KR101702931B1 - 푸르푸랄에 고내성을 갖는 균주의 분리방법 및 이에 의해 분리된 균주 - Google Patents

푸르푸랄에 고내성을 갖는 균주의 분리방법 및 이에 의해 분리된 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 푸르푸랄에 고내성을 갖는 균주의 분리방법 및 이에 의해 분리된 균주에 관한 것으로 (A) 토양과 등장액을 혼합한 후 토양 상등액을 회수하는 단계; (B) 토양 상등액을 희석하여 카르복시메틸 셀룰로오스를 영양원으로 하는 배지에서 도말하는 단계; 및 (C) 희석된 토양 상등액이 도말된 배지를 배양하여 생장된 균주를 분리하는 단계;를 포함함으로써 푸르푸랄에 고내성을 갖는 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주[기탁번호 KCTC 12672BP]를 분리할 수 있다.

Description

푸르푸랄에 고내성을 갖는 균주의 분리방법 및 이에 의해 분리된 균주{Method for selection of strain having furfural resistant and strain produced by the same}
본 발명은 당화액 내의 독성물질인 푸르푸랄에 고내성을 갖는 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주를 분리할 수 있는 방법 및 이에 의해 분리된 균주에 관한 것이다.
이산화탄소에 의한 지구 온난화와 석유 자원의 고갈로 인하여 석유를 대체할 수 있는 에너지 자원에 대한 관심이 증가하고 있다. 이중에서 바이오에너지는 이산화탄소를 발생하지 않는 탄소중립적(carbon neutral)인 에너지인 동시에 기존 석유화학산업을 대체할 만한 자원으로 주목받고 있다.
상기 바이오에너지를 생산하기 위하여 1세대 바이오매스인 옥수수나 사탕수수를 이용하게 되면 식량자원을 에너지 자원으로 이용하게 되는 치명적인 단점이 발생하므로, 2세대인 목질계 비식용 바이오매스 자원을 이용하는 연구가 활발하게 진행되고 있다.
상기 목질계 바이오매스는 셀룰로오스(cellulose), 헤미셀룰로오스(hemicellulose), 리그닌(lignin) 등으로 구성되며 미생물의 당화 및 발효 과정을 거쳐 연료나 플라스틱과 같은 화학물질로 이용이 가능하다.
미생물이 상기 목질계 바이오매스를 이용하기 위해서는 전처리 과정을 거치게 되는데 고온, 고압 또는 산을 이용하는 전처리 과정을 거치게 되면 미생물이 쉽게 이용이 가능한 포도당(glucose)이나 목당(xylose) 등의 당 뿐만 아니라 전처리 당화과정 중에 불가피하게 만들어지는 여러 가지 부산물들도 함께 존재하게 된다.
상기 전처리 당화과정 중에 만들어지는 부산물로는 푸르푸랄(furfural), 히드록시메틸푸르푸랄(hydroxymethylfurfural, HMF), 아세트산(acetic acid) 등이 있는데 이들은 미생물에 대한 독성을 갖고 있어 당화액을 이용한 발효과정에서 생산성을 떨어뜨리게 된다.
목당(xylose)으로부터 만들어지는 푸르푸랄(furfural)은 당화액에 있는 중요한 미생물 발효 저해물질 중 하나로서, 당화액의 독성이 푸르푸랄(furfural)의 농도와 상당한 관련성을 갖는다. 상기 푸르푸랄은 세포내에서 상대적으로 푸르푸랄보다 독성이 덜한 푸르푸릴 알코올(furfuryl alcohol)로 전환되는데 이 과정에서 NADH 또는 NADPH를 사용하게 된다. 이 때문에 세포내 NAD(P)H 양의 불균형이 일어나 세포생장 및 발효를 저해하게 되는 것이 알려져 있다.
이 외에도 푸르푸랄은 유전자변이를 일으키거나 세포막을 약하게 만들고, 당화액 내의 다른 물질들(히드록시메틸푸르푸랄, 아세트산 등)과 상호작용해 독성이 더 심해진다고 알려져 있다.
따라서, 당화액 내의 독성물질, 특히 푸르푸랄에 내성을 갖는 균주 및 이를 분리하는 방법이 요구되고 있다.
