CN86101780A - 利用运动发酵单胞菌把蔗糖转化成乙醇和其它产品 - Google Patents
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Abstract
利用运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)菌株从以蔗糖为基础的物质中在微好氧条件下以单个阶段发酵法商业性生产乙醇以及果糖和/或山梨醇。已得到运动发酵单胞菌的果糖利用阴性突变株，它能提高发酵效率。
Description
本发明是关于利用运动发酵单胞菌的亲株或其变株在微好气条件下，用一步发酵法把蔗糖、葡萄糖-果糖糖浆混合物转化生成乙醇及与之一起的其他产品的方法。
制糖工业已经成为与由许多主要食品与饮料制造公司接连不断的宣传有关，他们希望用从玉米糖浆，果糖/山梨醇或果糖/葡萄糖（右旋糖）混合物中来的果糖以供应日常的，保健的和糖尿病市场的需要。果糖近乎有二倍蔗糖的甜度，因此在同一甜度水平，只需要一半的供应量，果糖热值低是这个保健养生界中一个重量方面，此外山梨醇和果糖对糖尿病比之于蔗糖是更安全的甜味剂。
把玉米糖浆要转化成果糖是与能量有关的。因为玉米糊首先要被变成葡萄糖，这一步正常是用淀粉酶或葡萄糖糖化酶来完成的。而葡萄糖以后必须用葡萄糖异构酶进一步变成果糖。这个酶法的转化结果成为近50∶50的葡萄糖与果糖的混合物。为要得到较高果糖值，葡萄糖必须用色层分析法去除它，这个方法是很费钱的而且从混合物中仍不能完全除尽葡萄糖。
从蔗糖生产乙醇是大家熟知的，在巴西乙醇是与石油混合以产生“石油醇”（gasohol）或单独地用作卡车燃料。在美国乙醇主要是从玉米中产生，而从蔗糖原料中生产乙醇则比较少，其中乙醇主要是在不加铅的石油中用作辛烷增强剂，有这样辛烷增强剂的混合物称作为“超级不加铅的汽油。
传统的生产乙醇方法是利用酵母菌经过两个阶段成批发酵完成，其中第一阶段包括酵母细胞的好气性增殖称为生长阶段;第二个阶段包括在少氧或缺氧条件下嫌气发酵产生乙醇。为了在乙醇生产的第二阶段能进一步增殖酵母细胞，而需要少量加入空气或氧气。如果要提高整个发酵过程的效率，通过沉淀和离心系统，偶而把酵母细胞再循环使用则加入少量空气和氧气也是需要的。因为酵母发酵恒定地依靠菌体生长和乙醇生产率两个因素的配合，为使乙醇产量高，其培养液中则必补充促进生长的物质或妥善地控制通气条件。
因此，传统的酵母发酵法（阶段2）建立在巨大的接种量上，几乎达每毫升5-10百万个细胞。较适宜的发酵温度是30℃，发酵产生的热量通过利用冷却设备而受到控制。用阶段2批量发酵法得到9-11%（体积/体积）乙醇，发酵时间是30-70小时。通过菌体循环使用以增加接种菌密度到80-100倍时，则发酵时间可减少10小时。
第二个发酵方法是大家所知道的，它是利用运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）细菌（参见欧州专利号0047641-George Weston Lta.）。这个方法也是一个二个阶段发酵法像如上用酵母菌所述那样，但细菌在生长阶段（阶段1）不需要添加空气。替代以增加适量氮气来维持厌气条件。在产生乙醇的第二阶段，糖的浓度决不能超过6%（重量/体积），因而需要分步地添加或流加浓缩的糖液。较适宜的发酵温度是28-33℃。较适宜的PH是5.5。这个方法也需要供给氮气和额外的营养物质。
第三个生产乙醇的方法也已叙述过了，它在二个阶段发酵中利用固定化酵母或固定化发酵单胞菌（Zymomonas）的菌株，每阶段都用限量的糖（即10%重量/体积）。（见英国专利号2055121-Tanabe Sugaku Co.Ltd.）。
