ES2568624T3 - Determinación de la concentración y de la viabilidad del esperma para inseminación artificial - Google Patents
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Abstract
Un método para la determinación objetiva de la concentración total de espermatozoides en una muestra de semen y la proporción de espermatozoides vivos en la misma, que comprende someter la muestra de semen, o una submuestra diluida de la muestra de semen, a tinción selectiva, en el que la tinción selectiva comprende un fluorocromo que se une a ADN y que tiñe todos los espermatozoides combinado con un fluorocromo que se une a ADN y que tiñe de forma selectiva los espermatozoides muertos, en el que la muestra o submuestra se combina con un medio estándar de concentración interna, y la determinación de la concentración total de los espermatozoides y la proporción de espermatozoides vivos se realizan de forma simultánea con un medio de detección sensible a la tinción selectiva y al medio de referencia de concentración interna, en el que la determinación de la concentración total de espermatozoides y la proporción de espermatozoides vivos se realizan usando la misma muestra o submuestra y se realizan de forma simultánea en la misma operación de determinación.
Description
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DESCRIPCION
Determinacion de la concentracion y de la viabilidad del esperma para inseminacion artificial Campo tecnico
La divulgacion se refiere a la determinacion simultanea de la concentracion de esperma y espermatozoides vivos en una muestra de semen.
Antecedentes de la divulgacion
La determinacion exacta y precisa de la concentracion de esperma viable es un tema importante para la industria de la Inseminacion Artificial (IA), ya que proporciona a los individuos de genero masculino y a los clientes la seguridad de que las dosis de inseminacion contienen los recuentos de esperma indicados. Esto es especialmente importante con respecto a la exportacion de semen de especies de animales domesticados (Foote, 1972; Fenton et al., 1990; Woelders 1990; Evenson et al., 1993; Donoghue et al., 1996).
En la tecnica se sabe como usar camaras de recuento, tales como Makler™ (Sefi Medical, Haifa, Israel) o hemocitometros para recuentos de esperma de rutina. Sin embargo, para conseguir una precision y exactitud aceptables se requieren multiples medidas. Este procedimiento requiere mucho tiempo y hace que el uso de las camaras de recuento sea lento. Los recuentos individuales con hemocitometro no son muy precisos debido a errores inherentes en la tecnica, tales como la obtencion de una submuestra representativa de la muestra de semen, etc., y ademas, el proceso es altamente dependiente de las habilidades del operador.
Una tecnica ampliamente usada por la industria de la inseminacion artificial para determinar la concentracion de espermatozoides se basa en la medida espectrofotometrica de la turbidez (Woelders 1990; Evenson et al., 1993). Sin embargo, este metodo requiere una calibracion del espectrofotometro que se repite a intervalos regulares ya que el rendimiento del instrumento variara con el tiempo, por lo que este metodo solamente es tan preciso como el metodo de calibracion. La calibracion se basa con mayor frecuencia en una de las camaras de recuento mencionadas anteriormente, por lo que el metodo de espectrofotometro es solamente tan preciso como los metodos de camara de recuento mencionados anteriormente.
Una desventaja adicional del metodo de espectrofotometro es que los residuos, tales como partfculas de gel en semen de porcino, aumentan la turbidez del semen mediante lo que se introducen errores en el metodo ya que la distincion de los residuos del semen es muy diffcil (Woelders 1990) y el metodo solamente se usa ampliamente debido a la rapidez del metodo y al hecho de que ningun otro metodo funciona de una manera satisfactoria para estas especies.
El semen de especies sin partfculas dejen grandes en el semen se puede analizar en contadores electronicos en los que se hace recuento de las partfculas tienen un tamano de partfcula espedfico (Parks et al., 1985). Sin embargo, los contadores electronicos no son capaces de distinguir celulas de semen a partir de los restos que tiene un tamano de partfcula que corresponde al tamano de partfcula de las celulas de semen. Dado que el semen de la mayona de las especies contiene un gran numero de partfculas que tienen un tamano que corresponde al tamano de los espermatozoides (es decir, gotitas citoplasmaticas) los recuentos resultantes para eyaculados individuales pueden ser muy inexactos (Parks et al., 1985).
La evaluacion de la calidad del semen en centros de inseminacion artificial, asf como en laboratorios para semen humano y la evaluacion de la calidad del semen para semen de animales de laboratorio normalmente se basa en una evaluacion de la movilidad el esperma usando un microscopio de contraste de fases con una fase caliente (Woelders, 1990). Aunque este procedimiento es valioso para asegurar que el semen de muy baja calidad se excluye de la inseminacion artificial, el metodo no tiene una precision o exactitud elevadas. Ademas, el metodo depende en gran medida de la destreza del operador y se observan grandes variaciones en los resultados obtenidos por diferentes operadores.
En la tecnica tambien se conoce como usar citometros de flujo para una caracterizacion del esperma (Szollosi et al., 1986; Takacs et al., 1987; Evenson et al., 1993). En los metodos desvelados, el esperma se ha matado y tenido con yoduro de propidio, PI, para medir la concentracion de esperma. De ese modo, solamente se encuentra concentracion de esperma. Una desventaja del metodo es que no se proporciona una indicacion de la cantidad de espermatozoides vivos.
En otro metodo, solamente se tinen con yoduro de propidio los espermatozoides muertos, tras lo cual se detecta la luz dispersada desde las partfculas sin tenir (incluyendo esperma vivo). Este metodo se ha usado por Takizawa et al. (1994, 1995 y 1998) asf como por Yamamoto et al. (1996). En este metodo, no hay discriminaciones entre espermatozoides vivos y residuos en el semen. De ese modo, partfculas de gel, gotitas citoplasmaticas, residuos y bacterias se van a incluir probablemente en el recuento o espermatico de acuerdo con este metodo, aumentando de ese modo el valor tanto de la concentracion medida como de la viabilidad detectada.
En la tecnica tambien se sabe como tenir espermatozoides usando un colorante fluorescente denominado SYBR-14 e
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yoduro de propidio, PI, (Kit de Vviabilidad del Esperma LIVE/DEAD®, Molecular Probes, Oregon, USA) y por medio de analisis de citometna de flujo para evaluar la viabilidad del esperma (Garner et al., 1994; Garner et al., 1995; Donoghue et al., 1995; Garner et al., 1996a; Garner et al., 1996b; Garner et al., 1997a; Garner et al., 1997b Garner et al., 1997c; Maxwell et al., 1997; Maxwell and Johnson, 1997; Penfold et al., 1997; Songsasen et al., 1997; Thomas et al., 1997; Vetter et al., 1998; Thomas et al., 1998; Chalah y Brillard, 1998).
Sin embargo, una desventaja de este metodo es que el SYBR-14 es altamente toxico para los espermatozoides y por lo tanto la cantidad de espermatozoides vivos en una muestra disminuira ruso durante un breve periodo de tiempo. Dado que un tiempo de tincion de 10 a 15 minutos sea usado de forma rutinaria en combinacion con 100 nM de SYBR-14, los resultados van a ser probablemente imprecisos debido a la disminucion de espermatozoides vivos con el tiempo (Christensen y Stenvang, datos sin publicar). Una desventaja adicional del metodo es que la incubacion de las muestras para tincion se realiza al 36-37 °C, lo que es altamente inconveniente en el trabajo de rutina en laboratorios opuestos de inseminacion artificial que evaluan la calidad del semen.
En la Patente de Estados Unidos n.° 4.559.309 se desvela un proceso para la caracterizacion de la movilidad y viabilidad del esperma. Una muestra de esperma se tine con Rodamina 123 y bromuro de etidio ay las emisiones de fluorescencia del esperma se miden por medio de un citometro de flujo. Midiendo las emisiones de fluorescencia a longitudes de onda de color verde y de color rojo, se obtiene una medida se correlaciona con la movilidad del esperma (recuentos de color verde) y de los espermatozoides muertos o supuestamente muertos (recuentos de color rojo), respectivamente. La tincion de una segunda muestra con naranja de acridina proporciona una medida del porcentaje de ADN monocatenario y bicatenario en los espermatozoides indicando de ese modo el esperma y las celulas somaticas maduras e inmaduras. Este proceso no proporciona una medida absoluta de la concentracion de semen. Ademas, son necesarios los procedimientos de tincion diferentes para obtener una medida de la movilidad del esperma y de las celulas muertas o moribundas y una medida de los tipos de espermatozoides en la muestra.
Ademas, la tincion de mitocondrias con Rodamina 123 y ADN con PI implica que se tiene como objetivo dos compartimentos celulares diferentes. En el semen de toros normales normalmente se observan 'cabezas separadas' (que afecta a un 5,3 ± 0,4 % del esperma; Barth y Oko, 1989) y la incidencia de este defecto puede ser mucho mas elevado para toros individuales. Con esta condicion, la parte media y la cola, conectadas, seran moviles y se teniran con R123. La cabeza separada se tenira con PI y posteriormente el porcentaje de espermatozoides viables o moribundos en la poblacion de esperma se calculara de forma imprecisa.
Ademas, en la tecnica se sabe como controlar la inyeccion de muestra a los contadores electronicos o citometro de flujo para obtener una medida de la concentracion. Sin embargo, en estos metodos, el control de las inyecciones de nuestra se ve influido por diferencias entre instrumentos, y se necesita calibracion a intervalos regulares. Un ejemplo de un instrumento de este tipo es el Sperm Cell Counter™ de Partec (Partec GmbH, Munster, Alemania) cuando el rendimiento es inaceptable para la evaluacion de la concentracion de esperma en semen de bovino (Dumont et al.,
1996) .