대한민국 등록특허 제1165733호 미국 공개특허 제2008/0090283호
Applied and environmental microbiology, 77(15), 5132-5140 Journal of bioscience and bioengineering, 113(4), 451-455
본 발명의 목적은 당화액 내의 독성물질인 푸르푸랄에 고내성을 갖는 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주를 분리할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 분리된 푸르푸랄에 고내성을 갖는 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주[기탁번호 KCTC 12672BP]를 이용하여 바이오에너지를 생산하는 방법을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 푸르푸랄에 고내성을 갖는 균주의 분리방법은 (A) 토양과 등장액을 혼합한 후 토양 상등액을 회수하는 단계; (B) 상기 토양 상등액을 희석하여 카르복시메틸 셀룰로오스를 영양원으로 하는 배지에 도말하는 단계; 및 (C) 상기 희석된 토양 상등액이 도말된 배지를 배양하여 생장된 균주를 분리하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 푸르푸랄에 고내성을 갖는 균주는 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주[기탁번호 KCTC 12672BP]이다.
상기 카르복시메틸 셀룰로오스를 영양원으로 하는 배지는 카르복시메틸 셀룰로오스를 3 내지 10 중량%로 함유한 것일 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주[기탁번호 KCTC 12672BP]는 푸르푸랄에 내성을 가질 수 있다.
상기 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주[기탁번호 KCTC 12672BP]는 푸르푸랄에 대하여 IC50 값이 45 내지 55 mM이다.
상기 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주[기탁번호 KCTC 12672BP]는 카르복시메틸 셀룰로오스를 영양원으로 하는 배지에서 생육할 수 있다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 바이오에너지를 생산하는 방법은 목질계 당화액을 탄소원으로 하는 발효배지에 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주[기탁번호 KCTC 12672BP]를 접종하고 발효시키는 공정을 포함할 수 있다.
상기 목질계 당화액은 목질계 바이오매스를 물리적 또는 화학적으로 전처리하여 얻어진 것일 수 있다.
본 발명의 푸르푸랄에 고내성을 갖는 균주는 기탁번호 KCTC 12672BP인 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주로서, 목질계 당화액에 함유되어 있는 독성물질인 푸르푸랄에 고내성을 가지며 푸르푸랄을 독성이 덜한 푸르푸릴 알코올로 전환시키면서 푸르푸랄을 80% 이상 제거할 수 있다.
또한, 본 발명의 푸르푸랄에 고내성을 갖는 균주는 목질계 당화액을 발효시켜 바이오연료 및 플라스틱과 같은 화합물질 뿐만 아니라, 젖산, 숙신산, MSG(L-글루탐산일나트륨) 등의 대사물질을 생산하기 위하여 당화액 내의 독성물질에 의한 생장저해 및 생산성 감소를 줄이거나 제거하여 효율적인 미생물 발효에 도움을 줄 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주를 광학 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 2A는 푸르푸랄이 첨가되지 않은 배지에서의 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주, 대장균(E. coli) 및 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 성장을 나타낸 사진이다.
도 2B는 푸르푸랄이 첨가된 배지에서의 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주, 대장균(E. coli) 및 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 성장을 나타낸 사진이다.
도 3은 푸르푸랄의 농도에 따른 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주의 생장저해정도를 나타낸 그래프이다.
도 4A는 푸르푸랄이 20 mM이 첨가된 배지에서 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주의 성장에 따른 배양액 내의 푸르푸랄 및 푸르푸릴 알코올의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 4B는 푸르푸랄이 40 mM이 첨가된 배지에서 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주의 성장에 따른 배양액 내의 푸르푸랄 및 푸르푸릴 알코올의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 4C는 푸르푸랄이 60 mM이 첨가된 배지에서 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주의 성장에 따른 배양액 내의 푸르푸랄 및 푸르푸릴 알코올의 농도를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 푸르푸랄에 고내성을 갖는 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주[기탁번호 KCTC 12672BP]를 분리할 수 있는 방법 및 이에 의해 분리된 균주에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 푸르푸랄에 고내성을 갖는 균주의 분리방법은 (A) 토양과 등장액을 혼합한 후 토양 상등액을 회수하는 단계; (B) 상기 토양 상등액을 희석하여 카르복시메틸 셀룰로오스를 영양원으로 하는 배지에서 도말하는 단계; 및 (C) 상기 희석된 토양 상등액이 도말된 배지를 배양하여 생장된 균주를 분리하는 단계;를 포함한다.
