BR112015007479B1 - Métodos de processamento de esperma para separação com base no sexo - Google Patents

Métodos de processamento de esperma para separação com base no sexo Download PDF

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Abstract

métodos de processamento de esperma para separação com base no sexo são divulgados métodos para processamento e separação de esperma. porções de processos de separação ou coloração de esperma podem incluir padronização de amostras de esperma por ajuste da concentração da amostra de esperma até uma concentração pré-determinada e ajuste do ph da amostra até um valor pré-determinado. o esperma pode ser também corado em um único tampão de coloração tendo um corante seletivo quanto a dna e um corante de extinção.

Description

[001] Geralmente, esta divulgação se relaciona com métodos de coloração e separação, tais como aqueles usados em Separação de Células Ativada por Fluorescência (FACS); e mais particularmente, esta divulgação se relaciona com métodos de coloração que melhoram a viabilidade de espermatozóides separados.
Antecedentes [002] Os métodos de separação de esperma se baseiam frequentemente em FACS para a detecção de diferenças quantificáveis no conteúdo de DNA de espermatozóides portadores de cromossomo X e espermatozóides portadores de cromossomo Y. De modo a medir o conteúdo de DNA, um passo típico na separação de esperma inclui coloração de uma população de espermatozóides com um corante fluorescente seletivo quanto a DNA que se liga estequiometricamente a DNA nuclear. Hoechst 33342, por vezes referido como Hoechst bisbenzimida 33342, é o corante o mais amplamente utilizada porque pode ser usado em uma quantidade suficiente para diferenciar pequenas variações em DNA nuclear sem exibição da toxicidade de outros corantes.
|003] Em última instância, uma pequena variação no conteúdo de
DNA é quantificada diferenciando espermatozóides portadores de cromossomo X de espermatozóides portadores de cromossomo Y. Nos bovinos, por exemplo, os touros Holstein têm uma diferença de cerca de
3,8 % no conteúdo de DNA, enquanto os touros Jersey têm uma diferença de cerca de 4,1 %. Devido à natureza inexata da coloração estequiométrica do DNA, estas pequenas variações podem ser difíceis de verificar. As
2/27 amostras de esperma, mesmo amostras dentro de uma única raça, podem variar grandemente em concentração, pH, motilidades e morfologias. Por esta razão, as condições de coloração que trabalham bem em uma circunstância podem corar a menos ou corar a mais outras amostras de esperma, mesmo amostras de esperma coletadas da mesma raça, ou mesmo do mesmo animal. Várias condições de coloração podem ser testadas antes de a amostra inteira ser corada por esta razão. Infelizmente, o processo de separação de esperma é danoso a espermatozóides críticos em relação ao tempo, não regenerativos e o passo de coloração pode ser especialmente prejudicial. Embora Hoechst 33342 possa ser usado em concentrações não tóxicas, o esperma tem de ser incubado a temperaturas elevadas e pHs elevados para penetração suficiente de Hoechst 33342 com uniformidade suficiente para análise ou separação. Cada uma de elevação da temperatura do esperma e elevação do pH do esperma pode contribuir para danos ao esperma. Portanto pode existir um certo equilíbrio entre as condições para estabelecimento de uma coloração mais uniforme e redução da percentagem de esperma danificado e morto no processo de separação.
Divulgação da invenção [004] Certas formas de realização da invenção reivindicada estão resumidas em baixo. Estas formas de realização não se destinam a limitar o escopo da invenção reivindicada, mas ao invés servir como breves descrições de possíveis formas da invenção. A invenção pode englobar uma variedade de formas que diferem destes sumários.
[005] Uma forma de realização se relaciona com um método de processamento de esperma que se inicia com obtenção de uma amostra de esperma. A concentração da amostra de esperma pode ser ajustada até uma concentração pré-determinada e o pH da amostra de esperma pode ser ajustado na direção de um valor pré-determinado antes de coloração da amostra de esperma.
3/27 [006| Outra forma de realização se relaciona com um método de separação de esperma que se inicia por obtenção de uma amostra de esperma. O esperma estendido pode ser depois corado com um único tampão de coloração tendo um corante seletivo quanto a DNA e um corante de extinção e os separados.
|007| Ainda outra forma de realização se relaciona com um método de separação de esperma que se inicia por obtenção de uma amostra de esperma. A amostra de esperma pode ser depois corada com um tampão de coloração tendo um corante seletivo quanto a DNA a um pH elevado. A amostra de esperma pode ser também corada com um corante de extinção e separada tal que o pH elevado introduzido com o corante seletivo quanto a DNA seja mantido até ao momento de separação.
Breve descrição dos desenhos
1008] A FIG. 1 ilustra um esquema de um citômetro de fluxo para separação de esperma de acordo com certas formas de realização da invenção.
[009| A FIG. 2 ilustra uma representação gráfica de vários parâmetros de separação adquiridos em um citômetro de fluxo enquanto se separa esperma preparado e corado de acordo com várias formas de realização da presente invenção.
|010] A FIG. 3 ilustra uma representação gráfica de valores de pH adquiridos durante preparação e coloração de um esperma.
1011] Embora a presente invenção possa realizada com várias modificações e formas alternativas, formas de realização específicas são ilustradas nas figuras e descritas aqui por meio de exemplos ilustrativos. Deve ser entendido que as figuras e descrições detalhadas não se destinam a limitar o escopo da invenção à forma divulgada particular, mas que todas as modificações, alternativas, e equivalentes abrangidos pelo espírito e escopo das reivindicações se destinam a estar englobados.
4/27
Modos de realização da invenção [012| Em certos aspetos, a presente invenção proporciona procedimentos de tratamento de esperma melhorados com benefícios particulares aos espermatozóides separados com base no sexo. Por exemplo, certos aspetos se relacionam com estabelecimento de um pH e concentração do esperma padronizados antes de passos de separação adicionais, tais como coloração. Em métodos prévios, as amostras de esperma tendo vários pHs e concentrações puros podem requerer processos de manuseamento, que podem ser determinados com uma base caso a caso. A padronização de ejaculados pode resultar em coloração mais eficaz entre diferentes amostras.