Ademas, se sabe como usar una solucion de perlas estandarizada para el recuento absoluto de la concentracion de esperma; sin embargo, se encontro que el rendimiento de este metodo era inaceptable para la evaluacion de la concentracion de esperma (Dumont et al., 1996).
Para todos los metodos mencionados anteriormente es comun determinar solamente la proporcion de espermatozoides vivos a la concentracion de los espermatozoides muertos o eliminados. La lista inicial para obtener una determinacion de la proporcion de espermatozoides vivos y una determinacion de la concentracion del semen, se necesita una evaluacion de la muestra de semen usando al menos dos metodos diferentes.
Ademas, un objetivo que existe desde hace mucho tiempo en la industria de inseminacion artificial (IA) de ganado es la obtencion de un metodo simple, preciso y exacto para el examen de semen de toro que se correlacione altamente con la fertilidad despues de la lA. La evaluacion de rutina de volumen del semen, concentracion de esperma, la movilidad y movimiento ondulado en un individuo de genero masculino de lA son valiosos para descartar el semen de baja calidad, pero parece de poco valor para predecir la fertilidad de los machos individuales (Christensen et al., 1999). En los ultimos anos, el analisis de esperma asistido por ordenador (CASA; Budworth et al., 1988) ha proporcionado una evaluacion objetiva de la movilidad del esperma. Las desventajas de esta tecnica tales como una precision escasa, el sesgo debido a las configuraciones del programa y la migracion esperma durante el analisis (Christensen y Stryhn,
1997) limitan el uso potencial.
Resumen de la divulgacion
La invencion es como se define en las reivindicaciones.
Un objeto de la presente divulgacion es proporcionar un metodo que permita una determinacion simultanea de la concentracion de espermatozoides y la proporcion de espermatozoides vivos en una muestra de semen.
Un objeto adicional de la presente divulgacion es proporcionar un metodo para una determinacion simultanea de la
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concentracion de espermatozoides y la proporcion de espermatozoides vivos, moribundos y muertos.
Ademas, otro objeto adicional de la presente divulgacion es proporcionar un metodo de acuerdo con el metodo mencionado anteriormente en el que el proceso de tincion se puede realizar rapido y a temperature ambiente.
La divulgacion se refiere a un metodo un metodo para la determinacion de la concentracion total de espermatozoides en un muestra de semen y la proporcion de espermatozoides vivos en la misma, metodo que comprende someter la muestra de semen o una submuestra diluida de la muestra de semen a tincion selectiva de espermatozoides vivos y muertos y determinar la concentracion total de los espermatozoides y la proporcion de espermatozoides vivos mediante un medio de deteccion sensible a la tincion selectiva.
Como se explicara con mayor detalle en lo sucesivo, un modo para determinar la concentracion total de los espermatozoides y la proporcion de espermatozoides vivos es mediante el uso de citometna de flujo en el que el medio de deteccion es un fotodetector y en el que la informacion con respecto a concentracion se obtiene mediante la incorporacion de un patron interno en forma de partfculas fluorescentes, pero en los ultimos anos se han desarrollado otros metodos de determinacion basados en tincion selectiva y tambien se podran adaptar al metodo de la divulgacion. Un metodo de este tipo es un metodo de microscopfa asistida por ordenador en el que se detecta una imagen de partfculas tenidas en una cubeta de un volumen definido exactamente por medio de una matriz de fotodetectores tales como una matriz de CCD y se somete a procesamiento de imagenes, consultar el documento WO 98/50777.
La informacion representada por la concentracion absoluta (en peso o en volumen, siendo la base normalmente preferente en volumen) de espermatozoides y la proporcion de espermatozoides vivos constituye un conjunto de datos relevante, pero se entendera que este conjunto, por supuesto, se puede expresar como la concentracion de espermatozoides vivos, o la concentracion de espermatozoides muertos, u otros parametros que se pueden calcular sobre la base de la combinacion de la concentracion de espermatozoides y la proporcion de espermatozoides vivos.
Independientemente de la forma en la que se exprese el conjunto de datos, se puede usar para la evaluacion de semen de rutina, por ejemplo, para inseminacion artificial y para determinacion del grado de dilucion necesario para asegurar un numero adecuado de espermatozoides vivos en cada dosis de inseminacion.
La determinacion de la concentracion total de espermatozoides y la proporcion de espermatozoides vivos se realiza preferentemente usando la misma muestra o submuestra y en la misma rutina de determinacion, es decir, la secuencia de etapas de determinacion realizada en una y en la misma muestra. La determinacion de la concentracion total de espermatozoides y la proporcion de espermatozoides vivos se realiza preferentemente de forma basicamente simultanea y preferentemente en la misma operacion de determinacion, es decir, en la misma etapa.
Como las muestras de semen son relativamente viscosas, normalmente se prefiere que la muestra de semen este diluida para formar una submuestra diluida. La dilucion de la muestra se realiza preferentemente usando un diluyente que mantenga la viabilidad de los espermatozoides durante la determinacion, tal como solucion salina tamponada con fosfato.
La tincion selectiva adecuada comprende una tincion que tine todos los espermatozoides combinada con una tincion que tine de forma selectiva las celulas muertas. La direccion selectiva se puede realizar de forma adecuada usando uno o mas fluorocromos que dan como resultado cualidades fluorescentes que se confieren a los espermatozoides vivos y los espermatozoides muertos, pudiendose distinguir la cualidad o cualidades fluorescentes de las celulas vivas, con los medios de deteccion, de la cualidad por cualidades fluorescentes de los espermatozoides muertos, determinacion que se realiza mediante recuento selectivo de celulas de cada cualidad fluorescente. En este contexto, la expresion "recuento selectivo" pretende incluir cualquier metodo de recuento o calculo o procesamiento de imagenes que se base en la deteccion realizada y que de como resultado datos que indiquen por un lado la concentracion total de espermatozoides y por otro lado la proporcion de celulas muertas; pudiendose volver a calcular a continuacion la ultima proporcion facilmente en la proporcion de celulas vivas, consultar anteriormente.
Los fluorocromos que tinen los espermatozoides pueden ser cualquier fluorocromo que se una a ADN. Los fluorocromos normalmente comprenden un fluorocromo capaz de tenir de forma selectiva espermatozoides muertos o moribundos, siendo capaz este fluorocromo de entrar en un espermatozoide traves de una membrana plasmatica con escapes o defectuosa, pero que es basicamente incapaz de entrar en un espermatozoide que tiene una membrana plasmatica intacta, y otro fluorocromo capaz de tenir todos los espermatozoides, siendo este fluorocromo capaz de entrar en una celula a traves de la membrana celular intacta.
Mediante adaptacion adecuada de la tincion, tambien se ha encontrado que es posible determinar de forma selectiva la proporcion de espermatozoides moribundos. Esto se obtiene por lo general mediante el uso de una concentracion menor de la usada convencionalmente para la tincion con fluorocromo de todos los espermatozoides, tal como se explicara con mayor detalle en lo sucesivo. De este modo es posible diferenciar entre espermatozoides vivos y espermatozoides moribundos. Aunque las determinaciones de movilidad convencionales realizadas mediante microscopfa no permiten una distincion de este tipo, en el metodo de la divulgacion, es posible usar una tincion que permita una determinacion de una fase de transicion durante la que la membrana plasmatica de los espermatozoides
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se hace cada vez mas permeable como una indicacion de los espermatozoides que estan sometidos a deterioro. Tales espermatozoides apareceran con movimiento en las observaciones de movilidad con microscop^a, pero tendran un periodo de movilidad activa mucho mas corto que los espermatozoides que tienen una membrana plasmatica intacta (Christensen et al., datos sin publicar).
Los espermatozoides moribundos tienen una membrana plasmatica con escapes o no intacta por lo que estos espermatozoides se tinen por los fluorocromos que tinen todos los espermatozoides y tambien por los fluorocromos que tinen los espermatozoides muertos. La tincion de los espermatozoides muertos, sin embargo, sera mucho mas fuerte que la tincion de la celula moribunda, con lo que la intensidad de la tincion proporciona informacion sobre el estado de la celula. Al mantener una concentracion adecuadamente baja de la tincion con fluorocromo de todos los espermatozoides, se hace posible el recuento de forma selectiva de la proporcion de espermatozoides que tienen una calidad fluorescente (respectivas intensidades de longitudes de onda caractensticas de los dos fluorocromos) que se puede distinguirtanto de las celulas vivas como de las celulas muertas.
Los espermatozoides que tienen una membrana plasmatica con escapes por lo general moriran poco despues de que este proceso haya comenzado. El numero de espermatozoides moribundos por lo general es el mas elevado cuando una las de semen se ha congelado o se ha almacenado durante un periodo de tiempo anterior a la evaluacion. Por lo tanto, este metodo tambien se puede usar para desarrollo y evaluacion de los nuevos medios para congelacion o almacenamiento de lfquido de esperma y/o para la mejora de los procedimientos de almacenamiento y/o congelacion/descongelacion o incluso para el desarrollo de nuevos procedimientos de este tipo.
La excitacion de los fluorocromos se puede realizar por medio de luz en el intervalo de longitud de onda de 488 nm ("laser de color azul"), en cuyo caso el fluorocromo que tine los espermatozoides vivos pueden ser adecuadamente SYBR-14, y el fluorocromo que tine los espermatozoides muertos o moribundos puede ser, adecuadamente, yoduro de propidio, PI.