먼저, 상기 (A)단계에서는 채취한 토양과 등장액(토양과의 등장액)을 1 : 80 내지 150의 중량비로 혼합하여 교반한 후 토양 상등액을 회수한다.
상기 등장액은 0.5 내지 1.0 중량%, 바람직하게는 0.85 중량%의 NaCl용액으로서, 토양 내부에 함유되어 있는 균주의 정상상태를 유지하도록 한다.
다음으로, 상기 (B)단계에서는 상기 회수된 토양 상등액을 희석액으로 5 내지 10배 희석한 후 카르복시메틸 셀룰로오스를 영양원으로 하는 고체배지에 도말(spreading)한다.
상기 희석액은 0.5 내지 1.0 중량%, 바람직하게는 0.85 중량%의 NaCl용액이다.
상기 회수된 토양 상등액을 고체배지, 액체배지 등의 배지에 도말하여 콜로니를 얻을 수 있지만 푸르푸랄에 고내성을 갖는 본 발명의 균주를 다량 얻기 위해서는 고체배지에 스프레딩(spreading) 방식으로 도말하는 것이 바람직하다.
본 발명에 이용되는 고체배지는 카르복시메틸 셀룰로오스를 영양원으로 하는 배지로서, 구체적으로 3 내지 10 중량%의 카르복시메틸 셀룰로오스, 0.1 내지 1 중량%의 염화암모늄(NH4Cl), 0.1 내지 1 중량%의 염화마그네슘(MgCl2), 0.1 내지 1 중량%의 염화칼슘(CaCl2), 0.1 내지 1 중량%의 인산칼륨(KH2PO4), 0.2 내지 1.5 중량%의 효모 추출물 및 잔량의 증류수를 포함하는 고체배지 조성물 100 중량부에 대하여 건조분말한천 1 내지 5 중량부를 혼합하여 가압멸균한 후 가압멸균된 액체를 플라스틱 페트리디쉬에 분주하고 응고시켜 제조된 것이다.
다음으로, 상기 (C)단계에서는 상기 희석된 토양 상등액이 도말된 고체배지를 25 내지 35 ℃에서 2 내지 5일 동안 배양하여 푸르푸랄에 고내성을 갖는 균주를 얻는다.
상기 푸르푸랄에 고내성을 갖는 균주는 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주[기탁번호 KCTC 12672BP]이다.
상기 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주[기탁번호 KCTC 12672BP]는 독성물질, 예컨대 푸르푸랄에 대하여 IC50 값이 45 내지 55 mM, 바람직하게는 47 내지 50 mM이다. 상기 IC50(half maximal inhibitory concentration)은 미생물의 최대성장의 50% 저해하는데 필요한 독성 물질의 농도, 즉 IC50의 값이 높을수록 높은 농도의 독성에서도 성장이 우수함을 의미한다.
상기 푸르푸랄은 그의 독성 때문에 발효공정에서 낮은 생산성을 보이이므로 발효공정에 적용하기 위해서는 상기 독성물질을 제거하는 과정이 필요하다. 그러나, 본 발명의 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주[기탁번호 KCTC 12672BP]는 푸르푸랄에 대한 내성이 강하므로 별도의 독성물질 제거공정 없이 바로 발효공정에 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주[기탁번호 KCTC 12672BP]를 이용하여 바이오에너지를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바이오에너지를 생산하는 방법은 목질계 당화액을 탄소원으로 하는 발효배지에 상기 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주[기탁번호 KCTC 12672BP] 단독, 또는 상기 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주를 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) 또는 싸카로마이세스 쎄레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 등의 다른 균주와 혼합하여 접종한 후 이를 발효시켜 바이오에너지를 얻을 수 있다. 이때 바이오에너지인 바이오연료 및 플라스틱과 같은 화합물질뿐만 아니라, 이외에 젖산, 숙신산, MSG(L-글루탐산일나트륨) 등의 대사물질도 생산할 수 있다.
