CN112553119A - 一种巨大芽孢杆菌菌株以及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种巨大芽孢杆菌菌株以及其应用,本发明的巨大芽孢杆菌菌株是利用现有的生产菌种VC2‑M‑171212‑47经过诱变分离筛选,结合噬菌体抗性选育,最终筛选得到性状稳定的抗性菌株VC2‑M‑180914‑145巨大芽孢杆菌,通过液态发酵生产2‑KLG,产量稳定。
Description
技术领域
本发明涉及抗生素发酵技术领域,具体地来说是涉及一种巨大芽孢杆菌菌株以及其应用。
背景技术
维生素C(VC)是人体必需的一种维生素,在抗氧化和维持新陈代谢平衡等方面具有广泛的生理作用。在医药工业、食品工业、饲料行业以及化妆品行业上均有重要用途。其应用范围广阔,市场规模也巨大。
目前,全球90%以上的VC生产,均利用我国发明的“二步发酵法”,即第一步是单菌发酵,将D-山梨醇转化成L-山梨糖;第二步是混合菌发酵,通过普通产酮古洛糖酸菌(俗称小菌)和巨大芽孢杆菌(俗称大菌)的共同作用将L-山梨糖转化成2-酮基 -L-古龙酸(2-KGA)。2-酮基-L-古龙酸再经过提取和转化生成维生素C。在其混合菌系中:普通产酮古洛糖酸菌(俗称小菌)是产2-KLG的关键菌株,具有氧化底物L-山梨糖为2-KLG的酶系统。但该菌独立生长及产2-KLG能力非常弱,需要巨大芽孢杆菌(俗称大菌)提供某些效应物促进其生长及产2-KLG。大菌本身能独立生长,却不能转化L-山梨糖为2-KLG。在实际生产中,大菌极易被噬菌体污染,导致产2-KLG水平下降甚至发酵失败,又进一步加大了工艺控制的难度。因此,提供一种防止噬菌体侵染的抗性菌株,对于保障维生素C发酵生产的安全性和稳定性具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的就在于提供一种防止噬菌体侵染,保障维生素C发酵生产的安全性和稳定性的巨大芽孢杆菌菌株。
本发明的另一目的是提供上述巨大芽孢杆菌菌株的应用。
为实现上述发明目的所采取的技术方案为:
一种巨大芽孢杆菌菌株,其特征在于:所述菌株为VC2-M-180914-145 巨大芽孢杆菌,于2020年8月6日在中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号为:CCTCC NO:M2020399。
如上述所述的巨大芽孢杆菌菌株在维生素C二步发酵法中的应用。
本发明的巨大芽孢杆菌菌株是利用现有的生产菌种VC2-M-171212-47经过诱变分离筛选,结合噬菌体抗性选育,最终筛选得到性状稳定的抗性菌株VC2-M-180914-145 巨大芽孢杆菌,通过液态发酵生产2-KLG,产量稳定。
使用FMIC-QO01-001-2015微生物学检测,细菌多相鉴定检测方法对该菌株进行菌种鉴定。鉴定结果如下:
1、生物学特性:使用TSA培养基,在固体培养基上30℃培养24h,菌落形态凸起呈圆形,完整,边缘整齐。菌落表面湿润光滑呈黄色油状,不透明。显微镜观察菌体成对或呈链状短杆排列,可形成短链或丝状体,革兰氏染色为革兰阳性菌。
2、生理生化特征:通过VITEK BCL鉴定卡对其代谢利用的碳源、氮源的种类的检测,可确定其有无特殊营养需要,存在的酶的种类等代谢特性。
符号说明:“+”阳性:“-”阴性。
使用本发明的巨大芽孢杆菌菌株抗性菌株具有抗性,防止专性微生物(噬菌体)的系统污染和爆发,可切断寄主菌大菌的传染途径,解决后期菌体自容,活力降低,产酸量下降的现状,可解决生产发酵后期的异常代谢,有效的保障维生素C生产的安全性和稳定性,完全解决了现有技术中噬菌体侵染VC产生菌的发酵问题。
本发明菌株的保藏信息如下:
分类命名:巨大芽孢杆菌VC2-M-180914-145(大菌)(Bacillus megaterium VC2-M-180914-145(大菌)),
保藏编号:CCTCC NO:M2020399,
保藏时间:2020年8月6日,
保藏单位:中国典型培养物保藏中心(CCTCC),
保藏单位地址:中国武汉武汉大学。
