ES2733531T3 - Procedimientos de tratamiento del esperma para la clasificación del sexo - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento de clasificación de esperma que comprende las etapas de: ajustar la concentración de una muestra de esperma a un intervalo de concentración predeterminado entre 1.400 millones de espermatozoides por ml y 2.100 espermatozoides por ml diluyendo la muestra de esperma en un diluyente inicial que tiene un pH entre 7,1 y 7,6 a una relación entre de muestra de esperma y diluyente inicial entre 1:1 y 1:10, centrifugar la muestra de esperma diluida y eliminar el sobrenadante hasta que se alcance la concentración predeterminada; seguir la etapa de ajuste de la concentración de una muestra de esperma, tiñendo la muestra de esperma con un tampón de tinción individual que tiene un tinte selectivo de ADN y un tinte de desactivación en un volumen de un tampón de tinción individual que proporciona una concentración adecuada para la clasificación; y clasificar la muestra de esperma teñida.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos de tratamiento del esperma para la clasificación del sexo
Campo de la técnica
En general, esta divulgación se refiere a los procedimientos de tinción y clasificación, como los utilizados en la Clasificación de Células Activadas por Fluorescencia (FACS); y, más particularmente, esta divulgación se refiere a procedimientos de tinción que mejoran la viabilidad del esperma seleccionado.
Antecedentes
Los procedimientos de clasificación del esperma a menudo se basan en la FACS para la detección de diferencias cuantificables en el contenido de ADN del espermatozoide portador del cromosoma X y del espermatozoide portador del cromosoma Y. Con el fin de medir el contenido de ADN, una típica etapa en la clasificación del esperma incluye la tinción de una población de espermatozoides con un tinte fluorescente selectivo de ADN que estequiométricamente se une al ADN nuclear. Hoechst 33342, a veces conocido como Hoechst bis-benzimida 33342, es la tinción más ampliamente utilizada porque se puede utilizar en una cantidad suficiente para diferenciar pequeñas variaciones en el ADN nuclear sin mostrar la toxicidad de otros tintes.
En definitiva, una pequeña variación en el contenido de ADN se cuantifica diferenciando el espermatozoide portador del cromosoma X del espermatozoide portador del cromosoma Y. En bovino, por ejemplo, los toros Holstein tienen una diferencia de aproximadamente 3,8% en el contenido de ADN, mientras que los toros de Jersey tienen una diferencia de aproximadamente 4,1%. Debido a la naturaleza inexacta de la tinción estequiométrica de ADN, estas pequeñas diferencias pueden ser difíciles de determinar. Las muestras de espermatozoides, incluso las muestras dentro de una única raza, pueden variar mucho en concentración, pH, motilidades y morfologías. Por esta razón, las condiciones de tinción que funcionan bien en una circunstancia pueden infrateñir o sobreteñir otras muestras de espermatozoides, incluso muestras de espermatozoides recogidas de la misma raza, o incluso del mismo animal. Por esta razón, se pueden analizar varias condiciones de tinción antes de que sea teñida toda la muestra.
Desafortunadamente, el procedimiento de clasificación del esperma es perjudicial para los espermatozoides no regenerativos y de período crítico, y la etapa de tinción puede ser especialmente dañina. Mientras que Hoechst 33342 se puede utilizar en concentraciones no tóxicas, los espermatozoides deben ser incubados a temperaturas elevadas y pH elevados para una penetración suficiente del Hoechst 33342 con suficiente uniformidad para el análisis o clasificación. Cada elevación de la temperatura del espermatozoide y elevación del pH del espermatozoide puede contribuir a dañar al espermatozoide. En consecuencia, puede existir un cierto equilibrio entre las condiciones para establecer una tinción más uniforme y reducir el porcentaje de espermatozoides dañados y muertos en el procedimiento de clasificación.
