CN110448673A - 具有抗肿瘤免疫增强的柑橘果胶-多肽复合物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了具有抗肿瘤免疫增强的柑橘果胶‑多肽复合物的制备方法，包括以下步骤：Step1制备果胶溶液、Step2酶解脱酯、Step3过滤、Step4制备果胶粉和Step5制备复合物。本发明的方法能将天然的柑橘高酯果胶酶解得到改性低酯小分子果胶，使其具有高溶解度和高分散性，从而提高在体内的利用率，且与肽粉混合后具有良好的抗肿瘤及免疫增强的功效。

Description

具有抗肿瘤免疫增强的柑橘果胶-多肽复合物的制备方法
技术领域
本发明属于大分子化合物水解以及复配技术领域，特别涉及具有抗肿瘤免疫增强的柑橘果胶-多肽复合物的制备方法。
背景技术
研究证实，多肽是涉及各种细胞功能的生物活性物质，调节人体的生理活动和生化反应，人体中几乎所有的细胞都能合成多肽，又受多肽调节。现已发现人体中具有活性的多肽多达1000多种，它们在生长发育、细胞分化、肿瘤病变、免疫防御、抗衰防老等方面承担着重要的生理作用。能够产生免疫反应的物质，大多也是蛋白质或多肽，如B淋巴细胞产生的抗体，是1000多个氨基酸组成的多肽；T淋巴细胞产生的细胞因子，也是一些特殊的蛋白质或多肽。多肽在人体中扮演着调节免疫、修复肝脏细胞、杀灭病毒乃至癌细胞等等极其重要的角色，维护着人的生命活动的稳定。
另外，目前国内外已有多项临床前研究表明小分子果胶在离体细胞水平或整体动物体内，对多种肿瘤具有抑制作用，包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌以及白血病等。果胶与多肽的联合使用具有更加显著的抗肿瘤且增强免疫功效。
但是，柑橘果胶广泛存在于植物的初生细胞壁和中胞间层，是植物细胞壁的主要成分之一，其主要成分是通过α-1，4糖苷键连接而成的部分甲酯化的D-半乳糖醛酸多聚物，分子量约3-40万。柑橘果胶由于分子量大、酯化度高，在水中的溶解度低，在体内的利用率低，导致食用后不能被肠道吸收，只在肠胃中作用，对身体有益但其功能仅限于消化系统。
发明内容
本发明针对上述现有技术的存在的问题，针对柑橘高酯果胶溶解性差，水解度低，在体内利用率低的特性，提出一种酶解方法将柑橘高酯果胶酶解降酯，并与肽粉复合成具有抗肿瘤功效的混合物。
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
具有抗肿瘤免疫增强的柑橘果胶-多肽复合物的制备方法，包括以下步骤：
Step1制备果胶溶液：将柑橘高酯果胶粉用乙醇浸泡，加入质量为大分子柑橘高酯果胶粉干重10～50倍的水，加入至20～60℃，搅拌溶胀2～6h，配成大分子高酯果胶溶液；
Step2酶解脱酯：调节高酯果胶溶液的PH至2～7，在搅拌条件下加入质量为高分子果胶粉干重1％～10％的果胶酯酶，在温度为30～70℃下进行酶解脱酯，反应时间30～120min，灭酶活后冷却至室温，得到酯化度为2％～35％的脱酯果胶溶液；
Step3过滤：将脱酯果胶溶液在常温下搅拌过滤，得到分子量为0.2～5万的低分子果胶溶液；
Step4制备果胶粉：将低分子果胶溶液经碱中和、浓缩、喷雾干燥后得到目标酯化度和分子量的高品质果胶粉；
Step5制备复合物：将得到的果胶粉与肽粉按比例混合，即得到具有抗肿瘤功效的果胶-多肽复合物。
进一步的，所述Step1制备果胶溶液步骤中，用乙醇将干燥的高酯果胶粉浸润。
进一步的，所述Step1制备果胶溶液步骤中大分子高酯果胶溶液的质量百分含量为2％～5％。