对在用酵母发酵的实施例中已知被转化的碳源是蔗糖、葡萄糖、糖蜜和甘蔗汁;而利用发酵单胞菌（Zymomonas）的两个阶段发酵的实施例中碳源限定为葡萄糖;在用固定化细胞发酵中，则限定是葡萄糖和糖蜜。
生产乙醇的二个发酵法已知是利用葡萄糖作为基质，一个是再循环的方法，发酵后生物量（菌体）从啤酒中分离出来，再循环到发酵系统中（见美国专利4，403，034号（Rogers ct al）和澳大利亚专利申请号78199181（unisearch Ltd.）。第二个方法是利用水解淀粉衍生来的葡萄糖连续发酵生产乙醇。所有这二个方法都在30℃与PH5进行发酵。
本发明的目的在于提供一种以蔗糖为基础的物质（例如甘蔗汁或其糖浆。甜菜汁或甜菜糖浆、糖蜜、棕榈糖汁或棕榈糖浆，粗制或精制糖）和/或葡萄糖-果糖混合物（例如高果糖玉米糖浆、人造混合液、高级糖蜜或转化糖溶液）生产乙醇及与之一起的果糖，山梨醇或果糖-山梨醇混合物。
本发明的较好目的是提供这样一种单阶段批量发酵的方法。如果需要，还可以调节这个培养方法，例如批量给养料流加，或多阶段系统，其中放入的能量是低的。
进一步较好的目的是提供一种方法，其中基质的纯度不是使本方法成功的主要因素。
进一步还有一个较好目的是提供一种方法，其中生产乙醇过程能用作能源以维持方法的妥贴进行，而在发酵罐中产生的粘质物是可被除去的，至少是极少的。
进一步还有一个较好目的是产生果糖利用阴性运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）的菌株以适合上述的方法。
本发明其他较好的目的，将从下面的叙述中变得清楚明白。
本发明一个方面在于从蔗糖为基础的物质和/或葡萄糖-果糖混合物中生产乙醇的方法是与果糖和/或山梨醇一起产生的。其发酵的特征在于用微生物运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）以单阶段发酵法，把罐中发酵培养液中含有的以蔗糖为基础的物质，和/或葡萄糖-果糖混合物作为基质在微好气条件下进行发酵。
“单阶段发酵”是指发酵中生长和产生乙醇阶段都在同一发酵罐中发生。发酵开始可用含有运动发酵单胞菌（Zymomonus mobi-lis）种子培养物加到含有发酵培养基的罐中来完成，或把发酵培养基加到含有前批发酵的一部分发酵过的培养基的罐中来完成，该发酵过的培养基含有运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）。
“微好气条件”是指在培养条件不加入气体（氧，空气，氮气等等）到发酵罐中。而发酵培养基暴露于大气中。运动发酵单胞菌在从生长和生产乙醇中不需要空气或氧气（好气的）或氮气（嫌气的），但能忍受发酵培养基表面存在的空气。
用微生物游离形式或固定化形式都可完成发酵。以蔗糖为基础的物质包括甘蔗汁或其糖浆，甜菜汁或其糖浆，糖蜜，棕榈糖汁或其糖浆，粗制或精制糖。葡萄糖和/或果糖混合物包括玉米高果糖浆，人造混合物，高级糖蜜或转化糖溶液。
最好基础培养基要包括酵母浸取物，酪蛋白水介物，硫酸铵或尿素，硫酸镁，磷酸二氢钾，和/或葡萄糖。在这个基础培养基中所有的成分较好是在0.01到0.2%的范围，更好是在0.2%到1%（重量/体积）。最好在近30℃培养一段期间例如2到15小时。果糖与葡萄糖加到培养基中的量，较好的范围在0.5到3%，更好在1到2%（重量/体积）。
