JPS61219386A - 分極性微粒体の集合方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は複数の分極性微粒体、特に、細胞を不均一電
界内において互いに接触状態に集合させる方法および装
置に関する。

技術背景 一般に、生体細胞を電界中におくと細胞膜部分に電気二
重層が形成され、即ち、分極される。従来、このような
分極性微粒体を不均一電界内に置いて電束密度もしくは
電気変位が極大となる極点に向けて移動、即ち、誘電泳
動させ、該極点において分極性微粒体を互いに接触状態
に集合させることが知られている。

上記集合方法を用いる一興体例として誘電泳動を利用す
る電気的細胞融合法が公知である。即ち、マンニトール
溶液等の非電解質溶液に細胞を懸濁し、この懸濁液を、
例えば、平板状電極−棒状電極あるいは棒状電極−棒状
電極間等に形成される不均一電界内に置くと、該溶液中
の各細胞が誘電泳動し、当該不均一電界における電気変
位が極大となる棒状電極の先端部およびその表面に数珠
状に連なり、次いで、接触細胞に適当な電気パルスによ
る刺激を加えて細胞融合が成就される。

しかしながら、上記従来の方法においては、接触状態に
集合させようとする分極性微粒体が電極表面に直接接触
する方式のものであるため、電極表面が汚損され、当該
電界の強さを一定に維持することが出来ず、連続的に安
定して集合操作を行うことが困難であった。特に、細胞
融合等において細胞の集合操作を行うときには、電極表
面の汚損のみならず、電極表面に直接接触する細胞が破
損する危険性が大いにあった。また、互いに接触させら
れた細胞対の組み合わせは不規則的なものであり、たと
えば、異種細胞ＡおよびＢの細胞融合を行うにあたり、
電極表面の近傍に配列される細胞の組み合わせは、Ａ−
ＡＳＢ−８１Ａ−Ｂ等が不規則に現れ、所要の細胞対Ａ
−Ｂのみを得難く、このため、たとえば、顕微鏡等を使
用して所要の細胞対Ａ−Ｂを選別するようにしており、
このような余分の選別工程が必要なため融合操作全体の
作業能率が良くなかった。

解決しようとする課題 この発明は、上述した種々の問題点を解消するためにな
されたものであり、原理的に、電界発生用の一対の電極
間の中間部に電気変位あるいは電束密度が極大となる極
大点を形成する一方、該極点の少なくとも２つ以上の相
対向する側方位置から当該不均一電界内にそれぞれ接触
させようとする分極性微粒体を装入して、各電極表面か
ら離間した極点において所望の組み合わせの分極性微粒
体群を得るようにした分極性微粒体の集合方法を提供し
ようとするものである。

更に、この発明は、電気絶縁性の容器内に設置された電
界発生用の一対の平板状電極間に電気絶縁体を介在させ
て該電極間の中間部において断面積が極小となる導通路
を形成し、これにより該導通路の狭隘部に電気変位ある
いは電束密度が極大となる極大点を形成する一方、上記
導通路における狭隘部の相対向する側方位置にそれぞれ
分極性微粒体の装入口部を形成した分極性微粒体の集合
装置を提供しようとするものである。

なお、この発明は、特に、異種細胞融合用として非常に
有用なものであるか、これに限らず、マイクロカプセル
にＤＮＡ（デオキシリボ核酸）等の所要の物質を封入し
、このマイクロカプセルと細胞とを溶液内で互いに接触
させて該細胞に上記物質を導入する、いわゆる、カプセ
ル法による物質の導入とか、溶液中での細胞へのＤＮＡ
−ベクターの導入等に有用なものである。

この明細書において細胞とは、前後の文章から矛盾のな
い限り、完全な細胞のみならず、細胞融合の目的で予め
所定の処理を施した細胞、たとえば、プロトプラストな
どを包含するものとする。

又、用語“細胞融合”は便宜上、細胞と、例えばＤＮＡ
を封入したマイクロカプセルとの融合、さらには細胞へ
のＤＮＡ−ベクターの導入をも意味するものとする。こ
のマイクロカプセルは、人工および天然のいずれのもの
であってもよい。

