CN105192310A - 一种含有红酵母的复合饲料添加剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有红酵母的复合饲料添加剂及其制备方法，属于饲料酶制剂领域。所述含有红酵母的复合饲料添加剂由以下重量份数的组分组成：抗菌肽10-15份，蜂胶10-20份，女贞子萃取物10-25份，红酵母培养物15-30份，灵芝菌固体发酵培养物20-50份，玉米蜂花粉提取物10-30份。其中红酵母为海洋红酵母WYN1(Rhodotorula？sp.WYN1)，保藏编号为：CCTCC？No：M？2014592。由于本发明所使用的红酵母能够高产胡萝卜素，并且将培养基中的无机铜转化为螯合铜进行富集，更好的促进了动物的生长发育，提高饲料利用率，以及改善饲料添加剂的热稳定性。

Description

一种含有红酵母的复合饲料添加剂

技术领域：

本发明属于饲料领域，尤其涉及饲料添加剂。

背景技术：

现代畜禽养殖过程中，为了预防和治疗动物疾病，常使用过量抗生素产品来确保动物健康，但过量抗生素的使用常导致动物肉制品及其产物的品质下降和抗生素耐性增强，通过食物链的传递导致人类健康也受到抗生素问题的严重影响。

源自自然界的一些天然物质不仅具有良好的营养特性，同时还具有抗病毒、消炎、抗氧化、调节机体免疫功能等作用，具有广阔的应用前景。

蜂胶的主要成分是黄酮类化合物、酚类、内酯、香豆精类、醛酮，少量的铁、钙、硅、锰、铅、镍、铝、铜、锌等微量元素及维生素B族、维生素A，以及多种氨基酸、酶、多糖类及丰富的阿散酸等。蜂胶还是国内外专家公认的“天然抗生物质”,因为它不仅具有防御外来的入侵者及感染病原菌扩散的作用，还具有抗病毒、消炎、抗氧化、调节机体免疫功能等作用。

女贞子又称女贞实、冬青子、白蜡树子、鼠梓子。女贞子果实含齐墩果酸(Oleanolicacid)、甘露醇、葡萄糖、棕榈酸、硬脂酸、油酸及亚麻酸。果皮含熊果酸(Ursolicacid)、齐墩果酸、乙酰齐墩果酸(Acetyloleanolicacid)。种子含脂肪油14.9％,油中棕榈酸与硬脂酸为19.5％、油酸及亚麻酸等为80.5％。女贞子中尚含铜、锌、铁、锰等微量元素。

女贞子补肝肾阴，乌须明目，现代医学研究认为女贞子可以抑制幽门螺杆菌的作用可以治疗胃病，还具有抑制嘌呤异常代谢用于痛风和高尿酸血症的治疗。用于肝肾阴虚，腰酸耳鸣，须发早白；眼目昏暗，视物昏暗；阴虚发热，胃病及痛风和和高尿酸血症。女贞子是一味临床常用中草药，近几年已经开始研究其作为饲料添加剂在畜禽生产中的作用。

抗菌肽是一类具有抗菌活性的生物小肽,是动物天然免疫防御系统的重要组成部分。抗菌肽的理化性质稳定,相对分子质量小,抗菌谱广,抗菌机制独特。与传统抗生素相比,具有抗菌活性强、无耐药性、无残留和毒性小的优点。近年来,抗菌肽作为抗生素的理想替代品一直是研究的热点。据报道，抗菌肽作为添加剂饲喂动物，具有提高免疫性能、减少疾病的发生和提高成活率的作用。同时，抗菌肽对动物有良好的促生长作用，可提高动物的生长性能，降低料肉比。因此，抗菌肽具有成为绿色安全饲料添加剂的潜力。

灵芝[Ganoderemalucidum(LeyssexFr.)karst]，又称灵芝草，属担子菌亚门、多孔菌目、灵芝科、灵芝属。历代的医典把灵芝归位于“上上药”，其排位在人参之前。《神农本草经》、《本草纲目》记载，灵芝可明目、补肝气、安神、益精、益心气、益脾气、益肺气、益肾气、通九窍、耳聪、目明、利关节、利尿、养颜美容，是上好的滋补佳品。灵芝多糖能促进蛋白质、核酸的合成，对血清、肝脏及骨髓细胞蛋白质或核酸的更新、合成有促进作用,它是灵芝扶正固本的主要有效成分之一。灵芝多糖主要存在于灵芝真菌子实体、菌核、菌丝体或发酵液中；存在于灵芝中的灵芝酸有止痛、镇静、抑制组织胺释放、解毒、保肝、毒杀肿瘤细胞的功用，是灵芝的主要有效成分之一。

此外，在动物饲料领域中，多以硫酸铜等无机铜作为铜元素的来源，但是无机铜存在吸收率低，与其他营养物质存在拮抗作用等问题，而螯合铜则可以很好的解决上述问题，它能够减轻与其他营养物质的拮抗，促进铜和其他矿物质元素的利用，促进动物的生长发育，提高饲料利用率，改善胴体品质，提高繁殖性能，同时还具有抗生物氧化和免疫以及良好的稳定性等一系列功能，能够带来较佳的经济效益。