微生物运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）一个较好的亲株已经保存在澳大利亚路两州，昆士兰昆士兰大学，微生物系中菌种库中。保存号为VQM2716，1984年4月24日也把菌保存在美国标准菌种库（ATCC），12301，Purklawn，Drive，Rockville，Maryland，20852，USA）中，其保存号为39676，这个菌株是从ATCC运动发酵单胞菌菌株保存号为2919发展来的，它是适合用于本发明第二个较好的亲株，这个亲株也已在英国AB98DG Aberdeed，Abbey路，Torry研究站国家工业细菌保存库保存，保存号为NCIB11199。ATCC39676菌株的扩展，是用恒化器培养技术为增加基质利用即改进它对蔗糖转化特性和转化蔗糖的代谢率得到的，而这些特性是与亲株ATCCNo29191按伯齐氏细菌鉴定手册（第8版）（1975）576-580页提出的分类描述唯一的差异。
二个较好微生物Zymomonas mobilis菌株的果糖利用阴性（Fru-）突变株（E977和E4381）已经保存在澳大利亚昆士兰路西亚州，昆士兰大学微生物系菌种库中，登记号为VQM2841（＝E977）和VQM2864（＝E4381），并也于86年元月17日送往美国Manyland，20852，Rockville，parklawn 12301，标准菌种库保存，保存号为53432（VQM284）和53431（VQM2864）。利用果糖阴性（Fru-）突变株是分别用硫酸甲乙酯（EMS）处理亲株ATCC29191和39676发展得来的。每株在分类上的描述是按与其亲株比较而论的，除了果糖利用阴性的特性外，每株都是一群格兰氏阴性杆蓄。果糖利用阴性菌株产生的方法将在实施例1中提出。
在以蔗糖为基础的基质中蔗糖较好的浓度范围是在10到40%（重量/体积）间，在相应的混合物中，葡萄糖与果糖的浓度范围是在5到20%（重量/体积）间。
最好发酵培养基包含的只是一种或更多的下列成分：蛋白胨（酪蛋白水介物），酵母浸取物，冷酸钙，磷酸二氢钾，硫酸铵，尿素以及硫酸镁。最好所提供的成分，每个浓度范围在0.01到0.5%间，最好选择在近0.2%。
发酵过程中维持的PH最好的范围是在4.0到7.0，起始的PH较好是放在6.5到7.0范围，当发酵进行，PH下降然后例如在1-2小时以后，PH可以维持在5.0到6.2。PH的范围也可以用添加Na-oH或其他合适的碱性物质进行控制。
较可取的温度是维持在34℃到40℃的范围，温度范围看来似乎会使产生最好的生长与最好的产物产量，并使在发酵罐中减少或显著地降低粘液的产生。
最好在发酵已经完成时，微生物就从发酵产品中分开，乙醇被蒸馏走，而产物被浓缩或使结晶化。
本发明第二个方面在于产生是微生物运动发酵单胞菌的果糖利用阴性突变株，它包括运动发酵单胞菌的果糖利用阴性突变株的方法。
本发明第三个方面在于产生运动发酵单胞菌的果糖利用阴性突变株的方法包含的步骤为：
在基础培养基生长运动发酵单胞菌以形成第一代细胞培养物。
加硫酸甲乙酯和/或亚硝基胍到第一代的细胞培养物中并培养这个混合物。
从第一代细胞培养物中移走细胞，在基础培养液中悬浮细胞，并培养这个混合物以产生第二代细胞培养物。
从第二代细胞培养物中收集细胞，把这些细胞悬浮在基础培养基中，以产生第三代细胞培养物;和
把在基础培养基中的第三代细胞培养物连同葡萄糖和/或果糖用倒培养皿方法而得到运动发酵单胞菌的果糖利用阴性株。
最好，至少把一部分第二代细胞培养物与基础培养液混合连同果糖与青霉素一起，并培养这个混合物以形成新的细胞培养物，它是收集以后再悬浮于基础培养基上以产生第三代细胞培养物的细胞培养物。
本发明的第四个方面在于运动发酵单胞菌的果糖利用阴性菌株是用上述方法产生的。
为使充分了解本发明，现在叙述发明的一些较好实施例，在所有实施例中百分率表示为“%（重量/体积），此处的1%相当于10克/1升。
实施例1：果糖利用阴性（Fru-）突变株的产生。
下述的操作步骤是用于获得运动发酵单胞菌亲株ATCC 29191和ATCC，39676的果糖利用阴性株（例如运动发酵单胞菌的突变株E977和E4381）：