De forma alternativa, la excitacion de los fluorocromos se puede realizar por medio de luz en el intervalo de longitud de onda de aproximadamente 543 nm ("laser de color verde"), en cuyo caso el fluorocromo que tine los espermatozoides vivos puede ser adecuadamente MPR71292, y el fluorocromo que tine los espermatozoides muertos o moribundos puede ser el homodfmero 2 de etidio, EHD2.
El SYBR-14 usado en concentraciones estandar es ligeramente toxico para los espermatozoides con lo que la cantidad de espermatozoides vivos en una muestra disminuira incluso en un breve periodo de tiempo. Dado que se ha usado un tiempo de tincion de 10 a 15 minutos en el uso convencional de SYBR-14, los resultados tienden a ser ligeramente inexactos debido a la disminucion de espermatozoides vivos en el tiempo (Christensen y Stenvang, datos sin publicar). Por lo tanto, de acuerdo con una realizacion de la divulgacion, se usa un breve periodo de tincion (2^-5 min) con lo que se reduce la toxicidad de los colorantes, tales como SYBR-14, facilitando la determinacion de la viabilidad del esperma con alta precision y exactitud. Ademas, se prefiere realizar la tincion de los espermatozoides a una temperatura inferior a 35 °C, tal como, como maximo 30 °C, por ejemplo, a una temperatura entre 15 °C y 25 °C, preferentemente a temperatura ambiente, tal como aproximadamente 20 °C.
El fluorocromo que tine todos los espermatozoides se puede usar en concentraciones inferiores a las concentraciones aplicadas convencionalmente para tales fluorocromos para evitar la toxicidad de los colorantes, por ejemplo en concentraciones en el intervalo de 25 a 75 nanomolar, preferentemente tal como en concentraciones de 50 nanomolar.
El uso de tales concentraciones por debajo de concentraciones convencionales para la tincion de espermatozoides vivos tiene una serie de ventajas en el metodo de la divulgacion; a continuacion se proporcionan algunos ejemplos para la combinacion de los fluorocromos SYBR-14 y PI, pero las ventajas tambien se podran obtener con otras combinaciones pertinentes.
En primer lugar, como se ha mencionado anteriormente, se ha demostrado que el uso de concentraciones convencionales de SYBR-14 para tenir espermatozoides es toxico para los espermatozoides. Algunos estudios han demostrado que una concentracion de SYBR-14 de 100 nM da como resultado una disminucion de la cantidad de espermatozoides vivos de un 0,6 % por minuto, mientras que no se encuentra una disminucion en la cantidad de espermatozoides vivos cuando la concentracion aplicada de SYBR-14 esta por debajo de las concentraciones convencionales como se ha mencionado anteriormente.
Ademas, para facilitar la deteccion de espermatozoides moribundos, la intensidad de la senal fluorescente del SYBR-14 se debena reducir al mmimo. La razon de esto es que los espermatozoides moribundos que tienen una membrana con escapes absorben facilmente el SYBR-14, pero absorben solo ligeramente el fluorocromo PI, por lo cual la senal de PI fluorescente emitida desde un espermatozoide moribundo es relativamente debil. Por lo tanto, la intensidad de la respuesta fluorescente de SYBR-14 de los espermatozoides que estan moviendose de reducir al mmimo para facilitar la deteccion simultanea de la respuesta fluorescente debil de PI presente en los espermatozoides moribundos y la fuerte respuesta fluorescente del SYBR-14 tambien presente en los espermatozoides moribundos. Cuando una muestra de semen se ha congelado, tanto como un 30 % de los espermatozoides pueden ser espermatozoides moribundos. Por lo tanto, es de suma importancia que los espermatozoides moribundos se
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discriminen de los espermatozoides vivos para proporcionar un verdadero recuento de espermatozoides vivos. Si se usaron concentraciones convencionales de SYBR-14, solamente se puede desvelar una cantidad tan pequena como un 10% de los espermatozoides moribundos, por lo que el numero de espermatozoides vivos estana muy sobrestimado.
Como se ha mencionado anteriormente, una realizacion importante del metodo de la divulgacion se realiza usando un citometro de flujo, tal como un citometro de barrido laser. En este caso, la determinacion del parametro de concentracion se obtiene mediante la combinacion de la muestra o submuestra con un medio estandar de concentracion interna que determina la concentracion total de los espermatozoides y la proporcion de espermatozoides vivos de forma simultanea por medio de un medio de deteccion sensible a la tincion selectiva y a los medios internos de referencia de concentracion.
El medio estandar de concentracion interna puede ser cualquier medio de patron de concentracion que se pueda combinar de forma adecuada con la muestra o submuestra y se detecta con el medio de deteccion para funcionar como una referencia indicativa de la concentracion de espermatozoides. El medio estandar de concentracion interna puede estar formado de forma conveniente por partfculas de normalizacion, siendo las partfculas de normalizacion anadidas en un numero predeterminado por unidad de peso o normalmente de volumen de la muestra o submuestra. Las partfculas de normalizacion son partfculas fluorescentes, en particular perlas fluorescentes, que tienen una cualidad fluorescente que se puede distinguir de las cualidades fluorescentes de los espermatozoides vivos, espermatozoides muertos, y espermatozoides moribundos.
El tamano y la concentracion total de espermatozoides de la submuestra se puede adaptar de forma adecuada para que el numero de espermatozoides corresponda a entre una decima parte y diez veces el numero de las los de normalizacion, en particular, a entre una cuarta parte y cuatro veces el numero de las partfculas de normalizacion, como por ejemplo a entre la mitad y dos veces el numero de las partfculas de normalizacion.
Las perlas se pueden proporcionar en una suspension que comprende perlas y diluyente. Una ventaja de una suspension es que comprende tanto las perlas como el diluyente para que la suspension la pueda preparar un fabricante en un proceso altamente automatizado para obtener un numero muy preciso de perlas en la suspension. Ademas, la suspension que comprende el diluyente y las perlas se puede preparar en tubos, siendo los tubos adecuados como camaras de medida en clasificadores de celulas activadas con fluorescencia, tales como citometros de flujo. De este modo, las inexactitudes procedentes de la redistribucion y la dilucion de la suspension se reducen al mmimo. Ademas adicionalmente, usando tubos del mismo proceso de preparacion con el mismo numero de lote, se pueden obtener los resultados correspondientes con independencia de los diferentes aparatos usados por diferentes usuarios. Por ejemplo, se pueden usar tubos CD4/3 y CD8/3 fabricados por Becton Dickinson (documento EP 0 568 183) que contienen un numero predeterminado de perlas en un diluyente. Ademas, se pueden usar tubos que contienen solamente perlas, tales como los tubos "Trucount" fabricados por Becton Dickinson y que contienen un numero predeterminado de perlas.
El diluyente puede ser un diluyente que no sea toxico para el esperma y que mantenga la viabilidad durante los procedimientos de tincion y analisis. El diluyente puede ser un diluyente que disminuya el tiempo de tincion. El diluyente puede comprender cualquier medio capaz de evitar que los espermatozoides se peguen a las paredes laterales de la camara de medida o el tubo de medida, tal como un compuesto qmmico, tal como una protema, tal como BSA, u otro compuesto adecuado, tal como alcohol de polivinilo (PVA), etc.
Para obtener una precision de las medidas incluso mas elevada, la dilucion automatizada del semen se puede aplicar. De este modo, la parte que depende del operador del proceso se elimina lo que hace que el proceso sea altamente reproducible.
La determinacion de la concentracion de los espermatozoides y la proporcion de espermatozoides vivos se puede determinar como un valor medio de la determinacion de la concentracion total de los espermatozoides y la proporcion de espermatozoides vivos realizada en dos o mas submuestras de la muestra de semen. Por la presente, la concentracion de los espermatozoides y la proporcion de espermatozoides vivos se puede determinar de forma mas precisa.
Despues del analisis de la submuestra, la muestra se puede diluir hasta una concentracion de semen determinada previamente o un numero de espermatozoides vivos determinado previamente y se puede distribuir con el fin de llenar una dosis de inseminacion con un numero apropiado de espermatozoides vivos para inseminacion artificial. Una indicacion de la calidad del semen basandose en la concentracion del semen y el numero de espermatozoides vivos en el eyaculado correspondiente puede acompanar a la dosis de inseminacion. De este modo, los usuarios, tales como los centros de inseminacion artificial, pueden obtener informacion valiosa con respecto al semen.
Ademas, el metodo de la divulgacion hace que sea posible obtener una base solida para aceptar o rechazar el semen de eyaculados en funcion de si cumplen o no cumplen los valores especificados para la concentracion total de espermatozoides y la proporcion de espermatozoides vivos, con el fin de garantizar que para inseminacion artificial solamente se usa el semen de una cierta calidad.
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El metodo de la divulgacion tambien se puede usar para determinar el numero absoluto de espermatozoides producidos por los animales sometidos a texicolog^a u otros experimented farmacologicos. Ademas, el metodo de la divulgacion se puede usar para demostrar que animales o seres humanos se han visto influidos por ejemplo, por un entorno toxicologico o invasiones qmmicos en el organismo.
Ademas, debido a la objetividad y la reproducibilidad del metodo, el metodo se puede usar para evaluar la calidad del semen y la cantidad de semen humano, tanto en relacion con inseminacion artificial como con fecundacion in vitro y en relacion con investigaciones de la disminucion propuesta en la calidad del semen humano.
