CN86107547A - 利用运动发酵单胞菌使淀粉水解物转化成酒精 - Google Patents

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Abstract

在微需氧条件下，利用运动发酵单胞菌的一步发酵过程，从淀粉水解物工业生产酒精的一种新的发酵方法。

Description

本发明所阐述的，是在微需氧条件下，利用高效细菌-运动发酵单胞菌（Zymomonas    mobtlis）菌株，一步完成淀粉水解物转化成酒精的方法。
酒精生产的传统方法是用酵母分两步进行批量培养。第一步是酵母的需氧繁殖，叫生长期;第二步是无氧或微需氧条件下生产酒精的厌氧过程。在第二步酒精生产过程中，为使酵母能进一步繁殖，需要引入微量空气或氧气。如果要增加整个过程的效率可以通过如沉淀、离心方法，应用酵母细胞临时性循环，则需要氧气。酵母发酵固定地依靠其本身生长与酒精产生速率的协调，所以为使酒精产量达到最高，必须在培养液中加入促生长物质，或提供可控通气装置。
传统酒精发酵过程（第二步）依赖于大量地接菌，几乎达（5～10）×106细胞/毫升。发酵最适温度在30～40℃。通过利用冷却装置来控制其产热。为得到9-11%（体积/体积）的酒精，第2步的批量或半连续系列发酵过程的时间需要40～60小时。通过细胞再循环增加接入菌种密度80～100倍，发酵时间可减少到10小时。为提高淀粉水解物转化成酒精的效率，最好在系列发酵过程中连续接加新鲜酵母。并且，为达到最大利用率，得到11%（体积/体积）的酒精，在第2步里要使用3～5个发酵罐。
酒精发酵的第二种已知方法，是利用细菌运动发酵单胞菌（见欧洲专利NO.0047641-George    Waston    Ltd.）如前述的酵母批量发酵一样，此法也需分两步进行。但这种细菌在其生产期（第一步）不需要引入空气。此法也需加入有机或无机氮源，以及一些附加养料，以利于细胞的生长。为满足严格厌氧，需要向发酵罐缓慢鼓泡通入氮气。在酒精生产的第二步里，糖浓度一定不能超过6%（重量/体积），所以要分步地加入或连续加入浓缩糖液，最适温度在28～33℃，最适PH为5.5。（在此方法的第二步里，是否需要向发酵罐里通入氮气慢泡，上述专利未交待清楚）。
酒精生产的第三种已知方法，是利用固定化的酵母或发酵单胞菌（Zymomonas）的菌株，分两步进行，每一步都限定糖的含量（10%重量/体积）（见英国专利NO.2，055，121-Tanabe    Sugaku    Co.Ltd.）。
酒精生产的第四种已知方法，是以细胞再循环连续方式利用运动发酵单胞菌（澳大利亚专利AU-B-67696/81），或利用絮状的运动发酵单胞菌菌株进行半批量培养（澳大利亚专利AU-B-78199/81）。这两种情况的发酵温度都控制在30℃，PH在5.0，培养液中含有纯葡萄糖和5～10克/升的酵母膏。
酵母发酵时，被转化的碳源可例举出：蔗糖，葡萄糖，糖蜜，甘蔗汁和淀粉水解物。发酵单胞菌发酵时，只限于葡萄糖，在固定化细胞情况下，可以是葡萄糖和糖蜜。以前本发明者申请专利用的都是蔗糖，糖蜜，甘蔗糖浆，甜菜糖浆和葡萄糖/果糖混合物。
本发明的目的是，提供一种方法。它能够从淀粉基本材料，例如从谷物或根类作物的淀粉水解物中，生产出酒精。它以运动发酵单胞菌为发酵菌，而底物的纯度对于这种方法的成功与否并不太重要。