把亲株生长于含有0.2%（重量/体积）酵母浸取物，0.2%（重量/体积）酪蛋白的水解物，0.2%（重量/体积）硫酸铵，0.2%（重量/体积）MgSO4·7H2O，0.2%（重量/体积）KH2pO4以及1%（重量/体积）葡萄糖，生长近109cfu/毫升此处Cfu代表菌落形成单位。在这样的培养物中，直接加入各种体积（0.1到0.5毫升）的硫酸甲乙酯（EMS）和各种量的（60到100毫克）的亚硝基胍（NTC）。混合物在30℃培养2个小时，经过离心用上述基础培养液洗涤这个细胞并再悬浮于10毫升上述培养基中，经过在30℃18小时培养后，取2毫升培养物转移到10毫升含有2%（重量/体积）和1000单位/毫升，青霉素G的上述培养基中，在30℃再经过5小时培养，收集细胞并再悬浮于上述培养基中并在30℃保留过夜。在含有1%（重量/体积）葡萄糖的上述培养基的平面培养上得到存活的菌落。分离到的菌落再在含葡萄糖1%（重量/体积）或果糖1%（重量/体积）的相同培养基上进行比较。菌株果糖利用阴性的行为就可以用含1%和10%（重量/体积）果糖的上述培养基中大量接种得到确证。如果培养7天后，没有生长发生，则果糖利用阴性突变体就被得到。（突变体E977，青霉素这一步可以省去）。
亲株ATCC 39676和ATCC 29191能生长在含1%（重量/体积）和10%（重量/体积）蔗糖，18%（重量/体积）和1%（重量/体积）葡萄糖，1%（重量/体积）和10%（重量/体积）的果糖中，但它们的突变衍生株E4381和E977能生长于1%（重量/体积）和10%（重量/体积）蔗糖，1%（重量/体积）和10%（重量/体积）葡萄糖，而不能在1%（重量/体积）或10%（重量/体积）的果糖中生长。
蔗糖发酵的初步比较研究是用Fru-突变株和其亲株完成的。用125毫升瓶子和含10%（重量/体积）蔗糖的几倍量培养基（Xmedium），用生长在葡萄糖上的种子培养物接种并在37℃静止培养48小时。在培养结束时15分钟取样离心和分析。
结果表明变株能积累到100%理论上得到的果糖，而现在这个变株表现的最低果糖积累量少于理论值18%，而突变株所产生的乙醇为34到36%（重量/体积）但亲株产生量为66%到71%（重量/体积）
实施例2：
用Fru-突变株发酵（生长与产生阶段）
含有192克/升（重量/体积）的蔗糖的2500毫升蔗糖溶液转移到开口的3.5升发酵罐中，如果需要，天菌地加入含有任一种或更多的蛋白胨，酵母浸取物，磷酸二氢钾，硫酸铵或尿素，以及硫酸镁的200毫升培养基，其中每一个成分为0.2%或少一些的浓度，而蛋白胨和酵母浸取物能用0.5%（重量/体积）的泛酸钙代替，总培养基能用含甘蔗糖浆的，甜菜糖浆或加添加一部分糖蜜的2700毫升蔗糖液代替。
生长于含有10%（重量/体积）蔗糖，0.2%（重量/体积）酵母浸取物，0.2%（重量/体积）酪蛋白水介物，（蛋白胨），0.2%（重量/体积）磷酸二氢钾，0.2%（重量/体积）含结晶水的硫酸镁，0.2%（重量/体积）硫酸铵，在37℃生长12到24小时的果糖利用阴性突变株的种子培养物300ml加入到发酵罐中，培养基的起始PH调到7.0，经过第一个1到2小时，PH下降到6.0，因而用添加2摩尔氢氧化钠（80克/升）维持PH在6.0，在温度35℃和搅拌速度50转/分下完成培养。
24小时以后发生最大的蔗糖转化生成乙醇浓度为46.7克/升或4.7%（重量/体积），果糖浓度为828克/升（重量/体积）山梨醇浓度为15.7克/升（重量/体积）。
实施例3：
用Fru-突变株发酵（生长与生产阶段）