Otro aspecto de la divulgacion se refiere a un metodo para predecir la probabilidad de fertilizacion de un animal hembra mediante inseminacion artificial con una dosis de inseminacion, que comprende la determinacion de la concentracion total de espermatozoides en la muestra de semen de la que se toma o se va a tomar la dosis de inseminacion, y la proporcion de espermatozoides vivos en la misma con un metodo tal como se describe en el presente documento, y que incluye la concentracion total determinada de ese modo de los espermatozoides en la muestra de semen y la proporcion de espermatozoides vivos en la misma, o la concentracion, que se puede calcular a partir de la misma, de espermatozoides vivos en la muestra, en los parametros sobre la base de los cuales se preve la posibilidad de la fertilizacion del animal. La probabilidad de que la fertilizacion del animal hembra se puede predecir sobre la base de la concentracion total de espermatozoides determinada en la muestra de semen y la proporcion de espermatozoides vivos en la misma, o la concentracion, que se puede calcular a partir de la misma, de espermatozoides vivos en la muestra.
La prediccion de la probabilidad de fertilizacion del animal hembra se puede realizar sobre la base de correlaciones estadfsticamente significativas entre datos de fertilidad obtenidos en experimentos de inseminacion con varios animales hembra y los datos que indican la concentracion total de espermatozoides en la muestra de semen usada en los experimentos de inseminacion y la proporcion de espermatozoides vivos en la misma, y/o datos que indican la concentracion de espermatozoides vivos en la misma. El protocolo para un ejemplo de experimentos adecuados se proporciona en el Experimento 3 que sigue a continuacion.
Cuando el animal hembra es un animal mulrtparo, el numero de cnas resultantes de la fertilizacion tambien se puede predecir, a partir de datos establecidos por el metodo de la divulgacion como se describe en el presente documento, en correlacion con los resultados de experimentos disenados de forma adecuada.
La prediccion se puede realizar sobre la base de los resultados obtenidos de un eyaculado recien obtenido o sobre la base de los resultados obtenidos de una muestra de semen que es una dosis de inseminacion congelada, siendo la muestra descongelada antes de someterla al metodo de determinacion, o sobre la base de una combinacion de una determinacion en la muestra congelada-descongelada y una determinacion en el eyaculado recien obtenido del que se derivo la muestra congelada-descongelada. Otro tipo de muestra es una muestra diluida y almacenada.
Breve descripcion de las figuras
La Fig. 1 muestra una representacion de los resultados del FACSCount con laser de 488 nm que muestra la intensidad de fluorescencia de color verde con respecto a fluorescencia de color rojo usando el metodo de la divulgacion. El esperma vivo (a), esperma muerto (b) asf como esperma moribundo (c) se puede identificar y se separan claramente de residuos (d) y perlas (e). En esta muestra en particular, el esperma moribundo representa un 9,4 % del recuento de esperma total.
Las Figs. 2A y 2B muestran resultados de la evaluacion de la concentracion del esperma en el contador de partteulas Sysmex. Una diferencia entre la primera discriminacion (flechas) y la segunda discriminacion (lmea vertical punteada) conduce a diferencias en la concentracion de esperma de 750 x 106 espermatozoides/ml y 700 x 106 espermatozoides/ml, respectivamente. Observar que el Sysmex esta disenado para recuento de hematologfa y que el recuento del esperma se hace en el canal de los globulos rojos (RBC). El eje x indica el tamano de la partteula de acuerdo con el principio de Coulter y la curva ilustra la distribucion de partteulas en relacion con el tamano.
La Fig. 3 muestra la lmea de regresion para FACSCount con laser de color azul (488 nm) con respecto a la Camara Makler. Los datos son datos corregidos a partir del modelo de error de medida.
La Fig. 4 muestra la lmea de regresion para FACSCount con laser de color verde (543 nm) con respecto a la Camara Makler. Los datos son datos corregidos a partir del modelo de error de medida.
La Fig. 5 muestra la lmea de regresion para Espectrofotometro (L'Aiglon) con respecto a la camara Makler. Los datos son datos corregidos a partir del modelo de error de medida.
La Fig. 6 muestra la lmea de regresion para contador de partteulas (Sysmex) con respecto a la camara Makler. Los datos son datos corregidos a partir del modelo de error de medida.
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La Fig. 7 muestra la lmea de regresion para FACSCount con laser de color verde (543 nm) con respecto a FACSCount con laser de color azul (488 nm). Los datos no corregidos muestran una correlacion muy elevada entre estas tecnicas. La pendiente p es 0,99 y el coeficiente de correlacion es 0,99.
Descripcion de realizaciones preferentes
EXPERIMENTO 1 Resumen
En un primer experimento, la concentracion y la viabilidad de esperma en eyaculados de toro se determino mediante tincion selectiva de los espermatozoides vivos y muertos en una muestra de semen y posteriormente, mediante analisis de las muestras de semen con citometna de flujo de acuerdo con una realizacion preferente de la divulgacion. Para fines de comparacion, la concentracion del esperma tambien se determino usando metodos de la tecnica anterior, es decir, mediante la determinacion de la concentracion del esperma con un espectrofotometro (L'Aiglon, IMV, Cedex, Francia) y un contador de partfculas (Sysmex F-820, SYSMEX, Almind, Dinamarca), y haciendo uso adicionalmente un contador manual que usa una camara Makler (Sefi Medical, Haifa, Israel) y un microscopio de contraste de fases.
Los analisis que usan citometna de flujo para determinacion simultanea de la concentracion y la viabilidad del esperma en eyaculados de toro en el puesto de lA se realizaron usando dos citometros de flujo FACSCount diferentes (BDIS Europe, Erembodegem-Aalst, Belgica) equipados con un laser de color azul (488 nm), y un laser de color verde (543 nm), respectivamente. El esperma se tino con una combinacion de SYBR-14 y PI para analisis con la longitud de onda de excitacion de color azul (488 nm) o se tino con una combinacion de MPR71292 y EHD2 para analisis con la longitud de onda de excitacion de color verde (543 nm). Los datos obtenidos de los citometros de flujo se analizaron posteriormente con el software Attractor™ (BDIS Europe, Erembodegem-Aalst, Belgica). Ademas de la determinacion de la concentracion del esperma, los analisis citometna de flujo tambien proporcionaron un calculo de la viabilidad del esperma.
En general, se encontro un buen acuerdo entre los metodos mencionados anteriormente. El breve periodo de tincion (2^-5 min) en combinacion con una concentracion minima de SYBR-14, reducfa la toxicidad de este colorante, facilitando, de este modo, la determinacion de la viabilidad del esperma con precision y exactitud elevadas. Ademas, el protocolo usado permitfa la deteccion de esperma vivo, muerto asf como moribundo.
MATERIALES Y METODOS
Muestras de semen
Las muestras de semen a usar en los experimentos se recogieron de 25 toros proporcionando un total de 52 eyaculados. Las muestras de semen se recogieron durante 4 dfas de toros con diferencias tanto en la concentracion como en la calidad del semen. Una alfcuota de 2-3 ml del semen sin procesarse como con un tubo (n.° de Cat 347880 de NUNC Intermed, Lifetechnologies, Roskilde, Dinamarca) y se coloco en una mezcladora Swelab-820 (Bie & Berntsen, R0dovre, Dinamarca) y se mezclo continuamente. Todos los procesamientos y analisis se realizaron en 30 minutos despues de la recogida de semen.
Determinacion de la concentracion de esperma usando la camara Makler
Dos muestras de semen sin procesar se diluyeron a 1:40 con un aparato de autodilucion Hamilton Microlab A503 (Struers KEBO lab., Albertslund, Dinamarca) y usando una solucion salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4, 300 mOsm con BSA al 0,1 %). Las muestras diluidas se colocaron en una mezcladora (Adams Nutator, NC. Nielsen, Br0ndy, Dinamarca). Antes de la evaluacion, los espermatozoides se inmovilizaron mediante la adicion de 7,5 pl de formaldehndo al 4 % (p/v) y la camara Makler se cargo con una submuestra de 7,5 pl. La tapa de la camara Makler se coloco en posicion y se toco suavemente con la punta de una una para asegurarse de que permaneda firmemente en los pilares (anillos de Newton). Se hizo el recuento de un total de 25 cuadrados con microscopfa de contraste de fases un aumento de 200x. Despues del recuento, la camara se lavo con agua destilada, se seco y se volvio a cargar con una submuestra de la misma muestra. Posteriormente, este procedimiento se aplico para la segunda submuestra y se obtuvo un total de 4 medidas (2 muestras x 2 replicados) por eyaculado.
Determinacion de la concentracion de esperma usando espectrofotometro
Una muestra de 20 pl del semen sin procesar se diluyo hasta un volumen total de 4 ml (1:200) en una cubeta para el espectrofotometro de L'Aiglon. La dilucion se realizo con un aparato de autodilucion CAVRO (Z 069, IMV). Despues de la dilucion, una pequena pieza de papel de aluminio se coloco sobre la cubeta y la muestra diluida se mezclo suavemente con la mano. Despues de reposar aproximadamente 10 segundos, la cubeta se coloco en el espectrofotometro y la concentracion de espermas se midio. La cubeta se cubrio de nuevo con papel de aluminio se
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mezclo cuidadosamente con la mano, y despues de un periodo de reposo, la cubeta se midio una vez mas en el espectrofotometro. Despues de esta medida, una segunda muestra se diluyo y se midio. Por lo tanto, se obtuvo un total de 4 medidas por eyaculado.
