JPS63269977A - 細胞融合方法 - Google Patents
細胞融合方法Info
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- JPS63269977A JPS63269977A JP62104250A JP10425087A JPS63269977A JP S63269977 A JPS63269977 A JP S63269977A JP 62104250 A JP62104250 A JP 62104250A JP 10425087 A JP10425087 A JP 10425087A JP S63269977 A JPS63269977 A JP S63269977A
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は細胞融合装置に係り、特に、多数の細胞を所望
の組合せで融合せしめるのに好適な細胞融合装置に関す
る。
の組合せで融合せしめるのに好適な細胞融合装置に関す
る。
異種細胞に電気パルスを加えて融合せしめる細胞融合法
に関しては、従来、ザ・ジャーナル・オブ・メンブレン
・バイオロジー、６７ （１９８２年）第１６５頁から
１８２頁（Ｊ、ｏｆ ＭｅｍｂｒａｎｅＢｉｏｌｏｇｙ
、ｖｏｌ、６７ （１９８２）ＰＰ１６５−１８２）
において論じられている。
に関しては、従来、ザ・ジャーナル・オブ・メンブレン
・バイオロジー、６７ （１９８２年）第１６５頁から
１８２頁（Ｊ、ｏｆ ＭｅｍｂｒａｎｅＢｉｏｌｏｇｙ
、ｖｏｌ、６７ （１９８２）ＰＰ１６５−１８２）
において論じられている。
上記の従来技術では、異種の細胞群が分散している液に
交流電界を加えることによって、細胞を鏡状に連結させ
た状態（バールチェーン）を作り、しかる後に電気パル
スを加えることによって、接触した細胞同士を融合せし
めるものであった。このため、融合した細胞は必ずしも
２種の細胞ＡおよびＢの組合せ、すなわちＡ−Ｂ、たけ
てなくＡ−Ａ、あるいはＢ−Ｂ、またＡ−Ａ−Ａ、Ａ−
Ａ−Ｂなどの様々の組合せが混じり合っている。さらに
液中には融合されなかった細胞群Ａ、Ｂを混入しており
、その中から所望のＡ−Ｂの組合せで融合した細胞を選
抜し培養するには、大きな困難を伴っていた。
交流電界を加えることによって、細胞を鏡状に連結させ
た状態（バールチェーン）を作り、しかる後に電気パル
スを加えることによって、接触した細胞同士を融合せし
めるものであった。このため、融合した細胞は必ずしも
２種の細胞ＡおよびＢの組合せ、すなわちＡ−Ｂ、たけ
てなくＡ−Ａ、あるいはＢ−Ｂ、またＡ−Ａ−Ａ、Ａ−
Ａ−Ｂなどの様々の組合せが混じり合っている。さらに
液中には融合されなかった細胞群Ａ、Ｂを混入しており
、その中から所望のＡ−Ｂの組合せで融合した細胞を選
抜し培養するには、大きな困難を伴っていた。
本発明の目的は、上記の問題点を解決し、所望の単位細
胞のみを大量に融合させることが可能な細胞融合装置を
提供することにある。
胞のみを大量に融合させることが可能な細胞融合装置を
提供することにある。
上記目的は、融合すべき少なくとも一対の単位細胞を収
納する微小な容器（マイクロチャンバと称する）を密に
配置した部材（チャンバプレートと称する）を用意し、
それぞれの容器内に細胞を導入すること、および、該部
材の一部に電極を形成し、容器内の細胞対に電圧を印加
することによって達成される。
納する微小な容器（マイクロチャンバと称する）を密に
配置した部材（チャンバプレートと称する）を用意し、
それぞれの容器内に細胞を導入すること、および、該部
材の一部に電極を形成し、容器内の細胞対に電圧を印加
することによって達成される。
細胞を収納する容器に供給された細胞は、容器から飛び
出さないように、液体的手段等によって容器内に保持さ
れる。これによって、近隣に配置された容器との間での
細胞の移動、混入は生じない。一方、電極は容器内の融
合すべき少なくとも１対の細胞の間にのみ電圧を加える
ことができるように配置されている。これによって、容
器内に形成した個々の単位細胞についてのみ融合が行わ
れる。
出さないように、液体的手段等によって容器内に保持さ
れる。これによって、近隣に配置された容器との間での
細胞の移動、混入は生じない。一方、電極は容器内の融
合すべき少なくとも１対の細胞の間にのみ電圧を加える
ことができるように配置されている。これによって、容
器内に形成した個々の単位細胞についてのみ融合が行わ
れる。
〔実施例〕
以下、本発明を実施例を用いて詳細に説明する。
第１図には、本発明を用いたチャンバプレートの概観と
、その一部の断面を示している。プレート本体１には、
細胞を収納するマイクロチャンバ２が多数配置されてい
る。マイクロチャンバの底には、スリット３が設けてあ
り、液体が貫流する構造になっている。融合すべき細胞