裏廠佐 この発明を、実施例を示す添付図面とともに説明する。

なお、この実施例は植物プロトプラストの集合および融
合に適用するものである。

第１図および第２図において、■はアクリル樹脂により
外形が略矩形板状に一体成形された枠体である。この枠
体ｌの対向する２つの長辺側壁にそれぞれ対称形の４角
錐台形状の突起部２−１．２−２が互いに対向するよう
に形成されている。

両突起部２−１．２−２のテーパー面３．３および先端
面４は断面積が枠体１の中心部で最小となるテーパー状
の導通路５を形成している。なお、突起部２−１．２−
２は枠体Ｉとは個別のものとしてもよい。また、これら
の突起部２−１．２−２はアクリル樹脂に限らず、高電
気絶縁性のテフロン（米国デュポン社の商品名）、マイ
ラ（米国デュポン社の商品名）等、他の合成プラスッチ
ック材またはセラミックス、マイカ等から形成したもの
であってもよい。

上記枠体ｌの底面１−１には電気絶縁性の透明ガラス板
８が接着される一方、上面１−２には電気絶縁材料から
成る蓋体９が取り付けられる。このようにして、枠体１
の側壁と透明ガラス板８と蓋体９とにより対称形の２つ
の密閉チャンバ６−１．６−２が形成されている。両密
閉チャンバ６−１．６−２は枠体！の中央部で収束する
導通路５を介して接続されている。導通路５における断
面積の極小となる部分を狭隘部７という。第１図および
第２図に示すように、この狭隘部７の長さＱ１幅ｄおよ
び高さｈは集合させようとする細胞に応じて適宜な寸法
とされる。

上記密閉チャンバ６−１．６−２内に互いに平行にかつ
対向状に平板電極１１−Ｌ　　１１−２が設置される。

両手板電極１１−３　１１−２は共に白金（Ｐｔ）から
形成され、それらの平面形状および面積は同等とされる
。なお、電極材料として、たとえば、ステンレス、銀−
塩化銀、あるいはアザブリッジ等の液絡電極などを使用
するようにしてもよい。そして、両手板電極１１〜ＩＳ
　１！−２は詳細に後述するように電界発生用交流（Ａ
Ｃ）電源回路１３と接続され、該交流電源回路１３から
交流電圧が印加されると、平板電極１１−３１１−２間
におけるチャンバ６−１，６−２および導通路５の内部
領域に電界を発生する。この電界は枠体１１透明ガラス
板８および蓋体９により該チャンバ６−１，６−２およ
び導通路５の内部領域に有効に閉じ込められるとともに
電気絶縁体の突起部２−１．２−２により、第３図に示
すように導通路５における断面積が最小もしくは極小と
なる位置で電束密度あるいは電気変位が極大となる。こ
のようにして、密閉チャンバ６−！、６−２および導通
路５の内部領域に不均一電界が形成される。

上記密閉チャンバ６−１，６−２の側壁部にそれぞれ細
胞装入口２１−１，２１−２が設けられる。そして、各
装入口２１−１１２１−２にそれぞれコンジット２２−
１，２１−２が接続されるとともに図示しないポンプに
よりバルブ２３−１゜２３−２を介して細胞懸濁液が注
入されるようになっている。さらに、導通路５の狭隘部
７を形成する一方の突起部、たとえば、２−１の先端面
に融合細胞取出口２５が設けらる。この取出口２５にコ
ンジット２６が接続され、図示しないポンプによりバル
ブ２７を介して融合細胞が取り出されるようになってい
る。融合しようとする細胞は、好ましくは、浸透圧およ
び比重調整用としてマンニトール、ソルビトール、グル
コースまたはシュクロース等と、細胞安定性および伝導
度調整剤として塩化カルシュラム（ＣａＣ１ｔ）等並び
にｐＨ緩衝塩等を含む電解質溶液に懸濁され、懸濁液の
状態で上記不均一電界内に導入される。

一方、上記対向平板電極＋１−１，１１２は、リード線
１２およびスイッチ手段１４を介して交流（ＡＣ）電源
回路Ｉ３と接続されるとともにリード線１２およびスイ
ッチ手段１６を介してパルス発生器１５と接続される。

