JPH08332098A - ラットの精子生存率識別方法 - Google Patents
ラットの精子生存率識別方法Info
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- JPH08332098A JPH08332098A JP16153895A JP16153895A JPH08332098A JP H08332098 A JPH08332098 A JP H08332098A JP 16153895 A JP16153895 A JP 16153895A JP 16153895 A JP16153895 A JP 16153895A JP H08332098 A JPH08332098 A JP H08332098A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 エステラーゼ活性を標識する生存膜透過性蛍
光色素（例えばCalceimAM）、及び、損傷した細胞膜に
のみ透過性を有し核酸と選択的に結合する蛍光色素（例
えばEthidium Homodimer）を用いて、ラットの精子を染
色することにより、生存精子及び死滅精子をそれぞれ識
別する。 【効果】 染色部位及び発色の相違によって、生存精子
と死滅精子とが、同時にしかも正確に識別でき、ラット
精子の生存率が効率的に識別できる。
光色素（例えばCalceimAM）、及び、損傷した細胞膜に
のみ透過性を有し核酸と選択的に結合する蛍光色素（例
えばEthidium Homodimer）を用いて、ラットの精子を染
色することにより、生存精子及び死滅精子をそれぞれ識
別する。 【効果】 染色部位及び発色の相違によって、生存精子
と死滅精子とが、同時にしかも正確に識別でき、ラット
精子の生存率が効率的に識別できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ラットの精子生存率識
別方法に関するものであって、検体中の生存精子と死滅
精子を同時にしかも明確に判定することができる効率的
な識別方法に関するものである。
別方法に関するものであって、検体中の生存精子と死滅
精子を同時にしかも明確に判定することができる効率的
な識別方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ラットは実験動物として飼育され、薬効
試験、安全性試験のみでなく、遺伝の研究等広範に利用
されている。そのため、ラットを大量に繁殖せしめるこ
とが行われているが、繁殖を効率良く行うためには、先
ず受精を効率良く行うことが必要である。
試験、安全性試験のみでなく、遺伝の研究等広範に利用
されている。そのため、ラットを大量に繁殖せしめるこ
とが行われているが、繁殖を効率良く行うためには、先
ず受精を効率良く行うことが必要である。
【０００３】受精を効率良く行うためには、人工受精の
場合はもちろん自然受精の場合においても、少なくとも
精子は生きていることが必要であって、受精率を高める
には、生存精子の割合の高いラット精子を使用すること
が必要である。
場合はもちろん自然受精の場合においても、少なくとも
精子は生きていることが必要であって、受精率を高める
には、生存精子の割合の高いラット精子を使用すること
が必要である。
【０００４】そして、現に、ＩＣＨガイドラインでは、
「受胎能および着床までの初期胚発生に関する試験」に
おいて雄性生殖器の機能的影響を検索するため「精巣上
体または精巣中の精子数の精子の生存率」の評価が推奨
されている。しかし、生体染色（エオジン、エオジン・
アニリンブルーなど）を用いた従来の方法ではラット精
子の生存率算定は非常に困難である。
「受胎能および着床までの初期胚発生に関する試験」に
おいて雄性生殖器の機能的影響を検索するため「精巣上
体または精巣中の精子数の精子の生存率」の評価が推奨
されている。しかし、生体染色（エオジン、エオジン・
アニリンブルーなど）を用いた従来の方法ではラット精
子の生存率算定は非常に困難である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ラッ