保藏证明:巨大芽孢杆菌VC2-M-180914-145Bacillus megaterium,于2020年8 月6日在中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号为:CCTCC NO:M2020399。
具体实施方式
下面用实例予以说明本发明,应该理解的是,实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
一、本发明VC2-M-180914-145 巨大芽孢杆菌的筛选方法。
1分离平板的制备:
分离培养基:山梨糖1.0%,酵母膏0.5%,玉米浆0.5%,尿素0.3%,硫酸镁0.03%,磷酸氢二钾0.05%,碳酸钙0.5%,琼脂2.0%,pH7.0。按照以上配比配制培养基,灭菌后冷却制备分离平板备用。
2大菌种液培养:
摇瓶种子培养基:山梨糖2.5%,葡萄糖0.2%,玉米浆0.5%,尿素0.1%,碳酸钙0.2%。
挑选生产使用的大菌菌株VC2-M-171212-47接入20ml上述摇瓶种子培养基内,30℃,200r/n,22hr结束培养,镜检:有大菌的实体及空孢存在,确定为纯大菌种液。
3诱变分离操作:
将制备的新鲜大菌种液,依次稀释至10-3,吸取原液0.2ml到¢100mm的空白分离平板上涂布均匀,置操净台上用自然风风干约2分钟,待分离平板内液体干燥后移至离子束生物工程装置(离子束注入设备)操作室处理。时间分别为15s,30s,60s,90s,120s,180s,将处理后的样品加入1.0ml的无菌水,再用无菌的刮棒洗脱,最后将洗脱后的溶液取0.1ml/0.2ml/0.3ml加至分离培养基平板上涂布均匀,即为诱变分离平板。同时分别设立真空对照,设立风干对照及正常对照进行分离培养,同期放置在温度控制在29-31℃,湿度35-55%的恒温室内培养。通过对诱变分离平板、对照分离平板的单菌落进行计数,统计不同诱变剂量的死亡率,变异率,突变幅度等参数来评价诱变效果。
4离子束注入设备的特点:
该N离子束注入装置的设计采用双潘宁工作原理。该设备真空腔室模仿太空环境,以氮气为离子源,进行高电能N离子注入。电离的N离子为DNA碱基的重要元素之一,不仅可以直接引起碱基分子结构的变化,还可以参与细胞结构的重组和修复。所以离子注入诱变可得到较高的突变率,且突变谱广、死亡率低、正突变率高、性状稳定。
5制作双层抗性检测平板:
先将配制灭菌的营养琼脂培养基注入到培养皿内,待其凝固后,即为下层培养基。将菌种编号为QF的噬菌体菌液加入到抗性平板的上层培养基内混匀,并注入到平板上形成上层培养基,待其凝固后即制作成双层抗性检测平板,(浓度为102~105个/皿)。编号为QF的噬菌体菌株是有VC生产车间环境内获得分离纯化保存。
菌落影印:挑选生长良好、稀密度适中的诱变分离平板,使用影印用的自制的绒布章,水平轻触分离平板的单菌落,将其先影印至一正常的分离培养基平板上,即为号平板;再平移影印至一涂有QF(浓度为102~105个/皿)的抗性检测平板上,即为号平板。对影印位置采用上下两点定位进行标记。影印的号平板和号平板的单菌落位置需一一对应编号。
将以上平板分别置于恒温箱温度29.0~31.0℃,湿度35~55%培养一定时间,根据生长情况,确定终止培养。
抗性平板检测的作用机理:利用噬菌体的专一侵染性,配制双层固体培养基平板。利用沉降、接触、侵染、形成噬菌斑的生理过程,通过肉眼观察菌斑的大小而判断验证结果。这种方法可以直观的观察到噬菌体是否存在,还可对噬菌体的数量和沉降速率进行检测。
6抗性菌落挑选:
二、生产能力考查和抗性验证
1种子培养基:山梨糖1.5-2.5%,葡萄糖0.2%,玉米浆0.4-0.6%,尿素0.1%,碳酸钙0.2%。
2发酵培养基:山梨糖8.0-10.0%,玉米浆1.0-1.4%,尿素1.0-1.4%,磷酸二氢钾0.1%,七水硫酸镁0.01%,碳酸钙0.4-0.6%。
3接种,移种及检测验证