[013] Outro aspeto se relaciona com um pH mais constante ao longo do decurso de coloração, e mesmo através dos passos de separação e congelamento do esperma. Os métodos de processamento de esperma prévios podem ter introduzido danos ao esperma no levar a cabo de passos que se destinavam a reduzir os danos ao esperma. O benefício à saúde do esperma pode ser diretamente refletida por uma redução na percentagem de espermatozóides que absorvem corante de extinção de morte e são removidos da população de espermatozóides vivos durante a separação.
1014] Ainda outro aspeto se relaciona com um processo de coloração em um passo que proporciona viabilidade dos espermatozóides melhorada em relação a processos em dois passos prévios. Adicionalmente à motil idade melhorada, uma maior percentagem de espermatozóides vivos resultou em taxas de separação aumentadas.
[0151 Os métodos de coloração prévios incluíam dois passos, tipicamente o primeiro passo incluía incubação com um primeiro tampão, e um corante seletivo quanto a DNA, tal como Hoechst 33342, a um pH e temperatura elevados. Para separação de bovinos, o primeiro tampão pode ter um pH elevado de cerca de 7,4. O valor 7,4 pode estar ligeiramente fora
5/27 da faixa na qual os espermatozóides estão confortáveis, mas ser necessário para permitir que o corante seletivo quanto a DNA permeie a membrana dos espermatozóides.
[016] Após o período de incubação, um segundo passo de incubação incluía os espermatozóides corados são estendidos em um volume igual de um segundo tampão que incluía um corante de extinção de morte, tal como um corante alimentar. O segundo tampão pode ser o mesmo tampão do primeiro tampão, mas ajustado para baixo até um pH de cerca de 5,5. Deste modo, o 7,5 é trazido de volta até um valor mais físiologicamente aceitável para o esperma. Se acreditava previamente que era mais benéfico para a saúde do esperma devolver o pH até um valor próximo de 6,8.
[017] No entanto foi apreciado pelos requerentes que o processo pelo qual o segundo tampão é introduzido pode estar causando mais danos do que está prevenindo. Especificamente, à medida que o segundo tampão é introduzido na amostra de espenna estendido com o primeiro tampão, bolsas de fluido tendo o pH 5,5 podem contatar com espermatozóides antes de a mistura estar uniformemente dispersa e o volume inteiro estar a um único pH. O elevado nível de acidez no segundo tampão pode ser prejudicial pois o segundo tampão é dispensado na amostra de espenna estendido antes de alcançar o equilíbrio.
[018] Em um aspeto, a invenção proporciona um método de processamento de esperma incluindo os passos de: (1) obtenção de uma população de espermatozóides; (2) ajuste da concentração da amostra de esperma até uma concentração pré-determinada; (3) ajuste do pH da amostra até um valor pré-determinado e (4) coloração da população de espermatozóides.
[019] Várias formas de realização descritas aqui podem adicionalmente incluir o passo de separação da população de espermatozóides corados, tal como separação com base no sexo da
6/27 população de espermatozóides corados com base no conteúdo de DNA. Em uma tal forma de realização, a amostra de esperma pode ser mantida ao, ou próximo do, pH pré-determinado através dos passos de coloração e separação.
[020] Várias formas de realização adicionais podem incluir os passos de separação de esperma e congelamento dos espermatozóides separados. Em tais formas de realização, a amostra de esperma pode ser mantida ao, ou próximo do, pH pré-determinado através dos passos de coloração, separação, e congelamento.
[021] Em outro aspeto, a invenção proporciona um método de seleção de populações enriquecidas quanto ao gênero de espermatozóides incluindo os passos de: (1) obtenção de uma população de espermatozóides; (2) coloração da amostra de espermatozóides com um único tampão de coloração tendo um corante seletivo quanto a DNA e um corante de extinção; e (3) separação da amostra de esperma corada.
[022] Várias formas de realização podem incluir ajuste da amostra de esperma até uma concentração pré-determinada e/ou a um valor de pH pré-determinado antes da coloração. O esperma pode ser separado e congelado enquanto é mantido ao, ou próximo do, valor de pH prédeterminado.
[023[ E m ainda outro aspeto, a invenção proporciona um método de processamento de esperma incluindo os passos de: (1) obtenção de uma população de espermatozóides; (2) ajuste da concentração da amostra de esperma até uma concentração pré-determinada; (3) ajuste do pH da amostra na direção de um valor pré-determinado e (4) coloração da amostra de esperma com um único tampão de coloração tendo um corante seletivo quanto a DNA e um corante de extinção e (5) separação do esperma corado.
Obtenção do esperma /27
1024] A população de espermatozóides pode ser obtida na forma de sêmen puro, esperma estendido, esperma congelado-descongelado ou em suas combinações. A população de espermatozóides pode ser obtida no mesmo local onde os passos restantes são realizados, ou pode estar estendida em um tampão de esperma apropriado para transporte até uma instalação de separação. O esperma pode ser mantido à temperatura ambiente, refrigerado, ou mesmo congelado em um tampão apropriado para uso posterior. O passo de obtenção do esperma pode considerado aquisição do esperma de um mamífero, mas pode também incluir aquisição do esperma de armazenamento, tal como obtenção de uma palheta congelada ou refrigerada de armazenamento, ou mesmo agrupamento de esperma congelada ou refrigerada.
[025] A população de espermatozóides pode ter origem em mamíferos, tais como um mamífero não humano listado por Wilson, D.E. e Reeder, D.M., Mammal Species of the World, Smithsonian Institution Press, (1993), os conteúdos inteiros do qual são incorporados aqui por referência.
[□26] Aquando da coleta, ou descongelamento, ou mesmo agrupamento, o esperma pode ser checado quanto a concentração, pH, motilidade e/ou morfologia. Adicionalmente podem ser adicionados antibióticos antes de quaisquer passos de processamento adicionais.
|027] Ajuste do esperma até uma concentração pré-determinada e na direção de um pH pré-determinado |028] Uma vez obtido, o esperma pode ser padronizado até uma concentração pré-determinada e/ou na direção de um pH pré-determinado. Cada uma da concentração e pH pré-determinados pode ser específico de diferentes espécies, ou mesmo de diferentes raças de animais dentro de uma espécie. Em uma forma de realização, o esperma pode ser combinado com um tampão inicial na forma de um tampão de elevada capacidade.
