纪70年代初由孟山都公司开发以来，被用于防除一年生、二年生禾本科、莎草科和阔叶杂草，对多年生恶习性杂草如茅草、香附子、狗牙根也有很好的防除效果，广泛应用于农田、果园、桑园、茶园、草原更新以及免耕地等的化学除草(Duke SO and PowlesSB.Mini-review glyphosate:a once-in-a-century herbicide.Pest Manag Sci,2008,64:319-325；Duke SO.The history and current status of glyphosate.Pest ManagSci.2018,74:1027-1034)。

Powles和Yu(Powles SB,Yu Q.Evolution in action:Plants resistan t toherbicides.Annual Review of Plant Biology.2010,61:317-347)依据除草剂作用机理将现有除草剂划分为靶标型与非靶标型，草甘膦属于前者。在植物细胞内，5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshiki mate 3-phosphate synthase,简称EPSPS或EPSP合成酶)是芳香族氨基酸(包括苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)合成途径中的一个关键酶，也是草甘膦专一抑制的靶酶。该酶可以将莽草酸-3-磷酸(Shikimate-3-phophate,S3P)和磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyrurate,PEP)催化缩合成芳香族氨基酸合成的重要前体物5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate，EPSP)。而草甘膦的化学分子结构与PEP类似，因此一旦植物吸收草甘膦后，其将与EPSP合成酶相结合并妨碍该酶与正常底物PEP的结合，导致EPSP合成酶活力下降甚至丧失，最终干扰苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸等芳香氨基酸的生物合成，进而影响植物的正常生长发育，最终导致植物死亡(Steinrücken HC,Steinruecken HC,Amrhein N,Amrhein N.The herbicide glyphosateis a potent inhibitor of 5-enolpyruvylshikimi c acid-3-phosphatesynthase.Biochemical and Biophysical Research Communications.1980,94:1207-1212)。

此外，草甘膦还可以抑制其它植物酶的活性，而且在高等植物体内还具有高度的运转性及缓慢的降解性，因此对植物易造成高度的毒性而成为一种理想的防除杂草的广谱灭生性除草剂(Malik J,Barry G,Kishor G.The herbicideglyphosate.Biofactors.1998,2:17-25；Smith EA,Oehme F W.The biological activityof glyphosate to plants and animals:a literatu re review.Veterinary and HumanToxicology.1992,34:531-543；Powles SB,Yu Q.Evolution in action:Plantsresistant to herbicides.Annual Re view of Plant Biology.2010,61:317-347)。

因此，利用基因工程手段培育抗草甘膦的转基因作物新品种是解决作物抗草甘膦的重要手段。

自1996年抗草甘膦转基因棉花商品化以来，至今已培育抗草甘膦的转基因大豆、玉米、及油菜等大田作物。2017年全球约种植1.21亿公顷抗草甘膦农作物，占全球转基因作物种植总面积的65％(http://www.isaaa.o rg/resources/publications/briefs/53/default.asp)(Bonny S.Genetically modif ied herbicide-tolerant crops,weeds,andherbicides:Overview and Impact.Environ Manage.2016,57:31-48；Green JM.The riseand future of gly phosate and glyphosate-resistant crops.Pest Manag Sci.2018,74:1035-1039)。

目前，可利用的抗草甘膦基因包括EPSPS和GOX基因，其中前者又包括CP4-EPSPS和改良玉米EPSPS基因(Zhou H,Arrowsmith JW,Fro mm ME,Hironaka CM,Taylor ML,Rodriguez D,Pajeau ME,Brown S M,Santino CG,Fry JE.Glyphosate-tolerant CP4 andGOX genes as a s electable marker in wheat transformation.Plant CellReports.1995,15:159-163；Yu Q,Jalaludin A,Han H,Chen M,Douglas Sammons R,Powles SB.Evolution of a double amino acid substitution in the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase in Eleusine indica conferring high-lev elglyphosate resistance.Plant Physiology.2015,167:1440-1447；Green JM.The riseand future of glyphosate and glyphosate-resistant crops.Pes t Manag Sci.2018,74:1035-1039)。