进一步的，所述Step2酶解脱酯步骤中酶解脱酯的温度为40～60℃，果胶酯酶加入量是果胶粉干重的3％～6％，脱酯时间为60～120min。
进一步的，所述Step2酶解脱酯步骤中灭酶时间为10～30min，温度为80～120℃。
进一步的，所述Step4制备果胶粉步骤中浓缩条件为40～100℃，真空度-0.06MPa～-0.08MPa，浓缩至高酯果胶溶液的1/5～1/10。
进一步的，所述Step4制备果胶粉步骤中喷雾干燥的条件为：进风口温度160～190℃，排风口温度70～100℃，转速200～500r/s。
进一步的，所述Step5制备复合物步骤中果胶粉与肽粉是按照1:1～1:5的比例混合而成的。
进一步的，所述Step5制备复合物步骤中肽粉的制备原料为鳙鱼或鳕鱼的鱼肉。
本发明的有益效果为：本发明的方法能将天然的柑橘高酯果胶酶解得到改性低酯小分子果胶，使其具有高溶解度和高分散性，从而提高在体内的利用率，且与肽粉混合后具有良好的抗肿瘤和免疫增强功效。
附图说明
图1是本发明实施例4中的免疫实验的RBC结果；
图2是本发明实施例4中的免疫实验的RBC结果；
图3是本发明实施例4中的免疫实验的HB结果；
图4是本发明实施例5中的溶解性实验结果；
图5是本发明实施例6中的抗肿瘤实验结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的肽粉包括一切植物蛋白或动物蛋白，优选的为鳙鱼或鳕鱼的鱼肉，其具体的制备方法如下：
(1)将鳙鱼鱼肉500克洗净，用打浆机将鱼肉打成浆，得鱼肉浆；然后向鱼肉浆中加入2.0倍鱼肉重量的水1000克，在90℃中水浴20min，再用分散均质机在12000rpm下匀浆2min，得到鱼肉浆液1500克。通过8000g离心10min，去上层脂肪，得到去脂的鱼肉浆液1430克。将去脂鱼肉浆液的温度调整到60℃，于超声波发生器中经超声波(频率为45kH)处理20分钟。
(2)调节步骤(1)鱼肉浆液的温度为60℃，然后按照复合蛋白酶(碱性蛋白酶：风味蛋白酶：菠萝蛋白酶＝2：2：1)与鱼肉质量比为1：400加入复合蛋白酶1.25克，在65℃下酶解3小时，然后在95℃下保温4min，冷却至室温，再在5000g条件下离心15min，收集上清液。
(3)利用孔径为2000道尔顿的陶瓷膜对步骤(2)所得的上清液进行超滤，收集滤液，再经过Sephadex G-25(长60cm，直径4.6cm)凝胶色谱分离，洗脱液为去离子水，流速为0.8mL/min，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰，再用RP-HPLC反相高校液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是为5～90％乙腈溶液作为洗脱液，流速为1mL/min，得到高活性的抗氧化肽溶液。
(4)将步骤(3)得到的抗氧化活性肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得鱼肉抗氧化活性肽。
通过LC-MS/MS对所得的鱼肉抗氧化活性肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Lys-Ala-Gln–Arg-Leu-Lys-Glu和Lys-Gln-Ser-Asp-Val的肽的含量为41.6％。
实施例1
