CN112553119A - 一种巨大芽孢杆菌菌株以及其应用 - Google Patents

一种巨大芽孢杆菌菌株以及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种巨大芽孢杆菌菌株以及其应用，本发明的巨大芽孢杆菌菌株是利用现有的生产菌种VC2‑M‑171212‑47经过诱变分离筛选，结合噬菌体抗性选育，最终筛选得到性状稳定的抗性菌株VC2‑M‑180914‑145巨大芽孢杆菌，通过液态发酵生产2‑KLG，产量稳定。

Description

一种巨大芽孢杆菌菌株以及其应用
技术领域
本发明涉及抗生素发酵技术领域，具体地来说是涉及一种巨大芽孢杆菌菌株以及其应用。
背景技术
维生素C（VC）是人体必需的一种维生素，在抗氧化和维持新陈代谢平衡等方面具有广泛的生理作用。在医药工业、食品工业、饲料行业以及化妆品行业上均有重要用途。其应用范围广阔，市场规模也巨大。
目前，全球90%以上的VC生产，均利用我国发明的“二步发酵法”，即第一步是单菌发酵，将D-山梨醇转化成L-山梨糖；第二步是混合菌发酵，通过普通产酮古洛糖酸菌（俗称小菌）和巨大芽孢杆菌（俗称大菌）的共同作用将L-山梨糖转化成2-酮基 -L-古龙酸（2-KGA）。2-酮基-L-古龙酸再经过提取和转化生成维生素C。在其混合菌系中：普通产酮古洛糖酸菌（俗称小菌）是产2-KLG的关键菌株，具有氧化底物L-山梨糖为2-KLG的酶系统。但该菌独立生长及产2-KLG能力非常弱，需要巨大芽孢杆菌（俗称大菌）提供某些效应物促进其生长及产2-KLG。大菌本身能独立生长，却不能转化L-山梨糖为2-KLG。在实际生产中，大菌极易被噬菌体污染，导致产2-KLG水平下降甚至发酵失败，又进一步加大了工艺控制的难度。因此，提供一种防止噬菌体侵染的抗性菌株，对于保障维生素C发酵生产的安全性和稳定性具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的就在于提供一种防止噬菌体侵染，保障维生素C发酵生产的安全性和稳定性的巨大芽孢杆菌菌株。
本发明的另一目的是提供上述巨大芽孢杆菌菌株的应用。
为实现上述发明目的所采取的技术方案为：
一种巨大芽孢杆菌菌株，其特征在于：所述菌株为VC2-M-180914-145 巨大芽孢杆菌，于2020年8月6日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M2020399。
如上述所述的巨大芽孢杆菌菌株在维生素C二步发酵法中的应用。
本发明的巨大芽孢杆菌菌株是利用现有的生产菌种VC2-M-171212-47经过诱变分离筛选，结合噬菌体抗性选育，最终筛选得到性状稳定的抗性菌株VC2-M-180914-145 巨大芽孢杆菌，通过液态发酵生产2-KLG，产量稳定。
使用FMIC-QO01-001-2015微生物学检测，细菌多相鉴定检测方法对该菌株进行菌种鉴定。鉴定结果如下：
1、生物学特性：使用TSA培养基，在固体培养基上30℃培养24h,菌落形态凸起呈圆形，完整，边缘整齐。菌落表面湿润光滑呈黄色油状，不透明。显微镜观察菌体成对或呈链状短杆排列，可形成短链或丝状体，革兰氏染色为革兰阳性菌。
2、生理生化特征：通过VITEK BCL鉴定卡对其代谢利用的碳源、氮源的种类的检测，可确定其有无特殊营养需要，存在的酶的种类等代谢特性。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
符号说明：“+”阳性：“-”阴性。
使用本发明的巨大芽孢杆菌菌株抗性菌株具有抗性，防止专性微生物（噬菌体）的系统污染和爆发，可切断寄主菌大菌的传染途径，解决后期菌体自容，活力降低，产酸量下降的现状，可解决生产发酵后期的异常代谢，有效的保障维生素C生产的安全性和稳定性，完全解决了现有技术中噬菌体侵染VC产生菌的发酵问题。
本发明菌株的保藏信息如下：
分类命名：巨大芽孢杆菌VC2-M-180914-145(大菌)(Bacillus megaterium VC2-M-180914-145(大菌))，
保藏编号：CCTCC NO：M2020399，
保藏时间：2020年8月6日，
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，
保藏单位地址：中国武汉武汉大学。
保藏证明：巨大芽孢杆菌VC2-M-180914-145Bacillus megaterium，于2020年8 月6日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M2020399。
