CN108048375A

CN108048375A - 一种含油污泥中石油烃类的降解菌株jn6及其应用

Info

Publication number: CN108048375A
Application number: CN201810115869.9A
Authority: CN
Inventors: 叶正芳; 姜楠; 赵泉林
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2018-02-06
Filing date: 2018-02-06
Publication date: 2018-05-18
Anticipated expiration: 2038-02-06
Also published as: CN108048375B

Abstract

本发明公开一株含油污泥中石油烃类的高效降解菌JN6及其应用，属于生物修复技术领域。所述降解菌JN6保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.14977，分类号为丛毛单胞菌属Comamonas sp.。本发明所述的具有石油烃类降解功能的菌株JN6用途为以降解石油烃类的方式进行含油污泥的治理，该细菌以单一菌株30天内对含油污泥中总石油烃(TPH)的降解率为62.16％，该细菌对石油污染物的最适降解条件为15‑40℃、pH值7‑11。该生物法用于含油污泥的修复技术，具有高效、成本低、环境友好等优点。

Description

一种含油污泥中石油烃类的降解菌株JN6及其应用

技术领域

本发明涉及生物修复技术领域，具体涉及一株含油污泥降解修复的菌株，及其在降解含油污泥中的应用。

背景技术

自20世纪以来，石油已成为人类最主要的能源之一，而在被大量开采和使用的同时，石油及其加工品对环境及人类造成的危害也日趋严重。我国自改革开放以来原油年产量已超过1亿t，成为世界十大产油国之一的中国拥有400多个勘探、开发的油田和油气田，以约占国土面积3％的比例分布于全国25个省(市)和自治区。然而在经济技术快速发展以及石油需求量不断上升的过程中，我们对油田区域进行采油的技术工艺仍然相对落后，环境影响评价体系相对不完善，同时对石油类污染的修复技术较缺乏，使得我国石油类污染程度远高于发达国家，且呈逐年累积加重态势。

油泥是中国各大油田普遍存在的主要废弃物污染问题，早在1998年国家环保总局就将油泥列为危险废物(废物类别HW08)，要求必须对含油污泥等废弃物进行无害化处理。由于含油污泥的来源不同，其组分、性质也不尽相同。通过对各类含油污泥的取样分析，含油污泥一般含油15％～50％。对环境危害较大。按照《中华人民共和国清洁生产促进法》要求必须对含油污泥进行无害化处理。目前国内外动用了大量人力、物力进行含油污泥有效处理的研究，相继尝试过固化填埋、焚烧、淋洗、化学氧化和生物修复等方法处理含油污泥。生物修复技术具有成本相对较低、安全性高、操作简单、不易造成二次污染、能实施原位处理等优点，被认为是最有前景的修复手段。但由于含油污泥成分复杂难于降解，目前国内外对含油污泥的微生物降解修复研究相对较少。

CN103421692A公开了强化活性污泥的复合微生物活菌制剂及其制备方法和应用。该复合微生物活菌制剂含有纺锤芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)，丛毛单胞菌(Comamonas sp.)和苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)。该制备方法包括以下步骤：(1)将经过斜面活化的纺锤芽孢杆菌、丛毛单胞菌和苍白杆菌分别接种于液体培养基中，30℃～37℃培养40～54小时，得微生物菌液；(2)将步骤(1)得到微生物菌液均匀混合，以40℃～60℃烘干，粉碎至15～50目，过筛即可。该复合微生物活菌制剂在造纸废水处理工艺中作为活性污泥降解COD强化剂中的应用能够有效、迅速、强化活性污泥性能，高效降解造纸废水COD，改善污水色度与水质。

CN103792203A公开了一种全合成酯类润滑油在土壤基质中的降解分析方法，其特征在于：选取试验土壤，按土壤中土著微生物种类多少对其分类，将土壤划分出初始自然条件完全相同的四个试验模块，在模块中添加润滑油、活性污泥微生物菌种和液体培养基，完成全合成酯类润滑油的降解过程；其中，测试模块分为多因素降解和非生物降解两种，参照模块为毒性模块，因土壤中自有一部分微生物和有机物，又因测试模块添加了微生物菌种，故增加了中性模块设计，将这部分做空白扣除；降解结束时取样预处理后分别检测并计算残余润滑油的含量，根据降解前后润滑油含量的变化值计算确定其降解率，参照降解率计算结果及平行测定的最大误差范围考察数据的重复性和稳定性。