当然，为了降低EPSP合成酶对草甘膦的亲和性并提高该酶的草甘膦抗性，前人研究证实EPSP合成酶部分氨基酸残基的突变，诸如第102处的苏氨酸突变成异亮氨酸、第106处的脯氨酸突变成丝氨酸、第42处的苏氨酸突变成甲硫氨酸、第173处的脯氨酸突变成丝氨酸等均可赋予该酶的更高草甘膦抗性(Yu Q,Jalaludin A,Han H,Chen M,Douglas Sammons R,Powles SB.Evolution of a double amino acid substitution in the5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase in Eleusine indica conferrin ghigh-level glyphosate resistance.Plant Physiology.2015,167:1440-1447；FartyalD,Agarwal A,James D,Borphukan B,Ram B,Sheri V,Yad av R,Manna M,Varakumar P,Achary VMMM,Reddy MK.Co-expressi on of P173S mutant rice EPSPS and igrA genesresults in higher glypho sate tolerance in transgenic rice.Frontiers in PlantScience.2018,9:144；朱祯和周敏.一种水稻EPSP合成酶突变体及其编码基因、获得方法与应用，中国发明专利20051002739.7)，以及第102处的苏氨酸突变成异亮氨酸和第106处的脯氨酸突变成丝氨酸的双突变体(Heap I and Duke SO.Ove rview of glyphosate-resistant weeds worldwide.Pest Manag Sci.2018,74:1040-1049；王建胜，何云蔚，崔洪志.一种棉花EPSP合成酶突变体基因及其应用。中国发明专利201010277667.8；米歇尔·利布朗，阿兰·赛兰德，乔治斯·弗赖西耐特，埃里克·德格里西。突变的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶以及编码此蛋白的基因。中国发明专利96196889.3)。

而且，研究证实，TIPS(第102处的苏氨酸突变成异亮氨酸和第106处的脯氨酸突变成丝氨酸的双突变体)对草甘膦的抗性显著高于P106S(第106处的脯氨酸突变成丝氨酸的单突变体)(Yu Q,Jalaludin A,Han H,Chen M,Douglas Sammons R,Powles SB.Evolutionof a double aminoacid substitution in the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase in Eleusine indica conferring high-level glyphosate resistance.PlantPhysiology.2015,167:1440-1447)。

然而，上述双突变体对草甘膦的抗性仍有待提高；因此，有必要获取比TIPS的草甘膦抗性更高的EPSPS突变体，这将为培育高抗草甘膦作物新品种提供新的基因资源。

发明内容

本发明提供了一种水稻EPSP合成酶突变基因、突变体及其应用，该水稻EPSP合成酶突变基因能够在现有技术的基础上，进一步提高转基因作物的草甘膦抗性，为培育高抗草甘膦作物新品种提供新的基因资源。

具体技术方案如下：

一种水稻EPSP合成酶突变基因，即突变基因OsmEPSPS1，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

上述突变基因的野生型OsEPSPS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，在野生型OsEPSPS1基因的基础上，将编码第102位氨基酸残基T的密码子(ACT)突变为编码氨基酸残基I的密码子(ATT)、编码第106位氨基酸残基P的密码子(CCA)突变为编码氨基酸残基S的密码子(TCA)、编码第381位氨基酸残基由P的密码子(CCT)突变为编码氨基酸残基L的密码子(CTG)，得到上述水稻EPSP合成酶突变基因。

在现有技术中，将野生型EPSPS基因中的第381个氨基酸残基由脯氨酸(P)突变成亮氨酸(L)的这种单突变方式已被证实与草甘膦抗性无关(B aerson SR.,etal.Glyphosate-resistant goosegrass.identification of a mut ation in thetarget enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase.Plant Physiology,2002,129:1265–1275)；本发明在进行EPSPS基因相关研究时意外发现若将第102位氨基酸、第106位氨基酸和第381位氨基酸进行三突变，能够显著提高转基因植物的草甘膦抗性。