具体实施方式
下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
一、本发明VC2-M-180914-145 巨大芽孢杆菌的筛选方法。
1分离平板的制备：
分离培养基：山梨糖1.0%，酵母膏0.5%，玉米浆0.5%，尿素0.3%，硫酸镁0.03%，磷酸氢二钾0.05%，碳酸钙0.5%，琼脂2.0%，pH7.0。按照以上配比配制培养基，灭菌后冷却制备分离平板备用。
2大菌种液培养：
摇瓶种子培养基：山梨糖2.5%，葡萄糖0.2%，玉米浆0.5%，尿素0.1%，碳酸钙0.2%。
挑选生产使用的大菌菌株VC2-M-171212-47接入20ml上述摇瓶种子培养基内，30℃,200r/n,22hr结束培养,镜检：有大菌的实体及空孢存在，确定为纯大菌种液。
3诱变分离操作：
将制备的新鲜大菌种液，依次稀释至10-3，吸取原液0.2ml到￠100mm的空白分离平板上涂布均匀，置操净台上用自然风风干约2分钟，待分离平板内液体干燥后移至离子束生物工程装置（离子束注入设备）操作室处理。时间分别为15s，30s，60s，90s，120s，180s,将处理后的样品加入1.0ml的无菌水，再用无菌的刮棒洗脱，最后将洗脱后的溶液取0.1ml/0.2ml/0.3ml加至分离培养基平板上涂布均匀，即为诱变分离平板。同时分别设立真空对照，设立风干对照及正常对照进行分离培养，同期放置在温度控制在29-31℃，湿度35-55%的恒温室内培养。通过对诱变分离平板、对照分离平板的单菌落进行计数，统计不同诱变剂量的死亡率，变异率，突变幅度等参数来评价诱变效果。
4离子束注入设备的特点：
该N离子束注入装置的设计采用双潘宁工作原理。该设备真空腔室模仿太空环境，以氮气为离子源，进行高电能N离子注入。电离的N离子为DNA碱基的重要元素之一，不仅可以直接引起碱基分子结构的变化，还可以参与细胞结构的重组和修复。所以离子注入诱变可得到较高的突变率，且突变谱广、死亡率低、正突变率高、性状稳定。
5制作双层抗性检测平板：
先将配制灭菌的营养琼脂培养基注入到培养皿内，待其凝固后，即为下层培养基。将菌种编号为QF的噬菌体菌液加入到抗性平板的上层培养基内混匀，并注入到平板上形成上层培养基，待其凝固后即制作成双层抗性检测平板，（浓度为102～105个/皿）。编号为QF的噬菌体菌株是有VC生产车间环境内获得分离纯化保存。
菌落影印：挑选生长良好、稀密度适中的诱变分离平板，使用影印用的自制的绒布章，水平轻触分离平板的单菌落，将其先影印至一正常的分离培养基平板上，即为
Figure DEST_PATH_IMAGE002
号平板；再平移影印至一涂有QF（浓度为102～105个/皿）的抗性检测平板上，即为
Figure DEST_PATH_IMAGE003
号平板。对影印位置采用上下两点定位进行标记。影印的
Figure 933916DEST_PATH_IMAGE002
号平板和
Figure 858009DEST_PATH_IMAGE003
号平板的单菌落位置需一一对应编号。
将以上平板分别置于恒温箱温度29.0～31.0℃，湿度35～55%培养一定时间，根据生长情况，确定终止培养。
抗性平板检测的作用机理：利用噬菌体的专一侵染性，配制双层固体培养基平板。利用沉降、接触、侵染、形成噬菌斑的生理过程，通过肉眼观察菌斑的大小而判断验证结果。这种方法可以直观的观察到噬菌体是否存在，还可对噬菌体的数量和沉降速率进行检测。
6抗性菌落挑选：
Figure 554570DEST_PATH_IMAGE002
号平板上生长的菌落为乳脂色，边缘无噬菌斑现象，说明影印大菌未受噬菌体污染。
Figure 120680DEST_PATH_IMAGE003
号平板，多处菌落四周均有透明的噬菌斑出现，少数几个菌落无噬菌斑，即为我们挑选的目的菌株。可以将
Figure 156769DEST_PATH_IMAGE003
号平板山无噬菌斑的菌落在
Figure 189448DEST_PATH_IMAGE002
号平板处对应位置的菌落标记，将其分别与生产小菌搭接在试管斜面上保存留种考察。
二、生产能力考查和抗性验证
1种子培养基：山梨糖1.5-2.5%，葡萄糖0.2%，玉米浆0.4-0.6%，尿素0.1%，碳酸钙0.2%。
2发酵培养基：山梨糖8.0-10.0%，玉米浆1.0-1.4%，尿素1.0-1.4%，磷酸二氢钾0.1%，七水硫酸镁0.01%，碳酸钙0.4-0.6%。