Determinacion de la concentracion de esperma usando contador de particulas
Para el recuento de la concentracion de esperma en el contador de partfculas Sysmex F-820 es necesaria una dilucion de dos etapas. La primera etapa fue la dilucion de 20 pl de semen sin procesar hasta un volumen de 10 ml (1:500) y en la segunda etapa, se diluyeron 100 pl de semen diluido hasta un volumen total de 10 ml y se coloco en una taza de muestra (1:100, dando como resultado una dilucion combinada de 1:50.000). Ambas etapas de dilucion se realizaron con un aparato de autodilucion AD-270 (SYSMEX, Almind, Dinamarca). La taza de muestra se cubrio con un trozo pequeno de papel de aluminio y se mezclo cuidadosamente con la mano y se dejo reposar durante aproximadamente 10 segundos antes de hacer el recuento en el Sysmex. Despues del recuento, la taza de muestra se cubrio de nuevo con papel de aluminio, se mezclo y se hizo el recuento una vez mas. A continuacion, la muestra se descarto y una segunda muestra se diluyo, se trato y se hizo recuento de acuerdo con este procedimiento. Se obtuvo un total de 4 recuentos por eyaculado.
Determinacion de la concentracion y viabilidad del esperma usando citometro de flujo
Para los analisis de citometna de flujo es necesaria una dilucion en dos etapas. En primer lugar, la muestra se diluye 250x en un medio de PBS que contiene BSA al 0,1 %, (n.° de Cat 3478880 NUNC Intermed, Lifetechnologies, Roskilde, Dinamarca), y en segundo lugar una muestra de 20 pl se transfiere a un tubo de Recuento de Esperma que contiene aproximadamente 100.000 perlas usando pipeteo manual inverso. Los colorantes se anadieron a los tubos de Recuento de Esperma menos de 12 horas antes de usar los tubos en el procedimiento de analisis. Como se ha mencionado anteriormente, se usaron dos citometros de flujo diferentes, siendo uno un FACSCount equipado con un laser de color verde (543 nm) y siendo el segundo un FACSCount equipado con un laser de color azul (488 nm).
A cada tubo de Recuento de Esperma a analizar en el primer FACSCount (543 nm), se anadieron 2 pl de MPR71292 y 2 pl de EHD-2 para proporcionar concentraciones finales de 100 nM y 5 pM, respectivamente.
A cada tubo de Recuento de Esperma a analizar en el segundo FACSCount (488 nm), se anadieron 5 pl de SYBR-14 y 5 pl de PI para proporcionar concentraciones finales de 50 nM y 12 pM, respectivamente.
Antes de la apertura de los tubos de Recuento de Esperma, los tubos se mezclaron en centrifugadora durante 3 segundos en una posicion boca abajo y durante numero de segundos en una posicion normal. La mezcla en centrifugadora se repitio durante dos segundos despues de la adicion del esperma y antes de cada analisis. Despues de la adicion del esperma, los tubos de Recuento de Esperma se colocaron en una mezcladora (Adams Nutator, N.C. Nielsen, Br0ndby, Dinamarca) durante 4 min a temperatura ambiente sin luz que alcanzara el tubo. Despues de 4 min, los primeros replicados se analizaron de forma simultanea en los dos citometros de flujo y los segundos replicados se analizaron despues de un periodo de tincion de 6 min. Los tubos se analizaron dos veces para proporcionar un segundo replicado en lugar de pipetear dos submuestras de los tubos. En cada citometro de flujo se realizo un total de 4 analisis por eyaculado.
Analisis de datos de FACSCount
Durante los analisis de citometna de flujo, los datos se almacenaron en un disco flexible en el FACSCount, y despues de las medidas, los datos del disco flexible se analizaron usando el software Attractor™ (BD) en la Royal Veterinary and Agricultural University, Seccion de Reproduccion.
Analisis estadistico
Los datos obtenidos a partir de los cinco metodos (camara Makler, espectrofotometro (L'Aiglon), contador de particulas (Sysmex), y citometros de flujo (FACSCount con laser de color verde o de color azul) se sometieron a analisis de varianza para resaltar efectos significativos de fecha, toro, muestra, replicado, combinaciones de estos efectos asf como variacion residual. Los datos de viabilidad de los analisis de FACSCount tambien se sometieron a analisis de varianza. Se uso el siguiente modelo estadistico (1):
(D
Yi =
Oli,fecha + Bj ,toro + Cj,torofecha + Df, fecha’toro1 muestra +■ £j
en el que: Yi = resultado para el metodo ai,fecha = efecto de la fecha (sistematico)
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Bitoro = efecto del toro Ci,toro*fecha = efecto del eyaculado
Di,fecha*toro*muestra = efecto de la muestra £i = error residual
i = el numero de observacion (medida), 1,..., 208.
Las letras en el modelo mencionado anteriormente indican efectos aleatorios. Sin embargo, los calculos para la muestra global y las diferencias de replicados se realizaron en un modelo estadfstico con efecto sistematico demuestra, replicado y fecha e.
Los datos de los cuatro metodos (espectrofotometro, contador de pardculas, citometro de flujo con laser de color verde o de color azul) se sometieron a analisis de regresion para comparar los resultados de estos metodos con los resultados obtenidos con la camara Makler. Los analisis de regresion se basaron en los valores medios para las cuatro medidas por eyaculado para cada uno de los metodos. Al principio, los analisis de regresion se realizaron sin correcciones, pero debido a una gran variacion de los datos de la camara Makler, los analisis de regresion tambien se realizaron usando un modelo de error de medida que tiene en cuenta la imprecision de la camara Makler. Todos los analisis estadfsticos se realizaron con la version 6.12 de SAS (SAS, 1990).
Como se puede observar a partir de las Figs. 3-6 que muestran las lmeas de regresion de los resultados de cada uno de los cuatro metodos con respecto al recuento manual de la camara Makler, la concentracion de los espermatozoides vana de 200 *106 a 3000 *106. Esta variacion es una variacion entre toros asf como una variacion entre eyaculados de cada toro como tambien se indica en el metodo estadfstico mencionado anteriormente.
Camara Makler
Los datos obtenidos con la camara Makler paredan mas imprecisos de lo que se prevefa a partir de estudios iniciales y el coeficiente de variacion fue de un 21,3 %.
Precision del metodo de espectrofotometro
Los resultados de los analisis de varianza para datos obtenidos con el espectrofotometro se muestran en la tabla 1. El coeficiente instrumental de variacion (% de CV) es de un 2,10% y la gran variacion entre muestras dentro de eyaculados (variacion de la muestra) hace que el metodo sea significativamente mas impreciso, y el intervalo de confianza de un 95 % para la determinacion de la concentracion del esperma con el espectrofotometro de L'Aiglon es ± 169 x 106 espermatozoides/ml cuando se realiza una sola medida (una muestra, una medida). Una variacion general pequena se detecto en la concentracion entre las dos muestras con la muestra 1 siendo 48,5 ± 15 x 106 espermatozoides/ml inferior a la de la muestra 2. La razon para esta diferencia no es evidente.
Precision del metodo de contador de particulas
La Tabla 1 tambien muestra los resultados para el contador de partfculas Sysmex. El coeficiente de variacion con este metodo es elevado, 6,1 %. En las medidas se usaron dos conjuntos de recuentos en los que la discriminacion en el tamano de partfcula difena en los dos replicados, respectivamente, incluyendo y excluyendo una poblacion de particulas mas pequenas en el "recuento de esperma" (veanse las Figs. 2A y2B). Si estas observaciones se excluyen, el coeficiente de variacion para el Sysmex es de un 4,0 %. La variacion de la muestra con el contador de particulas Sysmex es pequeno y el intervalo de confianza de un 95 % del metodo para una sola medida por eyaculado es de ± 118 x 106 espermatozoides/ml (dos conjuntos de recuentos mencionados anteriormente se excluyen en este calculo, si se incluyen, el intervalo de confianza de un 95 % es ± 182 x 106 espermatozoides/ml).
Tabla 1. Fuentes de variacion para los cuatro metodos: espectrofotometro (L'Aiglon), contador de particulas (Sysmex) y FACSCount (laser de color verde) y FACSCount (laser de color azul). Los numeros entre corchetes indican el ___________________________porcentaje de la variacion total para los metodos.____________________________
- Fuente de variacion
- L'Aiglon Sysmex FACSCount (laser de color verde) FACSCount (laser de color azul)
- Toro1
- 179,312 (52) 197,497 (51) 220,714 (58) 226,901 (59)
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- Fuente de variacion
- L'Aiglon Sysmex FACSCount (laser de color verde) FACSCount (laser de color azul)
- Toro2 fecha*
- 155,884 (45) 186,918 (48) 153,674 (40) 151.766 (39)
- Toro3 *fecha*muest ra
- 6,462 (1,9) 64 (~0) 4,896 (1,3) 1,554 (0,4)
- Residual4
- 968 (0,3) 3,599 (0,9) 3,755 (1,0) 7,285 (1,4)
- % de CV5
- 2,10 4,0* 4,3 6,0
- 95 % de int. de confianza6
- ±169x 106 ± 118 x 106** ±182x 106 ± 84 x 106
- 1Variacion general entre toros 2Variacion entre eyaculados dentro de toros. (variacion de eyaculado) 3Variacion entre muestras (variacion de muestra) 4Variacion residual (variacion instrumental) coeficiente de variacion instrumental 695 % de intervalo de confianza para una sola medida por eyaculado (una muestra, un replicado)
- *6,1 % si se incluyen todas las medidas **± 182 x 106 espermatozoides/ml si se incluyen todas las medidas
Precision del metodo de contador de particulas
La Tabla 1 tambien muestra los resultados para el contador de particulas Sysmex. El coeficiente de variacion con este metodo es elevado, 6,1 %. En las medidas se usaron dos conjuntos de recuentos en los que la discriminacion en el tamano de partfcula difena en los dos replicados, respectivamente, incluyendo y excluyendo una poblacion de particulas mas pequenas en el "recuento de esperma" (veanse las Figs. 1 y 2). Si estas observaciones se excluyen, el coeficiente de variacion para el Sysmex es de un 4,0 %. La variacion de la muestra con el contador de particulas Sysmex es pequeno y el intervalo de confianza de un 95 % del metodo para una sola medida por eyaculado es de ± ll8 x 106 espermatozoides/ml (dos conjuntos de recuentos mencionados anteriormente se excluyen en este calculo, si se incluyen, el intervalo de confianza de un 95 % es ± 182 x 106 espermatozoides/ml).