类胡萝卜素是一类呈黄色、橙色或红色的多烯类化合物，它是自然界中最普遍存在也是最稳定的天然色素，广泛存在于许多动植物中。类胡萝卜素作为一种优良的添加剂和改善营养的营养增补剂，它的优良品质和效果，很久以来就被世界各国所公认，被誉为最有希望的抗氧化剂。目前，类胡萝卜素被广泛应用于饲料添加剂行业中，由于其良好的应用前景及卓越的功能，长久以来倍受人们青睐。如何有效开发以天然植物以及真菌获得绿色饲料添加剂产品对饲料添加剂行业发展具有重要意义。

发明内容：

本发明提供一种含有红酵母的复合饲料添加剂；

复合饲料添加剂重量分数组成如下：

抗菌肽10-15份，蜂胶10-20份，女贞子萃取物10-25份，红酵母培养物15-30份，灵芝菌固体发酵培养物20-50份，玉米蜂花粉提取物10-30份；

本发明所使用的红酵母，为一株高产类胡萝卜素的富铜海洋红酵母WYN1，所述菌株已于2014年11月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072)，保藏编号为：CCTCCNo：M2014592，分类命名：海洋红酵母WYN1(Rhodotorulasp.WYN1)。

所述抗菌肽及蜂胶均为市售产品；

所述女贞子萃取物制备方法如下：

女贞子粉碎，过40-50目筛后，添加女贞子3-6倍重量无水乙醇浸渍提取，控制温度30-45℃，2-4小时后调整温度为55-60℃1-2小时，提取液浓缩、干燥得到乙醇提取物；乙醇提取后的女贞子残渣中添加75-85℃热水，热水添加量为女贞子残渣重量的2-4倍，处理时间30-50分钟，连续提取2-3次，将提取液真空浓缩后喷雾干燥，得到热水提取物；将上述乙醇提取物和热水提取物合并粉碎，过60目筛，即得女贞子提取物。

所述灵芝菌固体发酵培养物制备方法如下：

斜面菌种活化培养：将保藏的灵芝斜面菌种转接到斜面培养基上，22-28℃培养96-120小时左右，至菌丝长满斜面即可；最佳培养温度25℃；

1.液体一级种子培养：将上述灵芝斜面菌种挑取一块接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行一级种子培养，培养条件：旋转式摇床80-180转/分，22-28℃培养96-130小时左右；旋转式摇床150转/分为宜，培养温度以25℃为宜；

2.液体二级种子培养：将一级摇瓶种子以5-20％接种量接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行二级种子培养，培养条件：旋转式摇床80-180转/分，22-28℃培养96-130小时左右；合适接种量为10％，旋转式摇床150转/分为宜，培养温度以25℃为宜；

3.固体发酵培养：将二级摇瓶种子以5-10％接种量接入装有灭菌后固体发酵培养基的500L固体发酵罐中，培养条件：装料量50％，培养温度20-27℃，湿度75-90％，通风量0.3-1.0(V/V),培养时间15-40天。每隔3-10天开启搅拌10分钟。采用SGF固体发酵罐；

4.发酵培养结束，选择流化床等多种干燥方法，将物料干燥到水分含量在7％以下，对固体发酵物料进行粉碎既得灵芝菌固体发酵培养物。

本发明固体发酵培养基的碳源主要选择麸皮、葡萄糖、蔗糖、淀粉、玉米粉、玉米芯(粉碎后)等常用原料，氮源可以选择花生饼粉、蛋白胨、脱脂大豆蛋白粉、豆饼粉、酵母粉等；需要添加的无机盐有磷酸二氢钾，硫酸镁。

优选的，在上述固体发酵培养基中添加有质量比为2-6％粉碎后，过40-50目的当归、3-8％的粉碎后，过40-50目的板蓝根，2-5％粉碎后，过40-50目的麝香草。

所述玉米蜂花粉提取物的制备方法包括如下步骤：按质量比30-50:3-5:2-4分别称取玉米蜂花粉、糯玉米须和脱脂玉米粉，首先将玉米蜂花粉、糯玉米须分别置装有0.2-0.4％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中，室温下于200W、40KHz清洗3-5min，沥干，然后与脱脂玉米粉混合，加入原玉米蜂花粉质量3-5倍的水，用乳酸调节pH值为4-6，于电场强度20-40kV/cm，脉冲时间400-500μs,脉冲频率200-300Hz条件下进行高压脉冲电场处理，然后室温400W、40KHz条件超声处理10-15min；升温至30-40℃，加入原玉米蜂花粉质量3-10％的酶制剂，搅拌均匀，酶解15-20min，酶解液液经100-300目筛网过滤，滤液经超滤、减压浓缩、冷冻干燥即得玉米蜂花粉提取物；

所述酶制剂的质量组成为：蛋白酶:糖化酶:果胶酶:纤维素酶:脂肪酶＝11-13:5-10:4-6:3-5:1-3。

所述红酵母培养物制备方法如下：

种子培养按酵母常规培养方法进行培养；

发酵培养：初始pH为8，将种子培养液按接种量3-8％接种于发酵培养基，摇床转速为50-80r/min，24-28℃培养10-15小时后调整温度为16-20℃进行低温静止培养，停止搅拌，pH调整为3-5，保持2-4小时；之后阶梯形升温到24-30℃，pH调整为4.6-5.5，按照2.5％的添加量添加蛋白胨，按照2％的量添加酵母粉；摇床转速为50-100r/min，继续发酵10-15h。

发酵结束后，发酵液经孔径10-1000μm粗滤，然后与10-20℃循环超滤浓缩去除水分得固形物含量20-40％浓缩液，浓缩液经真空冷冻干燥、超微粉碎得红酵母培养物。