本发明中的突变基因OsmEPSPS1是通过人工突变水稻EPSP合成酶的第102、106和381等3个氨基酸残基获得的；利用转基因水稻比较分析OsmEPSPS1、OsmEPSPS2(水稻EPSP合成酶的第102和106氨基酸分别突变为I和S)、OsmEPSPS3(水稻EPSP合成酶的第102和381氨基酸分别突变为I和L)及OsmEPSPS4(水稻EPSP合成酶的第106和381氨基酸分别突变为S和L)，结果显示转OsmEPSPS1的转基因水稻的草甘膦抗性最好；因此，OsmEPSPS1可应用于作物育种领域，对筛选和培育抗草甘膦作物新品种具有重要意义。

作为优选，所述水稻EPSP合成酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种重组表达载体，包括原始载体和插入所述原始载体的目的基因，所述目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述原始载体为pCAMBIA1300或pSB326-Actin-NOS；其中，超表达载体pSB326-Actin-NOS是双T-DNA载体，可显著提高目的基因的表达量，以及培育Marker-free的转基因后代。

本发明还提供了一种包含所述重组表达载体的转化子。

进一步地，所述宿主菌为农杆菌。转化受体植物时，可采用农杆菌介导转化的方法，具体地，所述的农杆菌为农杆菌EHA105。

本发明还提供了水稻EPSP合成酶突变基因在提高转基因作物的草甘膦抗性中的应用。

进一步地，所述作物为水稻或棉花。

本发明通过人工突变技术将野生型水稻EPSP合成酶基因中编码第102位氨基酸、第106位氨基酸和第381位氨基酸的密码子进行突变得到，使得第102位氨基酸残基由苏氨酸突变成异亮氨酸、第106位氨基酸残基由脯氨酸突变成丝氨酸、第381位氨基酸残基由脯氨酸突变成亮氨酸，得到水稻EPSP合成酶突变基因OsmEPSPS1；将水稻EPSP合成酶突变基因OsmEPSPS1转入受体后获得的转基因作物具有较好的草甘膦抗性，对筛选和培育抗草甘膦作物新品种具有重要意义。

附图说明

图1为本发明EPSP合成酶突变基因OsmEPSPS1的测序结果。

图2为本发明OsmEPSPS1-OsmEPSPS4的过表达载体pmEPSPS1-pmEPSPS4构建简图。

图3为本发明转基因水稻的目的基因的PCR鉴定；

其中，M为DNA marker；P为质粒；CK为非转基因水稻DNA；1-20为转基因水稻DNA。

图4为本发明喷施20mM草甘膦的T1代转基因棉花的分离情况。箭头所指单株为分离出来的草甘膦敏感植株。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

以下实施例中所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知技术，在Ausubel编写的由John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in Molecular Biology和J.Sambrook等编写的由Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的MolecularCloning:A Laboratory Mannual,3rd ED.等文献均有详细说明。以下实施例中所用的实验材料如无特殊说明均为市售购买产品。

实施例1人工突变水稻EPSP合成酶基因

步骤1：水稻叶片总RNA提取及野生型OsEPSPS1基因的克隆

水稻品种钱江6号B经发芽后，取3-4叶期幼苗叶片50mg，于液氮中迅速研磨成粉末，加入750μl NucleoZOL(NEB)混匀，而后再加入300μl DEPC-H₂O并剧烈震荡混匀；室温放置15min后离心10min，将500μl上清转移至新的离心管；加入等体积的异丙醇；室温放置10min后离心10min，去上清；加入1ml75％的酒精清洗；离心去上清，室温稍微晾干后加入20μlDEPC-H₂O溶解RNA。

取1μg RNA，以EPSPS基因的3端反向引物EPSP-R3(5’-CAGTGGTACCTCAGTTCCTGACGAAAGTGC-3’SEQ ID NO.4)为引物，利用M-MLV反转录酶合成cDNA第一链。反转录反应程序为：37℃，60min；99℃,5min。

而后以OsEPSPS1基因的5端正向引物EPSPS-R5(5’-AAGGCGGAG GAGATCGTGCTC-3’；SEQ ID NO.5)及EPSPS-R3为引物，利用高保真酶Phanta Max(Vazyme)扩增获得OsEPSPS1(序列见SEQ ID NO.3)基因。