本发明的另一目的是，当发酵液中的葡萄糖组分浓度大于10%（重量/体积）时，本方法可以实施。
本发明进一步的目的是，能提供一种一步完成的批量发酵方法，以及一些对此方法的调节手段，如一次加给、半连续系列发酵罐、连续或多步系统，而其中的能量输入很低。
本发明想达到的其它一些目的，可从下文的叙述中清楚了解。
总的看来，本发明是一种发酵生产酒精的方法，其特征是：在发酵培养基中利用运动发酵单胞菌，在单一的发酵培养基中一步把淀粉水解物发酵成酒精。
发酵步骤包括：
（1）在发酵液中由淀粉葡萄糖苷酶糖化淀粉成葡萄糖，以及
（2）糖化后，通过加到发酵液中的菌株的作用，从葡萄糖生产出酒精。
另一种途径是，菌株对加到发酵液中的淀粉水解物混合物作用，从而生成酒精。
“淀粉水解物”，是对液化淀粉进行物理的、化学的或酶法的处理，所得到的一种复杂混合物，除主要成分葡萄糖外，还有少量的Maltrin、糊精、麦芽糖、脂类和蛋白质等。
“一步发酵”定义为，微生物的生长和酒精的产生同时发生在同一个发酵罐中。把含有运动发酵单胞菌的种子培养液加到盛有发酵培养液的发酵罐中;或者在发酵罐中先装入一部分前一轮发酵的含运动发酵单胞菌的发酵液，然后加入发酵培养液。这两种方法都能启动发酵过程。
最好本发酵过程在微需氧条件下实现。“微需氧条件”定义为，在发酵罐中不通入任何气体（如氧气、空气、氮气等），而让发酵液的表面暴露在大气中。运动发酵单胞菌在其生长以及生产酒精时，不需要空气、氧气（好氧的），或氮气（厌氧的），但可以耐受发酵液表面所存在的空气。
微生物运动发酵单胞菌的一些较好的菌株都已保存在澳大利亚昆斯兰大学的菌种保藏中心（the    Culture    Collection    of    the    University    of    Queensland，Microbiology    Deparfment，St.Lucia，Queensland，4067，Australian）。保藏号（Deposit    Nos.）：UQM2716，UQM2841和UQM2864。还保存在美国标准菌种保藏中心（the    American    type    Culture    Collection（ATCC）12301    Parklawn    Drire，Rockville，Maryland，20852，U.S.A），时间为1984年4月24日以及1986年1月17日，保藏号分别为：39676，53432，53431。
菌种UQM2716是用连续培养技术，从英国工业细菌保藏中心（the    National    Collection    of    Industrial    Bacteria，Torry    Research    Station，Abbey    Road，Aber    deen，AB98DG，United    Kindom）里的保藏号为NCIB11199菌株，ATCC里的保藏号为29191菌株以及昆斯兰大学里的保藏号为UQM2007菌株中筛选出来的衍生株。筛选的标准是，与亲代菌株UQM2007比较，能在其糖转化代谢速度及其特性上有所改进。
菌种UQM2864是从菌株UQM2716中得到的果糖利用的阴性突变株;第三个菌种UQM2841是从菌株UQM2007中得到的果糖利用的阴性突变株。这些菌株可以是游离的或固定化的形式。它们的突变株或变异株也可使用。