把含有217.1克/升（重量/体积）蔗糖的2500毫升的蔗糖溶液转移到开口的3.5升发酵罐中，如果需要，把200毫升培养基无菌地加入其中，该培养基含有任何一种或多种的蛋白胨，酵母浸取物，磷酸二氢钾，硫酸铵或尿素，硫酸镁，其每种成分浓度为0.2%或少一些，而其中的蛋白胨和酵母浸取物可用泛酸钙代替，总培养基也能用含甘蔗糖浆，甜菜糖浆或添加一部分糖蜜的2700毫升蔗糖液代替。
把300毫升在37℃培养12到24小时的果糖利用阴性突变株（E977或E4381）的种子培养物加到发酵罐中，这些种子培养物生长在含10%（重量/体积）蔗糖，0.2%（重量/体积）酵母浸取液，0.2%（重量/体积）酪蛋白水介物（蛋白胨），0.2%（重量/体积）磷酸二氢钾，0.2%（重量/体积）含结晶小的硫酸镁，0.2%（重量/体积）硫酸铵。开始的PH调到7.0，在发酵中用添加2摩尔氢氧化钠（80克/升）维持PH在6.0，在35℃和搅拌速度50转/分的条件下完成培养。
24小时后，使蔗糖最大转化生成乙醇浓度为51.7克/升（重量/体积），果糖浓度为109.7克/升（重量/体积），和山梨醇浓度为4.1克/升（重量/体积）。
实施例4：
用Fru-突变株发酵（生长和生产阶段）
含390克/升（重量/体积）蔗糖的2500毫升蔗糖溶液转移到3.5升发酵罐中，如果需要，可将200毫升培养基无菌地加入其中该培养基含有一种或多种的蛋白胨（酪蛋白水介物）酵母浸取物，磷酸二氢钾，硫酸铵或尿素含结晶水的硫酸镁，而每个成分浓度为0.2%（重量/体积），其中蛋白胨和酵母浸取物能用0.5%（重量/体积）泛酸钙代替，或其总培养基能够用2700毫升含甘蔗糖浆，甜菜糖浆，或添加一部分糖蜜的蔗糖液代替。
取300毫升的果糖利用阴性突变株（E977或E4381）生长于含10%（重量/体积）酪蛋白水介物（蛋白胨），0.2%（重量/体积），磷酸二氢钾，0.2%（重量/体积）含结晶水的硫酸镁，0.2%（重量/体积）硫酸铵，在37℃培养12到24小时的种子培养物加到发酵罐中。开始的PH调到7.0，然后用添加2摩尔氢氧化钠（80克/升）维持PH在6.0，在35℃和搅拌转速50转/分完成培养。
31小时后，到最高的蔗糖转化生成乙醇浓度为69.4克/升（重量/体积），果糖浓度为171.1克/升（重量/体积）和山梨醇浓度为34.5克/升（重量/浓度）。
实施例5：用亲株ATCC 39676发酵
（生长和生产阶段）
含400克/升蔗糖的1500毫升蔗糖溶液，转移到2升发酵罐中，如果需要，把300毫升培养基无菌地加入其中，该培养基含有任何一种或多种的蛋白胨，酵母浸取物，磷酸二氢钾，硫酸铵或尿素，硫酸镁，其每种成分浓度为0.2%（重量/体积），而蛋白胨和酵母浸取物能被0.5%（重量/体积）的冷酸钙代替。
把200毫升的运动发酵单胞菌（ATCC39676）生长在含10%（重量/体积）蔗糖，0.2%（重量/体积）酵母提取物，0.2%（重量/体积）酪蛋白水介物（蛋白胨）0.2%（重量/体积）磷酸二氢钾，0.2%（重量/体积）含结晶水的硫酸镁以及0.2%（重量/体积）硫酸铵的培养基中在35℃或37℃培养12到24小时的种子培养物加到发酵罐中。开始的PH调到6.5，然后用添加2摩尔氢氧化钠（80克/升）维持PH在5.5，在35℃和以搅拌速度100转/分下完成培养。
72小时以后，使达蔗糖最大的转化生成乙醇浓度为86克/升（重量/体积）和果糖浓度为50克/升（重量/体积）。
实施例6：用亲株ATCC 39676发酵
（生长和生产阶段）
含400克/升（重量/体积）蔗糖的85升蔗糖溶液，转移到100升中试发酵罐中。如果需要，把5升培养基无菌地加入基中，此培养基含有任何一种或更多的，蛋白胨（酪蛋的水介物），酵母提供取物，磷酸二氢钾，硫酸铵或尿素，和含结晶水的硫酸镁，以及每种成分浓度为0.2%（重量/体积），而蛋白胨和酵母提取物能用0.5%泛酸钙代替，或总的培养基能用含有甘蔗糖浆、甜菜糖浆或添加一部分糖蜜的90升蔗糖液代替。