Precision del FACSCount con laser de color verde (543 nm)
Los resultados del FACSCount con laser de color verde se muestran en la tabla 1. El coeficiente de variacion es de un 4,3 % y el intervalo de confianza de un 95 % para una sola medida por eyaculado es ± 182 x 106 espermatozoides/ml. Se debena indicar que no se observan diferencias significativas entre replicados o muestras.
Precision del FACSCount con laser de color azul (488 nm)
Los resultados del FACSCount con laser de color azul (tabla 1) tienen un coeficiente de variacion mas elevado (6,0 %) pero debido a una variacion menor entre muestras, el intervalo de confianza de un 95 % para una sola medida por eyaculado es ± 184 x 106 espermatozoides/ml. Se observo una concentracion de esperma mas elevada para el replicado 2 (54,7 ± 11 x 106 espermatozoides/ml mas elevada que la del replicado 1). La razon para esa diferencia no era evidente.
Precision del FACSCount (laser de color verde) para determinacion de la viabilidad del esperma
Los resultados para la determinacion de la viabilidad del esperma con FACSCount (laser de color verde) se muestran en la tabla 2. El coeficiente de variacion para el metodo es de un 1,2 %. El intervalo de confianza de un 95 % para la determinacion de la viabilidad del esperma basandose en una medida por eyaculado es ± 4,0 %. Se observo una pequena disminucion en la viabilidad del esperma con el tiempo (- 0,27 ± 0,07%/min). Esta disminucion es mucho menor que las disminuciones observadas en los ensayos que usan un tiempo de tincion superior a 10 minutos. Con un tiempo de tincion de 3-5 minutos, la precision del metodo solo se ve influida ligeramente.
Precision del FACSCount (laser de color azul) para determinacion de la viabilidad del esperma
Los resultados del FACSCount (laser de color azul) para determinacion de la viabilidad del esperma se muestran en la tabla 2. El coeficiente de variacion es igual (CV = 1,1 %) al del FACSCount con laser de color verde pero debido a una variacion de la muestra ligeramente mayor, el intervalo de confianza de un 95 % para una sola medida por eyaculado desde un 6,2%. La viabilidad del esperma no disminuyo con el tiempo (-0,15 ± 0,07%/min) de un efecto
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probablemente por la reduccion de la concentracion de la tincion con SYBR-14 (50 nM)).
Tabla 2. Fuentes de variacion para la determinacion con citometna de flujo de la viabilidad del esperma. Los numeros ___________________entre corchetes indican el porcentaje de la variacion total del metodo.___________________
- FACSCount (laser de color verde) FACSCount (laser de color azul)
- Toro1
- 29,73 (65,8) 24,16 (45,8)
- Toro2 fecha*
- 11,24 (24,9) 18,75 (35,5)
- Toro3 *fecha*muestra
- 3,26 (7,2) 9,01 (17,0)
- Residual4
- 0,94 (2,1) 0,83 (1,6)
- % de CV5
- 1,2 1,1
- 95 % de int. de confianza6
- ± 4,0 % ± 6,2 %
- Variacion general entre toros 2Variacion entre eyaculados dentro de toros. (variacion de eyaculado) 3Variacion entre muestras dentro de eyaculados (variacion de muestra) 4Variacion residual (variacion instrumental) 5Coeficiente instrumental de variacion 695 % de intervalo de confianza para una sola medida por eyaculado (una muestra,
- un replicado)
ANALISIS DE REGRESION
Las lmeas de regresion para los cuatro metodos despues de correccion para imprecision de la "regla de oro" se muestran en las Figs. 3 a 6 y los resultados de los analisis de regresion se muestran en la tabla 3. Las concentraciones de espermatozoides en las muestras de semen vanan de 200 *106 a 3000 * 106 espermatozoides por ml. Las pendientes de todas las lmeas de regresion no son significativamente diferentes de 1 y las intersecciones para las diferentes lmeas de regresion no son significativamente diferentes de 0. A partir de la tabla 3, a decir que el error de los analisis de FACSCount es mas elevado que para el espectrofotometro y el contador de partmulas. Los coeficientes de correlacion a partir de los analisis de regresion incorreccion mostraron una correlacion ligeramente menor para los analisis con FACSCount en los que la correlacion para el laser de color verde y de color azul era respectivamente de 0,91 y 0,9 frente a 0,945 para contador de partmulas y 0,96 para espectrofotometro. Esto esta en contraste con los resultados obtenidos anteriormente en los que los coeficientes de correlacion para contador de partmulas, espectrofotometro y FACSCount fueron respectivamente 0,93, 0,93 y 0,97. En teona, la correlacion para el FACSCount (cualquier laser) debena ser mas elevada que la de los otros metodos por que el metodo de citometna de flujo identifica esperma a partir de una tincion del ADN. Sin embargo, dado que el semen de toro contiene una cantidad de residuos muy pequena, la diferencia entre los resultados obtenidos usando citometna de flujo y los resultados obtenidos usando otras tecnicas es pequena.
DISCUSION GENERAL
Viabilidad del esperma: Los dos metodos para la determinacion de la viabilidad del esperma son muy precisos y solamente para la combinacion de 292 y EHD2 se observo una ligera disminucion en la viabilidad (-0,27 ± 0,07 %/min). Dado que los analisis se pueden realizar despues de un tiempo de tincion de 21^ min, la viabilidad se puede determinar de forma precisa asf como de forma exacta. Puede ser deseable tenir dos muestras por eyaculado dado que la diferencia de las muestras es una fuente significativa de variacion. Con dos muestras por eyaculado, el intervalo de confianza de un 95 % para la determinacion de la viabilidad del esperma sera de un 2,8 % (laser de color verde) a un 4,4 % (laser de color azul). Usando las tecnicas descritas, la viabilidad del esperma se puede determinar con un grado de precision y exactitud mucho mas elevado que lo que es posible con la evaluacion microscopica de la movilidad del esperma. Esto implica que la fertilidad de una muestra de semen se puede predecir de forma mas exacta a partir de los datos de viabilidad del esperma. La correlacion entre la viabilidad y la fertilidad del esperma se demuestra en el experimento 3
Tabla 3. Resultados de los analisis de regresion (corregidos para imprecision de la camara Makler). Valores ± ____________________________________desviacion estandar (sd).___________________________________
- Metodo
- interseccion (a) pendiente (p) error
- FACSCount (laser de color verde)
- -150± 115 1,03 ± 0,07 70
- FACSCount (laser de color azul)
- -200 ± 130 1,05 ± 0,08 70
- Espectrofotometro (L'Aiglon)
- 20 ± 75 0,94 ± 0,05 40
- Contador de Partmulas (Sysmex)
- -50 ± 85 1,01 ± 0,05 40
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Concentracion del esperma: En la presente investigacion, la determinacion de la concentracion del esperma con FACSCount (cualquier laser) es muy proxima a los resultados conseguidos usando el contador de partfculas (Sysmex) o el espectrofotometro (L'Aiglon) y la correlacion entre metodos de FACSCount es muy elevada (Fig. 7). En ambos metodos de citometna de flujo, se tomaron muestras de 5000 sucesos por analisis, y se cree que se pueden obtener resultados todavfa mejores tomando muestras de 10000 sucesos.
Una fuente de variacion significativa para la determinacion con citometna de flujo de la concentracion de esperma es la diferencia entre muestras. Esta diferencia se refiere tanto a la diferencia real entre muestras como la diferencia entre tubos de Recuento de Esperma. La variacion entre muestras se puede reducir mediante la aplicacion de un procedimiento de dilucion totalmente automatizado reduciendo de este modo al mmimo el factor dependiente del operador. Ademas, los resultados del metodo se pueden mejorar mediante una determinacion de la concentracion de esperma para un eyaculado basandose en un valor medio obtenido a partir de analisis de dos tubos de Recuento de Esperma. De ese modo, tanto la influencia de la variacion en el numero de cuentos entre tubos individuales de Recuento de Esperma se podna reducir, y ademas la viabilidad del esperma se podna determinar de forma mas precisa si se basara en dos muestras.