は、蔗糖やマニトール溶液中に分散して、マイクロチャ
ンバに１個ずつ供給される。１個ずつ細胞を送り込む方
゛？」、てｔ”、例えば特開昭６２−３２８７４で知ら
れているような流体的な方法がある。マイクロチャンバ
に入った細胞粒子４は、チャンバの底に設けたスリット
３を介してチャンバ裏面から負圧で吸引されることによ
り、チャンバ底面に吸着されてチャンバ外に出ることは
ない。この目的から、チャンバ底面に設けたスリットの
幅は細胞粒子の直径より小さくなくてはならない。
、その一部の断面を示している。プレート本体１には、
細胞を収納するマイクロチャンバ２が多数配置されてい
る。マイクロチャンバの底には、スリット３が設けてあ
り、液体が貫流する構造になっている。融合すべき細胞
は、蔗糖やマニトール溶液中に分散して、マイクロチャ
ンバに１個ずつ供給される。１個ずつ細胞を送り込む方
゛？」、てｔ”、例えば特開昭６２−３２８７４で知ら
れているような流体的な方法がある。マイクロチャンバ
に入った細胞粒子４は、チャンバの底に設けたスリット
３を介してチャンバ裏面から負圧で吸引されることによ
り、チャンバ底面に吸着されてチャンバ外に出ることは
ない。この目的から、チャンバ底面に設けたスリットの
幅は細胞粒子の直径より小さくなくてはならない。
上記のようにして２種の細胞群から１個ずつの細胞をす
べてのチャンバ内に供給すれば、所望の細胞対がチャン
バ内に形成される。
べてのチャンバ内に供給すれば、所望の細胞対がチャン
バ内に形成される。
次いで、細胞間に融合を生じさせるために、各チャンバ
の中に電界を加える。このために本発明では、第１図に
示すように、Ｐｔからなる電極５８および５ｂをその端
部が各チャンバ内に配置されるようにチャンバプレート
上に形成した。電極５ａ、５１）の間に電気的パルスを
加えることにより、チャンバ内には電界が生じ、電気的
な融合が可能になる。この結果融合するのは、所望の組
合せの細胞対のみである０本例ではチャンバプレート表
面からチャンバ内に深く電極が伸長しており、融合しよ
うとする細胞のごく近くまで１！極を近づけることが可
能である。この結果、融合に必要な電圧パルスの大きさ
は電極間隙に比例して小さくなり、在来の電気融合用チ
ャンバに比べて電極配置の適正化により、チャンバプレ
ート上の全チャンバに同時に電圧を印加すれば、逐次パ
ルスを印加することができるから、電極間の静電容量が
実効的に小さくなる結果、融合効率を左右する電圧パル
スの波形が鈍ることなくチャンバ内に加わる。
の中に電界を加える。このために本発明では、第１図に
示すように、Ｐｔからなる電極５８および５ｂをその端
部が各チャンバ内に配置されるようにチャンバプレート
上に形成した。電極５ａ、５１）の間に電気的パルスを
加えることにより、チャンバ内には電界が生じ、電気的
な融合が可能になる。この結果融合するのは、所望の組
合せの細胞対のみである０本例ではチャンバプレート表
面からチャンバ内に深く電極が伸長しており、融合しよ
うとする細胞のごく近くまで１！極を近づけることが可
能である。この結果、融合に必要な電圧パルスの大きさ
は電極間隙に比例して小さくなり、在来の電気融合用チ
ャンバに比べて電極配置の適正化により、チャンバプレ
ート上の全チャンバに同時に電圧を印加すれば、逐次パ
ルスを印加することができるから、電極間の静電容量が
実効的に小さくなる結果、融合効率を左右する電圧パル
スの波形が鈍ることなくチャンバ内に加わる。
以下にチャンバプレー１−の製造プロセスの１例を第２
図を用いて説明する。プレートの素材はＳｉ単結晶の（
１００）ウェハ６であり、板厚３９０μｍ、直径は７６
ｍである。チャンバを形成するにはＫＯＨ水溶液による
異方性エツチングを利用し、サイドエッチを防いで精密
なエッチプロフィルを得る。まず、第２図（ａ）に示す
ようにウェハの裏面からチャンバのスリットに相当する
部分７をエツチングし、次いで第２図（ｂ）に示すよう
に裏面からチャンバ本体の部分８をエツチングする。い
ずれもエツチングのマスクとしてはＳｉＯ２膜を使い、
エツチングする裏面も５ｊＯｚ膜で保護しておく。この
結果第２図（Ｑ）に示すようにチャンバ底厚約２５μｍ
、スリット幅約１５μｍのチャンバができる。この大き
さのチャンバは約６００μｍの間隔でＳｉウェハの全面
に形成することができるから、１ウエハ上に約５０００
個程度のチャンバを作ることができる。
図を用いて説明する。プレートの素材はＳｉ単結晶の（
１００）ウェハ６であり、板厚３９０μｍ、直径は７６
ｍである。チャンバを形成するにはＫＯＨ水溶液による
異方性エツチングを利用し、サイドエッチを防いで精密
なエッチプロフィルを得る。まず、第２図（ａ）に示す
ようにウェハの裏面からチャンバのスリットに相当する
部分７をエツチングし、次いで第２図（ｂ）に示すよう
に裏面からチャンバ本体の部分８をエツチングする。い