PCR反应条件如下：

PCR反应成分：

反应参数：95℃，3分；95℃，10秒，56℃，15秒，72℃，2分，40个循环；72℃延伸5分钟。

PCR产物经琼脂糖胶电泳后，回收相应片段并利用胶纯化试剂盒纯化后，再利用Clontech的

HD Cloning Kit将上述2种DNA片段克隆到pMD20-T载体，而后酶切鉴定并测序验证(PE公司，377测序仪；上海生工生物工程技术服务有限公司)，正确的质粒命名成pMD-EPSPS1。

步骤2：人工突变水稻OsEPSPS1基因获得OsmEPSPS1-OsmEPSPS4，并构建植物表达载体

首先，合成如下引物：

P1:AAGGCGGAGGAGATCGTGCTC(SEQ ID NO.5)

P2:CAATGATCGCATTGCAATTCCAGCATTCCCCAAGAAGAG(该序列含有第102和106氨基酸突变的碱基)(SEQ ID NO.6)；

P3:CTCTTCTTGGGGAATGCTGGAATTGCAATGCGATCATTG(该序列是P2的互补序列)(SEQID NO.7)

P4:GGTGATGATGCAGTAGTCCAGTCCTTCCTCGACCGACGCTC(该序列含有第381氨基酸突变的碱基)(SEQ ID NO.8)；

P5:GAGCGTCGGTCGAGGAAGGACTGGACTACTGCATCATCACC(该序列是P4的互补序列)(SEQ ID NO.9)；

P6:CAGTGGTACCTCAGTTCCTGACGAAAGTGC(含有KpnI的酶切位点)(SEQ ID NO.4)。

利用高保真酶Phanta Max(Vazyme)以pMD-EPSPS1为模板分别用3对引物(即引物P1和P2、P3和P4、P5和P6)扩增获得三个片段，再利用Overlap extension PCR(An Y.,Ji J,Wu W,Lv A,Huang R,Wei Y.A rapid and efficient method for multiple-sitemutagenesis with a modified overlap extension PCR.Appl MicrobiolBiotechnol.2005,68:774-778)技术将这三个片段融合成一个片段，即OsmEPSPS1。

经测序证实，该片段第102个氨基酸残基由T变为I、第106个氨基酸残基由P突变为S、第381个氨基酸残基由P突变成L(图1)。在OsmEPSPS1三突基因的基础上，继续利用Overlap extension PCR获得了三个双突基因,分别是OsmEPSPS2(第102个氨基酸残基由T变为I、第106个氨基酸残基由P突变为S)、OsmEPSPS3(第102个氨基酸残基由T变为I、第381个氨基酸残基由P突变成L)以及OsmEPSPS4(第106个氨基酸残基由P突变为S、第381个氨基酸残基由P突变成L)。

然后，合成下列引物：

上游引物：

P7：CAGTCTAGACCATGGCGTCCAACGCCGCG(含有XbaI的酶切位点)(SEQ ID NO.10)；

下游引物：

P8：ACGATCTCCTCCGCCTTCGCCGCCGGCGCTGCCAC(SEQ ID NO.11)；

克隆EPSP合成酶基因的信号肽序列(signal peptide,SP)：用引物P7和P8从籼稻钱江6号B基因组总PCR扩增获得SP。再将SP片段分别与OsmEPSPS1-OsmEPSPS4融合，最终获得含有SP的mEPSPS1-mEPSPS4基因片段。

最后，用XbaI和KpnI双酶切mEPSPS1-mEPSPS4基因片段，并插入到经XbaI和KpnI酶切的1300-Actin::NOS超表达双元载体(Wang Y,Zhang X,Lu S,Wang M,Wang L,Wang W,etal.Inhibition of a basal transcription factor 3-like gene Osj10gBTF3 in riceresults in significant plant miniaturization and typical pollenabortion.Plant and Cell Physiology.2012,53:2073-2089)或双T-DNA超表达载体pSB326-Actin-NOS中，酶切鉴定，正确的载体分别命名成pmEPSPS1、pmEPSPS2、pmEPSPS3和pmEPSPS4(图2)。