8/27
Tampões exemplares podem incluir TRIS citrato, citrato de sódio, bicarbonato de sódio, HEPES, TRIS, TEST, MOPS, KMT, TALP e suas combinações. Qualquer tampão tendo uma elevada capacidade para tamponamento de pH pode ser também empregue, e pode ser usado em combinação com componentes adicionais que promovem a viabilidade dos espermatozóides tais como gema de ovo, e fontes de citratos ou ácido cítrico. Adicionalmente podem ser empregues antioxidantes e antibióticos no tampão inicial para promover a viabilidade do esperma.
[029] O tampão inicial pode estar definido a um pH pré-determinado para normalizar o pH de todas as amostras de esperma obtidas. Em uma forma de realização, o tampão é ajustado até um pH de 7,2. Adicionalmente, o sêmen pode se tornar crescentemente ácido ao longo do tempo, possivelmente devido a proteínas no fluido seminal, ou possivelmente devido a subprodutos ácidos de células mortas ou morrendo. Em qualquer um dos casos, o tampão inicial introduz ligações de ligação de prótons livres (p.ex., El+) suficientes para manter o pEI próximo do alvo pré-determinado. Mesmo à luz da tendência natural do esperma de se tornar mais ácido ao longo do tempo, o tampão inicial proporciona um meio para estabilização do pH ao longo de passos de processamento adicionais.
[030] Como um exemplo, a amostra de esperma pode ser diluída no tampão de elevada capacidade em razões de cerca de 1:1 a cerca de 1:10. A mistura resultante terá uma concentração de esperma muitas vezes abaixo das concentrações de esperma natural para uma espécie particular. O esperma estendido pode ser centrifugado de modo a reconcentrar o esperma, A centrifugação do esperma e remoção do sobrenadante permitem que o esperma seja reconcentrado até uma concentração pré-determinada. A concentração pré-determinada pode ser selecionada com base em passos de processamento de esperma adicionais. Por exemplo, no caso de bovinos separados quanto ao sexo, o esperma pode ser reconcentrado a entre cerca
9/27 de 2400 milhões de espermatozóides por mL e cerca de 900 milhões de espermatozóides por mL para simular uma faixa de concentrações natural. Outras concentrações, tais como entre cerca de 1400 milhões de espermatozóides por mL e cerca de 2100 milhões de espermatozóides por mL podem ou entre cerca de 1700 milhões de espermatozóides por mL e cerca de 2100 milhões de espermatozóides por mL, podem ser também alcançadas para processamento adicional.
[031] O ajuste da concentração e pH do esperma pode proporcionar um ponto de partida uniforme para processamento adicional. Por exemplo, um pH e concentração relativamente consistentes podem proporcionar maior previsibilidade na coloração do esperma, por exemplo com um corante seletivo quanto a DNA. Se cada amostra for ajustada até aos mesmos pH e concentração pré-determinados, menos ensaios podem ser requeridos em cada nova coleta para assegurar coloração adequada para separação com base no sexo.
Coloração do esperma [032] A amostra de esperma pode incluir espermatozóides portadores de cromossomo X e espermatozóides portadores de cromossomo Y. Adicionalmente, cada um dos espermatozóides portadores de cromossomo X e dos espermatozóides portadores de cromossomo Y pode incluir espermatozóides viáveis e espermatozóides não viáveis. Os espermatozóides viáveis podem ser considerados espermatozóides com membranas intactas enquanto os espermatozóides não viáveis podem ser considerados espermatozóides com membranas comprometidas. Os espermatozóides viáveis, na dosagem apropriada, serão geralmente capazes de alcançar fertilização em uma inseminação artificial, enquanto os espermatozóides não viáveis, ou espermatozóides com membranas comprometidas, podem ser incapazes de alcançar fertilização em uma inseminação artificial ou terão uma capacidade grandemente reduzida de a
10/27 fazer. No entanto, alguns espermatozóides capazes de fertilização podem ter membranas comprometidas, e alguns espermatozóides com membranas intactas podem ser incapazes de fertilização.
[033] Quer padronizados ou não, os espermatozóides podem ser corados com um tampão de coloração para introdução de um corante seletivo quanto a DNA. No passo de coloração, pelo menos uma porção da população de espermatozóides é incubada com um tampão de coloração e um corante fluorescente seletivo quanto a DNA de modo a colorir estequiometricamente o conteúdo de DNA de cada célula na população de células. Hoechst 33342 é o mais comummente usado na área de separação de esperma, pois tende a ser menos tóxico do que outros corantes seletivos quanto a DNA. O veículo para distribuição deste corante pode estar na forma de um tampão de TALP modificado ajustado até um pH de cerca de
7,4. Hoechst 33342 é descrito na Patente dos EUA 5,135,759, e é comummente usado para este propósito. No entanto poderíam ser também usados outros corantes excitáveis por UV, bem como corantes excitáveis por luz visível, poliamidas fluorescentes, sequências de nucleotídeos fluorescentes, e anticorpos específicos quanto ao sexo.
[034] Os espermatozóides em um estado natural não são frequentemente permeáveis a tais corantes. De modo a se produzir uma coloração uniforme, o primeiro passo da coloração pode incluir incubação de pelo menos uma porção da população de espermatozóides a uma temperatura elevada em um tampão de coloração a um pH elevado adicionalmente ao corante. Exemplos de tampões de primeira coloração apropriados podem ser um TALP, TES-TRIS, TRIS citrato, citrato de sódio, ou um meio à base de HEPES, cada um descrito em W02005/095960, incorporada aqui por referência. Um TALP modificado exemplar descrito em WO2001/37655, incorporada aqui por referência, está ilustrado na Tabela 1.