CN105624063A公开了一种用于处理污泥的高效混合菌群，所述高效混合菌群包含以下组分：睾丸酮丛毛单胞菌、产碱假单胞菌、嗜根寡养单胞菌、假产碱假单胞菌和固氮螺菌属。本发明的优点是：所得的混合菌群，能有效分解污泥。

发明人从辽河油田含油污泥中筛选出一株高效石油烃降解菌丛毛单胞菌属(Comamonas sp.)CGMCC NO.14977，并进一步研究菌株对含油污泥中石油烃的降解能力，以期应用于含油污泥的微生物修复。

发明内容

本发明目的是提供一株石油烃类降解菌株，并将其在含油污泥降解修复过程中的应用。

本发明所述的一株丛毛单胞菌及其在降解含油污泥中的应用，技术方案为：

一种石油烃类降解菌株，其特征在于，所述菌株为丛毛单胞菌属(Comamonassp.)，于2017年12月1日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏号为CGMCC NO.14977。

一种如上所述的从辽河油田某含油污泥中分离高效降解菌株来降解含油污泥中的石油烃类污染物的方法，其特征在于具体按照以下步骤实施：

取辽河油田某含油污泥10g放入装有100mL LB液体培养基的锥形瓶中，在30℃、120rpm的恒温摇床上进行震荡，富集培养24h。

所述LB培养基的组分为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL。

24h后接种静置后的上层菌液于筛选培养基中，筛选培养基初始的正十八烷的加入量为1g/L，其后不断提高筛选培养基中的正十八烷含量直至5d内无菌落生长。

所述无机盐培养基的组分为：NaCl 30g，NH₄NO₃ 3g，KH₂PO₄ 1g，K₂HPO₄ 1g，CaCl₂0.02g,MgSO₄ 0.5g，琼脂粉20g；去离子水1L；微量元素溶液10ml。

微量元素溶液：CuSO₄ 0.05g，MnSO₄ 0.05g，FeSO₄·7H₂O 0.05g，去离子水50ml。

筛选培养基(烷烃培养基)：在无机盐培养基中添加正十八烷作为唯一碳源。

待菌落长出后，观察菌落形态，用无菌接种环从上述无菌落生长的前一浓度的筛选培养基中挑选形态差距大的菌落，采用平板划线分离法接种于LB固体培养基上，置于恒温培养箱中30℃倒置培养24h，待菌落长出后挑取单菌落，并以同样的方法接种至LB固体培养基。重复上述划线分离过程，直至形成形态单一的纯化菌落，将其接种于保存培养基斜面上于4℃的冰箱保存备用。

上述菌株的菌落形态为：菌落呈淡黄色，表面略有光泽，光滑，边缘不整齐，如图1。菌体呈短杆状，细菌形态见扫描电镜图2。

上述菌株的16S ribosomal RNA基因序列特征，采用分析法将序列与数据库进行比对分析，发现该菌株属于丛毛单胞菌属(Comamonas sp.)，其DNA序列表如序列表所示。

使用前将其在LB液体培养基中活化24h制成菌液，将菌液以10％的接种量接种于含油污泥中。

优选的，所述的降解的最佳条件为：10％的接种量，温度20℃、pH为9的条件下降解效果最佳。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明的丛毛单胞菌属(Comamonas sp.)JN6源于含油污泥，因此该菌株进入含油污泥后很快成为优势菌群，占据一定生态位，有效促进石油烃类的降解，优化土壤微生物体系，改善土壤的物理性状，增强土壤的生物活性。

2、本发明的丛毛单胞菌属(Comamonas sp.)JN6是以正十八烷为唯一碳源筛选出来的优势菌株，菌株在生长繁殖过程中可改变含油污泥中石油烃类物质的性质，使含油污泥中石油烃类的组分发生变化。

3、本发明的丛毛单胞菌属(Comamonas sp.)JN6是以单一的菌种实现较为优异的含油污泥中石油烃类的降解，减少混合菌剂制备过程中各菌株分别活化并按比例混合的复杂步骤，易于控制含油污泥石油烃类降解的最佳反应条件，且单一的菌株降解避免降解后的反应产物复杂，易于联合其他方法对含油污泥中的石油烃类物质进一步降解。