发酵培养基质量体积比组成为：葡萄糖1％，酶解玉米粉1-3％，蛋白胨2.5％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.15％，铜含量150-200mg/L，氯化钠20％，其余为水；

所述酶解玉米粉的制备方法为：将玉米粉置于配料罐中，以V:m为2:1加入纯净水，调节pH值3-7，加入中温淀粉酶，酶活为30u/g玉米粉，与酶活为30u/g玉米粉的蛋白酶，边搅拌边升温至45-55℃保温15-30min，然后缓慢升温至60-65℃保温15-30min，冷冻干燥备用。

所述复合饲料添加剂由以下方法制得：

粉碎后灵芝菌培养物、抗菌肽、蜂胶、女贞子萃取物、玉米蜂花粉提取物和红酵母培养物按照比例混合得到复合饲料添加剂。

有益效果：

1、本发明利用从海洋环境中分离获得一株高产胡萝卜素的富铜海洋红酵母WYN1，通过静止培养方法有效的提高了酵母中胡萝卜素和铜产量。采用上述方法发酵培养海洋红酵母WYN1，其生物量、类胡萝卜素产量及胞内铜含量分别为27g/L以上、35-40mg/L和7240-8000μg/g干菌。研发中，发明人意外发现低温静止培养可以有效提高胡萝卜和铜含量，是本发明的重要成果。

2、由于本发明所使用的红酵母能够高产胡萝卜素，并且将培养基中的无机铜转化为螯合铜进行富集，更好的促进了动物的生长发育，提高饲料利用率，对于哺乳母猪断奶窝重可以提高58.6％，仔猪头日增重提高41.7％，腹泻率减少54.1％，对于断奶仔猪日增重提高48.91％，料肉比提高14.1％，腹泻率减少10％，死淘率提高3.7％。

3、由于螯合铜具有良好的热稳定性，使得本发明所提供的饲料添加剂具有较好的保存活性和热稳定性，使得添加剂的保存活性提高35％，热稳定性提高25％以上

4、本发明女贞子进行粉碎破壁处理，使女贞子中功能因子实现全价溶出和高效提取利用，分别采用有机溶剂和热水实现其中不同功效成分的有效提取，特别是控制温度分段提取更是有效提高了女贞子提取物的提取效率和质量。

5、本发明通过科学复配，将红酵母、灵芝菌实现了有机组合，特别是灵芝菌培养中添加了中药成分，本发明产品可以有效降低抗生素类药物在饲养动物中的使用量，提高动物肉制品的安全性，提高动物的饲料利用效率，增强动物的免疫力，提高饲养效益。

具体实施方式：

实施例1：海洋红酵母菌WYN1的获得及耐铜能力驯化

(1)将从黄海海边采集新鲜的海虾、海星、海藻等生物样本，置于无菌的YEPD培养基中，挑取红色或粉红色圆形菌落，进一步纯化培养。根据各菌种类胡萝卜素的积累量，筛选类胡萝卜素产量高的菌种。其中类胡萝卜素产量较高的海洋红酵母WYN1，细胞为卵圆形，没有假菌丝；在海水配置的YEPD培养基上形成红色菌落，表面光滑，边缘整齐；在产孢培养基上不产子囊孢子，多边芽殖，无掷孢子；不发酵糖，不形成类淀粉化合物，不同化肌醇。根据上述特点，初步确定属于红酵母属(Rhodotorula)。斜面保存于冰箱中。

(2)海洋红酵母WYN1的发酵培养

将菌种转接到斜面培养基上活化，28℃培养24h后，接种于液体种子培养基中，28℃振荡培养36h得种子液，按10％接种量接入装有60mL发酵培养基的250mL三角瓶中，28℃，振荡培养48h(摇床转速为180r/min)。发酵培养基组成为葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母膏1％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.15％，盐度20。28℃摇床培养48h，转速为180r/min。

(3)耐铜能力驯化

将海洋红酵母菌WYN1接种于铜离子含量为50mg/L(硫酸铜配置)培养基中，置于28℃，180r/min恒温摇床上震荡培养24h。然后从该培养物中取3ml发酵物接种到不含铜的麦芽汁培养基中，培养24h。反复培养几代，使酵母在含铜的培养基中生长稳定，且数量不再增多时，再逐步提高培养基的铜浓度。如此反复便可使得酵母菌能够适应铜离子含量为300mg/l的环境，获得了耐铜的特性。本发明经过对海洋红酵母进行耐铜能力驯化后，能有效地提高细胞生物量、类胡萝卜素的产量及酵母的富铜能力。

(4)细胞生物量的测定

将发酵液3000r/min离心10min，弃上清液，菌体经无菌水洗2～3次后再次离心，所得菌体置于60℃烘箱中干燥至恒重，准确称重。

(5)类胡萝卜素的提取：

将1g干菌体放入100mL三角瓶中，加入5mL3mol/L的盐酸室温浸泡1h，沸水浴4min，迅速冷却，3000r/min离心15min沉淀为细胞残渣，用丙酮定容至20mL萃取，得类胡萝卜素浸提液。

(6)类胡萝卜素的测定

将提取液适当稀释后，用722型分光光度计在475nm条件下测定光吸收值。按下式计算类胡萝卜素含量：

式中：Aλ_max为475nm波长处的吸光度；D为测定试样时的稀释倍数；V为丙酮用量(mL)；0.16为类胡萝卜素的克分子消光系数；W为红酵母菌体干重(g)。

(7)酵母含铜量测定

用原子吸收法测定。

(8)菌种保藏

将上述经过驯化的富铜海洋红酵母WYN1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNo：M2014592。