Divulgación de la invención
La invención se refiere a un procedimiento de clasificación de esperma que comprende las etapas de ajustar la concentración de una muestra de esperma a un intervalo de concentración predeterminado entre 1.400 millones de espermatozoides por ml y 2.100 espermatozoides por ml diluyendo la muestra de esperma en un diluyente inicial que tiene un pH entre 7,1 y 7,6 en una relación entre muestra de esperma y diluyente inicial entre 1:1 y 1:10, centrifugando la muestra de esperma diluida y eliminando el sobrenadante hasta que se alcanza la concentración predeterminada tras la etapa de ajuste de la concentración de un muestra de esperma, tiñendo la muestra de esperma con un tampón de tinción individual que tiene un tinte selectivo del ADN y un tinte de desactivación en un volumen del tampón de tinción individual que proporciona una concentración adecuada para la clasificación; y clasificar la muestra de esperma teñida.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 ilustra un esquema de un citómetro de flujo para la clasificación de esperma según ciertas realizaciones de la invención.
La Fig. 2 ilustra una representación gráfica de varios parámetros de clasificación adquiridos en un citómetro de flujo mientras se clasifica el esperma preparado y teñido según varios ejemplos de la presente invención.
La Fig. 3 ilustra una representación gráfica de los valores de pH adquiridos durante una preparación y tinción de esperma.
Modos para llevar a cabo la invención
La presente invención proporciona procedimientos mejorados de tratamiento de espermatozoides con beneficios particulares para la clasificación sexual de los espermatozoides. La invención se refiere a establecer un pH y concentración del esperma normalizado antes de las etapas de clasificación adicionales, tal como la tinción. En procedimientos anteriores, las muestras de esperma que tienen varios pH y concentraciones excelentes pueden requerir diferentes procedimientos de manipulación, que pueden determinarse en un caso particular. La normalización de los eyaculados puede dar como resultado una tinción más consistente entre diferentes muestras. Un ejemplo de un procedimiento relevante para este campo de la tecnología se refiere al mantenimiento de un pH más constante a lo largo de la tinción, e incluso a través de las etapas de clasificación y congelación de espermatozoides. Los procedimientos previos del tratamiento de los espermatozoides pueden haber introducido daño a los espermatozoides en la realización de las etapas que estaban destinadas a reducir el daño a los espermatozoides. El beneficio para la salud de los espermatozoides puede estar reflejado directamente por una reducción en el porcentaje de espermatozoides que absorben el tinte de desactivación de los muertos y son retirados de la población de espermatozoides vivos durante la clasificación.
La invención también se refiere a un procedimiento de tinción en una etapa que proporciona una mejor viabilidad de los espermatozoides sobre los procedimientos previos de dos etapas. Además de la mejorada motilidad, un mayor porcentaje de espermatozoides vivos dio como resultado mayores tasas de clasificación.
Los procedimientos de tinción previos incluyeron dos etapas, normalmente la primera etapa incluía la incubación con un primer tampón, y un tinte selectivo de ADN, como Hoechst 33342, a un pH y temperatura elevados. Para la clasificación bovina, el primer tampón puede tener un pH elevado de aproximadamente 7,4. El valor 7,4 puede estar ligeramente fuera del intervalo en el que los espermatozoides están cómodos, pero necesario para permitir que el tinte selectivo del ADN penetre la membrana del espermatozoide.
Después del período de incubación, una segunda etapa de tinción incluyó que los espermatozoides teñidos se diluyeran en un volumen igual de un segundo tampón que incluyó un tinte de desactivación de muertos, tal como un colorante alimentario. El segundo tampón puede ser el mismo tampón que el primer tampón, pero ajustado a un pH de aproximadamente 5,5. De esta manera, el 7,4 se devuelve a un valor más aceptable fisiológicamente para los espermatozoides. Anteriormente se creía que era más beneficioso para la salud de los espermatozoides devolver el pH a un valor cercano a 6,8.