両スイッチ手段１４および１６は、たとえば、トランジ
スタ等から成る電子スイッチが用いられ、公知の方法に
より制御回路１７に設定された所定のタイムチャートに
従ってオン・オフ制御される。この構成により、交流電
源回路■３からスイッチ手段１４を介して平板電極１１
−１１１１−２に周波数的１０ＫＨｚ〜５００ＫＨｚ、
ピーク電圧的５ｖ〜２０００Ｖ（ボルト）の正弦波交流
ｍｍが約Ｉ秒〜６００秒間加えられ、前述したようにチ
ャンバ６−１，６−２および導通路５の内部領域に、該
導通路５の狭隘部７において電気変位を最大もしくは極
大とする不均一電界が形成される。なお、交流電源回路
！３の出力波形は正弦波に限らず、三角波、方形波ある
いは鋸歯状波等であってもよい。また、上記狭隘部７に
細胞が接触状態に集合した後、パルス発生器１５からス
イッチ手段１６を介して平板電極＋　１−１，１１−２
にパルス幅約１．０μ５ｅｃ（マイクロ秒）〜１０ｍ５
ｅｃ（ミリ秒）、ピーク電圧的１Ｏｖ（ボルト）〜５Ｋ
Ｖ（キロボルト）の方形状パルスが約１　ｍ５ｅｃ（ミ
リ秒）〜数ｍ５ｅｃ（数ミリ秒）の間隔で１〜数回加え
られる。このようにして、上記狭隘部７に集合した細胞
対に電気パルスによる刺激が加えられ、公知の成長過程
をもって細胞融合が成就される。なお、このパルス発生
器１５の出力パルスは上記交流電源回路１３の出力電圧
に重畳して平板電極１１−１．１１−２に加えるように
してもよい。これにより、細胞融合処理の所要時間の短
縮化を図ることができる。

次に、上記構成の装置を使用して異種細胞Ａ、Ｂの融合
を行う操作について説明する。

まず、バルブ２３−１を開いて装入口２１−１からチャ
ンバ６−１内に細胞Ａを懸濁した懸濁液を注入するとと
もにバルブ２３−２を開いて装入口２Ｉ−２からチャン
バ６−２に上記懸濁液と同様の細胞Ｂを懸濁した懸濁液
を注入する。

次いで、制御回路１７により公知の方法でスイッチ手段
１４を閉じ、交流電源回路１３から該スイッチ手段Ｉ４
を介して平板電極１１−１．１１−２間に、たとえば、
周波数的１００ＫＨｚ（キロヘルツ）、ピーク電圧的４
０Ｖ〜８０Ｖの正弦波、三角波または方形波等の交流電
圧を印加する。この場合、電極間距離は２ミリメートル
（ｍｍ）であった。

両手板電極＋１−１，１１−２、枠体Ｉおよび突起部２
−１．２−２により区画された領域、即ち、密閉チャン
バ６−１，６−２および導通路５の内部領域には該導通
路５の狭隘部７における電気変位を最大とする不均一電
界が形成される。以下に、この狭隘部７における電気変
位の最大となる部分を極大点という。なお、上記装置の
平板電極間距雌、平板電極寸法、導通路寸法は次のとお
りであった。： 平板電極間距離　　　　；　　２．Ｏｍｍ。

平板電極寸法（幅×高さ）；　０．８ｍｍＸ０．５ｍｍ
、導通路寸法（ｄｘｈｘ（り　　；　　（０，１−０，
２５ｎ＋＋ｎ）Ｘ（０，５ｍｍ）Ｘ（０，０１ｍｍ） 上記不均一電界がチャンバ６−１，６−２および導通路
５内の細胞Ａ、Ｈに作用すると、各細胞Ａ、Ｈの細胞膜
部分に電気二重層が誘起され、即ち、分極される。これ
らの分極された細胞Ａ、　Ｂは当該不均一電場のエネル
ギーに基づき狭隘部７の極大点に向かって移動、いわゆ
る、誘電泳動する。ある瞬時における誘電泳動の様子を
模擬的に第３図に示す。即ち、チャンバ６−１内の細胞
Ａは平板電極１１−１側から極大点に向かって移動する
一方、チャンバ６−２内の細胞Ｂは上記細胞Ａの移動方
向とは逆方向に平板電極１に一２側から極大点に向かっ
て移動する。そして、互いに近接した細胞Ａ、Ｂは各細
胞の異極性の分極電荷間に作用するクーロン力に基づき
互いに吸引され、接触状態となる。この様子は、当該装
置の透明ガラス板８側に設置した図示しない顕微鏡を介
して観察することができる。