胡萝卜素产量及胞内螯合铜含量分别为27.52g/L、25.12mg/L和6240μg/g干菌。

实施例2一种含有红酵母的复合饲料添加剂

复合饲料添加剂重量分数组成如下：

抗菌肽10份，蜂胶15份，女贞子萃取物15份，红酵母培养物20份，灵芝菌固体发酵培养物40份，玉米蜂花粉提取物20份；红酵母为CCTCCNo：M2014592；

抗菌肽为上海楚肽生物科技有限公司销售产品；

蜂胶为市售；

所述女贞子萃取物制备方法如下：

女贞子粉碎，过45目筛后，添加女贞子5倍重量无水乙醇浸渍提取，控制温度40℃，3小时后调整温度为58℃维持1.5小时，之后提取液浓缩、干燥得到乙醇提取物；乙醇提取后的女贞子残渣中添加80℃热水，热水添加量为女贞子残渣重量的3倍，处理时间40分钟，连续提取2次，将提取液真空浓缩后喷雾干燥，得到热水提取物；将上述乙醇提取物和热水提取物合并粉碎，过60目筛，即得女贞子提取物。灵芝菌固体发酵培养物制备方法如下：

斜面菌种活化培养：将保藏的灵芝斜面菌种转接到斜面培养基上，25℃培养110小时左右，至菌丝长满斜面即可；

1.液体一级种子培养：将上述灵芝斜面菌种挑取一块接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行一级种子培养，培养条件：旋转式摇床150转/分，25℃培养110小时左右；

2.液体二级种子培养：将一级摇瓶种子以10％接种量接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行二级种子培养，培养条件：旋转式摇床150转/分，25℃培养110小时左右；

3.固体发酵培养：将二级摇瓶种子以8％接种量接入装有灭菌后固体发酵培养基的500L固体发酵罐中，培养条件：装料量50％，培养温度25℃，湿度80％，通风量0.5(V/V),培养时间25天。每隔5天开启搅拌10分钟，采用SGF固体发酵罐；

4.发酵培养结束，选择流化床干燥，将物料干燥到水分含量在5％，对固体发酵物料进行粉碎既得灵芝菌固体发酵培养物；

所用灵芝菌种购于中国工业微生物菌种保藏中心，菌号CICC14080；

斜面培养基组成可以为PDA斜面培养基；

固体发酵培养基质量分数组成如下：60％麸皮、1.4％蔗糖、10％玉米粉、16％玉米芯(粉碎后)，0.1％蛋白胨、2％脱脂大豆蛋白粉、0.5％酵母粉；3％粉碎后过50目的当归、4％的粉碎后过40目的板蓝根，3％粉碎后过40目的麝香草；培养基pH自然。灭菌条件：121℃，2小时。

液体发酵种子培养基组成：淀粉3％，蔗糖4％，葡萄糖2％，蛋白胨0.5％，脱脂大豆蛋白粉2％，磷酸二氢钾0.15％，硫酸镁0.12％，维生素B₁2PPm，PH6.5。

所述玉米蜂花粉提取物的制备方法包括如下步骤：按质量比40:4:3分别称取玉米蜂花粉、糯玉米须和脱脂玉米粉，首先将玉米蜂花粉、糯玉米须分别置装有0.2-0.4％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中，室温下于200W、40KHz清洗4min，沥干，然后与脱脂玉米粉混合，加入原玉米蜂花粉质量4倍的水，用乳酸调节pH值为5，于电场强度30kV/cm，脉冲时间450μs,脉冲频率250Hz条件下进行高压脉冲电场处理，然后室温400W、40KHz条件超声处理12min；升温至35℃，加入原玉米蜂花粉质量5％的酶制剂，搅拌均匀，酶解18min，酶解液液经200目筛网过滤，滤液经超滤、减压浓缩、冷冻干燥即得玉米蜂花粉提取物；

所述酶制剂的质量组成为：蛋白酶:糖化酶:果胶酶:纤维素酶:脂肪酶＝12:8:5:4:2。

所述红酵母培养物制备方法如下：

按常规酵母培养方法进行种子培养；

发酵培养：初始pH为8，将种子培养液按接种量5％接种于发酵培养基，摇床转速为65r/min，26℃培养12小时后调整温度为18℃进行低温静止培养，停止搅拌，pH调整为4，保持3小时；之后没小时升温2℃至26℃，pH调整为5，按照2.5％的添加量添加蛋白胨，按照2％的量添加酵母粉；摇床转速为80r/min，继续发酵12h；

发酵结束后，发酵液经孔径500μm粗滤，然后与15℃循环超滤浓缩去除水分得固形物含量30％浓缩液，浓缩液经真空冷冻干燥、超微粉碎得红酵母培养物。

发酵培养基质量体积比组成为：葡萄糖1％，酶解玉米粉2％，蛋白胨2.5％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.15％，铜含量180mg/L，氯化钠20％，其余为水；

所述酶解玉米粉的制备方法为：将玉米粉配料罐中，以V:m为2:1加入纯净水，调节pH值5，加入中温淀粉酶，酶活为30u/g玉米粉，与酶活为30u/g玉米粉的蛋白酶，边搅拌边升温至50℃保温25min，然后缓慢升温至62℃保温25min，冷冻干燥备用。