附图说明

图1为菌株JN6的群落形态。

图2为菌株JN6的扫描电镜图。

图3 Comamonas sp.JN6对含油污泥中石油烃类的降解曲线。

图4 Comamonas sp.JN6在不同pH下对含油污泥中石油烃类的降解曲线。

图5 Comamonas sp.JN6在不同温度下对含油污泥中石油烃类的降解曲线。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明内容进行进一步详细说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

一种含油污泥中石油烃类的降解菌株，菌株为丛毛单胞菌属。

(一)材料准备

从辽河油田某地取回含油污泥，4℃保存，运回实验室后将其接种到LB培养基中进行活化。

2.培养基：

无机盐培养基的组分为：正十八烷1g，NaCl 30g，NH₄NO₃ 3g，KH₂PO₄ 1g，K₂HPO₄ 1g，CaCl₂ 0.02g，MgSO₄ 0.5g，琼脂粉20g；去离子水1L；微量元素溶液10ml。

微量元素溶液：CuSO₄ 0.05g，MnSO₄ 0.05g,FeSO₄·7H₂O 0.05g，去离子水50ml。

LB固体培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、琼脂粉20蒸馏水1000mL，调节pH为7

3.实验仪器和设备

恒温振荡器

电热恒温培养箱

高压灭菌锅,

UV-1750紫外可见分光光度计-----上海棱光技术有限公司,

超净工作台,

OIL 480红外分光测油仪-----北京华夏科创有限公司，

PCR仪。

(二)菌株的分离筛选与驯化

取含油污泥10g放入装有100ml LB液体培养基的锥形瓶中，在30℃、120rpm的恒温要床上进行震荡，富集培养24h；

24h后取1ml培养液用涂布棒涂布到含有正十八烷的固体无机盐培养基中，放入恒温培养箱培养7d；

待菌落长出后，观察菌落形态，用无菌接种环从上述固体无机盐培养基中挑选形态差距大的菌落，采用平板划线分离法接种于LB固体培养基上，置于恒温培养箱中30℃倒置培养24h，待菌落长出后挑取单菌落，并以同样的方法接种至LB固体培养基。重复上述划线分离过程，直至形成形态单一的纯化菌落。将单菌落在液体LB培养基中扩繁，并保存在4℃，备用。使用前将保存的菌株在LB液体培养基中活化。

下面为具体实施例部分。

实施例1：辽河油田含油污泥的降解修复试验

取辽河油田含油污泥，风干研磨、过1mm筛，备用。挑取单菌落于灭菌的LB液体培养基中，用透气封口膜封口，将锥形瓶置于摇床中于120rpm、30℃活化24h。称取上述风干研磨过筛后的含油污泥40g，按照10％的接种量加入OD600＝1的Comamonas sp.JN6活化的菌液，并用蒸馏水调节水土比为2:5，用透气封口膜封口。将所有锥形瓶放置于30℃的恒温培养箱中静置培养，每隔5d取样，采用红外分光测油仪测定含油污泥中总石油烃类含量，降解曲线如附图3所示。由图可知该细菌对含油污泥中的石油烃类具有较好的降解效果，30天内对含油污泥中总石油烃(TPH)的降解率为56.71％。

Comamonas sp.JN6降解30天前后的含油污泥的GC-MS分析结果可以看出(表1)，原始的含油污泥中的主要成分是萘烷、正十四烷、十八烯、四甲基十五烷、四甲基十六烷、茚烷、高雄烃、N-(2-三氟甲基苯)-3-吡啶甲酰胺肟(C₁₃H₁₀F₃N₃O)、二十六碳烯、藿烷。Comamonas sp.JN6微生物降解后的含油污泥中含有磷酸三乙酯、4,4’-二甲基联苯、18氧-甲基酯-十九烷酸、5β-雄烷、C₁₅H₁₁ClO、C₁₀H₁₄O、C₈H₁₅B和异甲基紫罗兰酮，说明Comamonassp.JN6在含油污泥中利用无机盐培养基的离子与石油烃类物质发生共代谢，使含有污泥中的石油烃类污染物发生了分子结构的变化，大分子结构的污染物质在微生物的作用下被氧化分解成小分子结构。同时微生物降解后的含油污泥中二甲基十六烷，说明Comamonassp.JN6微生物与四甲基十六烷的支链先发生反应，去甲基后再进一步降解。Comamonassp.JN6对含油污泥中的萘烷(C₁₀H₁₈)、十四烷、十八烯、四甲基十五烷和二十六碳烯的降解能力较强，降解率达100％。Comamonas sp.JN6降解30天后，含油污泥中仍有部分石油烃类物质残留，可以延长增加微生物降解时间和改变微生物降解条件等方式进一步降解。