なお、上記狭隘部７において細胞Ａ、Ｂが３個以上数珠
状に連ねられる、たとえば、細胞対Ａ−Ａ−Ｂ−Ｂ、Ａ
−Ａ−Ａ−Ｂ、Ａ−Ｂ−Ｂ等が生じるようなときには、
上記不均一電界発生用の交流電圧印加時間を適宜調節す
ることにより１個の細胞Ａと１個の細胞Ｂとから成る細
胞対Ａ−Ｂを得ることができる。

次いで、スイッチ手段１６を閉じ、パルス発生器１５か
ら該スイッチ手段１６を介して平板電極１１−１，１に
２間にピーク電圧約５０Ｖ〜２００Ｖ１パルス幅約２０
　ｍ５ｅｃ　〜２００　ｐ　ｓｅｃの方形状パルスを１
秒〜数秒の間隔をもって１〜数回印加する。これにより
、細胞懸濁溶液を介して導通路５の狭隘部７に集合した
細胞対Ａ−Ｂに電気パルス刺激が加わり、これらの細胞
対Ａ−Ｂはそれぞれ融合する。

次ぎに、バルブ２７を開き、図示しないポンプよりそれ
ぞれコンジット２２−１および２２−２を介して細胞Ａ
およびＢの懸濁液をチャンバ６−１．６−２内に導入す
る。これで細胞融合操作の１サイクルが完了する。

その後、再び上述したように、不均一電界の発生、細胞
Ａ、Ｂの集合、細胞対Ａ−Ｂへの電気刺激の印加、融合
細胞の取り出しおよび新しい細胞Ａ、Ｈの導入操作を繰
り返し行う。

なお、上述したと同様にして、３個以上の細胞を集合さ
せて融合することもできる。

次ぎに、上記装置の幾つかの変形例を第４図〜第８図と
ともに説明する。なお、これらの図面において、第１図
および第２図の装置における構成部分と等価の部分には
同一符号を付してその説明を省略する。

第４図の装置は、突起部２−１，２−２に代え、複数の
貫通孔３１を有する電気絶縁板体３０を平等電界発生用
平板電極１１−１、ｌｌ−２間に設置して構成したもの
である。各貫通孔３Ｉは、上記突起部２−１，２−２に
より形成される導通路５と同様、中央部で断面積が最小
もしくは極小となるテーパー面を形成している。このよ
うにして、両手板電極１１−Ｌ　　１１−２間に電圧を
印加した際に各貫通孔３１の狭隘部３２で電気変位が極
大となる。又、両手板電極１１−１，１１−２と当該電
気絶縁板体３０との間部はチャンバ６−１１６−２とし
て使用される。この構成により異種細胞の細胞融合を効
能率に行うことができる。

上記電気絶縁板体３０および平板電極１１−１．１１−
２は、第５図に示すように、水平状に配置するようにし
てもよい。これにより、融合細胞の自重を有効に利用し
て下側のチャンバ６−１に誘導し、該チャンバ６−１を
融合細胞の取り出し用コンジットとしても兼用すること
ができる。

また、第６図および第７図に示すように、電気絶縁板体
３３の下端部３４を凸状に形成し、該下端部３６と当該
装置の底面部の透明ガラス板８とで中央部の断面積が最
小もしくは極小となる導通路３５を形成するようにして
もよい。この電気絶縁板体３３は融合しようとする細胞
の大きさに応じて白抜き矢印で示すように上・下に移動
調整可能とされる。これにより第７図の表面に沿って上
・下方向に、即ち、当該狭隘部３７において水平にかつ
単層状に整列して互いに接触した直鎖状の複数の細胞群
を生成することができる。