ト精子の生存率を迅速且つ正確にしかも格別の熟練を要
することなく容易に識別することのできる新規システム
を開発することにある。
ト精子の生存率を迅速且つ正確にしかも格別の熟練を要
することなく容易に識別することのできる新規システム
を開発することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、精子の生存率を正
確に識別するには、生存精子と死滅精子の双方を正確に
識別する必要がある点にはじめて着目した。
成するためになされたものであって、精子の生存率を正
確に識別するには、生存精子と死滅精子の双方を正確に
識別する必要がある点にはじめて着目した。
【０００７】そこで各方面から検討した結果、精子が呼
吸し、運動を行うために必要なエネルギー供給源の１つ
として、細胞膜の主要構成成分であるリン脂質を基質と
した内因性呼吸の存在が知られている。この点に着目し
て、本発明者らは、この脂質代謝により上昇したエステ
ラーゼ活性を、生体膜透過性の蛍光色素（Calcein AM）
で標識することにより生存精子の識別に成功した。同時
に、損傷した細胞膜にのみ透過性を有し、核酸と選択的
に結合する蛍光色素（Ethidium Homodimer）を用いるこ
とにより、死滅精子の確認も併せて行うことに成功し、
更に研究を継続し、遂に本発明の完成に至ったものであ
る。
吸し、運動を行うために必要なエネルギー供給源の１つ
として、細胞膜の主要構成成分であるリン脂質を基質と
した内因性呼吸の存在が知られている。この点に着目し
て、本発明者らは、この脂質代謝により上昇したエステ
ラーゼ活性を、生体膜透過性の蛍光色素（Calcein AM）
で標識することにより生存精子の識別に成功した。同時
に、損傷した細胞膜にのみ透過性を有し、核酸と選択的
に結合する蛍光色素（Ethidium Homodimer）を用いるこ
とにより、死滅精子の確認も併せて行うことに成功し、
更に研究を継続し、遂に本発明の完成に至ったものであ
る。
【０００８】すなわち本発明は、２種類の蛍光プローブ
を用いて生存精子と死滅精子を同時に且つ明確に識別す
る点を基本とするものであって、更に詳細には、エステ
ラーゼ活性を標識する生体膜透過性蛍光色素（試薬Ａ）
によって生存精子を特異的に識別し、損傷した細胞膜に
のみ透過性を有し核酸と選択的に結合する蛍光色素（試
薬Ｂ）によって死滅精子を特異的に識別し、もって精子
生存率を判定するものである。
を用いて生存精子と死滅精子を同時に且つ明確に識別す
る点を基本とするものであって、更に詳細には、エステ
ラーゼ活性を標識する生体膜透過性蛍光色素（試薬Ａ）
によって生存精子を特異的に識別し、損傷した細胞膜に
のみ透過性を有し核酸と選択的に結合する蛍光色素（試
薬Ｂ）によって死滅精子を特異的に識別し、もって精子
生存率を判定するものである。
【０００９】試薬Ａとしては、例えばカルセイン エイ
エム（Calcein AM：アメリカ、Molecular Probes社製
品）が好適に使用され、Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭで染色す
ると、生存精子は、頭部〜尾部に至る全体がすべて緑色
の蛍光を発色するか、又は、頭部は赤色の蛍光を発色す
るが尾部は緑色の蛍光発色するので、直ちに生存精子の
識別、計数が可能となる。
エム（Calcein AM：アメリカ、Molecular Probes社製
品）が好適に使用され、Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭで染色す
ると、生存精子は、頭部〜尾部に至る全体がすべて緑色
の蛍光を発色するか、又は、頭部は赤色の蛍光を発色す
るが尾部は緑色の蛍光発色するので、直ちに生存精子の
識別、計数が可能となる。
【００１０】Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ蛍光プローブの発光
メカニズムは、現時点では次のように考えられている。
ほとんど蛍光を有しないＣａｌｃｅｉｎ ＡＭが、細胞
内に偏在するエステラーゼによって蛍光の強いＣａｌｃ