3接种，移种及检测验证
3.1分别取试验菌株VC2-M-180914-145和对照菌株VC2-M-171212-47的试管斜面，用接种环分别刮取面积约为0.5*1.0cm2的的菌体（搭接有小菌的巨大芽孢杆菌），将其加入到种子培养基中，在200r/min转速下、温度29.0～31.0℃，湿度35～55%条件下，放置在摇床上震荡培养24小时。
3.2分别取三瓶试验菌株和对照菌株的种子液，按10%的接种量分别接入正常发酵培养基中，每个设置3组，每组三瓶，共计9瓶发酵瓶平行考察，在温度29.0～31.0℃，湿度35～55%条件下培养至72小时后，对两个菌株的发酵瓶进行古龙酸的含量的检测。
3.3在正常的发酵培养基中菌加入一定量的QF菌液，一般加量为5*103～104个/瓶，即为抗性检测发酵培养基。分别取试验菌株和对照菌株的种子液各3瓶，按10%的接种量分别接入到抗性检测发酵培养基中，每个设置三组，每组三瓶，共计9瓶发酵瓶平行考察。在温度29.0～31.0℃，湿度35～55% 培养条件下培养46h后放瓶，制备菌体涂片观察菌体的生长状态，并进行古龙酸含量检测。
试验检测结果如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
考察结果显示，挑选的试验菌株VC2-M-180914-145 的正常发酵瓶较抗性发酵瓶的产酸量高1.95%，基本持平。试验株的正常发酵瓶较对照菌株VC2-M-171212-47的正常发酵瓶酸含量高5.01%。对照菌株的抗性发酵瓶产酸量明显较低，较正常发酵瓶低40.03%。此试验结果说明菌株VC2-M-180914-145 不论在正常发酵环境，还是含有其它专性微生物QF的培养环境下，都具有较高的发酵水平，说明其对QF噬菌体具有一定抗性，可保存该菌株进行进一步生产验证使用。
三、VC2-M-180914-145 巨大芽孢杆菌在二步发酵法生产维生素C生产上的应用。
对试验菌株VC2-M-180914-145进行生产应用考察，以生产菌株VC2-M-171212-47作为对照罐统计分析。
1. 工作细胞库种液进罐情况。
取试验菌株VC2-M-180914-145冻存液菌种进行两步活化，将活化的菌液接种至种子摇瓶中，培养温度29-31℃，培养周期28-34hr。种液控制标准：PH值7.6-8.2，古龙酸8.0-8.5mg/ml，镜检菌体形态正常无杂菌可进罐使用。
2.试验菌株的进罐批次统计。
采用试验菌株VC2-M-180914-145连续进罐，进一级与二级种子各30批，三级种子30批，发酵30批。试验菌株VC2-M-180914-145与对照菌株生产能力比较结果见下表：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
3.试验结果分析。
3.1种子罐生长情况分析：从数据变化率分析，试验菌株VC2-M-180914-145一级种子产酸速率较对照提高了8.8%，二级种子产酸率提高了8.82%，三级种子产酸率提高了7.69%，种子移罐pH值与对照没有明显差异，代谢趋势一致。说明该抗性菌株菌体活力强，代谢旺盛，生长代谢速率快，其代谢特征更符合生产需求。
3.2发酵罐生长情况分析：从数据变化率分析，试验菌株VC2-M-180914-145发酵放罐产酸量较对照提高了7.40%，总收率高于对照4.76%，说明其总体的代谢发酵水平显著提升，可有效降低物耗。通过生产应用考察结果说明试验菌株VC2-M-180914-145的整体生产能力高于对照菌株VC2-M-171212-47。
试验菌株VC2-M-180914-145进罐试验的30个批次均未有代谢异常罐批，后续连续进罐也从未发生噬菌体侵染造成罐批异常的情况，该菌株的使用有效切断了这种专性微生物的侵染途径，保障生产稳定。从生产考察结果说明抗性菌株VC2-M-180914-145具有一定抗性，且代谢稳定，发酵水平高，更适宜用于维生素C二步菌发酵生产使用。

Claims (2)

1.一种巨大芽孢杆菌菌株，其特征在于：所述菌株为VC2-M-180914-145 巨大芽孢杆菌，于2020年8月6日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M2020399。
2.如权利要求1所述的巨大芽孢杆菌菌株在维生素C二步发酵法中的应用。
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