采用上述方法发酵培养海洋红酵母WYN1，发酵液中生物量、类胡萝卜素产量及胞内螯合铜含量分别为32.52g/L、40mg/L和8000μg/g干菌。

所述复合饲料添加剂由以下方法制得：

粉碎后灵芝菌培养物、抗菌肽、蜂胶、女贞子萃取物、与蜜蜂花粉提取物和红酵母培养物按照比例混合得到复合饲料添加剂。

实施例3一种含有红酵母的复合饲料添加剂

复合饲料添加剂重量份数组成如下：

抗菌肽10份，蜂胶10份，女贞子萃取物10份，红酵母培养物15份，灵芝菌固体发酵培养物50份；玉米蜂花粉提取物10份，红酵母为CCTCCNo：M2014592；

抗菌肽为上海楚肽生物科技有限公司销售产品；

蜂胶为市售；

所述女贞子萃取物制备方法如下：

女贞子粉碎，过40目筛后，添加女贞子3倍重量无水乙醇浸渍提取，控制温度30℃，2小时后调整温度为55℃维持1小时，之后提取液浓缩、干燥得到乙醇提取物；乙醇提取后的女贞子残渣中添加75℃热水，热水添加量为女贞子残渣重量的2倍，处理时间30分钟，连续提取2次，将提取液真空浓缩后喷雾干燥，得到热水提取物；将上述乙醇提取物和热水提取物合并粉碎，过60目筛，即得女贞子提取物。灵芝菌固体发酵培养物制备方法如下：

斜面菌种活化培养：将保藏的灵芝斜面菌种转接到斜面培养基上，22℃培养96小时左右；

1.液体一级种子培养：将上述灵芝斜面菌种挑取一块接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行一级种子培养，培养条件：旋转式摇床80转/分，22℃培养96小时左右；

2.液体二级种子培养：将一级摇瓶种子以5％接种量接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行二级种子培养，培养条件：旋转式摇床80转/分，22℃培养96小时左右；

3.固体发酵培养：将二级摇瓶种子以5％接种量接入装有灭菌后固体发酵培养基的500L固体发酵罐中，培养条件：装料量50％，培养温度20℃，湿度75％，通风量0.3(V/V),培养时间15天，每隔3天开启搅拌10分钟，采用SGF固体发酵罐；

4.发酵培养结束，选择流化床干燥，将物料干燥到水分含量在4％，对固体发酵物料进行粉碎既得灵芝菌固体发酵培养物；

所用灵芝菌种购于中国工业微生物菌种保藏中心，菌号CICC14080；

斜面培养基组成为PDA斜面培养基；

固体发酵培养基组成如下：60％麸皮、1.4％葡萄糖、10％玉米粉、16％玉米芯(粉碎后)，0.1％花生粉饼、2％脱脂大豆蛋白粉、0.5％酵母粉；3％粉碎后过50目的当归、4％的粉碎后过40目的板蓝根，3％粉碎后过40目的麝香草；培养基pH自然，灭菌条件：121℃，2小时；

液体发酵种子培养基组成：淀粉3％，蔗糖4％，葡萄糖2％，蛋白胨0.5％，脱脂大豆蛋白粉2％，磷酸二氢钾0.15％，硫酸镁0.12％，维生素B₁2PPm，PH6；

所述玉米蜂花粉提取物的制备方法包括如下步骤：按质量比30:3:2分别称取玉米蜂花粉、糯玉米须和脱脂玉米粉，首先将玉米蜂花粉、糯玉米须分别置装有0.2％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中，室温下于200W、40KHz清洗3min，沥干，然后与脱脂玉米粉混合，加入原玉米蜂花粉质量3倍的水，用乳酸调节pH值为4，于电场强度20kV/cm，脉冲时间400μs,脉冲频率200Hz条件下进行高压脉冲电场处理，然后室温400W、40KHz条件超声处理10min；升温至30℃，加入原玉米蜂花粉质量3％的酶制剂，搅拌均匀，酶解15min，酶解液液经100目筛网过滤，滤液经超滤、减压浓缩、冷冻干燥即得玉米蜂花粉提取物；

所述酶制剂的质量组成为：蛋白酶:糖化酶:果胶酶:纤维素酶:脂肪酶＝11:5:4:3:1。

所述红酵母培养物制备方法如下：

种子培养按酵母常规培养方法进行培养；

发酵培养：初始pH为8，将种子培养液按接种量3％接种于发酵培养基，摇床转速为50r/min，24℃培养10小时后调整温度为16℃进行低温静止培养，停止搅拌，pH调整为3，保持2小时；之后每小时升温1.5℃升温到24-30℃，pH调整为4.6，按照2.5％的添加量添加蛋白胨，按照2％的量添加酵母粉；摇床转速为50r/min，继续发酵10h。

发酵结束后，发酵液经孔径100μm粗滤，然后与10℃循环超滤浓缩去除水分得固形物含量20％浓缩液，浓缩液经真空冷冻干燥、超微粉碎得红酵母培养物。

发酵培养基质量体积比组成为：葡萄糖1％，酶解玉米粉2％，蛋白胨2.5％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.15％，铜含量150mg/L，氯化钠20％，其余为水；