称取1000g柑橘高酯果胶粉，加入400g无水乙醇，充分搅拌，使果胶粉末湿润。加入10L水，在酶解罐中升温至20℃不断搅拌溶解，搅拌溶胀2h后，用食用碱调节溶解液的ph至2，加入10g果胶酯酶，充分搅拌溶解均匀，在30℃下酶解30min后，升温到80℃保温10min灭酶，冷却至室温后经过陶瓷膜过滤，滤液在真空度为-0.06MPa，40℃下真空浓缩到原液的1/5后，将浓缩液喷雾干燥，喷雾干燥条件为：进风口温度160℃，排风口温度70℃，转速200r/s。将喷雾干燥的果胶粉与肽粉，按1:1的比例混合即可得到具有抗肿瘤功效的果胶-多肽复合物产品。
实施例2
称取500g柑橘高酯果胶粉，加入100g无水乙醇，充分搅拌，使果胶粉末湿润。加入25L水，在酶解罐中升温至60℃不断搅拌溶解，搅拌溶胀6h后，用食用碱调节溶解液的ph至7，加入50g果胶酯酶，充分搅拌溶解均匀，在70℃下酶解120min后，升温到120℃保温30min灭酶，冷却至室温后经过陶瓷膜过滤，滤液在真空度为-0.08MPa，100℃下真空浓缩到原液的1/10后，将浓缩液喷雾干燥，喷雾干燥条件为：进风口温度190℃，排风口温度100℃，转速500r/s。将喷雾干燥的果胶粉与肽粉，按1:5的比例混合即可得到具有抗肿瘤功效的果胶-多肽复合物产品。
实施例3
称取500g柑橘高酯果胶粉，加入120g无水乙醇，充分搅拌，使果胶粉末湿润。加入25L水，在酶解罐中升温至60℃不断搅拌溶解，搅拌溶胀6h后，用食用碱调节溶解液的ph至7，加入70g果胶酯酶，充分搅拌溶解均匀，在70℃下酶解120min后，升温到120℃保温20min灭酶，冷却至室温后经过陶瓷膜过滤，滤液在真空度为-0.08MPa，100℃下真空浓缩到原液的1/10后，将浓缩液喷雾干燥，喷雾干燥条件为：进风口温度190℃，排风口温度100℃，转速500r/s。将喷雾干燥的果胶粉与肽粉，按1:3的比例混合即可得到果胶-多肽复合物产品。
实施例4
免疫低下模型的设计：
BAC小鼠共108只，体重18-22g，购于北京市北京大学医学部，适应饲养3d后，随机分成18组，每组6只，且实施例1、实施例2和实施例3各6组，每个实施例内设置如下组别：(1)正常对照组；(2)环磷酰胺组；(3)低剂量果胶-多肽复合物(10mg/Kg)组；(4)低剂量果胶-多肽复合物环磷酰胺组；(5)高剂量果胶-多肽复合物(150mg/Kg)组；(6)高剂量果胶-多肽复合物环磷酰胺组。(3)、(4)、(5)、(6)组每天灌胃不同剂量肽液，(1)、(2)组灌胃等体积的生理盐水，(2)、(4)、(6)组均于第3天、第4天、第5天腹腔注射环磷酰胺生理盐水溶液(20mg/Kg)，其他组注射等量无菌生理盐水，30d检测血生化和血常规结果。
实验结果详见图1～3，图中，对照组表示(1)正常对照组；环酰组表示(2)环磷酰胺组；低肽表示(3)低剂量果胶-多肽复合物(10mg/Kg)组；低肽环表示(4)低剂量果胶-多肽复合物环磷酰胺组；高肽表示(5)高剂量果胶-多肽复合物(150mg/Kg)组；高肽环表示(6)高剂量果胶-多肽复合物环磷酰胺组。其中数据部分，“±”前部数据表示每组六只小鼠测定指标平均值，“±”后部数据表示测量数据误差。
低肽和高肽对小鼠的外周白细胞数(wbc)有明显的增加作用，且随着浓度的升高，增加的也越多，所以本发明的果胶-多肽复合物对于增加固有免疫具有一定的效果；
血液循环中红细胞(RBC)和WBC对于机体免疫功能的维持具有重要作用。RBC和WBC能够识别和递呈抗原并发挥抗原清除的作用；此外，还能调控免疫功能相关细胞因子。治疗组小鼠血液中WBC、RBC含量均高于模型组，模型组小鼠血液中血红蛋白(HB)含量均低于对照组，治疗组均高于模型组，说明环磷酰胺(CTX)注射后模型小鼠发生了免疫功能抑制，而在给予肽粉后免疫功能得到了改善。