最好，葡萄糖是从谷物（如小麦，大麦，燕麦，黑麦，小麦属，玉米）或根类作物（如木薯，竹芋等）的淀粉水解物中得到的。也可以葡萄糖浆或葡萄糖/果糖混合物的形式，过滤或不过滤，或与其它任何有名称物质一起，送入发酵罐中。
本发明在典型的工业实施中，可以给发酵罐提供化学成分没有确定的（“复杂的”）淀粉水解物混合物，而此混合物可用酶解或非酶解的通常是提供者按商业秘密的方式进行生产的。（迄今认为，用运动发酵单胞菌，还不可能象发酵化学成分一定的“淀粉材料”那样，发酵一系列复杂的淀粉水解物的混合物）。
最好，葡萄糖组分的浓度范围在10～30%（重量/体积），15～20%（重量/体积）的浓度更有利于在单批量发酵中得到最大酒精产量;或者在连续给料系统，得到较高的酒精产量。
在使用葡萄糖浆或糖化淀粉时，培养基可包括下列一种或多种组分：蛋白胨（酪蛋白水解物），酵母膏，磷酸二氢钾（KH2PO4），硫酸铵（（NH4）2SO4）或氢氧化铵（NH4OH）或尿素，硫酸镁（MgSO4·7H2O）以及磷酸氢二铵〔（NH4）2HPO4〕。这些组分较好的浓度范围是在0.01～0.5%（重量/体积），最好是在约0.05～0.5%。其中的酵母膏和蛋白胨（酪蛋白水解物）可以被泛酸或β-丙氨酸代替。
上述命名的培养基组分，可以用适当浓度的甘蔗汁、甜菜汁或糖蜜代替，或以终浓度为1.5～7.5%（干固体）玉米浆代替（浸浆液是淀粉制造工业中为从植物材料中得到淀粉所采用的湿磨过程的副产品）。所含干固体总量根据应用方法可以在9到13%之间变动，也可浓缩到35～50%（做为动物饲料）或30～35%（做为发酵营养物）。它含有蛋白质、氨基酸、碳水化合物、植酸以及其它一些以有机或无机形式存在的不同矿物质的混合物。
通常发酵过程的PH维持在3.5～7.0。最好起始PH调到4.5～7.0，然后控制在3.9到5.0之间。或者可以不用控制其PH，淀粉水解物/玉米浸浆混合液的初始PH通常是在4.1左右，把此自然PH稍许调一下，到4.3和5.0之间，最好为4.3～4.5即可。然后开始发酵，PH就靠混合液中的自然的缓冲作用维持。这一点就使得此过程有显著的经济效益。
通常发酵罐中的温度保持在25～40℃，最好恒温控制在30～35℃之间。
为使本发明能全面地被了解，现叙述一些此方法的范例。
例1.
木薯根被捣成糊状，然后用淀粉酶（即淀粉葡萄糖苷酶）在60℃糖化之。含75克/升葡萄糖的水解糊状物（2，500毫升）转入3升的发酵罐中。再用无菌方法加入含有蛋白胨（酪蛋白水解产物），酵母膏，磷酸二氢钾，硫酸铵或尿素，以及硫酸镁（每一组分浓度为0.2%）中任一种或多种组分的培养基200毫升。其中蛋白胨和酵母膏可被泛酸钙代替，或整个培养液以加入适宜量的甘蔗糖浆、糖蜜或甜菜糖浆代替。
把生长在含有10%（重量/体积）蔗糖或葡萄糖、0.2%（重量/体积）酵母膏、0.2%（重量/体积）酪蛋白水解物、0.2%（重量/体积）KH2PO4或0.2%（重量/体积）MgSO4·7H2O、0.2%（重量/体积）（NH4）2SO4的培养基中的运动发酵单胞菌在37℃培养12～24小时的种菌培养物300毫升加入到发酵罐中。起始PH调到7.0，然后通过加2当量浓度的碱液（如80克/升NaOH），把PH控制在5.5。培养温度35℃，搅拌速度80转/分。
12小时后，达到最高的酒精产量，其酒精浓度为36.31克/升，转化率为92%。
假如把木薯水解物糖化后离心，则转化率至少可增加到95%。
例2.