表1 Comamonas sp.JN6降解30天前后的含油污泥的GC-MS结果

实施例2：Comamonas sp.JN6在不同pH值下对含油污泥中石油烃类的降解效果

取辽河油田含油污泥，风干研磨、过1mm筛。称取上述含油污泥40g于锥形瓶中，用稀H₂SO₄和NaOH调节土壤的pH分别为1、3、5、7、9、11，按照10％的接种量加入OD600＝1的Comamonas sp.JN6活化的菌液，并用蒸馏水调节水土比为2:5，用透气封口膜封口。将所有锥形瓶放置于30℃的恒温培养箱中静置培养并于25天后取样，采用红外分光测油仪测定含油污泥中总石油烃类含量。在不同pH条件下菌株Comamonas sp.JN6对含油污泥中的石油烃类的降解效果如图4所示。由图4可知，本发明所述菌株在pH 7-11范围内对含油污泥中的石油烃类具有较好的去除效果，pH 9的条件下降解效果最佳。

实施例3：Comamonas sp.JN6在不同温度下对含油污泥中石油烃类的降解效果

取辽河油田含油污泥，风干研磨、过1mm筛。称取上述含油污泥40g于锥形瓶中，按照10％的接种量加入OD600＝1的Comamonas sp.JN6活化的菌液，并用蒸馏水调节水土比为2:5，用透气封口膜封口。将锥形瓶分别放置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃的恒温培养箱中静置培养，并于25天后取样，采用红外分光测油仪测定含油污泥中总石油烃类含量。在不同温度下菌株Comamonas sp.JN6对含油污泥中的总石油烃类的降解效果如图5所示。由图5可知，本发明所述菌株在15-40℃范围内对含油污泥中的石油烃类具有一定的降解效果，且降解率随着温度的升高先升高而后降低，20℃条件下降解效果最佳。

实施例4：丛毛单胞菌属Comamonas sp.JN6修复实际含油污泥

在以上实施例的基础上，将丛毛单胞菌属Comamonas sp.JN6用于修复实际含油污泥，实验具体步骤如下：

(1)菌株Comamonas sp.JN6的菌悬液制备：挑取菌株JN6的单菌落于LB液体培养基中，放置于摇床中，于40℃，120rpm条件下培养24h。采用发酵罐进行发酵培养，将上述培养的种子液按5％的接种量接种于LB培养基中，采用空气压缩机进行曝气，搅拌转速为200r/min，定时取样检测OD600值，生长至对数生长期后备用。

(2)供试含油污泥：采自辽河油田某处含油污泥，经自然风干，过8目筛(3mm筛)。将含油污泥样品装入有机玻璃容器中，按照10％的接种量加入OD600＝1的Comamonas sp.JN6活化的菌液，并用无机盐培养基调节液土比为2:5，用透气封口膜封口。

(3)将添加了菌液和无机盐培养基的含油污泥放置于恒温培养箱中静置培养，为达到最佳的降解效果，调节土壤的pH值为9，并维持温度在20℃。

经过30天的生物降解处理后对含油污泥进行检测，发现对含油污泥中总石油烃(TPH)的降解率为62.16％，对含油污泥中的石油烃类具有较好的降解效果。

序列表

<110> 北京大学

<120> 一种含油污泥中石油烃类的降解菌株JN6及其应用

<130> 2018

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1404

<212> DNA

<213> 丛毛单胞菌(Comamonas sp.)