ｅｉｎに変換される。Ｃａｌｃｅｉｎは多陰イオン性
で、生細胞内によく保存され、生細胞内に強力で均一な
緑色（約５３０ｎｍ）の蛍光を発する。
メカニズムは、現時点では次のように考えられている。
ほとんど蛍光を有しないＣａｌｃｅｉｎ ＡＭが、細胞
内に偏在するエステラーゼによって蛍光の強いＣａｌｃ
ｅｉｎに変換される。Ｃａｌｃｅｉｎは多陰イオン性
で、生細胞内によく保存され、生細胞内に強力で均一な
緑色（約５３０ｎｍ）の蛍光を発する。
【００１１】試薬Ｂとしては、例えばエチジウム ホモ
ダイマー（Ethidium Homodimer、以下EthD-1ということ
もある：アメリカ、Molecular Probes社製品）が好適に
使用され、ＥｔｈＤ−１で染色すると、死滅精子は、頭
部のみが赤色の蛍光を発色し、中間部〜尾部は染色され
ないので、直ちに死滅精子の識別、計数が可能となる。
ダイマー（Ethidium Homodimer、以下EthD-1ということ
もある：アメリカ、Molecular Probes社製品）が好適に
使用され、ＥｔｈＤ−１で染色すると、死滅精子は、頭
部のみが赤色の蛍光を発色し、中間部〜尾部は染色され
ないので、直ちに死滅精子の識別、計数が可能となる。
【００１２】Ｅｔｈｉｄｉｕｍ Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ発
光メカニズムは、現時点では次のように考えられてい
る。ＥｔｈＤ−１は損傷した膜を有する細胞に侵入し、
核酸と結合して４０倍の蛍光増強を受け、死細胞中に明
るい赤色（＞６００ｎｍ）の蛍光を発する。ＥｔｈＤ−
１は生細胞の無傷の細胞膜によって排除される。なお、
５３０ｎｍでの測定も可能である。
光メカニズムは、現時点では次のように考えられてい
る。ＥｔｈＤ−１は損傷した膜を有する細胞に侵入し、
核酸と結合して４０倍の蛍光増強を受け、死細胞中に明
るい赤色（＞６００ｎｍ）の蛍光を発する。ＥｔｈＤ−
１は生細胞の無傷の細胞膜によって排除される。なお、
５３０ｎｍでの測定も可能である。
【００１３】本発明を完成するには、雄性生殖器におけ
る受胎能に及ぼす機能的な影響を検索するための精子検
査の常法にしたがい、ラットの麻酔→採血・放血→精巣
上体の摘出→重量測定→精子原液の作製を行った後、上
記した２種類の蛍光プローブを用いて精子の生存率を算
定すればよい。
る受胎能に及ぼす機能的な影響を検索するための精子検
査の常法にしたがい、ラットの麻酔→採血・放血→精巣
上体の摘出→重量測定→精子原液の作製を行った後、上
記した２種類の蛍光プローブを用いて精子の生存率を算
定すればよい。
【００１４】すなわち、精子原液は、牛血清アルブミン
加ハンクス平衡塩液その他既知の精子培養液を用いて約
２〜４倍に希釈して、精子希釈液を調製する。
加ハンクス平衡塩液その他既知の精子培養液を用いて約
２〜４倍に希釈して、精子希釈液を調製する。
【００１５】一方、試薬Ａ及びＢのリン酸緩衝化生理食
塩水と混合して蛍光染色液を調製する。例えば試薬Ａと
してＣａｌｃｅｉｎ ＡＭを使用する場合、１〜２０ｍ
Ｍ、好ましくは１５〜１８ｍＭ濃度のものを使用し、試
薬ＢとしてＥｔｈＤ−１を使用する場合には、０．５〜
１５ｍＭ、好ましくは７〜８ｍＭ濃度のものを使用する
のが好ましい。詳細には、１０ｍｌのダルベッコ・ＰＢ
Ｓ溶液に、４ｍＭ カルセインＡＭを４０μｌと２ｍＭ
エチジウム ホモダイマーを４０μｌ添加、混合し
て、蛍光染色液を調製する。
塩水と混合して蛍光染色液を調製する。例えば試薬Ａと
してＣａｌｃｅｉｎ ＡＭを使用する場合、１〜２０ｍ
Ｍ、好ましくは１５〜１８ｍＭ濃度のものを使用し、試
薬ＢとしてＥｔｈＤ−１を使用する場合には、０．５〜
１５ｍＭ、好ましくは７〜８ｍＭ濃度のものを使用する
のが好ましい。詳細には、１０ｍｌのダルベッコ・ＰＢ
Ｓ溶液に、４ｍＭ カルセインＡＭを４０μｌと２ｍＭ
エチジウム ホモダイマーを４０μｌ添加、混合し
て、蛍光染色液を調製する。
【００１６】このようにして調製した精子希釈液と蛍光
染色液とを混合し（その混合比率は、精子希釈液１部に
対して蛍光染色液０．１〜５部程度とするのが通常であ