所述酶解玉米粉的制备方法为：将玉米粉配料罐中，以V:m为2:1加入纯净水，调节pH值3，加入中温淀粉酶，酶活为30u/g玉米粉，与酶活为30u/g玉米粉的蛋白酶，边搅拌边升温至45℃保温15min，然后缓慢升温至60℃保温15min，冷冻干燥备用。

采用上述方法发酵培养海洋红酵母WYN1，发酵液中生物量、类胡萝卜素产量及胞内螯合铜含量分别为29.38g/L、35mg/L和7240μg/g干菌。

所述复合饲料添加剂由以下方法制得：

粉碎后灵芝菌培养物、抗菌肽、蜂胶、女贞子萃取物、玉米蜂花粉提取物及红酵母培养物按照比例混合得到复合饲料添加剂。

实施例4一种含有红酵母的复合饲料添加剂

复合饲料添加剂重量份数组成如下：

抗菌肽15份，蜂胶20份，女贞子萃取物25份，红酵母培养物30份，灵芝菌固体发酵培养物20份；玉米蜂花粉提取物30份，红酵母为CCTCCNo：M2014592；

抗菌肽为上海楚肽生物科技有限公司销售产品；

蜂胶为市售；

所述女贞子萃取物制备方法如下：

女贞子粉碎，过50目筛后，添加女贞子6倍重量无水乙醇浸渍提取，控制温度45℃，4小时后调整温度为60℃维持2小时，提取液浓缩、干燥得到乙醇提取物；乙醇提取后的女贞子残渣中添加85℃热水，热水添加量为女贞子残渣重量的4倍，处理时间50分钟，连续提取3次，将提取液真空浓缩后喷雾干燥，得到热水提取物；将上述乙醇提取物和热水提取物合并粉碎，过60目筛，即得女贞子提取物。

灵芝菌固体发酵培养物制备方法如下：

斜面菌种活化培养：将保藏的灵芝斜面菌种转接到斜面培养基上，28℃培养120小时左右；

1.液体一级种子培养：将上述灵芝斜面菌种挑取一块接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行一级种子培养，培养条件：旋转式摇床180转/分，28℃培养130小时左右；

2.液体二级种子培养：将一级摇瓶种子以20％接种量接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行二级种子培养，培养条件：旋转式摇床180转/分，28℃培养130小时左右；

3.固体发酵培养：将二级摇瓶种子以10％接种量接入装有灭菌后固体发酵培养基的500L固体发酵罐中，培养条件：装料量50％，培养温度27℃，湿度90％，通风量1.0(V/V),培养时间40天。每隔10天开启搅拌10分钟，采用SGF固体发酵罐；

4.发酵培养结束，选择流化床等多种干燥方法，将物料干燥到水分含量在6％，对固体发酵物料进行粉碎既得灵芝菌固体发酵培养物；

所用灵芝菌种购于中国工业微生物菌种保藏中心，菌号CICC14080；

斜面培养基组成可以为PDA斜面培养基。

固体发酵培养基质量比组成如下：60％麸皮、1.4％蔗糖、10％玉米粉、16％玉米芯(粉碎后)，0.1％花生粉饼、2％脱脂大豆蛋白粉、0.5％酵母粉；3％粉碎后过50目的当归、4％的粉碎后过40目的板蓝根，3％粉碎后过40目的麝香草；培养基pH自然，灭菌条件：121℃，2小时。

液体发酵种子培养基组成：淀粉3％，蔗糖4％，葡萄糖2％，蛋白胨0.5％，脱脂大豆蛋白粉2％，磷酸二氢钾0.15％，硫酸镁0.12％，维生素B₁2PPm，PH7。

所述玉米蜂花粉提取物的制备方法包括如下步骤：按质量比50:5:4分别称取玉米蜂花粉、糯玉米须和脱脂玉米粉，首先将玉米蜂花粉、糯玉米须分别置装有0.4％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中，室温下于200W、40KHz清洗5min，沥干，然后与脱脂玉米粉混合，加入原玉米蜂花粉质量5倍的水，用乳酸调节pH值为6，于电场强度40kV/cm，脉冲时间500μs,脉冲频率300Hz条件下进行高压脉冲电场处理，然后室温400W、40KHz条件超声处理15min；升温至40℃，加入原玉米蜂花粉质量10％的酶制剂，搅拌均匀，酶解20min，酶解液液经300目筛网过滤，滤液经超滤、减压浓缩、冷冻干燥即得玉米蜂花粉提取物；

所述酶制剂的质量组成为：蛋白酶:糖化酶:果胶酶:纤维素酶:脂肪酶＝13:10:6:5:3。

所述红酵母培养物制备方法如下：

种子培养按酵母常规培养方法进行培养；

发酵培养：初始pH为8，将种子培养液按接种量8％接种于发酵培养基，摇床转速为80r/min，28℃培养15小时后调整温度为20℃进行低温静止培养，停止搅拌，pH调整为5，保持4小时；之后每小时3℃升温到30℃，pH调整为5.5，按照2.5％的添加量添加蛋白胨，按照2％的量添加酵母粉；摇床转速为100r/min，继续发酵15h。

发酵结束后，发酵液经孔径1000μm粗滤，然后与20℃循环超滤浓缩去除水分得固形物含量40％浓缩液，浓缩液经真空冷冻干燥、超微粉碎得红酵母培养物。

发酵培养基质量体积比组成为：葡萄糖1％，酶解玉米粉3％，蛋白胨2.5％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.15％，铜含量200mg/L，氯化钠20％，其余为水；