구체적으로, 상기 발효배지는 목질계 당화액 100 중량부에 대하여 효모 추출물 0.1 내지 5 중량부, 황산마그네슘 0.01 내지 1 중량부, 황산망간 0.01 내지 1 중량부, 황산철 0.01 내지 1 중량부, 염화나트륨 0.01 내지 1 중량부를 첨가한 후 120 내지 130 ℃에서 5 내지 30분 동안 고압 멸균한다.
회분식 배양(batch culture)은 시료병(serum bottle)에 상기 배지를 넣고 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주[기탁번호 KCTC 12672BP] 및 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)을 접종한 후 진탕 배양기에서 35 내지 40 ℃의 온도 및 150 내지 300 rpm의 회전 속도로 40 내지 60시간 배양하여 바이오에너지를 얻는다.
상기 목질계 당화액은 통상의 방법으로 목질계를 당화시켜 얻은 당화액이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
제조예 1. 고체배지의 제조
카르복시메틸 셀룰로오스 5 중량%, 염화암모늄(NH4Cl) 0.3 중량%, 염화마그네슘(MgCl2) 0.3 중량%, 염화칼슘(CaCl2) 0.3 중량%, 인산칼륨(KH2PO4) 0.3 중량%, 효모 추출물 0.5 중량% 및 잔량의 증류수를 포함하는 고체배지 조성물 100 중량부에 대하여 건조분말한천 1.5 중량부를 혼합하여 121 ℃에서 15분 동안 가압멸균한 후 상기 가압멸균된 액체를 플라스틱 페트리디쉬에 20 ml씩 분주하고 응고시켜 제조하였다.
실시예 1. 엔테로박터 클로아케( Enterobacter cloacae ) GGTO36균주[기탁번호 KCTC 12672BP]의 분리
서울의 관악산 인근에서 채취한 토양 0.1g을 등장액(0.85 중량% NaCl용액) 10 mL에 첨가하여 교반한 후 토양 상등액을 회수하고, 상기 토양 상등액을 증류수로 5배 희석하여 제조예 1에서 제조된 고체배지에 스프레딩하여 30 ℃에서 3일 동안 배양하였다. 상기 고체배지에서 생장된 콜로니(집락)를 분리한 후 각 콜로니를 상기 고체배지에 스트리킹하여 최종적으로 순수한 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주를 얻었다(도 1).
상기 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주는 2014년 8월 29일에 KCTC 12672BP로 수탁번호를 부여받았다.
<시험예>
시험예 1. 푸르푸랄에 대한 내성 확인
도 2A는 푸르푸랄이 첨가되지 않은 배지에서의 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주, 대장균(E. coli) 및 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 성장을 나타낸 사진이며; 도 2B는 푸르푸랄이 첨가된 배지에서의 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주, 대장균(E. coli) 및 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 성장을 나타낸 사진이다.
엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주[기탁번호 KCTC 12672BP]의 푸르푸랄에 대한 내성 정도를 확인하여 위하여 푸르푸랄이 30 mM 포함된 배지에서 대장균(E. coli)(비교예 1)과 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)(비교예 2)과의 성장 정도(탁도)를 비교하였다.
사용된 배지는 LB배지에 1% 포도당(glucose)이 포함된 배지이며, 푸르푸랄의 유무에 따른 성장을 관찰하기 위하여 30 mM의 푸르푸랄을 첨가한 배지(도 2B)와 푸르푸랄을 첨가하지 않은 배지(도 2A)로 나누어 실험하였다.
배양은 글래스 튜브(24 mm)에 상기 배지 7 mL를 첨가한 후 실시예 1에서 얻은 콜로니를 접종하여 30 ℃에서 24시간 동안 배양하였다.
도 2에 도시된 바와 같이, 푸르푸랄이 첨가되지 않은 배지에서는 상기 세 균주 모두 성장하였지만(도 2A), 푸르푸랄이 첨가된 배지에서는 산업균주로 이용되는 대장균(E. coli)과 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)이 전혀 성장되지 않았고 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주[기탁번호 KCTC 12672BP]만이 세포의 성장이 관찰됨을 확인하였다(도 2B).