11/27
TABELA 1 - Tampão de TALP Modificado
Ingrediente Concentração
NaCl 95,0 mM
KC1 3,0 mM
NaHPO4 0,3 mM
NaHCO3 10,0 mM
MgCEóTfO 0.4 mM
Piruvato de Na 2,0 mM
Glucose 5,0 mM
Lactato de Na 25,0 mM
HEPES 40,0 mM albumina de soro bovino 3,0 mg/mL [035] Como um exemplo, a população de espermatozóides, ou uma porção da população de espermatozóides, podería ser diluída com o primeiro tampão até entre 640 x 106 e 40 x 106 espermatozoides/mL, até entre cerca de 320 x 106 e 80 x 106 espermatozoides/mL, ou até cerca de 160 x 106 espermatozoides/mL no primeiro tampão. O corante fluorescente seletivo quanto a DNA pode ser adicionado aos espermatozóides suspensos no primeiro tampão em uma concentração de entre cerca de 10 μΜ e 200 μΜ; entre cerca de 20 μΜ e 100 μΜ, ou entre cerca de 30 μΜ e 70 μΜ. O pH do primeiro tampão pode estar entre cerca de 6,8 e 7,9; cerca de 7,1 e 7,6; ou a cerca de 7,4 de modo a ajudar a assegurar uma coloração uniforme do DNA nuclear. Aqueles com perícia ordinária na técnica apreciarão que o pH pode ser elevado com a adição de NaOH e diminuído com a adição de HC1.
|036] A população de espermatozóides pode ser incubada entre 3039 °C, entre cerca de 32-37 °C, ou a cerca de 34 °C. O período de incubação pode variar entre cerca de 20 minutos e cerca de uma hora e meia, entre cerca de 30 minutos e cerca de 75 minutos, ou durante cerca de 45 minutos a cerca de 60 minutos. Como um exemplo, a população de espermatozóides
12/27 pode ser incubada durante cerca de 45 minutos a 34 °C. Mesmo dentro de uma única espécie, a concentração e pH dos espermatozóides e outros fatores afetando a capacidade de coloração podem variar de animal para animal. Aqueles com perícia ordinária podem apreciar variações mínimas para incubação de esperma entre espécies e mesmo entre raças ou animais da mesma raça para se alcançar coloração uniforme sem sobrecoloração de uma população de espermatozóides.
|0371 Adicionalmente ao corante fluorescente seletivo quanto a
DNA, um corante de extinção pode ser aplicado para o propósito de permeação de espermatozóides com membranas comprometidas e extinção dos sinais que eles produzem. Um corante de extinção de morte pode ser entendido como incluindo corantes que se associam diferencialmente a espermatozóides com membranas comprometidas. Pode ser que estes corantes entrem nos espermatozóides com membranas comprometidas mais facilmente porque as membranas estão se desagregando ou de outro crescentemente porosas, mas pode ser também que os corantes de extinção de morte entrem prontamente em todos os espermatozóides e que os espermatozóides saudáveis atuem para bombear os corantes de extinção de morte mais rapidamente do que os espermatozóides com membranas comprometidas. Em qualquer um dos casos, os espermatozóides com os quais os corantes de extinção de morte se associam incluem uma grande porção de espermatozóides mortes e morrendo, embora não necessariamente todos os espermatozóides mortos e morrendo. Os sinais extintos produzidos a partir de espermatozóides com membranas comprometidas tendo uma associação ao corante de extinção são distintos o suficiente dos sinais de espermatozóides saudáveis que possam ser removidos da análise e separação de espermatozóides viáveis.
|038] Em uma forma de realização, o corante de extinção e o corante seletivo quanto a DNA são aplicados em conjunto em um único tratamento.
13/27
Em esta forma de realização, o corante de extinção é incubado em conjunto com o corante seletivo quanto a DNA a uma temperatura elevada no TALP modificado que pode estar a um pH de 7,4. Em esta forma de realização acredita que existe uma sinergia quando os espermatozóides padronizados a um pH elevado de cerca de 7,2 antes de coloração a 7,4. Deste modo, o pEI ao qual o esperma é exposto permanece em uma faixa constante com variações mínimas. Porque tanto o tampão de coloração e o extensor inicial têm capacidades tamponantes elevadas se acredita que a tendência natural dos espermatozóides de se tornarem mais ácidos ao longo do tempo será evitada. Adicionalmente, por minimização das mudanças no pH vistas pelos espermatozóides se acredita que os espermatozóides estão em uma condição mais saudável para enfrentarem as várias pressões e estresses suportados no processo de separação com base no sexo.
Separação de Esperma Corado [039] A população de espermatozóides corados pode ser separada por citometria de fluxo. No que se refere agora à FIG. 1 está ilustrado um citômetro de fluxo com jato no ar (10), embora a separação possa ser realizada com chips microfluídicos ou outros tipos de citômetros de fluxo. O citômetro de fluxo (10) inclui uma fonte de células (12) fornecendo a amostra de esperma corado para separação. Os espermatozóides corados são depositados dentro de um bocal (14) e introduzidos em uma corrente de fluido (16) de fluido de revestimento (18). O fluido de revestimento (18) pode ser fornecido por uma fonte de fluido de revestimento (20) tal que a fonte de células (12) forneça o esperma ao fluido de revestimento (18) são concorrentemente alimentados através do bocal (14). Deste modo, o fluido de revestimento (18) forma uma corrente de fluido coaxial em relação à amostra tendo esperma corado. Uma vez que os vários fluidos são proporcionados ao citômetro de fluxo (10) a alguma pressão, eles fluem para fora do bocal (14) e saem no orifício do bocal (22). Ao proporcionar
14/27 um oscilador (24) que pode ser precisamente controlado com um controle do oscilador (26), ondas de pressão podem ser estabelecidas dentro do bocal (14) e transmitidas aos fluidos saindo do bocal (14) no orifício do bocal (22). Em resposta às ondas de pressão, a corrente de fluido (16) saindo do orifício do bocal (22) forma eventualmente gotas regulares (28) a intervalos precisos. Porque os espermatozóides corados estão rodeados pela corrente de fluido (16) ou ambiente de fluido de revestimento, as gotas (28) podem conter idealmente espermatozóides individualmente isolados.
[040] O citômetro de fluxo (10) atua para separar gotas com base nas características dos espermatozóides que se prevê estarem contidos dentro das gotas. Isto é alcançado através de um sistema sensor de células (30). O sistema sensor de células (30) inclui pelo menos um sensor (32) responsivo às células contidas dentro da corrente de fluido (16). O sistema sensor de células (30) pode causar uma ação dependendo da presença relativa ou ausência relativa de uma característica. Certas características, tais como o conteúdo de DNA relativo dos espermatozóides, podem ser detetadas através de excitação com uma fonte de radiação eletromagnética (34), tal como um laser gerando um feixe de irradiação ao qual os espermatozóides corados são responsivos. A fonte de radiação eletromagnética (34) pode ser um laser operado a comprimento de onda de UV, tal como a cerca de 355 nm. Um exemplo de um tal laser pode ser um Vanguard 350 (disponível da Spectra-Physics), que opera a 350 mW. Várias óticas podem ser usadas para moldar o perfil de feixe do laser, dividir o feixe em mais do que uma corrente, ou reduzir a potência do feixe a uma corrente. Exemplos não limitantes de tais óticas podem ser encontrados em WO/2004/104178 e WO/2001/85913, sendo cada uma incorporada aqui por referência.