把330克葡萄糖溶解在1.0升蒸馏水中，加热到60℃，保持10分钟。500毫升蒸馏水中溶解100克的玉米浆（干物质含量48～50%），再加水到800毫升，然后把它和前面的1.0升葡萄糖溶液相混合，共1.8升，一起放入3升的发酵罐中。温度调到25～38℃，最好调到32℃。在加入种菌之前，PH调到3.9～5.5，而以4.2～5.0最佳。
把生长在含5～10%（重量/体积）葡萄糖、3克/升酵母膏、3克/升蛋白胨、各2克/升的KH2PO4、（NH4）2SO4、MgSO4·7H2O的培养基中的运动发酵单胞菌在22～37℃培养12～24小时的种菌培养物200毫升加到发酵罐中。
在接菌期以及主要发酵期，葡萄糖可用淀粉水解物代替;酵母膏、蛋白胨、KH2PO4、（NH4）2SO4和MgSO4·7H2O可用1.5～7.5%（干物质）玉米浸浆（48～50%干物质的玉米浸浆液）代替。
起始PH调到4.5，发酵过程中，可用1到2当量浓度的碱液（如80克/升NaOH）控制PH在4.0～4.1之间。搅拌速度为60～80转/分。发酵开始混合好后，不再需要搅拌。17小时后，酒精产量达到最高，其酒精浓度为83.0克/升或10.54%（体积/体积）。发酵罐温度维持在25～39℃，32℃最好，酒精产量达最高时，发酵罐中残留葡萄糖少于0.1克/升。
例3.
用含165克葡萄糖，50克玉米浸浆（内含48～50%干物质）的1.0升液体，重复例2试验，按例2所述的种菌培养物100毫升加入发酵罐中以使发酵启动。17小时后，酒精产量达到最高所得酒精浓度为83.7克/升或10.63%（体积/体积）。温度保持在32℃，PH控制在4.1，酒精产量达最高时，葡萄糖残存含量少于0.1克/升。
例4.
用含180克葡萄糖，50克玉米浸浆（内含48～50%干物质）的1.0升液体，重复实施例2，按例2所述的种菌培养物100毫升加入发酵缶中以使发酵启动。23.6小时以后，酒精产量达最高所得酒精浓度为93.1克/升或11.8%（体积/体积）。此时，缶中葡萄糖含量为0.6克/升。
例5.
把含255克葡萄糖，75克玉米浸浆（内含48.8%的干物质）的培养液1，500毫升放入1.5升的发酵罐中。在含5%（重量/体积）葡萄糖，5克/升酵母膏，3克/升蛋白胨以及各2克/升的KH2PO4，MgSO4·7H2O，（NH4）2SO4的培养基中生长的运动发酵单胞菌在22～30℃培养12～24小时的种菌培养物300毫升，室温下，2，500转/分离心25分钟。收集沉淀的细胞块，用适量（约200毫升）葡萄糖-玉米浸浆混合液重新悬浮细胞。此细胞悬液然后被加入到1.5升的发酵罐中。
培养温度32℃，搅拌速度为60转/分，温度维持在25～37℃，而以30～33℃最适合。搅拌在这里不是必需的。
PH不需控制。15小时后，葡萄糖完全被利用给出的酒精浓度为82.9克/升或10.5%（体积/体积）。
所有这些例子中，发酵罐中仅需加入很少量的种菌（运动发酵单胞菌）培养物。由于发酵罐中的特异条件，运动发酵单胞菌的生长和酒精的产生是在真正的一步发酵过程中同时发生。这就避免了在发酵液中（酒精浓度低于6%）首先要生长运动发酵单胞菌以产生细胞悬液，然后把此悬液转入发酵罐中去生产酒精，如欧洲专利NO.0047641所述的情况。
当发酵完毕后，运动发酵单胞菌细胞从发酵液中分离出来，酒精也被蒸馏出去。或者，从前一发酵过程的发酵液中取出一部分，做为后一发酵的运动发酵单胞菌的接种种菌，加到后一发酵罐中。
生产出的酒精具有其商业价值，它可作为汽油的一个组分，或作为一种基本化工产品（例如用于生产乙烯）。另一副产品二氧化碳可用做干冰，或作为藻类生物量生长的碳源。
发酵过程只需输入很少的能量，因为微生物在发酵过程中产生相当量的热，另外发酵是在微需氧条件下进行，所以发酵液组分及产物只需要极少量的机械搅拌和PH控制（有时不需要PH控制）。