EXPERIMENTO 2
Resumen
En un segundo experimento, la concentracion y la viabilidad del esperma eyaculados de porcino se han determinado de acuerdo con una realizacion preferente de la presente divulgacion. Los espermatozoides vivos y muertos en muestras de semen de porcino se tineron de forma selectiva, y posteriormente las muestras de semen se analizaron con citometros del flujo FACSCount equipados con cualquiera de un laser de 488 nm o de 543 nm. Se analizo un total de 58 eyaculados en cada uno de los dos citometros de flujo y en un espectrofotometro (Corning 254). Ademas, el recuento del esperma se hizo en un hemocitometro Thoma usando microscopfa de contraste de fases con un aumento de 200x.
Los resultados de este experimento muestran que la determinacion de la concentracion del esperma con las dos tecnicas de citometna de flujo da como resultado una precision y exactitud mas elevadas que las obtenidas con el espectrofotometro Corning 254. Las partfculas de gel, presentes en un gran numero en el semen de porcino, aumentan la turbidez del semen de porcino y hacen que las medidas de espectro fotometna sean poco confiables. Esto es una ventaja significativa de la tecnica de citometna de flujo ya que proporciona un recuento de esperma mas preciso y exacto y proporciona de forma simultanea una determinacion precisa de la viabilidad del esperma.
MATERIALES Y METODOS
Muestras de semen
Se analizo un total de 58 eyaculados de porcino. Dos submuestras de cada eyaculado se diluyeron 250x en un medio de PBS que contema BSA al 0,1 % y una alfcuota de 60 pl se transfirio a un tubo de Recuento de Esperma. Los tiempos de tincion para SYBR-14/Pl asf como para MPR71292/EHD2 fueron de 4 mins y los tubos se analizaron posteriormente en dos citometros de flujo FACSCount equipados con un laser de 488 nm y un laser de 543 nm, respectivamente.
Los 58 eyaculados se recogieron de 40 cerdos. A partir de cada eyaculado, se tomo una alfcuota de 3 ml y se coloco en un tubo (n.° de Cat 347880 de NUNC Intermed, Lifetechnologies, Roskilde, Dinamarca) y se coloco en una mezcladora Swelab-820 (Bie & Berntsen, R0dovre, Dinamarca) y se mezclo continuamente. Todos los analisis posteriores se realizaron dentro del 30 mins despues de la recogida de semen.
Determinacion de la concentracion de esperma usando hemocitometro Thoma
El semen sin procesar se diluyo en una solucion de cloruro sodico al 5 % en p/v. La proporcion de dilucion vario de acuerdo con la concentracion del esperma determinada usando el metodo de espectrofotometna i para conseguir un numero de espermatozoides apropiado en el hemocitometro Thoma.
Por lo tanto, las muestras mas concentradas se diluyeron 72 x, mientras que las muestras 'finas' solamente se diluyeron 16 x. Las muestras se colocaron en una mezcladora (Adams Nutator, N.C. Nielsen, Br0ndy, Dinamarca) durante el recuento. La tapa del hemocitometro Thoma se coloco en posicion en los dos pilares (anillos de Newton) y las dos zonas de de recuento se llenaron tubo capilar. En cada mitad de la camara de recuento, se hizo el recuento de 5 campos grandes de cada 6 cuadrados pequenos. La camara de recuento se lleno dos veces por cada una de las dos personas implicadas en el recuento.
Determinacion de la concentracion de esperma usando espectrofotometro (Corning 254)
Para la determinacion espectrofotometrica de la concentracion del esperma, se diluyeron 0,25 ml de semen sin
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procesar con 9,75 ml de solucion de EDTA en una cubeta. La concentracion del esperma se midio posteriormente y la cubeta se mezclo cuidadosamente a mano y se volvio medio. Una muestra posterior se trato del mismo modo, por lo tanto, se realizaron 4 medidas por eyaculado.
Determinacion de la concentracion y viabilidad del esperma usando citometro de flujo
La dilucion de las muestras para los analisis de citometna de flujo se realizo como se ha descrito para semen de toro (experimento 1), aparte de un volumen de 60 pl de la muestra diluida 250 x que se transfieren a cada tubo de Recuento de Esperma usando pipeteo manual inverso. Las concentraciones del colorante y el protocolo del analisis son identicos a los mencionados anteriormente.
RESULTADOS Y DISCUSION
El coeficiente de variacion para la determinacion con citometna del flujo de la concentracion del esperma fue de un 3,2 % y de un 3,1 % para citometros de flujo FACSCount equipados con un laser de 488 nm y un laser de 543 nm, respectivamente. Para comparacion, el coeficiente de variacion para las medidas de espectrofotometna fue de un 5,9 % lo que indica una imprecision mas elevada de esta tecnica. Ademas, los datos para las medidas de espectrofotometna se distribrnan de forma mas aleatoria alrededor de la lmea de regresion que los datos obtenidos usando las medidas de citometna de flujo. En el modelo de error de medida, la desviacion estandar era 40 para el metodo de espectrofotometna que se debena comparar con una desviacion estandar de 20 para los resultados obtenidos usando los dos citometros de flujo. El coeficiente de variacion para la determinacion de la viabilidad del esperma era de un 1,4 % para ambas tecnicas de citometna de flujo.
La determinacion de la concentracion del esperma en semen de porcino es diffcil debido a una gran cantidad de partfculas de gel que hacen que las lecturas espectrofotometricas sean imprecisas. Del mismo modo, los resultados obtenidos usando contadores de partfculas, tal como el Sysmex usado para semen de toro, proporcionaran lecturas imprecisas debido a la gran cantidad de partfculas de gel con un tamano correspondiente al tamano de los espermatozoides, y ademas, el sistema de flujo de un contador de partfculas a menudo se obstruye con partfculas de genes grandes tambien presentes en el semen de porcino. La determinacion de la concentracion del esperma using metodos de citometna de flujo es significativamente mas exacta y precisa que las medidas de espectrofotometna y, ademas, la obstruccion del sistema de flujo debido a partfculas grandes es un suceso raro. La precision elevada de los metodos de citometna de flujo cuando se usa en el semen de porcino se explica por la gran cantidad de partfculas de ser presentes en el semen de porcino, haciendo que los metodos de la tecnica anterior sean altamente imprecisos. Ademas adicionalmente, el metodo de citometna de flujo proporciona una determinacion objetiva y precisa de la viabilidad del esperma, siendo el metodo significativamente mas preciso que la evaluacion microscopica subjetiva, convencional de la movilidad del esperma.
EXPERIMENTO 3
Resumen
Una aplicacion importante de los metodos de citometna de flujo descritos anteriormente es la posibilidad de predecir la fertilidad de acuerdo con la concentracion del esperma determinada previamente y viabilidad del esperma. Para evaluar el valor de esta tecnica para la seleccion de muestras de semen para inseminacion artificial (IA), se realizo un ensayo de fertilidad a gran escala con semen de toro. En el presente experimento se ha usado SYBR-14 en una concentracion de 50 nM y PI en una concentracion de 12 pM. Se analizaron cuatro eyaculados de cada uno de 157 toros (razas Holstein o Jersey) recien obtenidos se congelaron-descongelaron usando metodos de citometna de flujo y analisis de esperma asistido por ordenador (CASA). Ademas, Ademas, el semen recien obtenido se sometio a evaluacion morfologica del semen, y la evaluacion de rutina estandar de las muestras de semen se realizo en las estaciones de toro implicadas. Se realizaron un total de 121.232 inseminaciones con dosis de inseminacion proporcionadas a partir de los 4 x 157 eyaculados en los rebanos de vacuno daneses. Los datos preliminares de este ensayo extenso muestran que la determinacion de la determinacion con citometna de flujo de la viabilidad del esperma explica de un 30 % a un 50 % de la variacion en la fertilidad despues de la inseminacion. Por el contrario, la evaluacion de rutina solamente explicaba aproximadamente un 10 % de esta variacion y la determinacion computerizada de la movilidad del esperma era solo ligeramente mejor que la evaluacion microscopica usada de forma rutinaria. En conclusion, la determinacion con citometna del flujo de la viabilidad del esperma permite una seleccion mas precisa de muestras de semen para lA y esta tecnica es de gran valor para los criadores de ganado en todo el mundo.
MATERIALES Y METODOS
El semen de un total de 157 toros se recogio 4 veces cada una con un intervalo de una semana. El volumen del semen se evaluo y la concentracion de esperma se determino usando un contador de partfculas. La movilidad del esperma y el movimiento ondulado se determino usando un microscopio de contraste de fase con un aumento de 200 x y 100 x, respectivamente. La evaluacion morfologica se realizo en dos frotis tenidos con Eosina-Nigrosina por eyaculado. El analisis por ordenador de la movilidad del esperma se realizo con un sistema HTM IVOS (Christensen y Stryhn 1997). Para evitar el sesgo dependiente del tiempo, se tomaron 20 campos de forma aleatoria en dos camaras Makler. Los
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analisis de citometna de flujos se realizaron usando FACSCount citometros de flujo modificados.