Sin embargo, los solicitantes comprendieron que el procedimiento por el que se introduce el segundo tampón puede estar causando más daño del que está impidiendo. Concretamente, cuando el segundo tampón se introduce en la muestra de espermatozoides diluida con el primer tampón, las bolsas de fluidos que tienen pH 5,5 pueden entrar en contacto con espermatozoides antes de que la mezcla se disperse uniformemente y todo el volumen esté a un único pH. El alto nivel de acidez en el segundo tampón puede ser perjudicial cuando el segundo tampón se dispensa en la muestra de espermatozoides diluida antes de alcanzar el equilibrio.
Un ejemplo de un procedimiento relevante para este campo de la tecnología proporciona un procedimiento de tratamiento del esperma que incluye las etapas de: (1) obtener una población de espermatozoides; (2) ajustar la concentración de la muestra de espermatozoides a una concentración predeterminada (3) ajustar el pH de la muestra a un valor predeterminado y (4) teñir la población de espermatozoides.
Varios ejemplos descritos en este documento pueden incluir además la etapa de clasificar la población de espermatozoides teñidos, tal como la clasificación del sexo de la población de espermatozoides teñidos en función del contenido de ADN. En un ejemplo de este tipo, la muestra de espermatozoides puede mantenerse en o cerca del pH predeterminado a través de las etapas de tinción y clasificación.
Otros diversos ejemplos pueden incluir las etapas de clasificar el esperma y congelar el esperma clasificado. En los ejemplos de este tipo, la muestra de esperma puede mantenerse en o cerca del pH predeterminado a través de las etapas de tinción, clasificación y congelación.
En otro ejemplo, se proporciona un procedimiento de seleccionar poblaciones de espermatozoides de género enriquecido que incluye las etapas de: (1) obtener una población de espermatozoides; (2) teñir la muestra de espermatozoides con un único tampón de tinción que tiene un tinte selectivo de ADN y un tinte de desactivación; y (3) clasificar la muestra de esperma teñida.
Varios ejemplos pueden incluir el ajuste de la muestra de espermatozoides a una concentración predeterminada y/o a un valor de pH predeterminado antes de la tinción. Los espermatozoides pueden clasificarse y congelarse mientras se mantienen en o cerca del valor de pH predeterminado.
En otro ejemplo más, se proporciona un procedimiento de tratamiento de espermatozoides que incluye las etapas de: (1) obtener una población de espermatozoides; (2) ajustar la concentración de la muestra de espermatozoides a una concentración predeterminada; (3) ajustar el pH de la muestra a un valor predeterminado; (4) teñir la muestra de espermatozoides con un único tampón de tinción que tiene un tinte selectivo de ADN y un tinte de desactivación; y (5) clasificar los espermatozoides teñidos.
Obtención de los espermatozoides
La población de espermatozoides se puede obtener en forma de semen puro, espermatozoides diluidos, espermatozoides congelados-descongelados o en sus combinaciones. La población de espermatozoides se puede obtener en el mismo lugar donde se realizan las etapas restantes, o se puede extender en un tampón de espermatozoides adecuado para su transporte a un centro de clasificación. Los espermatozoides pueden mantenerse a temperatura ambiente, refrigerarse o incluso congelarse en un tampón adecuado para un uso posterior. La etapa de obtener espermatozoides se puede considerar como adquirir espermatozoides de un mamífero, pero también puede incluir adquirir espermatozoides del almacenamiento, tal como obtener de almacenamiento un tubillo congelado o refrigerado, o incluso agrupar espermatozoides congelados o diluidos.
La población de espermatozoides puede provenir de mamíferos, tal como mamíferos no humanos enumerados por Wilson, D.E. y Reeder, D.M., Mammal Species of the World, Smithsonian Institution Press (1993).
En el momento de la recogida, o de la descongelación, o incluso de la agrupación, los espermatozoides se pueden comprobar en cuanto a la concentración, pH, motilidad y/o morfología. Además, se pueden añadir antibióticos antes de cualquier etapa adicional del tratamiento.