[0411 As características de espermatozóides individuais, particularmente a presença de um cromossomo X ou cromossomo Y, podem ser determinadas a partir da fluorescência produzida em resposta à
15/27 fonte de radiação eletromagnética (34). O corante fluorescente seletivo quanto a DNA se liga estequiometricamente ao DNA dos espermatozóides. Porque os espermatozóides portadores de cromossomo X contêm mais DNA do que os espermatozóides portadores de cromossomo Y, os espermatozóides portadores de cromossomo X se conseguem ligar a uma maior quantidade de corante fluorescente seletivo quanto a DNA do que os espermatozóides portadores de cromossomo Y. Assim, por medição da fluorescência emitida pelo corante ligado após excitação é possível diferenciar entre espermatozóides portadores de X e espermatozóides portadores de Y.
[042] De modo a se alcançar a separação e isolamento com base em características de espermatozóides corados, a luz emitida pode ser detetada pelo sensor (32) e a informação alimentada a um analisador (36) acoplado a um carregador de gotículas que carrega diferencialmente cada gota (28) com base nas características dos espermatozóides corados contidos dentro dessa gota (28). Deste modo, o analisador (36) atua para permitir que as placas de deflexão eletrostátíca (36) deflitam gotas (28) com base em se elas contêm ou não a partícula ou célula apropriada.
[043] Como um resultado, o citômetro de fluxo (10) atua para separar esperma corado fazendo com que as gotas (28) contendo espermatozóides sejam direcionadas para um ou mais contentores de coleta (40). Por exemplo, quando o analisador diferencia espermatozóides com base em uma característica dos espermatozóides, as gotículas arrastando espermatozóides portadores de cromossomo X podem ser positivamente carregadas e assim defletirem em uma direção, enquanto as gotículas arrastando espermatozóides portadores de cromossomo Y podem ser negativamente carregadas e assim defletirem para o outro lado, e a corrente de desperdício (isto é, gotículas que não arrastam uma partícula ou célula ou arrastam células indesejadas ou que não podem ser orientadas) pode ser
16/27 deixada não carregada e assim é coletada em uma corrente não defletida em um tubo de sucção ou similar como discutido no Pedido de Patente dos Estados Unidos 09/001,394, incorporado por referência aqui. Naturalmente, numerosas trajetórias de deflexão podem ser estabelecidas e coletadas simultaneamente.
[044] Exemplo 1 - padronização de amostras de esperma e coloração em um passo [045] Coleta - Foi coletado esperma de cinco touros diferentes em um programa de coleta de rotina usando uma vagina artificial. Cada touro foi coletado 2 ou três vezes em um dia. Dos cinco touros, dois eram touros Jersey e três eram touros Holstein. Todos os ejaculados continham mais do que 60 % de motilidade progressiva e a concentração de esperma variava de 857 milhões de espermatozóides por mL a 2480 milhões de espermatozóides por mL. Os ejaculados coletados do mesmo touro foram agrupados, depois divididos em nove amostras de esperma para coleta e tratamentos de coloração.
[046] Coloração - Porções de cada ejaculado de touro foram coradas com nove métodos diferentes.
[047] (A) Controle (nenhuma padronização, separação em dois passos) - Foi estabelecido um controle que não incluiu o passo de padronização de ejaculados coletados e no qual o esperma foi corado em dois passos. Antes da coloração, as amostras de esperma foram concentradas até entre 1700 milhões de espermatozóides por mL e 1800 milhões de espermatozóides por mL por centrifugação ou pela adição de um tampão de tris-gema de ovo tendo um pH de 6,8, dependendo da concentração inicial das amostras.
[048] O espenna no grupo de controle foi diluído até 160 x 106 espermatozóides por mL em um tampão de TALP modificado, como descrito na Tabela 6, a um pH de 7,4. Cada amostra de esperma no grupo
17/27 de controle foi depois incubada com 16-17 pL de Hoechst 33342 por mL (64-68 μΜ) de amostra durante 45 minutos a 34 °C. Após incubação, um volume igual de um segundo TALP modificado foi adicionado reduzindo a concentração até 80 x 10 espermatozóides por mL. O segundo TALP modificado inclui os componentes descritos na Tabela 1 com a adição de gema de ovo a 4 %, corante alimentar amarelo No. 6 a 50 μΜ (20 g/L) e o pH foi diminuído para 5,5 com a adição de HC1.
[049| (B) Estendido (nenhuma padronização, coloração em dois passos) - No segundo grupo, o esperma não foi padronizado, mas foi estendido com um tampão e gema de ovo a 20 %. O esperma foi depois concentrado até entre 1700 milhões de espermatozóides por mL e 1800 milhões de espermatozóides por mL do mesmo modo descrito no que diz respeito ao grupo (A). O esperma foi depois diluído até 160 x 106 espermatozóides por mL em um tampão de TALP modificado, e corado do mesmo modo em dois passos descrito no grupo (A).
[0501 (C) Um Passo I (nenhuma padronização, coloração em um passo com gema de ovo a 1 %) - Em um terceiro grupo, o esperma foi coletado e a concentração foi ajustada do mesmo modo como o grupo de controle (A). Cada amostra de esperma foi depois diluída até 160 x 106 espermatozóides por mL em um tampão de TALP modificado a um pH de
7,4. O tampão de TALP modificado foi substancialmente idêntico ao tampão descrito na Tabela 1. exceto que incluiu gema de ovo a 1 % e corante alimentar amarelo No. 6 a uma concentração de 25 μΜ. Cada amostra de esperma em este grupo foi depois incubada com 14-15 pL de Hoechst 33342 por mL (46-60 μΜ) durante 45 minutos a 34 °C. Após incubação, o esperma permaneceu a uma concentração de 160 x 106 espermatozóides por mL.