En total, se realizaron 121.232 inseminaciones de forma aleatoria en rebanos de vacuno daneses. Los datos de fertilidad y los datos de los analisis del semen se analizaron usando modelos lineales mixtos
RESULTADOS Y DISCUSION
Los estudios anteriores han mostrado un valor limitado de la evaluacion subjetiva de la movilidad del esperma con respecto a la prediccion de fertilidad de una muestra de semen. La tincion del esperma de toro con SYBR-14 y PI y el posterior analisis en un citometro de flujo FACSCount tal como se realiza de acuerdo con una realizacion preferente de la presente divulgacion, proporciona una determinacion objetiva y precisa de la viabilidad, y ademas una determinacion precisa de la concentracion del esperma. Como se ha descrito anteriormente, este metodo permite la deteccion simultanea de espermatozoides vivos, muertos y moribundos, y los datos preliminares de los primeros analisis estadfsticos muestran una alta correlacion para la fertilidad in vivo. Aproximadamente de un 30 % a un 50 % de la variacion en la fertilidad despues de la inseminacion se puede explicar a partir del parametro de viabilidad. Por el contrario, la evaluacion microscopica rutinaria de la movilidad del esperma solamente explica aproximadamente un 10 % de la variacion. La viabilidad del esperma determina usando metodos de citometna de flujo representa la primera tecnica que hace posible mejorar la fertilidad de forma significativa mediante la seleccion de muestras pobres de esperma en el laboratorio de un centro de toros. Debido a la alta precision de esta tecnica, es posible resaltar los eyaculados en los que se puede anticipar un resultado inaceptable despues de la inseminacion. Por lo tanto, tales eyaculados se pueden descartar y la fertilidad en general se puede mejorar. La misma correlacion parece probable para una serie de diferentes especies, pero el valor preciso de la tecnica solamente se puede aclarar en ensayos de fertilidad para cada especie/raza. En la actualidad, un ensayo de este tipo esta en curso con semen de porcino.
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Claims (33)
- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. Un metodo para la determinacion objetiva de la concentracion total de espermatozoides en una muestra de semen y la proporcion de espermatozoides vivos en la misma, que comprende someter la muestra de semen, o una submuestra diluida de la muestra de semen, a tincion selectiva, en el que la tincion selectiva comprende un fluorocromo que se une a ADN y que tine todos los espermatozoides combinado con un fluorocromo que se une a ADN y que tine de forma selectiva los espermatozoides muertos, en el que la muestra o submuestra se combina con un medio estandar de concentracion interna, y la determinacion de la concentracion total de los espermatozoides y la proporcion de espermatozoides vivos se realizan de forma simultanea con un medio de deteccion sensible a la tincion selectiva y al medio de referencia de concentracion interna, en el que la determinacion de la concentracion total de espermatozoides y la proporcion de espermatozoides vivos se realizan usando la misma muestra o submuestra y se realizan de forma simultanea en la misma operacion de determinacion.
- 2. Un metodo de acuerdo con la precedente, en el que cualquier dilucion de la muestra se ha realizado usando un diluyente que mantiene la viabilidad de los espermatozoides durante la determinacion.
- 3. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la tincion selectiva se realiza usando uno o mas fluorocromos dando como resultado cualidades fluorescentes que se confieren a espermatozoides vivos y espermatozoides muertos, pudiendose distinguir la cualidad o cualidades fluorescentes de las celulas vivas, con los medios de deteccion, a partir de la cualidad o cualidades fluorescentes de los espermatozoides muertos, y la determinacion se realiza mediante recuento selectivo de celulas de cada cualidad fluorescente.
- 4. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que tambien se determina la proporcion de espermatozoides moribundos, siendo adaptada la tincion selectiva para permitir la distincion, con los medios de deteccion, entre espermatozoides moribundos, espermatozoides muertos y espermatozoides vivos.
- 5. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que la tincion selectiva se realiza usando uno o mas fluorocromos dando como resultado cualidades fluorescentes que se confieren a espermatozoides vivos, espermatozoides muertos y espermatozoides moribundos, pudiendose distinguir entre sf la cualidad o cualidades fluorescentes de espermatozoides vivos, espermatozoides muertos y espermatozoides moribundos con los medios de deteccion, y la determinacion se realiza mediante recuento selectivo de celulas de cada cualidad fluorescente.
- 6. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que los fluorocromos comprenden un fluorocromo capaz de tenir de forma selectiva espermatozoides muertos o moribundos, siendo este fluorocromo capaz de entrar en un espermatozoide a traves de una membrana plasmatica con escapes o defectuosa, pero siendo basicamente incapaz de entrar en un espermatozoide que tiene una membrana plasmatica intacta, y otro fluorocromo capaz de tenir todos los espermatozoides, siendo este fluorocromo capaz de entrar en una celula a traves de una membrana celular intacta.
- 7. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la excitacion de los fluorocromos se realiza por medio de luz en el intervalo de longitud de onda de aproximadamente 488 nm, siendo SYBR-14 el fluorocromo que tine todos los espermatozoides, y siendo yoduro de propidio el fluorocromo que tine los espermatozoides muertos o moribundos.
- 8. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la excitacion de los fluorocromos se realiza por medio de luz en el intervalo de longitud de onda de aproximadamente 543 nm, siendo MPR71292 el fluorocromo que tine todos los espermatozoides, y siendo el homodfmero 2 de etidio, EHD2, el fluorocromo que tine las celulas muertas o moribundas.
- 9. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el fluorocromo que tine todos los espermatozoides se usa en concentraciones totales inferiores a las concentraciones totales estandar aplicadas de forma convencional para tales fluorocromos.
- 10. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el fluorocromo que tine todos los espermatozoides se usa en concentraciones totales en el intervalo de 25 a 75 nanomolar.
- 11. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que el fluorocromo que tine todos los espermatozoides se usa en concentraciones totales de aproximadamente 50 nanomolar.
- 12. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que la tincion de los espermatozoides se realiza a una temperatura inferior a 35 °C.
- 13. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 12, en el que la tincion de los espermatozoides se realiza a una temperatura como maximo de 30 °C.
- 14. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 13, en el que la tincion de los espermatozoides se realiza a una temperatura entre 15 °C y 25 °C.5101520253035404550556065
- 15. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 14, en el que la tincion de las celulas se realiza a temperatura ambiente.
- 16. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio estandar de concentracion interna esta formado por partmulas de normalizacion, siendo anadidas las partmulas de normalizacion en un numero predeterminado por cantidad en peso o volumen de la muestra o submuestra.
- 17. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las partmulas de normalizacion son partmulas fluorescentes que tienen una cualidad fluorescente que se puede distinguir de las cualidades fluorescentes de los espermatozoides vivos, espermatozoides muertos, y espermatozoides moribundos.
- 18. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio de deteccion comprende un citometro de flujo.
- 19. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio de deteccion comprende un citometro de barrido por laser.
- 20. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el tamano y la concentracion total de espermatozoides de una submuestra se adaptan de modo que el numero de espermatozoides corresponde a entre una decima parte y diez veces el numero de partmulas de normalizacion.
- 21. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 20, en el que el tamano y la concentracion total de espermatozoides de la submuestra se adaptan de modo que el numero de espermatozoides corresponde a entre una cuarta parte y cuatro veces el numero de partmulas de normalizacion.
- 22. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 21, en el que el tamano y la concentracion total de espermatozoides de la submuestra se adaptan de modo que el numero de espermatozoides corresponde a entre la mitad y dos veces el numero de partmulas de normalizacion.
- 23. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el diluyente es un diluyente que contiene protema.
- 24. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 23, en el que la protema es BSA.
- 25. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el diluyente es un diluyente que contiene alcohol de polivinilo.
- 26. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la determinacion de la concentracion de los espermatozoides y la proporcion de espermatozoides vivos se determinan como un valor medio de la determinacion de la concentracion total de los espermatozoides y la proporcion de espermatozoides vivos realizada en dos o mas submuestras de una muestra de semen.
- 27. Un metodo para predecir la probabilidad de fertilizar un animal hembra mediante inseminacion artificial con una dosis de inseminacion, que comprende la determinacion de la concentracion total de espermatozoides en la muestra de semen a partir de la cual se toma o se va a tomar la dosis de inseminacion, y la proporcion de espermatozoides vivos en la misma con un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, y que incluye la concentracion total de los espermatozoides determinada de este modo en la muestra de semen y la proporcion de espermatozoides vivos en la misma, o la concentracion, que se puede calcular a partir de la misma, de espermatozoides vivos en la muestra, en los parametros sobre cuya base se predice la probabilidad de fertilizar al animal.
- 28. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 28, en el que la probabilidad de fertilizar al animal hembra se predice sobre la base de la concentracion total determinada de los espermatozoides en la muestra de semen y la proporcion de espermatozoides vivos en la misma, o la concentracion, que se puede calcular a partir de la misma, de espermatozoides vivos en la muestra.
- 29. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 27 o 28, en el que la prediccion de la probabilidad de fertilizar al animal hembra se realiza sobre la base de correlaciones estadfsticamente significativas entre datos de fertilidad obtenidos en experimentos de inseminacion con varios animales hembra y datos que indican la concentracion total de los espermatozoides en la muestra de semen usada en los experimentos de inseminacion y la proporcion de espermatozoides vivos en la misma, y/o datos que indican la concentracion de espermatozoides vivos en la misma.
- 30. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 27-29, en el que el animal hembra es un animal multiparo, y tambien se predice el numero de cnas que resultan de la fertilizacion.
- 31. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 27-30, en el que la muestra de semen es uneyaculado reden obtenido.
- 32. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 27-31, en el que la muestra de semen es una dosis de inseminacion congelada, siendo la muestra descongelada antes de someterla al metodo de determinacion.5
- 33. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 32, en el que los datos obtenidos con el metodo de determinacion realizado en el eyaculado recien obtenido a partir del que se tomo la dosis de inseminacion se incluyen en conjunto con datos obtenidos con el metodo de determinacion realizado en la dosis de inseminacion.
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