所述酶解玉米粉的制备方法为：将玉米粉配料罐中，以V:m为2:1加入纯净水，调节pH值7，加入中温淀粉酶，酶活为30u/g玉米粉，与酶活为30u/g玉米粉的蛋白酶，边搅拌边升温至55℃保温30min，然后缓慢升温至65℃保温30min，冷冻干燥备用。

采用上述方法发酵培养海洋红酵母WYN1，发酵液中生物量、类胡萝卜素产量及胞内螯合铜含量分别为28.76g/L、38mg/L和7580μg/g干菌。

所述复合饲料添加剂由以下方法制得：

粉碎后灵芝菌培养物、抗菌肽、蜂胶、女贞子萃取物、玉米蜂花粉提取物及红酵母培养物按照比例混合得到复合饲料添加剂。

实施例5实施例2所得饲料添加剂在断奶仔猪中的使用效果试验

试验方法：

选取120头断奶仔猪，按体重、血统及性别无差异分为实验组和对照组，每组3个重复，每个重复20头猪。实验期为28天，实验组每吨饲料添加本实施例2所述添加剂120g，对照组不添加添加剂，于试验期的始末日早晨空腹称重，计算饲料转化率、日增重、料肉比、腹泻率和死淘率。实验结果如下表所示：

	日增重	料肉比	腹泻率	死淘率
					对照组	226.31g	1.49	15％	5％
实验组	337.16g	1.28	5％	1.7％

由实验结果可知，添加有本发明所述添加剂的饲料可使断奶仔猪日增重提高48.91％，料肉比提高14.1％，腹泻率减少10％，死淘率提高3.7％

实施例6本发明例2饲料添加剂在哺乳母猪中的使用效果试验

试验采用单因素对比设计，随机选取30头健康的、产仔头数与出生均重相近的、胎次均为2或3胎的哺乳母猪，随机分为2组(即试验组和对照组)，每组15个重复，进行为期21天的饲喂试验。其中：试验组日粮添加由实施例2制备得的添加剂，对照组不添加。记录仔猪断奶重、腹泻率、死亡率。

项目	试验组	对照组
			产活仔数(头数)	12	10.9
出生均重(kg)	1.51	1.46
			21天断奶小猪(头)	10	8.30
21天断奶窝重(kg)	68.5	43.2
			21天断奶均重(kg)	6.85	5.20
头净增重(kg)	5.34	3.74
			头日增重(g)	252.28	178.1
仔猪腹泻率(％)	6.1	13.3

试验表明：试验组比对照组断奶窝重可以提高58.6％，仔猪头日增重提高41.7％，腹泻率减少54.1％。

上述结果表明本发明产品可改善母猪和仔猪机体免疫能力，减少抗生素用量，增加养殖质量和效益。

实施例7红酵母对添加剂保存活性的影响

以实施例2中所述的制备方法获得的添加剂为样品1，将实施例2中的红酵母替换为市售的饲料酵母，比较两种样品的保存活性。在室温下保存上述样品6个月，之后重复实施例8的实验，通过料肉比的变化表征添加剂活性的变化，结果表明：样品1的残余活性在85％以上，样品2的残余活性保持在60％左右。

实施例8红酵母对添加剂热稳定性的影响

以实施例2中所述的制备方法获得的添加剂为样品1，将实施例2中的红酵母替换为市售的饲料酵母，比较两种样品的热稳定性。在45℃下保存上述样品24h，之后重复实施例8的实验，通过料肉比的变化表征添加剂活性的变化，结果表明：样品1的残余活性在75％以上，样品2的残余活性保持在40％左右。

Claims (7)

1.一种含有红酵母的复合饲料添加剂，其特征在于，由以下重量分数的组分组成：抗菌肽10-15份，蜂胶10-20份，女贞子萃取物10-25份，红酵母培养物15-30份，灵芝菌固体发酵培养物20-50份，玉米蜂花粉提取物10-30份；

所述红酵母具体为海洋红酵母WYN1(Rhodotorulasp.WYN1)，保藏编号为：CCTCCNo：M2014592。

2.如权利要求1所述的一种含有红酵母的复合饲料添加剂，其特征在于，所述红酵母培养物制备方法如下：

种子培养按酵母常规培养方法进行培养；

发酵培养：初始pH为8，将种子培养液按接种量3-8％接种于发酵培养基，摇床转速为50-80r/min，24-28℃培养10-15小时后调整温度为16-20℃进行低温静止培养，停止搅拌，pH调整为3-5，保持2-4小时；之后阶梯形升温到24-30℃，pH调整为4.6-5.5，按照2.5％的添加量添加蛋白胨，按照2％的量添加酵母粉；摇床转速为50-100r/min，继续发酵10-15h。

发酵结束后，发酵液经孔径10-1000μm粗滤，然后与10-20℃循环超滤浓缩去除水分得固形物含量20-40％浓缩液，浓缩液经真空冷冻干燥、超微粉碎得红酵母培养物。

3.如权利要求2所述的一种含有红酵母的复合饲料添加剂，其特征在于，所述发酵培养基质量体积比组成为：葡萄糖1％，酶解玉米粉1-3％，蛋白胨2.5％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.15％，铜含量150-200mg/L，氯化钠20％，其余为水。