Ajustar los espermatozoides a una concentración predeterminada y con un pH predeterminado
Una vez obtenidos, los espermatozoides pueden ser normalizados a una concentración predeterminada y/o con un pH predeterminado. Cada concentración y pH predeterminados, pueden ser específicos para diferentes especies, o incluso para diferentes razas de animales dentro de una especie. En un ejemplo, los espermatozoides se pueden combinar con un tampón inicial en forma de un tampón de alta capacidad. Ejemplos de tampones pueden incluir TRIS citrato, citrato de sodio, bicarbonato de sodio, He PES, TRIS, TEST, MOPS, KMT, TALP y combinaciones de los mismos. También puede emplearse cualquier tampón que tenga una gran capacidad para amortiguar el pH, y puede utilizarse en combinación con componentes adicionales que fomenten la viabilidad de los espermatozoides, como la yema de huevo, y fuentes de citratos o ácido cítrico. Además, pueden emplearse antioxidantes y antibióticos en el tampón inicial para fomentar la viabilidad de los espermatozoides.
El tampón inicial se puede ajustar a un pH predeterminado para normalizar el pH de todas las muestras de espermatozoides obtenidas. En un ejemplo, el tampón se ajusta a un pH de 7,2. Además, el semen puede volverse cada vez más ácido con el tiempo, posiblemente debido a proteínas en el fluido seminal, o posiblemente debido a subproductos ácidos de células muertas o moribundas. En cualquier caso, el tampón inicial introduce suficientes sitios de unión de protones libres (por ejemplo, H+) manteniendo el pH cerca del objetivo predeterminado. Incluso a la luz de la tendencia natural de los espermatozoides de volverse más ácidos con el tiempo, el tampón inicial proporciona un medio para estabilizar el pH a lo largo de las etapas de tratamiento adicionales.
Como ejemplo, la muestra de espermatozoides puede diluirse en el tampón de gran capacidad en proporciones de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:10. La mezcla resultante tendrá una concentración de espermatozoides muchas veces por debajo de las concentraciones naturales de espermatozoides para una especie en particular. El esperma diluido puede ser centrifugado con el fin de reconcentrar el esperma. Centrifugar el esperma y eliminar el sobrenadante permite que el esperma sea reconcentrado a una concentración predeterminada. La concentración predeterminada se puede seleccionar en función de etapas adicionales de tratamiento del esperma. Por ejemplo, en el caso de la clasificación del sexo bovino, el esperma puede reconcentrarse entre aproximadamente 2.400 millones de espermatozoides por ml y aproximadamente 900 millones de espermatozoides por ml para simular un intervalo natural de concentraciones. Para su posterior tratamiento, pueden también conseguirse otras concentraciones, como entre aproximadamente 1.400 millones de espermatozoides por ml y aproximadamente 2.100 millones de espermatozoides por ml, o entre aproximadamente 1.700 millones de espermatozoides por ml y aproximadamente 2.100 millones de espermatozoides por ml.
El ajuste de la concentración de esperma y del pH puede proporcionar un punto de partida uniforme para el tratamiento posterior. Por ejemplo, un pH y una concentración relativamente consistentes pueden proporcionar una mayor previsibilidad en la tinción del esperma, por ejemplo, con un tinte selectivo del ADN. Si cada muestra se ajusta a los mismos pH y concentración predeterminados, es posible que se requieran menos pruebas en cada nueva recogida para garantizar la adecuada tinción para la clasificación del sexo.
Tinción del esperma
La muestra de esperma puede incluir espermatozoides portadores del cromosoma X y espermatozoides portadores del cromosoma Y. Además, cada uno de los espermatozoides portadores del cromosoma X y de los espermatozoides portadores del cromosoma Y pueden incluir espermatozoides viables y espermatozoides no viables. Los espermatozoides viables pueden considerarse espermatozoides con membranas intactas, mientras que los espermatozoides no viables pueden considerarse espermatozoides con membranas comprometidas. Los espermatozoides viables, en la dosis apropiada, podrán en general lograr la fertilización en una inseminación artificial, mientras que los espermatozoides no viables, o espermatozoides de membrana comprometida, pueden que sean incapaces de lograr la fertilización en una inseminación artificial o que tengan una capacidad muy reducida para hacerlo. Sin embargo, algunos espermatozoides capaces de fertilizar pueden tener membranas comprometidas, y algunos espermatozoides con membranas intactas pueden ser incapaces de fertilización.