最后，利用电转化法将上述4种农杆菌质粒转入EHA105，用于后续遗传转化试验。

实施例2高抗草甘膦转基因水稻的培育

步骤1：转基因水稻的遗传转化

水稻遗传转化参考Pan等(Pan G,Zhang X,Liu K,et al.2006，M ap-basedcloning of a novel rice cytochrome P450 gene CYP81A6 that c onfers resistanceto two different classes of herbicides.Plant Molecular Biology,61：933-943)的方法并所作改变。

简述如下：消毒后的日本晴种子接种到含2.5mg L^-1 2,4-D的N₆培养基，于32℃连续光照条件诱导愈伤10天；取约40μL含有pEPSP1、pEPSP2、pEPSP3或pEPSP4质粒的EHA105农杆菌菌液加入含25mg L^-1Rif和50mg L^-1Kan的20mL LB液体培养基中，28℃过夜震荡培养后离心收集菌体，用10mM MgSO₄将重悬菌液并离心；去上清后用含200μM AS的AA液体培养基重悬，调节菌液OD₆₀₀值至0.1～0.2；将诱导10天的愈伤组织于菌液中侵染10min；侵染后将愈伤转入灭菌滤纸上吸干多余菌液；再将愈伤转入CC-AS共培养基上，28℃暗培养55～60h后转入含250mg L^-1Cef的N₆培养基；28℃暗培养7d后将愈伤转至含250mg L^-1Cef和50mg L^- ¹Hyg的N₆培养基上继续筛选培养并获得抗性愈伤；抗性愈伤经再生培养获得转基因幼苗并种植于田间，自交收获T2代种子。

步骤2：转基因水稻的分子鉴定

将T2代转基因水稻种植于大田，按常规水肥进行管理。水稻生长至3-4叶期取幼叶，CTAB法提取基因组DNA，利用一对特异引物(正向引物：5′-CTTCGTCAGGCTTAGATGTG-3′SEQ ID NO.12)，反向引物：5′-CAACAACTACCGCTCTTTTG-3′SEQ ID NO.13)进行外源OsmEPSPS1-OsmEPSPS4基因PCR鉴定。结果显示，外源基因均已整合到水稻基因组中(图3)。此外，取生长7天的转基因水稻及其对照，利用NucleoZOL(NEB)提取总RNA。采用

Q RT Supermix for qPCR试剂盒(Vazyme，USA)进行反转录获得第一链cDNA。而后利用FastStart Essential DNA Green Master(Roche,USA)试剂盒、

96Instrument荧光定量仪进行q RT-PCR扩增以及

96SW 1.1软件进行分析。毎个样品技术重复三次。

qRT-PCR体系：PCR grade water 3μL，primers 2μL，Master mix 10μL，cDNA 5μL(总体系20μL)。qRT-PCR程序：95℃预孵育10min；45个扩增循环：95℃变性l0s，60℃退火l0s，72℃延伸20s；熔解：95℃10s，65℃60s，97℃1s。

qRT-PCR技术证实所有转基因水稻均超表达外源突变基因。而后选择4种质粒的转基因后代中目的基因基因表达水平基本一致，且表达量均为对照80倍左右的株系用于后续田间草甘膦抗性鉴定。

实施例3转基因水稻的草甘膦抗性鉴定

选择外源基因高表达且表达一致的转基因后代(每个载体选择3个不同的转化事件)种植于大田，待水稻幼苗田间生长30天后喷施220mM草甘膦溶液，3周后统计水稻存活率。

结果显示(表1)，转pmEPSPS1的后代存活率高达88.01％以上，而pmEPSPS2、pmEPSPS3和pmEPSPS4的后代存活率分别低于75.47％、37.21％和12.11％，t-test分析表明转pmEPSPS1的后代与转pmEPSPS2的草甘膦存活率差异至少达到显著水平以上，而转pmEPSPS1的后代与转pmEPSPS3和pmEPSPS4的草甘膦存活率差异达极显著。

总之，OsmEPSP1基因对草甘膦的抗性最强。

表1喷施220mM草甘膦3周的不同转基因水稻存活率

注：“-1、-2或-3”是指不同转化事件。

实施例4抗草甘膦转基因棉花的培育

步骤1：载体的构建

根据SEQ ID NO.1的序列，分别合成两条引物(引物序列委托海桑尼生物科技有限公司合成)，以质粒pmEPSPS1为模板经PCR扩增出含有SP的OsmEPSP1基因，引物序列如下：