实施例5
对实施例1～3所得的果胶-多肽复合物产品进行溶解性实验，实验中增加对照组，对照组为未处理果胶-多肽复合物，详细实验结果见图4。
实施例6
对实施例1～3所得的果胶-多肽复合物产品进行抗肿瘤实验，实验中增加对照组，对照组为未处理果胶-多肽复合物，详细实验结果见图5。
需要说明的是，在本文中，如若存在第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.具有抗肿瘤免疫增强的柑橘果胶-多肽复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
Step1制备果胶溶液：将柑橘高酯果胶粉用乙醇浸泡，加入质量为大分子柑橘高酯果胶粉干重10～50倍的水，加入至20～60℃，搅拌溶胀2～6h，配成大分子高酯果胶溶液；
Step2酶解脱酯：调节高酯果胶溶液的PH至2～7，在搅拌条件下加入质量为高分子果胶粉干重1％～10％的果胶酯酶，在温度为30～70℃下进行酶解脱酯，反应时间30～120min，灭酶活后冷却至室温，得到酯化度为2％～35％的脱酯果胶溶液；
Step3过滤：将脱酯果胶溶液在常温下搅拌过滤，得到分子量为0.2～5万的低分子果胶溶液；
Step4制备果胶粉：将低分子果胶溶液经碱中和、浓缩、喷雾干燥后得到目标酯化度和分子量的高品质果胶粉；
Step5制备复合物：将得到的果胶粉与肽粉按比例混合，即得到具有抗肿瘤功效的果胶-多肽复合物。
2.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤免疫增强的柑橘果胶-多肽复合物的制备方法，其特征在于，所述Step1制备果胶溶液步骤中，用乙醇将干燥的高酯果胶粉浸润。
3.根据权利要求2所述的具有抗肿瘤免疫增强的柑橘果胶-多肽复合物的制备方法，其特征在于，所述Step1制备果胶溶液步骤中大分子高酯果胶溶液的质量百分含量为2％～5％。
4.根据权利要求1～3中任一所述的具有抗肿瘤免疫增强的柑橘果胶-多肽复合物的制备方法，其特征在于，所述Step2酶解脱酯步骤中酶解脱酯的温度为40～60℃，果胶酯酶加入量是果胶粉干重的3％～6％，脱酯时间为60～120min。
5.根据权利要求4所述的具有抗肿瘤免疫增强的柑橘果胶-多肽复合物的制备方法，其特征在于，所述Step2酶解脱酯步骤中灭酶时间为10～30min，温度为80～120℃。
6.根据权利要求1、2、3或5所述的具有抗肿瘤免疫增强的柑橘果胶-多肽复合物的制备方法，其特征在于，所述Step4制备果胶粉步骤中浓缩条件为40～100℃，真空度-0.06MPa～-0.08MPa，浓缩至高酯果胶溶液的1/5～1/10。
7.根据权利要求6所述的具有抗肿瘤免疫增强的柑橘果胶-多肽复合物的制备方法，其特征在于，所述Step4制备果胶粉步骤中喷雾干燥的条件为：进风口温度160～190℃，排风口温度70～100℃，转速200～500r/s。
8.根据权利要求7所述的具有抗肿瘤免疫增强的柑橘果胶-多肽复合物的制备方法，其特征在于，所述Step5制备复合物步骤中果胶粉与肽粉是按照1:1～1:5的比例混合而成的。
9.根据权利要求8所述的具有抗肿瘤免疫增强的柑橘果胶-多肽复合物的制备方法，其特征在于，所述肽粉的制备原料为鳙鱼或鳕鱼的鱼肉。
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