さらに、第８図の装置においては、上記透明ガラス板８
に代えて、貫通長穴３９を有する電気絶縁板３８が設置
されるとともに該貫通長穴３９の下側開口を閉塞するよ
うに電極板４１が設置される。上記貫通長穴３９の上側
開口４０は上記電気絶縁板体３３の下端部３４の凸状部
と相似形態とされ、該開口４０に下端部３４の凸状部を
突入させることにより当該貫通長穴３９が密閉され、こ
の密閉部は細胞取り出し用コンジットとして使用される
。細胞集合用の不均一電界は第６図および第７図の装置
におけると同様にして対向平板電極ｌｌ−１、ｔ　Ｉ−
２間に電圧を印加することにより形成される一方、細胞
融合誘発用の電圧は平板電極１　＋−１および１１−２
と電極板４Ｉとの間に印加される。

なお、上述した実施例において、チャンバ６−１．６−
２は好ましくは溶液装填を容易にすべく密閉状とされる
が、蓋体の無い解放状のものとしてもよい。

上述した実施例において、対向電極間に交流電圧に代え
て直流電圧を印加して不均一電界を形成し、負の平板電
極側のチャンバに負電荷を有するベクターを装入する一
方、正の平板電極側のチャンバに細胞を装入し、細胞を
導通路５の狭隘部７に向けて誘電泳動させる一方、負電
荷を有するベクターを直流電界に基づき狭隘部７に向け
て電気泳動させる。このようにして、狭隘部７において
細胞とベクターを互いに接触させて該細胞にベクターを
導入することができる。

またミチャンバ６−１と６−２にそれぞれ細胞と所定の
物質、例えば、ＤＮＡ等が封入されたマイクロカプセル
を装入し、前述した異種の細胞融合と同様にして細胞と
マイクロカプセルとを互いに接触させ、次いで両者を融
合させて該細胞に所定の物質を導入することもできる。

発明の効果 この発明によれば、対向電極間領域の中間位置に電気変
位または電束密度が最大もしくは極大となる極大点を形
成し、上記極大点の相対向する側方位置から装入した分
極性微粒体を該不均一電界に基づき誘電泳動させて該極
大点で互いに接触させるものであるから、従来方式のも
のにおけるように誘電泳動される分極性微粒体が直接電
極に接触することもなく、したがって、電極を汚損する
こともなく安定した不均一電界を形成でき、それだけ安
定した集合操作を行うことができる。特に、分極性微粒
体が細胞である場合、電極の汚損を防止できるのみなら
ず、細胞自体の傷損を有効に防止することができる。

また、異種の分極性微粒体を種類毎に極大点の相対向す
る側方位置から極大点に向けて集合するようにしたから
、確実に互いに接触した所定の組み合わせの分極性微粒
体群を得ることができる。

特に、互いに異なった２種の細胞を融合するのに用いた
場合、極大点の相対向する側方位置から種類毎に細胞を
当該不均一電界内に装入すれば異種の組み合わせの細胞
対のみが得られ、したがって、選別作業を必要としない
ので高能率に異種細胞の融合を達成することができる。

なお、本発明は、細胞融合に限らず、他の分極性微粒体
の集合操作、例えば、マイクロカプセル法による細胞へ
の所定物質の導入とか、ＤＮＡ−ベクターの導入等に使
用すれば非常に高能率に導入操作を達成することができ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の一実施例の装置の構成を示す一部断
面図、第２図は第１図の■−■線断面図、第３図は上記
装置に形成される不均一電界の説明図、第４図はこの発
明の変形例の部分断面図、第５図はこの発明のもう１つ
の変形例の要部断面図、第６図はさらにもうｉつの変形
例の一部切欠した部分断面図、第７図は第６図の■−■
線断面図、第８図は更にもう１つの変形例の要部断面図
である。 ｌ・・・電気絶縁材製枠体、２−１．２−２・・・突起
部、　３・・・テーパー面（傾斜面）、　　５・・導通
路、６．−１，６−２・・・チャンバ、７・・・狭隘部
、８・・・透明ガラス板、９・・・蓋体、　　１１−１
．Ｉｆ−２・・・平板電極、１２・・−リード線、１３
・・・交流電源回路、１４・・・スイッチ手段、Ｉ５・
・・直流パルス発生器、１６・・・スイッチ手段、２＋
−１，２１２・・・装入口部、２２−１，２２−２．２
６・・・コンジット、２３−１．２３−２．２７・・・
バルブ、２５・・・融合細胞取出し口部、３０・・・電
気絶縁板体、３１・・・貫通孔、３２・・・狭隘部、３
３・・・電気絶縁板体、３４・・・凸状の下端部、３５
・・・導通路、３７・・・狭隘部、３９・・・貫通長穴
、４０・・・開口。 特許出願人　　　三洋電機株式会社 代　理　人　弁理士　青　山　葆　はか１名第８図