るが、場合によってはこの範囲を逸脱してもよい）、得
られた混合液を炭酸ガス培養器内（１〜１０％ＣＯ2、
３５〜３９℃）で３０〜９０分間保持、培養、染色す
る。
染色液とを混合し（その混合比率は、精子希釈液１部に
対して蛍光染色液０．１〜５部程度とするのが通常であ
るが、場合によってはこの範囲を逸脱してもよい）、得
られた混合液を炭酸ガス培養器内（１〜１０％ＣＯ2、
３５〜３９℃）で３０〜９０分間保持、培養、染色す
る。
【００１７】しかる後に、蛍光顕微鏡、蛍光マルチウエ
ル・プレート・スキャナー、フローサイトメーター、そ
の他既知の蛍光検出システムによって検出、識別すれば
よく、例えば試薬Ａ、ＢとしてＣａｌｃｅｉｎ ＡＭ、
ＥｔｈＤ−１を使用した場合、生存精子と死滅精子の判
定は次のようにして簡単に行うことができ、その結果か
ら精子の生存率を算出することができる。 生存精子：頭部〜尾部が緑色の蛍光を発する精子。頭
部が赤色の蛍光を、尾部が緑色の蛍光を発する精子。 死滅精子：頭部が赤色の蛍光を発し、尾部が染色され
ていない精子。
ル・プレート・スキャナー、フローサイトメーター、そ
の他既知の蛍光検出システムによって検出、識別すれば
よく、例えば試薬Ａ、ＢとしてＣａｌｃｅｉｎ ＡＭ、
ＥｔｈＤ−１を使用した場合、生存精子と死滅精子の判
定は次のようにして簡単に行うことができ、その結果か
ら精子の生存率を算出することができる。 生存精子：頭部〜尾部が緑色の蛍光を発する精子。頭
部が赤色の蛍光を、尾部が緑色の蛍光を発する精子。 死滅精子：頭部が赤色の蛍光を発し、尾部が染色され
ていない精子。
【００１８】本発明の実施態様のひとつとして、蛍光顕
微鏡を使用する例を説明すれば、次のとおりである。先
ず、ラットから摘出した精巣（上体）、電気刺激等によ
って採取したラット精液からその一部をサンプリング
し、得られた試料を希釈した後、Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ
及びＥｔｈＤ−１を含有する蛍光染色液を加えて炭酸ガ
ス培養器内で培養、染色する。
微鏡を使用する例を説明すれば、次のとおりである。先
ず、ラットから摘出した精巣（上体）、電気刺激等によ
って採取したラット精液からその一部をサンプリング
し、得られた試料を希釈した後、Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ
及びＥｔｈＤ−１を含有する蛍光染色液を加えて炭酸ガ
ス培養器内で培養、染色する。
【００１９】染色終了後、蛍光顕微鏡を用いて、上記し
た判定法にしたがって蛍光発色の違いに基づき生存精子
と死滅精子とを識別し、それぞれの数をカウントする。
観察部位をかえて同様に生存精子数と死滅精子数とをカ
ウントする。これらの結果から生存率を算出し、精子の
起源であるところの精巣（上体）及び雄性ラット個体の
生殖能を判断する。
た判定法にしたがって蛍光発色の違いに基づき生存精子
と死滅精子とを識別し、それぞれの数をカウントする。
観察部位をかえて同様に生存精子数と死滅精子数とをカ
ウントする。これらの結果から生存率を算出し、精子の
起源であるところの精巣（上体）及び雄性ラット個体の
生殖能を判断する。
【００２０】以下、本発明の実施例について述べる。
【００２１】
【実施例１】 （１）精子培養液の調製 精製培養液（０．５％牛血清アルミブミン加ハンクス平
衡塩液：０．５％ＢＳＡ・ＨＢＳＳ）を以下により調製
する。
衡塩液：０．５％ＢＳＡ・ＨＢＳＳ）を以下により調製
する。
【００２２】 １）組成 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)：GIBCO BRL 塩化カルシウム(無水)(CaCl2(Anhydrous))： 140mg／L 塩化カリウム(KCl) ： 400mg／L リン酸２水素カリウム(KH2PO4) ： 60mg／L 硫酸マグネシウム(MgSO4) ： 97.7mg／L 塩化ナトリウム(NaCl) ：8000mg／L リン酸水素２ナトリウム(Na2HPO4) ： 48mg／L グルコース(D-Glucose) ：1000mg／L 蒸留水あるいは日局注射用水 ：1000ml 炭酸水素ナトリウム(NaHCO3) ： 200mg／L 試薬特級 牛血清アルブミン(BSA) ：5000mg／L Fraction Ｖ