[051 ] (D) Padronizado I (padronizado com tampão de gema de ovo a
%) — Em este grupo, o esperma foi padronizado por ajuste do pH e
18/27 concentração do esperma antes da coloração e separação. Após coleta, o esperma foi diluído 1:3 em um tampão inicial tendo um pH de 7,2 bem como uma elevada capacidade para tamponamento do pH. O tampão de elevada capacidade foi suplementado com gema de ovo a 3 %. Todas as amostras foram depois centrifugadas para diminuir a concentração de esperma até entre 1700 milhões de espermatozóides e 1800 milhões de espermatozóides por mL. O esperma padronizado foi depois corado de acordo com o método com dois passos descrito em (A).
[052] (E) Padronizado II (padronizado com tampão de gema de ovo a 10 %, coloração em dois passos) - Em este grupo, o esperma foi padronizado por ajuste do pH e da concentração de esperma antes da separação do mesmo modo descrito no grupo (D), exceto que o tampão inicial foi gema de ovo a 10 %.
[053] (F) Lm Passo e Padronizado I (padronizado com tampão de gema de ovo a 3 %, coloração em um passo com gema de ovo a 1 %) - Em este grupo, o esperma foi padronizado por ajuste do pH e concentração do esperma antes da separação do mesmo modo descrito no grupo (D). A amostra padronizada foi depois corada com um processo de coloração em um passo como descrito no grupo (C).
[054] (G) Um Passo e Padronizado II (padronizado com tampão de gema de ovo a 10 %, coloração em um passo com gema de ovo a 1 %) Em este grupo, o esperma foi padronizado por ajuste do pH e concentração do esperma antes da coloração do mesmo modo descrito no grupo (E). A amostra padronizada foi depois corada com um processo de coloração em um passo como descrito no grupo (C).
[055] (H) Um Passo e Padronizado III (padronizado com tampão de gema de ovo a 3 %, coloração em um passo com nenhuma gema de ovo) Em este grupo, o esperma foi padronizado por ajuste do pH e concentração do esperma antes da coloração do mesmo modo descrito no grupo (D). A
19/27 amostra padronizada foi depois corada com um processo de coloração em um passo como descrito no grupo (C), exceto que não foi adicionado nenhuma gema de ovo ao TALP de coloração em um passo.
[056] (I) Um Passo e Padronizado IV (padronizado com tampão de gema de ovo a 10%, coloração em um passo com nenhuma gema de ovo) — Em este grupo, o esperma foi padronizado por ajuste do pH e concentração do esperma antes da separação do mesmo modo descrito no grupo (E). A amostra padronizada foi depois corada com um processo de coloração em um passo como descrito no grupo (C) exceto que não foi adicionado nenhuma gema de ovo ao TALP de coloração em um passo.
[057] Separação e aquisição de dados - Cada uma das amostras coradas foi separada em um MoFlo SX (Beckman Coulter, EUA). Aquelas amostras que foram coradas em um processo em dois passos foram separadas à concentração de 80 x 106 espermatozóides por mL, e aquelas amostras que foram coradas pelo processo em um passo foram separadas à concentração de 160 x 106 espermatozóides por mL. Os dados comunicados pelo citômetro de fluxo foram registrados incluindo informação se relacionando com as taxas de separação e intercepção de subpopulações de espermatozóides. Por exemplo, a percentagem de espermatozóides interceptados como mortos, bem como as percentagens de espermatozóides interceptados como orientados vivos e sobrefaixas, foram registradas e foram calculadas as suas médias para os cinco touros.
[058] Resultados - Uma comparação da percentagem de espermatozóides que estavam orientados, não orientados e mortos como determinado pelos parâmetros de separação estabelecidos no citômetro de fluxo está resumida na Tabela 2 abaixo.
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TABELA 2
%de Orientados % de Não orientados % de Mortos Taxa de Separação Sobre faixa
A) Controle 58,29 % 18,02% 16,89% 3500 4,32 %
B) Estendido 60,54 % 20,20 % 8,71 % 3400 10,36%
C) Cm Passo I 61,04% 17,96% 12,31 % 3500 5,65 %
D) Padronizado I 52,78 % 18,14% 9,71 % 2900 24,73 %
E) Padronizado II 55,20 % 18,70% 6,04 % 3200 23,44%
F) Um Passo + Padronizado I 57,33 % 20,35 % 5,39 % 3200 16,17%
G) Um Passo + Padronizado II 59,99 % 18,89% 5,19% 3600 16,83%
H) Um Passo + Padronizado III 62,67 % 22,02 % 6,97 % 3800 6,23 %
I) Um Passo + Padronizado IV 63,49 % 23,16% 5,61 % 4100 5,38 %
Ιθ59| Em comparação com o controle (A), os grupos Um Passo I (C), Padronizado I (D), e Padronizado II (E) exibiram cada um populações mortas significativamente mais baixas com reduções de 4,58 %, 7,18 % e 10,85 %, respectivamente. Com base em estas melhorias, os passos de padronização de amostras de esperma antes da coloração e modificação do processo de coloração para um único passo melhoram independentemente a capacidade dos espermatozóides de sobreviverem ao processo de separação. Adicionalmente, Um Passo e Padronizado I (F), Um Passo e Padronizado II (G), Um Passo e Padronizado III (H), e Um Passo e Padronizado IV (I) demonstram uma sinergia pela qual o efeito combinado /27 de padronização de um ejaculado e coloração do ejaculado em um único passo é maior do que qualquer uma das melhorias individualmente.
[060] No que se refere à Tabela 2 pode ser visto que Padronizado 1 (D), Padronizado II (E), Um Passo e Padronizado I (F), e Um Passo e Padronizado II (G) parecerem cada um proporcionar benefícios significativos em termos redução do número de espermatozóides mortos, mas a percentagem de espermatozóides orientados não melhorou. Isto pode ser relacionado com a coluna indicada como sobrefaixa. Embora mais espermatozóides tenham sido interceptados como vivos para separação parece existir um aumento nos sinais dispersos acima das faixas de portas de separação. Este sinal pode representar espermatozóides que estão grudados ou pode representar espermatozóides que estão ligados a lípidos da gema de ovo. Em qualquer um dos casos emerge o padrão geral de que maiores quantidades de gema de ovo reduzem os números de espermatozóides, mas podem introduzir uma nova questão e um equilíbrio pode ser portanto requerido.