<400> 1

cgtggtagcg ccctccttgc ggttaggcta cctacttctg gcgagacccg ctcccatggt 60

gtgacgggcg gtgtgtacaa gacccgggaa cgtattcacc gtgacattct gatccacgat 120

tactagcgat tccgacttca cgcagtcgag ttgcagactg cgatccggac tacgactggc 180

tttatgggat tagctccccc tcgcgggttg gcaacccttt gtaccagcca ttgtatgacg 240

tgtgtagccc cacctataag ggccatgagg acttgacgtc atccccacct tcctccggtt 300

tgtcaccggc agtcccatta gagtgctcaa ctaaatgtag caactaatgg caagggttgc 360

gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacagc catgcagcac 420

ctgtgttacg gctctctttc gagcactcct tcatctctaa aggattccgt acatgtcaaa 480

ggtgggtaag gtttttcgcg ttgcatcgaa ttaaaccaca tcatccaccg cttgtgcggg 540

tccccgtcaa ttcctttgag tttcaacctt gcggccgtac tccccaggcg gtcaacttca 600

cgcgttagct tcgttactga gtcagttaag acccaacaac cagttgacat cgtttagggc 660

gtggactacc agggtatcta atcctgtttg ctccccacgc tttcgtgcat gagcgtcagt 720

acaggcccag gggattgcct tcgccatcgg tgttcctccg catatctacg catttcactg 780

ctacacgcgg aattccatcc ccctctgccg tactctagcc ttgcagtcac aaaggcagtt 840

cccaggttga gcccggggat ttcacctctg tcttacaaaa ccgcctgcgc acgctttacg 900

cccagtaatt ccgattaacg cttgcaccct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt 960

agccggtgct tattcttacg gtaccgtcat ggctccaggg tattaacccg aagcttttcg 1020

ttccgtacaa aagcagttta caacccgaag gccttcatcc tgcacgcggc attgctggat 1080

caggctttcg cccattgtcc aaaattcccc actgctgcct cccgtaggag tctgggccgt 1140

gtctcagtcc cagtgtggct gatcgtcctc tcagaccagc tacagatcgt cggcttggta 1200

agcttttatc ccaccaacta cctaatctgc catcagccgc tctagtagca caaggtcttg 1260

cgatcccctg ctttcatccg tagatctcat gcggtattag ccactctttc gagtagttat 1320

cccccactac taggcacgtt ccgatgtatt actcacccgt tcgccactcg tcagcatccg 1380

aagacctgtt accgttcgac tgca 1404

Claims

1.一种含油污泥降解修复的菌株JN6，其特征在于，所述菌株为丛毛单胞菌属Comamonas sp.，保藏单位名称为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNO.14977。

2.根据权利要求1所述的一种含油污泥降解修复的菌株JN6，其特征在于：所述降解菌以石油烃类降解的方式进行含油污泥的降解修复的用途。

3.根据权利要求1所述的一种含油污泥降解修复的菌株JN6，其特征在于：所述降解菌对石油烃类的降解条件为15-40℃、pH值7-11。

4.根据权利要求2所述的一种含油污泥降解修复的菌株JN6的应用，其特征是，包括如下步骤：

(1)挑取Comamonas sp.JN6单菌落于灭菌的LB液体培养基的锥形瓶中，用透气封口膜封口，将锥形瓶置于摇床中于120rpm、30℃，活化24h制成种子培养液。

(2)将上述培养的种子液按5％的接种量接种于含LB培养基发酵罐进行培养，采用空气压缩机进行曝气，搅拌转速为200r/min，培养至对数生长期。

(2)将辽河油田含油污泥，风干研磨、过1mm筛后，按照10％的接种量加入OD600＝1的Comamonas sp.JN6活化的菌液，并用无机盐培养基调节液土比为2:5，用透气封口膜封口。

5.根据权利要求5所述的一种含油污泥降解修复的菌株JN6的应用，其特征是：所述的LB培养基的组分为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、蒸馏水1000mL，调节pH为7。

6.根据权利要求5所述的一种含油污泥降解修复的菌株JN6的应用，其特征是：所述的无机盐培养基的组分为：NaCl 30g，NH₄NO₃ 3g，KH₂PO₄ 1g，K₂HPO₄ 1g，CaCl₂ 0.02g，MgSO₄0.5g，琼脂粉20g；去离子水1L；微量元素溶液10ml。

7.根据权利要求6所述的无机盐培养基的组分，其特征是：微量元素溶液的组分为：CuSO₄ 0.05g，MnSO₄ 0.05g，FeSO₄·7H₂O 0.05g，去离子水50ml。