ずれもエツチングのマスクとしてはＳｉＯ２膜を使い、
エツチングする裏面も５ｊＯｚ膜で保護しておく。この
結果第２図（Ｑ）に示すようにチャンバ底厚約２５μｍ
、スリット幅約１５μｍのチャンバができる。この大き
さのチャンバは約６００μｍの間隔でＳｉウェハの全面
に形成することができるから、１ウエハ上に約５０００
個程度のチャンバを作ることができる。
このチャンバに電極を形成するため、Ｓｉの全面をＳｉ
Ｏ２，膜で覆い絶縁した後、第２図（ｄ）に示すように
ポジレジスト１０を塗布する。このような凹凸の激しい
表面にはレジスト膜が一定の厚さに塗布できないから、
このままでは電極パターンを形成できない。そこで第２
図（ｅ）に示すように遮光膜１１としてＣｒを全面に蒸
着し、これに電極パターンの反転像１２をホトリソグラ
フィで形成する。次いで上面から平行光を当てながら、
厚いレジスト層を現像していくと、第２図（ｇ）に示す
ように電極パターンが形成できる。
Ｏ２，膜で覆い絶縁した後、第２図（ｄ）に示すように
ポジレジスト１０を塗布する。このような凹凸の激しい
表面にはレジスト膜が一定の厚さに塗布できないから、
このままでは電極パターンを形成できない。そこで第２
図（ｅ）に示すように遮光膜１１としてＣｒを全面に蒸
着し、これに電極パターンの反転像１２をホトリソグラ
フィで形成する。次いで上面から平行光を当てながら、
厚いレジスト層を現像していくと、第２図（ｇ）に示す
ように電極パターンが形成できる。
ここに電極材としてＰｔ１３を全面に蒸着し、第２図（
ｈ）リフトオフの手法で不要部を除去すれば、第２図（
ｉ）に示すように電極がチャンバ内に形成される。
ｈ）リフトオフの手法で不要部を除去すれば、第２図（
ｉ）に示すように電極がチャンバ内に形成される。
上記の実施例では、電極をすべてチャンバ内に配置した
が、第３図に示すようにチャンバプレー・ト１４の表と
裏に電極１５ａおよび１５ｂを形成しても細胞１６を融
合させることができる。またこれらの電極の一方をチャ
ンバプレート上に形成し、他方を外部電極１９として接
近させても同様の効果が得られることは当然である。
が、第３図に示すようにチャンバプレー・ト１４の表と
裏に電極１５ａおよび１５ｂを形成しても細胞１６を融
合させることができる。またこれらの電極の一方をチャ
ンバプレート上に形成し、他方を外部電極１９として接
近させても同様の効果が得られることは当然である。
さらに、上記実施例ではチャンバプレートをＳｉで形成
したが、他の材料、例えば感光性ガラスを用いても、チ
ャンバプレート本体を形成することができる。また、細
胞を供給するのに液滴中に１個の細胞を入れてチャンバ
内に供給すれば、チャンバ底面のスリットは必ずしも必
要でない。
したが、他の材料、例えば感光性ガラスを用いても、チ
ャンバプレート本体を形成することができる。また、細
胞を供給するのに液滴中に１個の細胞を入れてチャンバ
内に供給すれば、チャンバ底面のスリットは必ずしも必
要でない。
この場合には、第４図に示すように電極１７ａおよび１
７ｂによって、細胞１８を融合することができる。
７ｂによって、細胞１８を融合することができる。
また、さきの実施例では細胞をチャンバ内に留めておく
手段として、流体的な手段を用いたが、本発明における
チャンバ内配線を利用して、静電的に細胞を電極部分に
吸着させておくことも可能である。
手段として、流体的な手段を用いたが、本発明における
チャンバ内配線を利用して、静電的に細胞を電極部分に
吸着させておくことも可能である。
、（電極材料としてはｐｔ以外にもＡｕなど、イオン化
しにくく、生体に害を及ぼしにくい導電体が使用可能で
ある。
しにくく、生体に害を及ぼしにくい導電体が使用可能で
ある。
また、上記実施例では細胞対を融合するものについて示
したが、例えば３個の細胞を融合する場合にはチャンバ
内に融合すべき３個の細胞を入れて融合させることも可
能である。
したが、例えば３個の細胞を融合する場合にはチャンバ
内に融合すべき３個の細胞を入れて融合させることも可
能である。
本発明によれば、細胞を電気的な手段によって大量に融
合させるプロセスにおいて、所望の組合せの少なくとも
一対の細胞を融合させることが可能になる。従来は集団
的に融合した細胞群の中から、所望の組合せの細胞を選
抜することができない、あるいは選抜法が極めて煩雑で
あるなどの障害があったが、本発明によれば、この困難
が解消される。
合させるプロセスにおいて、所望の組合せの少なくとも
一対の細胞を融合させることが可能になる。従来は集団
的に融合した細胞群の中から、所望の組合せの細胞を選
抜することができない、あるいは選抜法が極めて煩雑で
あるなどの障害があったが、本発明によれば、この困難
が解消される。
第１図は本発明の一実施例を示す細胞融合装置のチャン
バプレートの一部を切断した概観図、第２図は第１図の
チャンバプレートの製造工程の一実施例を示す断面図、