【００２３】２）調製方法 HBSS原末9.75g、炭酸水素ナトリウム0.2gおよび牛血
清アルブミン5.0gを蒸留水あるいは日局注射用水に溶解
し、全量1000mlにメスアップする。 pHメータを用いて、pHを7.2に調製する。 メンブランフィルター(0.45μ以下を使用)を用いて、
濾過滅菌する。
清アルブミン5.0gを蒸留水あるいは日局注射用水に溶解
し、全量1000mlにメスアップする。 pHメータを用いて、pHを7.2に調製する。 メンブランフィルター(0.45μ以下を使用)を用いて、
濾過滅菌する。
【００２４】（２）蛍光染色液の調製 試薬Ａ、Ｂとして、それぞれＣａｌｃｅｉｎ ＡＭ、Ｅ
ｔｈｉｄｉｕｍ Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ（Molecular Prob
es社製）を用いて、以下により蛍光染色液を調製する。
ｔｈｉｄｉｕｍ Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ（Molecular Prob
es社製）を用いて、以下により蛍光染色液を調製する。
【００２５】 １）組成 蛍光プローブ 4mM Calcein AM：40μL×2(Frozen) 2mM Ethidium Homodimer：150μL×2(Frozen) Dalbecco's Phosphate Buffered Saline(D-PBS)：GIBCO BRL 塩化カルシウム(無水)(CaCl2(Anhydrous))： 100mg／L 塩化カリウム(KCl) ： 200mg／L リン酸２水素カリウム(KH2PO4) ： 200mg／L 塩化マグネシウム(無水)(MgCl2(Anhydrous))：47mg／L 塩化ナトリウム(NaCl) ：8000mg／L リン酸水素２ナトリウム(Na2HPO4) ：1150mg／L 蒸留水 ：1000ml
【００２６】２）調製方法 D-PBS原末9.7gを蒸留水に溶解し、全量1000mlにメス
アップする。 メンブランフィルター(0.45μ以下を使用)を用いて、
調製したD-PBSを濾過滅菌する。 Calcein AMおよびEthidium Homodimerの必要量を室温
下で融解する。 蛍光染色液の調製 D-PBS ：10ml 4mM Calcein AM ：40μl 2mM Ethidium Homodimer ：40μl D-PBSに必要量のCalcein AMおよびEthidium Homodimer
を加え、タッチミキサーを用いて良く混和する。蛍光染
色液の調製は、用時に行う。
アップする。 メンブランフィルター(0.45μ以下を使用)を用いて、
調製したD-PBSを濾過滅菌する。 Calcein AMおよびEthidium Homodimerの必要量を室温
下で融解する。 蛍光染色液の調製 D-PBS ：10ml 4mM Calcein AM ：40μl 2mM Ethidium Homodimer ：40μl D-PBSに必要量のCalcein AMおよびEthidium Homodimer
を加え、タッチミキサーを用いて良く混和する。蛍光染
色液の調製は、用時に行う。
【００２７】（３）生存率の算定 １）上記により、精子培養液及び蛍光染色液を調製し、
準備しておく。 ２）精子培養液を炭酸ガス培養器内(5％CO2、37℃)で60
分以上加温・ガス置換する。 ３）ホットプレートの電源を入れ、温度を37℃に安定さ
せる。 ４）マイクロウェルプレートをホットプレート上あるい
は炭酸ガス培養器内で37℃に加温する。 ５）加温した精子培養液をマイクロウェルプレートに50
μl分注し、ホットプレート上で37℃に保温する。 ６）精子原液を精子培養液で約３倍に希釈する。精子数
が少ないと判断される場合には、希釈倍率を適宜変更す
る。 ７）蛍光染色液50μlと精子希釈液25μlをマイクロウェ
ルプレート内で混合する。 ８）炭酸ガス培養器内で約60分間染色する。 ９）染色終了後、精子染色液を適量スライドガラス上に
