JP4918811B2 - 細胞融合用チャンバーおよび細胞融合装置、並びにそれらを用いた細胞融合方法 - Google Patents
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Description
(1)本発明の細胞融合用チャンバーは、細胞融合を行なう細胞融合領域内に対向するように配置された導電部材よりなる一対の電極と、前記一対の電極間に介在し、かつ前記一対の電極方向に貫通した微細孔を有する隔壁とからなる、直径の異なる2種類の細胞を融合させる細胞融合用チャンバーであって、前記隔壁の微細孔の直径が、直径の大きい細胞の直径以下、直径の小さい細胞の直径以上である細胞融合用チャンバーであって、このようにすることで、微細孔の位置で電気力線の向きと同一方向に直径の異なる2つの細胞を接触させることができるようになり、より確実に細胞融合させることができる。また、融合した細胞を取り出す場合は、直径の大きい細胞を導入したチャンバー側から吸引する、あるいは直径の小さい細胞を導入したチャンバー側から加圧することで、容易に細胞を取り出すことが可能となり、電気的細胞融合において、より確実に細胞融合を実施でき、細胞融合後、速やかに細胞を取り出すことができる。
(2)本発明の細胞融合装置においては、微細孔を形成した絶縁体を細胞融合領域側のどちらか一方の電極面上に配置することで、微細孔に細胞を確実に固定し、微細孔近傍にある2細胞一対を選択的に細胞融合させることができ、2細胞一対での細胞融合を効率的に行うことが可能となる。
(3)本発明の細胞融合装置においては、微細孔の平面形状に内接する最大円の直径が、微細孔に固定する細胞の直径の1以上2倍未満の範囲であり、かつ微細孔の深さが、前記微細孔に固定する細胞の直径以下であり、このようにすることで、微細孔に確実に細胞を固定することができる。
(4)本発明の細胞融合装置においては、微細孔が絶縁体上に複数個、アレイ状に形成されており、このようにすることで、複数の微細孔に固定した2細胞一対の細胞を同時に細胞融合させることが可能となり、2細胞一対での細胞融合を効率的に行うことが可能となる。
(5)本発明の細胞融合装置においては、微細孔の隣り合う間隔が、微細孔に入れる細胞の直径の0.5倍以上6倍以下の範囲であり、このようにすることで、1つの微細孔に1つの細胞を固定する確率を高めることができ、微細孔において2細胞を一対で接触させる確率を上げることが可能になる。
(6)本発明の細胞融合装置においては、交流電源により電極間に印加する交流電圧の波形を制御することで、1つの微細孔に1つの細胞を固定することが可能となる。
(7)本発明の細胞融合方法においては、上記記載の細胞融合装置を用いた細胞融合方法であって、細胞融合領域内に第1の細胞を導入し、交流電圧を印加することで微細孔内に前記第1の細胞を固定した後、細胞融合領域内に第2の細胞を導入して、交流電圧を印加することで第1の細胞に第2の細胞を微細孔の位置において接触させ、直流パルス電圧を印加して細胞融合する細胞融合方法であり、前記交流電圧は、前述した波形を有する交流電圧であることが好ましく、また、第1の細胞と第2の細胞が微細孔表面の近傍で細胞融合するものであり、このようにすることで、微細孔近傍にある2細胞一対を選択的に細胞融合させることができ、2細胞一対での細胞融合を効率的に行うことが可能となる。
(8)本発明の細胞融合方法においては、第1の細胞の直径が、第2の細胞の直径よりも小さいものを用いるものであり、このようにすることで、直径の異なる細胞を細胞融合させる場合の細胞膜の可逆的乱れを生じさせる電圧の違いをある程度キャンセルすることが可能となる。
(実施例1)
実施例1に使用した細胞融合用チャンバーの概略図を図36に示す。また、図37には図36のDD’断面図を示す。基板(36)は透明なシリコーン樹脂からなり、基板に凹部を形成することで細胞融合領域(1)を形成した。また、細胞融合領域には、隔壁(35)が配置され、隔壁に微細孔(9)を設けた。また、融合領域の両側にはそれぞれ導電部材より成る電極(2)を配置した。
図7に実施例2に用いた細胞融合装置の概念図を示す。細胞融合装置は大きく分けて、細胞融合容器(13)と電源(4)から構成される。細胞融合容器は、図7に示すように上部電極(14)と下部電極(15)の間に、スペーサー(16)を配置し、複数の微細孔をアレイ状に形成した絶縁体(8)をスペーサーと下部電極で挟んだ構造を有する。なお、実施例2では、後述するように一般的なフォトリソグラフィーとエッチングにより、下部電極(15)と複数の微細孔をアレイ状に形成した絶縁体を一体形成した微細孔付き絶縁体一体型下部電極(28)を用いた。
比較例1として、通常の電気的細胞融合を行った。電気的細胞融合を行う電極には、電極間1mmの金製のワイヤー電極(ネッパジーン株式会社製、MSゴールドワイヤー電極)を用い、この電極に細胞融合用電源(ネッパジーン製、LF101)を接続した。