第３図はチャンバプレートの他の実施例を示す断面図、
第４図はチャンバプレートのさらに他の実施例を示す断
面図である。 １・・・チャンバプレート本体、２・・・マイクロチャ
ンバ、３・・・スリット、４・・・細胞、５ａ・・・電
極、５ｂ・・・電極。 ぢ １ 区 第 ２ 口 （ｅ）
（子ン（毛） （賃４ 第３ 口 ＋ ｒ／’／ ｒ−＋−一 第４区
バプレートの一部を切断した概観図、第２図は第１図の
チャンバプレートの製造工程の一実施例を示す断面図、
第３図はチャンバプレートの他の実施例を示す断面図、
第４図はチャンバプレートのさらに他の実施例を示す断
面図である。 １・・・チャンバプレート本体、２・・・マイクロチャ
ンバ、３・・・スリット、４・・・細胞、５ａ・・・電
極、５ｂ・・・電極。 ぢ １ 区 第 ２ 口 （ｅ）
（子ン（毛） （賃４ 第３ 口 ＋ ｒ／’／ ｒ−＋−一 第４区
Claims (1)
- １、融合を目的とする少なくとも一対の単位細胞を収納
するためのチャンバを複数個形成したチャンバプレート
を有する細胞融合装置において、融合を誘起せしめるた
めの電極が上記チャンバプレートの各チャンバの表面の
一部に形成されていることを特徴とする細胞融合装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62104250A JP2619387B2 (ja) | 1987-04-30 | 1987-04-30 | 細胞融合方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62104250A JP2619387B2 (ja) | 1987-04-30 | 1987-04-30 | 細胞融合方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63269977A true JPS63269977A (ja) | 1988-11-08 |
| JP2619387B2 JP2619387B2 (ja) | 1997-06-11 |
Family
ID=14375687
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62104250A Expired - Lifetime JP2619387B2 (ja) | 1987-04-30 | 1987-04-30 | 細胞融合方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2619387B2 (ja) |
Cited By (7)
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| FR2659347A1 (fr) * | 1990-03-12 | 1991-09-13 | Agronomique Inst Nat Rech | Dispositif de culture de cellules assurant leur immobilisation. |
| WO1993002178A1 (en) * | 1991-07-22 | 1993-02-04 | Schmukler Robert E | Apparatus and methods for electroporation and electrofusion |
| WO1999064581A1 (en) * | 1998-06-10 | 1999-12-16 | University Of South Florida | Electrofusion chamber |
| JP2004504022A (ja) * | 2000-07-14 | 2004-02-12 | ユニバーシティ オブ サウス フロリダ | 電気融合チャンバ |
| US7501276B2 (en) * | 1998-05-27 | 2009-03-10 | Micronas Gmbh | Apparatus for intracellular manipulation of a biological cell |
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| JPS63173573A (ja) * | 1987-01-13 | 1988-07-18 | Nok Corp | 細胞融合用電極 |
-
1987
- 1987-04-30 JP JP62104250A patent/JP2619387B2/ja not_active Expired - Lifetime
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2619387B2 (ja) | 1997-06-11 |
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