把10升的运动发酵单胞菌（ATCC 39676）在含有10%（重量/体积）蔗糖，0.2%（重量/体积）酵母提取物，0.2%（重量/体积）酪蛋白水介物（蛋白胨），0.2%磷酸二氢钾，0.2%（重量/体积）含结晶水的硫酸镁，0.2%（重量/体积）硫酸铵或尿素的培养基上生长在38℃经12到24小时的种子培养物加入到发酵罐中。开始的PH调到6.5，然后用添加2摩尔（80克/升）的氢氧化钠维持PH在6.2，在温度35℃和搅拌速度280转/分下完成培养。
72小时以后，最大蔗糖转化便产生乙醇浓度为75克/升（重量/体积），山梨醇浓度为23.5克/升（重量/体积）和果糖浓度88克/升（重量/体积）。
实施例7：用亲株ATCC 39676发酵
（生长和生产阶段）
把含有400克/升（重量/体积）蔗糖的蔗糖溶液2500毫升转移到3.5升的发酵罐中，如果需要，就加入200毫升培养基无菌地加入其中，该培养基含有任何一种或更多的蛋白胨，（酪蛋白水介物）酵母浸取物，磷酸二氢钾，含水硫酸镁，硫酸铵或尿素，每个成分浓度为0.2%（重量/体积），而蛋白胨和酵母提取液能用0.5%（重量/体积）冷酸钙代替，或总培养基能够用2700毫升含甘蔗糖浆，甜菜糖浆或添加一部分糖蜜的蔗糖液代替。
300毫升的运动发酵单胞菌生长在含有10%（重量/体积）蔗糖，0.2%（重量/体积）酵母浸提物，0.2%（重量/体积）酪蛋白水介物（蛋白胨），0.2%（重量/体积），磷酸二氢钾，0.2%（重量/体积）含结晶水的硫酸镁0.2%（重量/体积）硫酸铵培养基中在37℃培养12到24小时的种子培养物加入到发酵罐中。开始的PH调到7.0，以后用添加2摩尔（80克/升）的氢氧化钠维持PH在6.0，在温度35℃和搅拌80转/分的速率下完成培养。
在72小时后，使到蔗糖最大转化生成乙醇浓度为132克/升（重量/体积），和果糖浓度为104克/升（重量/体积）。
实施例8：用Fru-突变株对葡萄糖-果糖混合物的发酵
（生长和生产阶段）
含102克/升葡萄糖和105克/升果糖的2500毫升的溶液转移到3.5升发酵罐中，如果需要，可以无菌地加入200毫升培养基，其中含有任一种或多种的蛋白胨（酪蛋白水介物）酵母浸取物，磷酸二氢钾，含结晶水的硫酸镁，硫酸铵或尿素，其每种成分的浓度为0.2%（重量/体积），而蛋白胨和酵母浸取物能用0.5%（重量/体积）泛酸钙代替。
把300毫升的果糖利用阴性突变株（E977或E4381）在含10%（重量/体积）蔗糖，0.2%（重量/体积）酵母浸取物，0.2%（重量/体积）酪蛋白水介物（蛋白胨），0.2%（重量/体积）磷酸二氢钾，0.2%（重量/体积）含结晶水的硫酸镁，0.2%（重量/体积）硫酸铵的培养基上生长12到24小时的种子培养物加到发酵罐中，开始的PH调到7.0，然后用添加2摩尔（80克/升）的氢氧化钠维持PH在6.0或5.5，在温度35℃和搅拌速率在86转/分完成培养。
在28小时以后，使到最大转化生成乙醇浓度为42.2克/升（重量/体积），果糖温度在70克/升和山梨醇浓度为31.1克/升（重量/体积）。
试验已经用很多含葡萄糖和果糖在50到200克/升（重量/体积）范围内的葡萄糖-果糖混合液实现;用实施例8的种子培养物在相同的条件下，已达到相同的乙醇，果糖和山梨醇的浓度。
试验也已用发酵培养基加到含有近10%（重量/体积）前批发酵过的，含运动发酵单胞菌的发酵液的发酵罐中实现。发酵过的培养基在4000转/分离心10分钟，然后分别加入实施例2到4的发酵培养基中，此处发酵过的培养基含有果糖利用阴性（Fru-）突变株。前述的发酵培养基也可加到实施例5和6的发酵培养基中，此发酵培养基含亲株ATCC 39676。实施例的pH和温度条件，按照实施例中所说进行，在所有产生发酵的情况里都得到对应于每个实施例各所叙述的结果。