[061] Exemplo 2 - padronização de amostras de esperma e coloração em um passo [062] Coleta - Foi coletado esperma de seis touros Jersey diferentes em um programa de coleta de rotina usando uma vagina artificial. Todos os ejaculados continham mais do que 65% de motilidade progressiva e a concentração de esperma variava de 765 milhões de espermatozóides por mL a 1710 milhões de espermatozóides por mL. Cada amostra de Esperma foi dividida em duas partes em tubos de 15 mL para duas coletas e tratamentos de coloração. Foram tiradas medições de pH na coleta, e em cada passo de processamento subsequente.
Coloração [063] Controle (nenhuma padronização, separação em dois passos) Foi estabelecido um controle que não incluiu o passo de padronização de
22/27 ejaculados coletados e no qual o esperma foi corado em dois passos. Antes da coloração, as amostras de esperma foram concentradas até entre 1700 milhões de espermatozóides por mL e 1800 milhões de espermatozóides por mL por centrifugação ou pela adição de um tampão de tris-gema de ovo tendo um pH de 6,8, dependendo da concentração inicial das amostras.
[064] O espenna no grupo de controle foi diluído até 160 x 106 espermatozóides por mL em um tampão de TALP modificado, como descrito na Tabela 6, a um pH de 7,4. Cada amostra de esperma no grupo de controle foi depois incubada com 16-17 pL de Hoechst 33342 por mL (64-68 μΜ) de amostra durante 45 minutos a 34 °C. Após incubação, um volume igual de um segundo TALP modificado foi adicionado reduzindo a concentração até 80 x 106 espermatozóides por mL. O segundo TALP modificado inclui os componentes descritos na Tabela 1 com a adição de gema de ovo a 4 %, corante alimentar vermelho No. 40 a 50 μΜ (20 g/L) e o pH foi diminuído para 5,5 com a adição de HC1.
[065] Um Passo e Padronizado (padronizado com gema de ovo a 10 %, coloração em um passo com gema de ovo a um por cento) — O esperma foi padronizado por ajuste do pH e concentração do esperma antes da coloração. Após coleta, o esperma foi diluído 1:3 em um tampão inicial tendo um pH de 7,2 bem como uma elevada capacidade para tamponamento do pH. O tampão de elevada capacidade foi suplementado com gema de ovo a 3 %. Todas as amostras foram depois centrifugadas para diminuir a concentração de esperma até entre 1700 milhões de espermatozóides e 1800 milhões de espermatozóides por mL.
[066] As amostras de esperma foram depois diluídas até 160 x 106 espermatozóides por mL em um tampão de TALP modificado a um pH de
7,4. O tampão de TALP modificado foi substancialmente idêntico ao tampão descrito na Tabela 1, exceto que incluiu gema de ovo a 1 % e corante alimentar amarelo No. 6 a uma concentração de 25 μΜ. Cada
23/27 amostra de esperma em este grupo foi depois incubada com 16-17 pL de Hoechst 33342 por mL (64-68 μΜ) durante 45 minutos a 34 °C. Após incubação, o esperma permaneceu a uma concentração de 160 x 106 espermatozóides por mL.
[067] Separação e aquisição de dados - Cada amostra foi separada em um MoFlo SX (Beckman Coulter, EUA). O controle foi separado à concentração de 80 x 106 espermatozóides por mL, enquanto o esperma padronizado foi separado a 160 x 106 espermatozóides por mL. Os dados foram comunicados pelo citômetro de fluxo e depois foi calculada a sua média para os 6 touros.
[068] Resultados - A FIG. 3 ilustra o pH registrado do controle (A) e do ejaculado padronizado (B). Estes Valores estão refletidos na TABELA 3 em baixo. Embora o ejaculado padronizado seja sujeito a um aumento inicial, um aumento subsequente é evitado durante coloração e a seguinte queda é também evitada. Adicionalmente, a TABELA 4 ilustra benefícios similares na redução de espermatozóides mortos que foi vista no Exemplo
1. Especificamente, a amostra padronizada que foi corada em um passo teve 5,67 % menos espermatozóides mortos.
TABELA 3
Inicial Antes da Centrifugaç ão Após a Centrifugaç ão Durante a Coloração Após a coloração Antes de citômetro
Controle (A) Padroniza do (B) 6,34 6,34 6,34 6,25 7,22 7,07 6,59
7,12 6,85 7,18 6,98 6,98
24/27
TABELA 4
PV % de Orientados % de Mortos Taxa de Separação Dupletos/T ripleto s
Controle 1,86 52,99 14,63 35,83 21,73
Padronizado - Um Passo 1,97 57,22 8,96 37,00 24,59
Diferença 0,11 4,23 -5,67 1,17 2,86
[069] Como pode ser facilmente entendido a partir do acima mencionado, os conceitos básicos da presente invenção podem realizados de uma variedade de modos. A invenção envolve numerosas e variadas formas de realização de coloração de esperma para separação quanto ao sexo incluindo o, mas não limitada ao, melhor modo da invenção.
[0701 Como tal, as formas de realização ou elementos particulares da invenção divulgados pela descrição ou mostrados nas figuras ou nas tabelas acompanhando este pedido não se destinam a ser limitantes, mas ao invés exemplares das numerosas e variadas formas de realização genericamente englobadas pela invenção ou equivalentes englobados no que diz respeito a qualquer seu elemento particular. Adicionalmente, a descrição específica de uma única forma de realização ou elemento da invenção pode não descrever explicitamente todas as formas de realização ou elementos possíveis; muitas alternativas são implicitamente divulgadas pela descrição e figuras.