시험예 2. 푸르푸랄의 생장저해정도 확인
도 3은 푸르푸랄의 농도에 따른 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주의 생장저해정도를 나타낸 그래프이다.
배양액은 LB 배지에 탄소원으로 1% 포도당(glucose)을 첨가하였고 푸르푸랄을 각각 20 mM, 40 mM 및 60 mM 첨가하여 푸르푸랄이 없을 때의 생장속도와 비교하였다.
배양은 삼각 플라스크에 상기 배양액 50 mL를 넣고 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주[기탁번호 KCTC 12672BP]를 초기 OD600 1로 접종 후 30 ℃에서 배양하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, 푸르푸랄의 농도가 증가할수록 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주[기탁번호 KCTC 12672BP]의 생장속도가 약간 느려지는 것을 관찰하였다. 푸르푸랄의 농도가 60 mM의 경우에는 배양시간이 30시간 이후에도 OD가 2를 넘지 않아 거의 성장하지 않고 있음을 확인하였다.
하지만 세포저해농도지수(IC50)를 계산한 결과, 대장균(24.9 mM) 또는 코리네박테리움 글루미쿰 균주(10 mM)에 비해서 2배 또는 4배 정도 높은 지수의 값을 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주[기탁번호 KCTC 12672BP](47.7 mM)가 나타내므로 푸르푸랄에 고내성임을 확인하였다. 또한, 푸르푸랄의 농도에 대한 세포성장의 저해정도가 지수적으로 감소함을 고려할 때, 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주[기탁번호 KCTC 12672BP]가 푸르푸랄에 고내성임을 알 수 있다.
시험예 3. 푸르푸랄의 농도에 따른 푸르푸릴 알코올로 전환정도 확인
도 4A는 푸르푸랄이 20 mM이 첨가된 배지에서 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주의 성장에 따른 배양액 내의 푸르푸랄 및 푸르푸릴 알코올의 농도를 나타낸 그래프이며, 도 4B는 푸르푸랄이 40 mM이 첨가된 배지에서 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주의 성장에 따른 배양액 내의 푸르푸랄 및 푸르푸릴 알코올의 농도를 나타낸 그래프이고, 도 4C는 푸르푸랄이 60 mM이 첨가된 배지에서 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주의 성장에 따른 배양액 내의 푸르푸랄 및 푸르푸릴 알코올의 농도를 나타낸 그래프이다.
상기 푸르푸랄 및 푸르푸릴 알코올의 농도는 GC로 측정하였으며, 각 채취시간마다 얻은 배양액은 12000 rpm에서 5분간 원심분리 후 상등액만을 필터로 여과한 후 이를 분석에 사용하였다.
도 4에 도시된 바와 같이, 배양이 진행됨에 따라 푸르푸랄의 농도가 감소할수록 푸르푸릴 알코올의 농도는 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 푸르푸랄이 20 mM(도 4A), 40 mM(도 4B) 첨가된 경우에는 배양액내의 푸르푸랄이 모두 제거된 것을 확인하였으며, 푸르푸랄이 60 mM(도 4C) 첨가된 경우에는 10 mM 정도의 푸르푸랄이 남아있는 것을 확인하였다.
미생물자원센터 KCTC12672BP 20140829

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  6. 목질계 당화액 100 중량부에 대하여 효모 추출물 0.1 내지 5 중량부, 황산마그네슘 0.01 내지 1 중량부, 황산망간 0.01 내지 1 중량부, 황산철 0.01 내지 1 중량부, 염화나트륨 0.01 내지 1 중량부를 첨가한 후 120 내지 130 ℃에서 5 내지 30분 동안 고압 멸균하여 발효배지를 생성하는 단계;
    상기 발효배지에 푸르푸랄에 고내성을 갖는 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) GGTO36균주[기탁번호 KCTC 12672BP]와 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)을 접종하는 단계; 및
    상기 2종의 균주가 접종된 발효배지를 진탕 배양기에서 35 내지 40 ℃의 온도 및 150 내지 300 rpm의 회전 속도로 40 내지 60시간 배양하여 바이오에너지를 얻는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오에너지 생산방법.
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