应用前批发酵的发酵过培养液作为运动发酵单胞菌的接种物的发酵方法已进行几次重复都达到一致的结果。可以看到在发酵培养基中运动发酵单胞菌细胞生长很快，当含有发酵过的培养基的发酵罐中加入新鲜的发酵培养基开始生长阶段以后，生长阶段与生产阶段同时产生。
在实施例5，6，和7中亲株ATCC 39676可以用其他菌株，包括第二亲株ATCC 29191代替，但得到最好的结果是用ATCC 39676。
生产的乙醇有商业价值可以作汽油的成分或在无铅的石油中作辛烷助爆物或作为化学工业的低级产品，二氧化碳也可以作干冰用或作藻类生物量生长的碳源，果糖、山梨醇和甘露醇是高营养价值的甜味剂，在饮食业中，保健食品中，糖尿病食品例如饮食料中，糖果的或其他有关的工业中，有不同的商业价值。
发酵过程里只需要放入低能量，因为微生物在发酵中能产生相当的热量，此外发酵是在微好气的条件下完成的，因而省去了空气和另外气体（和附属装置）的供应，发酵的成分与产物需要很少机械搅拌和PH控制。
在用蔗糖情况里，试验已经表明，发酵法的成功不完全取决于基质的质地，用甘蔗汁和甘蔗糖浆初步试验说明此发酵法特别适合于工业应用和能被提供应用的发酵罐邻近糖厂，从而降低运费成本。由于甘蔗汁不一定消毒，所以投入的能量要得很低。
在葡萄糖-果糖混合物的情况里试验已经表明二种糖的比率起很大的作用，较好的是葡萄糖-果糖混合液在葡萄糖∶果糖在1∶4到4∶1范围内。很清楚，方法是可应用到转化糖溶液的发酵，因为这个溶液包含的是50%葡萄糖和50%果糖的混合液（即比率为1∶1），它是从用水解蔗糖得来的，转化糖是从96%甘蔗糖溶液，用商业上转化方法制备的。这就说明这个发酵方法特别适用于工业应用。尤其当能被提供使用的发酵罐邻近产生这些混合物的果糖玉米糖浆或糖异构化车间以降低运费成本。
对技术熟练的接受者对所叙述的实施例作各种变动与修改而不离开本发明在附属的权利要求书中所限定的范围，是很清楚的。
Claims (28)
1、一个从以蔗糖为基础的物质和/或葡萄糖-果糖混合液中生产乙醇与生产果糖和/或山梨醇一起的方法，其发酵特征在于用微生物运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)以单阶段在微好气条件下发酵以蔗糖为基础的混合物和/或葡萄糖-果糖混合物，其中蔗糖为基础的物质和/或葡萄糖混合液是含在发酵培养基中用作发酵基质。
2、按照权利要求1的方法特征在于运动发酵单胞菌是保存于美国标准菌种库（ATCC）的菌株，其保存号为39676或39676一个突变株或39676的变异株。
3、按照权利要求2的方法特征在于突变株是一个果糖利用阴性突变株，其在美国标准菌种库（ATCC）保存基保存号为53431或一个ATCC 53431的果糖利用阴性突变株或ATCC 53431的变异株。
4、按照权利要求1的方法特征在于运动发酵单胞菌是一个菌株保存于美国标准菌种库（ATCC）其保存号为2919或ATCC29191的突变株或其变异株。
5、按照权利要求4的方法，特征在于突变株是一个果糖利用阴性突变株，在美国标准菌种库（ATCC）保存，保存号为53432或ATCC 53432的果糖利用阴性突变株或其变异株。
6、按照权利要求1到5任何一个方法，特征在于蔗糖为基础的物质包含粗制糖，精制糖，甘蔗汁，或其糖浆，甜菜汁或其糖浆，棕榈汁或其糖浆或两个联合一起或这些中更多的联合一起。
7、按照权利要求6的方法特征在于蔗糖浓度在以蔗糖为基础的物质中在5到20%（重量/体积）的范围内。
8、按照权利要求1到5的任何一个方法，特征在于葡萄糖-果糖混合液包含高果糖的玉米糖浆，人造葡萄糖-果糖混合液，高级的糖浆或转化糖溶液或二个联合一起或这些中更多联合一起。