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）不均一電界内で複数の分極性微粒体を誘電泳動さ
   せて該不均一電界における電気変位の極大となる位置に
   互いに接触状態に集合させるにあたり、 電界発生用の対向電極間領域における中間位置に電気変
   位の極大点を有する不均一電界を発生させる一方、該極
   大点と上記両電極との中間位置から当該不均一電界内に
   分極性微粒体を装入することを特徴とする集合方法。
2. （２）異種の分極性微粒体が種類毎に極大点と電界発生
   用の対向電極との相対向する中間位置から当該不均一電
   界内に装入される特許請求の範囲第１項に記載の集合方
   法。
3. （３）対向電極間に電解質溶液を装填し、該電解質溶液
   に異種の分極性微粒体を懸濁する特許請求の範囲第１項
   または第２項に記載の集合方法。
4. （４）異種の分極性微粒体が互いに異なる２種の細胞で
   ある特許請求の範囲第３項に記載の集合方法。
5. （５）不均一電界内において集合により互いに接触させ
   られた複数の細胞に電気パルスを印加して細胞融合を行
   わせる特許請求の範囲第４項に記載の集合方法。
6. （６）電解質溶液が細胞融合誘発剤を含みかつ異種の分
   極性微粒体が細胞である特許請求の範囲第３項に記載の
   集合方法。
7. （７）異種の分極性微粒体が細胞と所定の物質を包含す
   るマイクロカプセルである特許請求の範囲第３項に記載
   の集合方法。
8. （８）異種の分極性微粒体が細胞とＤＮＡ−ベクターで
   ある特許請求の範囲第３項に記載の集合方法。
9. （９）不均一電界内で複数の分極性微粒体を誘電泳動さ
   せて該不均一電界における電気変位の極大となる位置に
   互いに接触状態に集合させる装置において、 電気絶縁性の容器、 上記容器内に互いに平行に所定の間隔をもって対向させ
   られた電界発生用の平板状電極、 上記平板状電極と接続された電源回路、 上記平板状電極間の電界形成空間に介在させられ、該両
   平板状電極間の中間位置において断面積が極小となる導
   通路を形成する電気絶縁体、および 上記導通路における狭隘部の相対向する両側方位置にそ
   れぞれ該導通路と連絡した複数の分極性微粒体装入口部
   を備え、 上記電源回路から平板状電極間に所定電圧を印加するこ
   とにより上記導通路の狭隘部において電気変位が極大と
   なる不均一電界を形成せしめることを特徴とする装置。
10. （１０）電気絶縁体が板状体とされ、該板状体の両面か
    らそれぞれ内方に向けて開口断面積の漸減するテーパー
    面を形成した少なくとも１つの貫通部を設けた特許請求
    の範囲第９項に記載の装置。
11. （１１）導通路が電気絶縁性板体の一端面に凸状に形成
    された傾斜もしくは円曲面と該面と対向したもう１つの
    電気絶縁性板体の一方の面とで形成される特許請求の範
    囲第９項に記載の装置。
12. （１２）電源回路が対向平板電極間に約５ＫＨｚ〜１０
    ＭＨｚ、電界の強さ約１０Ｖ／ｃｍ〜２ＫＶ／ｃｍの電
    界を発生する交流電圧を出力する特許請求の範囲第９項
    〜第１１項のいづれかに記載の装置。
13. （１３）容器の平板状電極間の中間領域に所定の電解質
    溶液が装填されるとともに該電解質溶液に細胞が懸濁さ
    れる一方、 もう１つのパルス電源回路が設けられ、該パルス電源回
    路から対向平板状電極を介して導通路において互いに接
    触状態とされた複数の細胞にパルス電圧を印加して細胞
    融合を行わせる特許請求の範囲第９項〜第１２項のいづ
    れかに記載の装置。
14. （１４）導通路の狭隘部に融合細胞取出し手段を設けた
    特許請求の範囲第１３項に記載の装置。