3.1分别取试验菌株VC2-M-180914-145和对照菌株VC2-M-171212-47的试管斜面,用接种环分别刮取面积约为0.5*1.0cm2的的菌体(搭接有小菌的巨大芽孢杆菌),将其加入到种子培养基中,在200r/min转速下、温度29.0~31.0℃,湿度35~55%条件下,放置在摇床上震荡培养24小时。
3.2分别取三瓶试验菌株和对照菌株的种子液,按10%的接种量分别接入正常发酵培养基中,每个设置3组,每组三瓶,共计9瓶发酵瓶平行考察,在温度29.0~31.0℃,湿度35~55%条件下培养至72小时后,对两个菌株的发酵瓶进行古龙酸的含量的检测。
3.3在正常的发酵培养基中菌加入一定量的QF菌液,一般加量为5*103~104个/瓶,即为抗性检测发酵培养基。分别取试验菌株和对照菌株的种子液各3瓶,按10%的接种量分别接入到抗性检测发酵培养基中,每个设置三组,每组三瓶,共计9瓶发酵瓶平行考察。在温度29.0~31.0℃,湿度35~55% 培养条件下培养46h后放瓶,制备菌体涂片观察菌体的生长状态,并进行古龙酸含量检测。
试验检测结果如下:
考察结果显示,挑选的试验菌株VC2-M-180914-145 的正常发酵瓶较抗性发酵瓶的产酸量高1.95%,基本持平。试验株的正常发酵瓶较对照菌株VC2-M-171212-47的正常发酵瓶酸含量高5.01%。对照菌株的抗性发酵瓶产酸量明显较低,较正常发酵瓶低40.03%。此试验结果说明菌株VC2-M-180914-145 不论在正常发酵环境,还是含有其它专性微生物QF的培养环境下,都具有较高的发酵水平,说明其对QF噬菌体具有一定抗性,可保存该菌株进行进一步生产验证使用。
三、VC2-M-180914-145 巨大芽孢杆菌在二步发酵法生产维生素C生产上的应用。
对试验菌株VC2-M-180914-145进行生产应用考察,以生产菌株VC2-M-171212-47作为对照罐统计分析。
1. 工作细胞库种液进罐情况。
取试验菌株VC2-M-180914-145冻存液菌种进行两步活化,将活化的菌液接种至种子摇瓶中,培养温度29-31℃,培养周期28-34hr。种液控制标准:PH值7.6-8.2,古龙酸8.0-8.5mg/ml,镜检菌体形态正常无杂菌可进罐使用。
2.试验菌株的进罐批次统计。
采用试验菌株VC2-M-180914-145连续进罐,进一级与二级种子各30批,三级种子30批,发酵30批。试验菌株VC2-M-180914-145与对照菌株生产能力比较结果见下表:
3.试验结果分析。
3.1种子罐生长情况分析:从数据变化率分析,试验菌株VC2-M-180914-145一级种子产酸速率较对照提高了8.8%,二级种子产酸率提高了8.82%,三级种子产酸率提高了7.69%,种子移罐pH值与对照没有明显差异,代谢趋势一致。说明该抗性菌株菌体活力强,代谢旺盛,生长代谢速率快,其代谢特征更符合生产需求。
3.2发酵罐生长情况分析:从数据变化率分析,试验菌株VC2-M-180914-145发酵放罐产酸量较对照提高了7.40%,总收率高于对照4.76%,说明其总体的代谢发酵水平显著提升,可有效降低物耗。通过生产应用考察结果说明试验菌株VC2-M-180914-145的整体生产能力高于对照菌株VC2-M-171212-47。
试验菌株VC2-M-180914-145进罐试验的30个批次均未有代谢异常罐批,后续连续进罐也从未发生噬菌体侵染造成罐批异常的情况,该菌株的使用有效切断了这种专性微生物的侵染途径,保障生产稳定。从生产考察结果说明抗性菌株VC2-M-180914-145具有一定抗性,且代谢稳定,发酵水平高,更适宜用于维生素C二步菌发酵生产使用。
Claims (2)
1.一种巨大芽孢杆菌菌株,其特征在于:所述菌株为VC2-M-180914-145 巨大芽孢杆菌,于2020年8月6日在中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号为:CCTCC NO:M2020399。
2.如权利要求1所述的巨大芽孢杆菌菌株在维生素C二步发酵法中的应用。
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