1071] Deve ser entendido que cada elemento de um dispositivo ou cada passo de um método pode ser descrito por um termo de dispositivo ou termo de método. Tais termos podem ser substituídos onde se deseja tomar explícito a cobertura implicitamente ampla à qual esta invenção está destinada. Como apenas um exemplo deve ser entendido que todos os passos de um método podem ser divulgados como uma ação, um meio para tomar essa ação, ou como um elemento que causa essa ação. Similarmente,
25/27 cada elemento de um dispositivo pode ser divulgado como o elemento físico ou a ação que esse elemento físico facilita. Como apenas um exemplo, a divulgação de separador deve ser entendida como englobando a divulgação do ato de separar - seja explicitamente discutido ou não — e, reciprocamente, existisse efetivamente divulgação do ato de separar, uma tal divulgação deve ser entendida como englobando a divulgação de um separador e mesmo um meio para separação. Tais termos alternativos para cada elemento ou passo são para ser entendidos como sendo explicitamente incluídos na descrição.
|072| Adicionalmente, quanto a cada termo usado deve ser entendido que, a não ser que a sua utilização em este pedido seja inconsistente com tal interpretação, as definições de dicionário comuns devem ser entendidas como estando incluídas na descrição para cada termo como contido no Random House Webster’s Unabridged Dictionaty, segunda edição, cada definição incorporada desse modo por referência.
[073] Além do mais, para os propósitos da presente invenção, o termo um ou uma entidade se refere a um ou mais dessa entidade. Como tal, os termos um ou uma, um(a) ou mais e pelo menos um(a) podem ser usados indistintamente aqui.
[074| Todos os valores numéricos aqui são assumidos como sendo modificados pelo termo cerca de, seja ou não explicitamente indicado. Para os propósitos da presente invenção, as faixas podem ser expressas como a partir de cerca de” um valor particular até cerca de outro valor particular. Quando uma tal faixa é expressa, outra forma de realização inclui a partir de um valor particular até ao outro valor particular. A recitação de faixas numéricas pelos pontos terminais inclui todos os valores numéricos subsomados dentro dessa faixa. Uma faixa numérica de um a cinco inclui por exemplo os valores numéricos 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, e assim por diante. Será adicionalmente entendido que os pontos terminais
26/27 de cada uma das faixas são significativos em relação ao outro ponto terminal, e independentemente do outro ponto terminal. Quando um valor é expresso como uma aproximação por uso do antecedente cerca de, deve ser entendido que o valor particular forma outra forma de realização.
[075| A seção de antecedentes deste pedido de patente proporciona uma declaração da área de esforço à qual a invenção pertence. Esta seção pode também incorporar ou conter parafraseamento de certas patentes dos Estados Unidos, pedidos de patente, publicações, ou assunto da invenção reivindicada úteis no relato de informações, problemas, ou preocupações sobre o estado da tecnologia ao qual a invenção está dirigida. Não se pretende que qualquer patente dos Estados Unidos, pedido de patente, publicação, declaração ou outra informação citado ou incorporado aqui seja interpretado, compreendido ou considerado como sendo admitido como técnica prévia no que diz respeito à invenção.
[076] As reivindicações apresentadas em esta especificação, se algumas, são deste modo incorporadas por referência como parte desta descrição da invenção, e o requerente expressamente reserva o direito de usar todo o ou uma porção de tal conteúdo incorporado de tais reivindicações como descrição adicional para suportar qualquer uma das ou todas as reivindicações ou qualquer seu elemento ou componente, e o requerente reserva expressamente adicionalmente o direito de mover qualquer porção do ou todo o conteúdo incorporado de tais reivindicações ou qualquer seu elemento ou componente da descrição para as reivindicações ou vice versa como necessário para definir a matéria para a qual é solicitada proteção por este pedido ou por qualquer pedido subsequente ou continuação, divisão, ou seu pedido de continuação em parte, ou para obter qualquer benefício de, redução em taxas nos termos de, ou para respeitar as leis de patentes, regras, ou regulamentos de qualquer país ou tratado, e tal conteúdo incorporado por referência deverá sobreviver
27/27 durante a pendência inteira deste pedido incluindo qualquer subsequente continuação, divisão, ou seu pedido de continuação em parte ou qualquer sua reedição ou extensão.

Claims (15)

1. Método de processamento de esperma, caracterizado por compreender os passos de:
ajustar a concentração da amostra de esperma até uma concentração pré-determinada na faixa entre 1400 milhões de espermatozóides por ml e 2100 espermatozóides por ml estendendo a amostra de esperma em um extensor inicial tendo um pH entre 7,1 e 7,6 em uma amostra de esperma em uma razão de extensor inicial entre 1:1 e 1:10, centrifugar a amostra de esperma estendida e remover sobrenadantes até a concentração predeterminada ser alcançada;
seguir o passo de ajuste da concentração de uma amostra de esperma, marcando a amostra de esperma com um tampão de marcação único tendo um corante seletor de DNA e um corante de atenuação em um volume do tampão de marcação única que fornece uma concentração adequada para processar; e processar a amostra de esperma marcada.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o tampão de marcação único compreender TALP modificado com um pH de 7,4.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o tampão de marcação única ser aplicado em um volume para alcançar uma concentração de esperma marcado entre 640 milhões de espermatozóides por ml e 80 milhões de espermatozóides por ml.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o corante de atenuação compreender corante alimentício amarelo N. 6.
Petição 870190069179, de 22/07/2019, pág. 8/10
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5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o pH da amostra de esperma ser mantido em um nível predeterminado através dos passos de marcação e atenuação.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o pH da amostra de esperma ser mantido dentro de 0,5 do pH predeterminado através dos passos de marcação e classificação.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o pH da amostra de esperma ser mantido entre 6,75 e 7,3 através dos passos de marcação e classificação.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ainda compreender a etapa de congelamento do esperma classificado.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o pH da amostra de esperma ser mantido a um nível predeterminado através dos passos de marcação, classificação e congelamento.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o extensor inicial compreender um extensor de tampão de pH com uma alta capacidade de tamponamento.
11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo extensor inicial compreender um ou mais selecionados do grupo de: bicarbonato de sódio, TRIS citrato, citrato de sódio, HEPES, TRIS, TEST, MOPS, KMT, TALP, e suas combinações.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo extensor inicial compreender adicionalmente entre cerca de 1 por cento e 10 por cento de gema de ovo.
13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo extensor inicial compreender adicionalmente ácido cítrico ou citratos.
Petição 870190069179, de 22/07/2019, pág. 9/10
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14. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo extensor inicial compreender adicionalmente um ou mais antioxidantes.
15. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo extensor inicial possuir um pH de cerca de 7,2.
Petição 870190069179, de 22/07/2019, pág. 10/10
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