上游引物：5’-CACGGGGGACTCTAGAACAATGAACATGAACAACACTAAG-3’(SEQ ID NO:14)；

下游引物：5’-CGGGGGATCCTCTAGTCACTCCTTAACAAGGGAAAC-3’(SEQ ID NO:15)；

PCR反应体系为：

PCR反应参数：95℃，3分；95℃，10秒，56℃，15秒，72℃，2分，40个循环；72℃延伸5分钟。

PCR产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后，以XbaI酶切双元T-DNA载体pLM-B001(LuL,Dong C,Liu R,Zhou B,Wang C,Shou H.Roles of soybeanplasmamembraneintrinsicproteinGmPIP2；9in droughttolerance and seeddevelopment.Front Plant Sci.2018,9:530)，用Clontech的

HD Cloning Kit将该片段克隆到pLM-B001，用XbaI酶切鉴定，获得的阳性克隆再测序(PE公司，377测序仪；上海生工生物工程技术服务有限公司)验证，测序正确的质粒命名为pLM-mEPSPS1。

步骤2：农杆菌制备与棉花遗传转化

通过电激法将质粒pLM-mEPSPS1导入农杆菌LBA4404。取含pLM-mEPSPS1的农杆菌划板，挑单菌落在LB培养基28℃过夜培养，为棉花转化准备农杆菌菌液。棉花转基因操作如下：

1)选取陆地棉品种柯字312无菌苗的下胚轴，用解剖刀切成0.5-0.6cm小段，接种于诱导培养基上(MS+B₅Vitamins+0.1mg/L 2,4-D+0.1mg/L KT+30g/L glucose+phytagel2.5g/L,pH＝5.8)诱导愈伤组织；

2)愈伤组织在继代培养基(MS(containing 2×KNO3，1/2NH4NO3)+B₅ Vitamins+0.1mg/L 2,4-D+0.1mg/L KT+30g/L glucose+phytagel 2.5g/L,pH＝5.8)继代，而后挑选米粒状颗粒愈伤组织转入分化培养基(MS+B₅Vitamins+30g/L glucose+2.5g/L phytagel+0.15mg/L KT+0.5mg/L IBA)培养成胚状体；

3)超低温冰箱内取出保存的农杆菌菌株的甘油管在冰上融化，LB平板上划线，26.5℃暗培养36-48hr后，挑取单菌落在另外的LB平板划线并于26.5℃暗培养36-48hr，待平板上长出足够的菌落后将表面菌落刮入三角瓶内的MGL液体培养基中，27℃、200r/min继续培养2hr至OD₆₀₀＝0.5-1.5；

4)将胚状体的愈伤组织于无菌培养皿自然吹干5分钟后转入上述农杆菌菌液中，静置侵染5-10分钟后倒掉菌液，用滤纸吸干残余菌液，将愈伤组织铺于垫有滤纸的共培养培养基中，19-21℃暗培养38-42hr；

5)将共培养后的愈伤组织在含500mg/L Cef的无菌水中清洗2-3次，每次10-20min，而后再用无菌水清洗三遍，滤纸吸干多余水分；

6)转入选择培养基上，弱光培养20天左右后转入选择培养基上正常光照培养30-40天(期间更换培养基2-3次)，待黑色死亡愈伤上长出浅黄色颗粒较小且生长正常的愈伤后将其继代培养20-30天(期间更换培养基1-2次)；

7)从选择培养基上长出的抗性愈伤接种到预分化培养基上(先暗培养5-7天，而后16小时光照分化发芽)4-6周，待抗性幼苗长成后转移到生根培养基上生根，最后将再生植株洗去培养基于温室或田间培养，直至收获T1种子；

将T1代种子种于大田，用特异引物(正向引物：5′-CTTCGTCAGGCTTAGATGTG-3′SEQID NO.12)，反向引物：5′-CAACAACTACCGCTCTTTTG-3′SEQ ID NO.13)鉴定转基因后代中的目的基因，而后用20mM抗草甘膦喷施转基因棉花证实转基因棉花抗草甘膦(图4)。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学