取り、カバーガラスをかけて蛍光顕微鏡にて200〜600倍
で観察する。 10）蛍光顕微鏡のフィルターの設定 ａ）ダイロックミラー：B-G励起ユニット ｂ）吸収フィルター：Ｏ530 11）観察部位を変えて約100個づつ計300個の精子を数
え、生存精子と死滅精子とに分類する。 12）生存精子と死滅精子の判定法 生存精子 頭部〜尾部が緑色の蛍光を発する精子。 頭部が赤色の蛍光を、尾部が緑色の蛍光を発する精子。 死滅精子 頭部が赤色の蛍光を発し、尾部が染色されていない精
子。
準備しておく。 ２）精子培養液を炭酸ガス培養器内(5％CO2、37℃)で60
分以上加温・ガス置換する。 ３）ホットプレートの電源を入れ、温度を37℃に安定さ
せる。 ４）マイクロウェルプレートをホットプレート上あるい
は炭酸ガス培養器内で37℃に加温する。 ５）加温した精子培養液をマイクロウェルプレートに50
μl分注し、ホットプレート上で37℃に保温する。 ６）精子原液を精子培養液で約３倍に希釈する。精子数
が少ないと判断される場合には、希釈倍率を適宜変更す
る。 ７）蛍光染色液50μlと精子希釈液25μlをマイクロウェ
ルプレート内で混合する。 ８）炭酸ガス培養器内で約60分間染色する。 ９）染色終了後、精子染色液を適量スライドガラス上に
取り、カバーガラスをかけて蛍光顕微鏡にて200〜600倍
で観察する。 10）蛍光顕微鏡のフィルターの設定 ａ）ダイロックミラー：B-G励起ユニット ｂ）吸収フィルター：Ｏ530 11）観察部位を変えて約100個づつ計300個の精子を数
え、生存精子と死滅精子とに分類する。 12）生存精子と死滅精子の判定法 生存精子 頭部〜尾部が緑色の蛍光を発する精子。 頭部が赤色の蛍光を、尾部が緑色の蛍光を発する精子。 死滅精子 頭部が赤色の蛍光を発し、尾部が染色されていない精
子。
【００２８】（４）結果 本法にしたがって染色を行った結果、緑色と赤色の蛍光
の発色がそれぞれ同時に且つ明確に認められ、生存精子
と死滅精子の標別がきわめて容易に行われ、これらの数
を蛍光顕微鏡のもとでカウントすることはきわめて容易
であった。したがって、これらの精子数に基づき、正確
な生存率を容易に算出することが可能となった。
の発色がそれぞれ同時に且つ明確に認められ、生存精子
と死滅精子の標別がきわめて容易に行われ、これらの数
を蛍光顕微鏡のもとでカウントすることはきわめて容易
であった。したがって、これらの精子数に基づき、正確
な生存率を容易に算出することが可能となった。
【００２９】また現に、生存精子を指標として算出した
ラットの精巣上体尾部精子の生存率は、９６．８％±
３．６５（Max：99.7％、Min：82.3％、ｎ＝45）であっ
た。さらに、物理的に死滅させた精子と生存精子とを任
意の割合で混合したサンプルを用いて生存率を算出した
ところ、理論値との間に良い相関が得られた。
ラットの精巣上体尾部精子の生存率は、９６．８％±
３．６５（Max：99.7％、Min：82.3％、ｎ＝45）であっ
た。さらに、物理的に死滅させた精子と生存精子とを任
意の割合で混合したサンプルを用いて生存率を算出した
ところ、理論値との間に良い相関が得られた。
【００３０】
【発明の効果】本発明によれば、１回の操作で生存精子
と死滅精子が同時に識別できるので、識別が短時間に且
つ簡単な操作で行うことができる。そのうえ、生存精子
と死滅精子とは染色部位及び発色が明らかに相違するた
め、識別が容易にしかも正確に行われ、格別の熟練も要
しないという著効が奏される。
と死滅精子が同時に識別できるので、識別が短時間に且
つ簡単な操作で行うことができる。そのうえ、生存精子
と死滅精子とは染色部位及び発色が明らかに相違するた
め、識別が容易にしかも正確に行われ、格別の熟練も要
しないという著効が奏される。
Claims (5)
- 【請求項１】 エステラーゼ活性を標識する生体膜透過
性蛍光色素（試薬Ａ）、及び、損傷した細胞膜にのみ透
過性を有し核酸と選択的に結合する蛍光色素（試薬Ｂ）
を使用して、ラットの生存精子及び死滅精子を識別する
こと、を特徴とするラットの精子生存率識別方法。 - 【請求項２】 試薬Ａとして蛍光色素カルセイン エイ