9、按照权利要求8的方法，特征在于在葡萄糖-果糖混合液中，葡萄糖和果糖二者的浓度是在5-20%（重量/体积）的范围内。
10、按照权利要求1到9的任何一个方法，特征在于发酵培养基含有一种或更多的下列成分：蛋白胨，酵母浸取物，磷酸二氢钾，硫酸铵或尿素，硫酸镁，每种成分的浓度在0.01到0.5%（重量/体积）的范围内。
11、按照权利要求10的方法特征在于每个成分的浓度是0.2%（重量/体积）。
12、按照权利要求1到11的任何一项方法特征在于发酵培养基的PH维持在4.0到7.0的范围。
13、按照权利要求12的方法，特征在于PH开始是在6.5到7.0的范围，当发酵开始让其下降然后维持在5.0到6.2的范围。
14、按照权利要求1到13的任何一种方法特征在于在发酵罐的温度维持在34℃到40℃的范围内。
15、按照权利要求14的方法特征在于温度维持在35℃。
16、按照权利要求1到15任何一种方法特征在于当发酵完成时，微生物运动发酵单胞菌从发酵培养基中分开，并把乙醇蒸馏走。
17、按照权利要求1的方法特征在于运动发酵单胞菌包括在发酵培养基中的运动发酵单胞菌细胞悬浮液。
18、按照权利要求1的方法特征在于把从前批发酵的一部分发酵过的培养基加到发酵罐中，作为继续发酵的运动发酵单胞菌细菌细胞
19、用按照权利要求1到18的任何一种方法从蔗糖为基础的物质中生产乙醇和果糖和/或山梨醇。
20、用按照权利要求1到18的任何一种方法从葡萄糖-果糖混合液中生乙醇和果糖和/或山梨醇。
21、生成微生物运动发酵单胞菌果糖利用阴性突变株的方法包括从运动发酵单胞菌的果糖利用阳性菌株突变形成运动发酵单胞菌的果糖利用阴性株。
22、微生物运动发酵单胞菌的果糖利用阴性突变株生成的方法，其特征在于通过下列步骤：
在基础培养基上生长运动发酵单胞菌以形成第一代细胞培养物;
加硫酸甲乙酯和/或亚硝基胍到第一代细胞培养物中并培养这个混合物;
从第一代细胞培养物中转移细胞，并在基础培养基中悬浮并培养这个悬浮混合物以产生第二代细胞培养物;
从第二代细胞培养物中收获细胞并把细胞悬浮在基础培养基中以产生第三代细胞培养物;和
用把第三代细胞培养物放在基础培养基与葡萄糖和/或果糖一块倒入平皿的方法，得到运动发酵单胞菌的果糖利用阴性细胞。
23、按照权利要求22的方法特征在于在第二代细胞培养物发生后，至少有一部分第二代细胞培养物与基础培养基连同果糖和青霉素混合一起，这个混合物经培养形成新的细胞培养物，从这个细胞培养物收得的细胞在基本培养基中悬浮以发生第三代细胞培养物。
24、按照权利要求22的方法其特征在于基础培养基中运动发酵单胞菌菌株是在ATCC中保存。保存号为39676。
25、按照权利要求22的方法特征在于基础培养基中的运动发酵单胞菌菌株是在ATCC中保存。保存号为29191。
26、运动发酵单胞菌的果糖利用阴性突变株是用权利要求22的方法产生的。
27、运动发酵单胞菌一个菌株在美国标准菌库（ATCC）保存。保存号是53431。
28、运动发酵单胞菌的另一个菌株也在美国标准菌种库（ATCC）中保存。保存号为53432
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| CN102071224B (zh) * | 2009-11-25 | 2013-09-11 | 华东理工大学 | 一种生产山梨醇和葡萄糖酸盐的方法 |
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Also Published As
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