实验表明，本发酵过程的成功与否不完全依赖于底物质量，因为我们已用过未过滤的淀粉水解物。
本发明不只限于上述几个特例。可以对这些例子进行各种变动及修改，只要不离开本发明权利要求书中所限定的范围。

Claims (26)

1、一种发酵生产酒精的方法，其特征在于，在发酵培养基中利用运动发酵单胞菌，在单一的发酵培养基中一步把淀粉水解物发酵成酒精。
2、按照权利要求1的方法，其特征在于，运动发酵单胞菌是保藏在ATCC中的一个菌株（保藏号为39676），或是ATCC39676的突变株或变异株。
3、按照权利要求1的方法，其特征在于，运动发酵单胞菌是保藏在ATCC中的一个菌株（保藏号为29191），或是ATCC29191的突发株或变异株。
4、按照权利要求1的方法，其特征在于，运动发酵单胞菌是保藏在ATCC中的一个菌株（保藏号为53431），或是ATCC53431的突变株或变异株。
5、按照权利要求1的方法，其特征在于，运动发酵单胞菌是保藏在ATCC中的一个菌株（保藏号为53432），或是ATCC53432的突变株或变异株。
6、按照权利要求1的方法，其特征在于，其发酵步骤包括：
（1）通过发酵液中的淀粉葡萄糖苷酶的作用，把淀粉糖化成葡萄糖;以及
（2）糖化后，通过加到发酵液中的菌株的作用，从培养液中的葡萄糖生产出酒精。
7、按照权利要求1的方法，其特征在于，通过菌株对加到发酵液中的淀粉水解物混合物的作用，来生产酒精。
8、按照权利要求1到7中任何一项的方法，其特征在于，淀粉或淀粉水解物是从谷物或根类作物中获得的。
9、按照权利要求8中的方法，其特征在于，谷物包括：小麦、大麦、燕麦、黑麦、玉米或小麦属。
10、按照权利要求8中的方法，其特征在于，根类作物包括：木薯或竹芋。
11、按照权利要求7中的方法，其特征在于，该淀粉水解物是化学成分不确定的（或复杂的）淀粉水解产物的混合物，此混合物通过酶促或非酶促方法产生。
12、按照权利要求1到11中任何一项的方法，其特征在于，发酵培养液中葡萄糖浓度的范围在10到30%（重量/体积）。
13、按照权利要求1到12中的任何一项的方法，其特征在于，该发酵培养液包含一种或几种下列成分：蛋白胨（酪蛋白水解物），酵母膏，磷酸二氢钾（或铵，或钠），硫酸铵或氢氧化铵或尿素，硫酸镁或磷酸氢二铵。
14、按照权利要求13的方法，其特征在于，每种组分的浓度范围都在0.01到0.5%（重量/体积）。
15、按照权利要求14的方法，其特征在于，每种组分的浓度范围都在0.2%到0.5%（重量/体积）。
16、按照权利要求13到15中任何一项的方法，其特征在于，酵母膏和蛋白胨可以被泛酸钙和β-丙氨酸代替。
17、按照权利要求13到16中任何一项的方法，其中发酵培养基包含玉米浸浆。
18、按照权利要求17的方法，其中玉米浸浆的浓度范围在2.0到7.5%（重量/体积）。
19、按照权利要求1到18中任何一项的方法，其特征在于，发酵液的PH范围被保持在3.5到7.0。
20、按照权利要求19的方法，其特征在于，PH范围是在3.0到5.0。
21、按照权利要求1到18中任何一项的方法，其特征在于，发酵罐中的温度范围保持在25℃到40℃。
22、按照权利要求21的方法，其特征在于，其温度范围保持在30到35℃。
23、按照权利要求1到22中任何一项的方法，其特征在于，当发酵完成时，运动发酵单胞菌细胞从发酵液中分离出来，酒精也被蒸馏出来。
24、按照权利要求1到23中任何一项的方法，其特征在于，从前一发酵过程的发酵液中取出一部分，做为运动发酵单胞菌的种菌，放入其后的发酵罐中。
25、按照权利要求1到24中的任何一项的方法，从淀粉材料生产的酒精。
26、按照权利要求1到18中的任何一项的方法，在发酵期间不需要控制PH。
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