エム、試薬Ｂとして蛍光色素エチジウム ホモダイマー
を使用すること、を特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 １〜２０ｍＭ、好ましくは１５〜１７ｍ
Ｍの試薬Ａ、及び、０．５〜１５ｍＭ、好ましくは７〜
８ｍＭの試薬Ｂを使用すること、を特徴とする請求項１
又は請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 試料、試薬Ａ、Ｂを炭酸ガス培養器内で
３５〜３９℃、３０〜９０分間保持して培養、染色を行
い、蛍光発色にしたがって生存精子と死滅精子を判定、
識別すること、を特徴とする請求項１〜請求項３のいず
れか１項に記載の方法。 - 【請求項５】 頭部〜尾部が緑色の蛍光を発する精子、
又は、頭部が赤色の蛍光を発し尾部が緑色の蛍光を発す
る精子を生存精子と判定し、頭部が赤色の蛍光を発し尾
部は染色されていない精子を死滅精子と判定すること、
を特徴とする請求項４に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16153895A JPH08332098A (ja) | 1995-06-06 | 1995-06-06 | ラットの精子生存率識別方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16153895A JPH08332098A (ja) | 1995-06-06 | 1995-06-06 | ラットの精子生存率識別方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08332098A true JPH08332098A (ja) | 1996-12-17 |
Family
ID=15737009
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16153895A Pending JPH08332098A (ja) | 1995-06-06 | 1995-06-06 | ラットの精子生存率識別方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08332098A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000054026A1 (en) * | 1999-03-05 | 2000-09-14 | Hatting-Ks | Determination of sperm concentration and viability for artificial insemination |
| CN112184708A (zh) * | 2020-11-04 | 2021-01-05 | 成都朴华科技有限公司 | 精子存活率检测方法及装置 |
| CN112184708B (zh) * | 2020-11-04 | 2024-05-31 | 成都朴华科技有限公司 | 精子存活率检测方法及装置 |
-
1995
- 1995-06-06 JP JP16153895A patent/JPH08332098A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000054026A1 (en) * | 1999-03-05 | 2000-09-14 | Hatting-Ks | Determination of sperm concentration and viability for artificial insemination |
| CN112184708A (zh) * | 2020-11-04 | 2021-01-05 | 成都朴华科技有限公司 | 精子存活率检测方法及装置 |
| CN112184708B (zh) * | 2020-11-04 | 2024-05-31 | 成都朴华科技有限公司 | 精子存活率检测方法及装置 |
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