<120> 一种水稻EPSP合成酶突变基因、突变体及其应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1335

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 1

aaggcggagg agatcgtgct ccagcccatc agggagatct ccggggcggt tcagctgcca 60

gggtccaagt cgctctccaa caggatcctc ctcctctccg ccctctccga gggcacaaca 120

gtggtggaca acttgctgaa cagtgaggat gttcactaca tgcttgaggc cctgaaagcc 180

ctcgggctct ctgtggaagc agataaagtt gcaaaaagag ctgtagtcgt tggctgtggt 240

ggcaagtttc ctgttgagaa ggatgcgaaa gaggaagtgc aactcttctt ggggaatgct 300

ggaattgcaa tgcgatcatt gacagcagcc gtgactgctg ctggtggaaa tgcaacttat 360

gtgcttgatg gagtgccacg aatgagggag agaccgattg gtgacttggt tgtcgggttg 420

aaacaacttg gtgcggatgt cgactgtttc cttggcactg aatgcccacc tgttcgtgtc 480

aagggaattg gaggacttcc tggtggcaag gttaagctct ctggttccat cagcagtcag 540

tacttgagtg ccttgctgat ggctgctcct ttggcccttg gggatgtgga gatcgaaatc 600

attgacaaac taatctccat tccttacgtt gaaatgacat tgagattgat ggagcgtttt 660

ggtgtgaagg cagagcattc tgatagttgg gacagattct atattaaggg agggcagaag 720

tacaaatctc ctggaaatgc ctatgttgaa ggtgatgcct caagcgcgag ctatttcttg 780

gctggtgctg caatcactgg aggcactgtg acagttcaag gttgtggtac gaccagtttg 840

cagggtgatg tcaaatttgc tgaggtactt gagatgatgg gagcaaaggt tacatggact 900

gacaccagtg taaccgtaac tggtccacca cgtgagcctt atgggaagaa acacctgaaa 960

gctgttgatg tcaacatgaa caaaatgcct gatgttgcca tgacccttgc cgttgttgca 1020

ctcttcgctg atggtccaac tgctatcaga gatgtggctt cctggagagt aaaggaaacc 1080

gaaaggatgg ttgcaattcg gaccgagcta acaaagctgg gagcgtcggt cgaggaagga 1140

ctggactact gcatcatcac cccaccggag aagctgaaca tcacggcaat cgacacctac 1200

gatgatcaca ggatggccat ggccttctcc ctcgctgcct gcgccgacgt gcccgtgacg 1260

atcagggacc ctggttgcac ccgcaagacc ttccccaact acttcgacgt tctaagcact 1320

ttcgtcagga actga 1335

<210> 2

<211> 444

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 2

Lys Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Arg Glu Ile Ser Gly Ala

1 5 10 15

Val Gln Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu Leu

20 25 30

Ser Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn Ser

35 40 45

Glu Asp Val His Tyr Met Leu Glu Ala Leu Lys Ala Leu Gly Leu Ser

50 55 60

Val Glu Ala Asp Lys Val Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys Gly

65 70 75 80

Gly Lys Phe Pro Val Glu Lys Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe

85 90 95

Leu Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Ser Leu Thr Ala Ala Val Thr