図28に比較例2に用いた細胞融合装置の概念図を示す。細胞融合装置は大きく分けて、細胞融合容器(13)と電源(4)から構成される。細胞融合容器は、図28に示すように上部電極(14)と下部電極(15)の間に、スペーサー(16)を2枚配置し、複数の微細孔をアレイ状に形成した絶縁体(8)を2枚のスペーサー間に挟んだ構造を有する。上部電極と下部電極は、縦70mm×横40mm×厚さ1mmのパイレックス(登録商標)基板に、ITOを成膜(膜厚150nm)したものを用いた。スペーサーは、縦40mm×横40mm×厚さ1mmのシリコンシートの中央を縦20mm×横20mmにくりぬいた形状にして用いた。また、図29に示すように、細胞が含有した細胞懸濁液を導入、排出するための導入口(19)と排出口(20)を設けた。複数の微細孔を有する絶縁体(8)は、縦40mm×横40mm×膜厚25μmのポリイミドフィルムに、フォトリソグラフィーとエッチングによる方法により、中央の縦30mm×横30mmのエリアに、微細孔と微細孔の縦と横の間隔が50μmで、縦300個×横300個のアレイ状に並べた直径φ20μmの微細孔を形成し製作した。
2:電極
3:導電線
4:電源
5:交流電源
6:直流パルス電源
7:切換スイッチ
8:絶縁体
9:微細孔
10:細胞A
11:細胞B
12:電気力線
13:細胞融合容器
14:上部電極
15:下部電極
16:スペーサー
17:微細孔A′
18:第1の細胞
19:導入口
20:排出口
21:微細孔A′′
22:第2の細胞
23:ITO
24:パイレックス(登録商標)ガラス
25:レジスト
26:露光用フォトマスク
27:露光
28:微細孔付き絶縁体一体型下部電極
29:コンデンサーA
30:コンデンサーB
31:抵抗
32:融合細胞
33:現像液
34:細胞懸濁液
35:隔壁
36:基板
37:カバー体
38:細胞導入チャンネルA
39:細胞導入チャンネルB
40:細胞導入口A
41:細胞導入口B
42:チューブ
43:ポンプA
44:ポンプB
45:細胞排出チャンネルA
46:細胞排出チャンネルB
47:細胞排出口A
48:細胞排出口B
49:バルブA
50:バルブB
51:融合細胞
52:導電線
53:電源
54:絶縁体
55:微細孔
56:細胞融合容器
57:上部電極
58:下部電極
59:スペーサー
60:細胞A′
61:細胞A′′
62:導入口
63:排出口
64:細胞融合領域
Claims (8)
- 細胞融合領域内に対向して配置される導電部材からなる一対の電極と、前記一対の電極間に平板状のスペーサーを介して配置され、かつ前記対向して配置された電極の方向に貫通した1または複数の微細孔を有した平板状の絶縁体からなる細胞融合容器と、前記一対の電極に交流電圧及び直流パルス電圧を印加する電源とを備え、(1)前記絶縁体は、前記電極の内いずれか一方の電極の細胞融合領域側の電極面上に配置され、(2)前記交流電圧の波形は、0以外の値を有する電圧が一定時間変化しない時間を半周期内に1以上有し、この0以外の値を有する電圧が所定時間変化しない時間は、細胞の静電容量(F)と細胞を含有する細胞懸濁液の抵抗(Ω)の積からなる時定数(S)以上である、ことを特徴とする細胞融合装置。
- 電源が、前記一対の電極に交流電圧を印加するための交流電源及び直流パルス電圧を印加するための直流パルス電源からなり、前記交流電源と前記直流パルス電源とを切り換える切換機構を有することを特徴とする請求項1記載の細胞融合装置。
- 絶縁体に形成される微細孔が、1つの微細孔につき1つの細胞を固定できる形状であることを特徴とする請求項1記載の細胞融合装置。
- 前記交流電圧の波形が、矩形波、台形波、またはこれらを組み合わせた波形であることを特徴とする請求項1記載の細胞融合装置。
- 絶縁体に形成される複数の微細孔が、絶縁体の面においてアレイ状に形成されていることを特徴とする請求項1記載の細胞融合装置。
- スペーサーが、細胞融合領域を形成する貫通孔を有することを特徴とする請求項1記載の細胞融合装置。
- スペーサーが、細胞を導入する導入流路および排出する排出流路を有することを特徴とする請求項1記載の細胞融合装置。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の細胞融合装置を用いた細胞融合方法であって、前記細胞融合領域内に第1の細胞を導入し、交流電圧を印加することで前記微細孔内に前記第1の細胞を固定した後、前記細胞融合領域内に第2の細胞を導入して、交流電圧を印加することで前記第1の細胞に前記第2の細胞を微細孔の位置において接触させ、直流パルス電圧を印加して細胞融合することを特徴とする細胞融合方法。
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