4.如权利要求2所述的一种含有红酵母的复合饲料添加剂，其特征在于，所述酶解玉米粉的制备方法为：将玉米粉置于配料罐中，以V:m为2:1加入纯净水，调节pH值3-7，加入中温淀粉酶，酶活为30u/g玉米粉，与酶活为30u/g玉米粉的蛋白酶，边搅拌边升温至45-55℃保温15-30min，然后缓慢升温至60-65℃保温15-30min，冷冻干燥备用。

5.一种制备如权利要求1所述的含有红酵母的复合饲料添加剂的方法，包括如下步骤：

(1)所述抗菌肽及蜂胶均为市售产品；

(2)所述女贞子萃取物制备方法如下：

女贞子粉碎，过40-50目筛后，添加女贞子3-6倍重量无水乙醇浸渍提取，控制温度30-45℃，2-4小时后调整温度为55-60℃1-2小时，提取液浓缩、干燥得到乙醇提取物；乙醇提取后的女贞子残渣中添加75-85℃热水，热水添加量为女贞子残渣重量的2-4倍，处理时间30-50分钟，连续提取2-3次，将提取液真空浓缩后喷雾干燥，得到热水提取物；将上述乙醇提取物和热水提取物合并粉碎，过60目筛，即得女贞子提取物；

(3)所述灵芝菌固体发酵培养物制备方法如下：

斜面菌种活化培养：将保藏的灵芝斜面菌种转接到斜面培养基上，22-28℃培养96-120小时左右，至菌丝长满斜面即可；最佳培养温度25℃；

①液体一级种子培养：将上述灵芝斜面菌种挑取一块接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行一级种子培养，培养条件：旋转式摇床80-180转/分，22-28℃培养96-130小时；

②液体二级种子培养：将一级摇瓶种子以5-20％接种量接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行二级种子培养，培养条件：旋转式摇床80-180转/分，22-28℃培养96-130小时左右；

③固体发酵培养：将二级摇瓶种子以5-10％接种量接入装有灭菌后固体发酵培养基的500L固体发酵罐中，培养条件：装料量50％，培养温度20-27℃，湿度75-90％，通风量0.3-1.0(V/V),培养时间15-40天，每隔3-10天开启搅拌10分钟，采用SGF固体发酵罐；

④发酵培养结束，选择流化床干燥，将物料干燥到水分含量在7％以下，对固体发酵物料进行粉碎既得灵芝菌固体发酵培养物；

(4)所述玉米蜂花粉提取物的制备方法包括如下步骤：

按质量比30-50:3-5:2-4分别称取玉米蜂花粉、糯玉米须和脱脂玉米粉，首先将玉米蜂花粉、糯玉米须分别置装有0.2-0.4％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中，室温下于200W、40KHz清洗3-5min，沥干，然后与脱脂玉米粉混合，加入原玉米蜂花粉质量3-5倍的水，用乳酸调节pH值为4-6，于电场强度20-40kV/cm，脉冲时间400-500μs,脉冲频率200-300Hz条件下进行高压脉冲电场处理，然后室温400W、40KHz条件超声处理10-15min；升温至30-40℃，加入原玉米蜂花粉质量3-10％的酶制剂，搅拌均匀，酶解15-20min，酶解液液经100-300目筛网过滤，滤液经超滤、减压浓缩、冷冻干燥即得玉米蜂花粉提取物；

所述酶制剂的质量组成为：蛋白酶:糖化酶:果胶酶:纤维素酶:脂肪酶＝11-13:5-10:4-6:3-5:1-3；

(5)所述红酵母培养物制备方法如下：

种子培养按酵母常规培养方法进行培养；

发酵培养：初始pH为8，将种子培养液按接种量3-8％接种于发酵培养基，摇床转速为50-80r/min，24-28℃培养10-15小时后调整温度为16-20℃进行低温静止培养，停止搅拌，pH调整为3-5，保持2-4小时；之后阶梯形升温到24-30℃，pH调整为4.6-5.5，按照2.5％的添加量添加蛋白胨，按照2％的量添加酵母粉；摇床转速为50-100r/min，继续发酵10-15h。

发酵结束后，发酵液经孔径10-1000μm粗滤，然后与10-20℃循环超滤浓缩去除水分得固形物含量20-40％浓缩液，浓缩液经真空冷冻干燥、超微粉碎得红酵母培养物；

发酵培养基质量体积比组成为：葡萄糖1％，酶解玉米粉1-3％，蛋白胨2.5％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.15％，铜含量150-200mg/L，氯化钠20％，其余为水；

所述酶解玉米粉的制备方法为：将玉米粉置于配料罐中，以V:m为2:1加入纯净水，调节pH值3-7，加入中温淀粉酶，酶活为30u/g玉米粉，与酶活为30u/g玉米粉的蛋白酶，边搅拌边升温至45-55℃保温15-30min，然后缓慢升温至60-65℃保温15-30min，冷冻干燥备用。

(6)所述复合饲料添加剂由以下方法制得：

粉碎后灵芝菌培养物、抗菌肽、蜂胶、女贞子萃取物、玉米蜂花粉提取物和红酵母培养物按照比例混合得到复合饲料添加剂。

6.一种权利要求1所述的含有红酵母的复合饲料添加剂，其特征在于，由以下重量分数的组分组成：抗菌肽10份，蜂胶15份，女贞子萃取物15份，红酵母培养物20份，灵芝菌固体发酵培养物40份，玉米蜂花粉提取物20份；红酵母为CCTCCNo：M2014592。

7.权利要求1所述的含有红酵母的复合饲料添加剂在畜禽饲料中的应用。