100 105 110

Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met

115 120 125

Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln Leu Gly

130 135 140

Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Glu Cys Pro Pro Val Arg Val

145 150 155 160

Lys Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser

165 170 175

Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala

180 185 190

Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser Ile Pro

195 200 205

Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala

210 215 220

Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys

225 230 235 240

Tyr Lys Ser Pro Gly Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala

245 250 255

Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr Val

260 265 270

Gln Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu

275 280 285

Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Asp Thr Ser Val

290 295 300

Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Tyr Gly Lys Lys His Leu Lys

305 310 315 320

Ala Val Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu

325 330 335

Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val

340 345 350

Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr

355 360 365

Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Leu Asp Tyr Cys

370 375 380

Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Ile Thr Ala Ile Asp Thr Tyr

385 390 395 400

Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Asp

405 410 415

Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro

420 425 430

Asn Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Arg Asn

435 440

<210> 3

<211> 1335

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 3

aaggcggagg agatcgtgct ccagcccatc agggagatct ccggggcggt tcagctgcca 60

gggtccaagt cgctctccaa caggatcctc ctcctctccg ccctctccga gggcacaaca 120

gtggtggaca acttgctgaa cagtgaggat gttcactaca tgcttgaggc cctgaaagcc 180

ctcgggctct ctgtggaagc agataaagtt gcaaaaagag ctgtagtcgt tggctgtggt 240

ggcaagtttc ctgttgagaa ggatgcgaaa gaggaagtgc aactcttctt ggggaatgct 300

ggaactgcaa tgcgaccatt gacagcagcc gtgactgctg ctggtggaaa tgcaacttat 360

gtgcttgatg gagtgccacg aatgagggag agaccgattg gtgacttggt tgtcgggttg 420

aaacaacttg gtgcggatgt cgactgtttc cttggcactg aatgcccacc tgttcgtgtc 480

aagggaattg gaggacttcc tggtggcaag gttaagctct ctggttccat cagcagtcag 540

tacttgagtg ccttgctgat ggctgctcct ttggcccttg gggatgtgga gatcgaaatc 600

attgacaaac taatctccat tccttacgtt gaaatgacat tgagattgat ggagcgtttt 660

ggtgtgaagg cagagcattc tgatagttgg gacagattct atattaaggg agggcagaag 720

tacaaatctc ctggaaatgc ctatgttgaa ggtgatgcct caagcgcgag ctatttcttg 780

gctggtgctg caatcactgg aggcactgtg acagttcaag gttgtggtac gaccagtttg 840

cagggtgatg tcaaatttgc tgaggtactt gagatgatgg gagcaaaggt tacatggact 900

gacaccagtg taaccgtaac tggtccacca cgtgagcctt atgggaagaa acacctgaaa 960

gctgttgatg tcaacatgaa caaaatgcct gatgttgcca tgacccttgc cgttgttgca 1020

ctcttcgctg atggtccaac tgctatcaga gatgtggctt cctggagagt aaaggaaacc 1080

gaaaggatgg ttgcaattcg gaccgagcta acaaagctgg gagcgtcggt cgaggaagga 1140

cctgactact gcatcatcac cccaccggag aagctgaaca tcacggcaat cgacacctac 1200

gatgatcaca ggatggccat ggccttctcc ctcgctgcct gcgccgacgt gcccgtgacg 1260

atcagggacc ctggttgcac ccgcaagacc ttccccaact acttcgacgt tctaagcact 1320

ttcgtcagga actga 1335

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

cagtggtacc tcagttcctg acgaaagtgc 30

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

aaggcggagg agatcgtgct c 21

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

caatgatcgc attgcaattc cagcattccc caagaagag 39

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

ctcttcttgg ggaatgctgg aattgcaatg cgatcattg 39

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

ggtgatgatg cagtagtcca gtccttcctc gaccgacgct c 41

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 9

gagcgtcggt cgaggaagga ctggactact gcatcatcac c 41

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 10

cagtctagac catggcgtcc aacgccgcg 29

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 11

acgatctcct ccgccttcgc cgccggcgct gccac 35

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 12

cttcgtcagg cttagatgtg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 13

caacaactac cgctcttttg 20

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 14

cacgggggac tctagaacaa tgaacatgaa caacactaag 40

<210> 15

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 15

cgggggatcc tctagtcact ccttaacaag ggaaac 36

Claims

1.一种水稻EPSP合成酶突变基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的水稻EPSP合成酶突变基因编码的突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组表达载体，包括原始载体和插入所述原始载体的目的基因，其特征在于，所述目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述原始载体为pCAMBIA1300。

5.一种包含权利要求3或4任一项所述重组表达载体的转化子，其特征在于，宿主菌为农杆菌。

6.如权利要求5所的转化子，其特征在于，所述农杆菌为农杆菌EHA105。

7.如权利要求1所述的水稻EPSP合成酶突变基因在提高转基因植物的草甘膦抗性中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物为水稻或棉花。