Ya sea normalizado o no, los espermatozoides pueden ser teñidos con un tampón de tinción para introducir un tinte selectivo de ADN. En la etapa de tinción, al menos una parte de la población de espermatozoides es incubada con un tampón de tinción y un tinte fluorescente selectivo de ADN con el fin de teñir estequiométricamente el contenido de ADN de cada célula en la población de espermatozoides. Hoechst 33342 es el más frecuentemente utilizado en el campo de la clasificación de espermatozoides, ya que tiende a ser menos tóxico que otros tintes selectivos del ADN. El vehículo para el suministro de este tinte puede estar en forma de un tampón TALP modificado ajustado a un pH de aproximadamente 7,4. Hoechest 33342 se describe en la patente de EE.UU. 5.135.759, y se utiliza frecuentemente para este fin. Sin embargo, también se podrían utilizar otros tintes excitables al UV, así como tintes excitables a la luz visible, poliamidas fluorescentes, secuencias de nucleótidos fluorescentes y anticuerpos específicos del sexo.
El espermatozoide en un estado natural no es, a menudo, fácilmente permeables a tintes de este tipo. Con el fin de producir una tinción uniforme, la primera etapa de la tinción puede incluir, además del tinte, la incubación de al menos una parte de la población de espermatozoides a una elevada temperatura en un tampón de tinción a un pH elevado. Ejemplos de adecuados primeros tampones de tinción pueden ser TALP, TES-TRIS, citrato TRIS, citrato de sodio o un medio basado en HEPES, cada uno descrito en WO2005/095960. En la Tabla 1 se ilustra un ejemplo de TALP modificado descrito en WO2001/37655.
Tabla 1 - Tampón TALP modificado
Ingrediente Concentración
NaCl 95,0 mM
KCl 3,0 mM
NaHPO4 0,3 mM
NaHCO3 10,0 mM
MgCl2 ■ 6H2O 0,4 mM
Piruvato de Na 2,0 mM
Glucosa 5,0 mM
Lactato de Na 25,0 mM
HEPES 40,0 mM
Seroalbúmina bovina 3,0 mg/ml
Como ejemplo, la población de espermatozoides, o una porción de la población de espermatozoides, podría diluirse con el primer tampón a entre 640 x 106 y 40 x 106 espermatozoides/ml, entre aproximadamente 320 x 106 y 80 x 106 espermatozoides/ml, o a aproximadamente 160 x 106 espermatozoides/ml en el primer tampón. El tinte fluorescente selectivo del ADN se puede añadir a los espermatozoides suspendido en el primer tampón en una concentración de entre 10 pM y 200 pM; entre aproximadamente 20 pM y 100 pM, o entre aproximadamente 30 pM y 70 pM. El pH del primer tampón puede estar entre aproximadamente 6,8 y 7,9; aproximadamente 7,1 y 7,6; o a aproximadamente 7,4 con el fin de contribuir a una tinción uniforme del ADN nuclear. Aquellos de experiencia corriente en la técnica comprenderán que el pH se puede elevar con la adición de NaOH y se puede bajar con la adición de HCl.
La población de espermatozoides se puede incubar entre 30-39 °C, entre unos 32-37 °C, o a aproximadamente 34 °C. El período de incubación puede variar entre unos 20 minutos y aproximadamente una hora y media, entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 75 minutos, o durante aproximadamente 45 minutos a aproximadamente 60 minutos. Como ejemplo, la población de espermatozoides puede ser incubada durante aproximadamente 45 minutos a 34 °C. Incluso dentro de una única especie, la concentración y el pH del esperma y otros factores que afectan a la capacidad de tinción pueden variar de un animal a otro. Los expertos corrientes en la técnica pueden comprender para incubar esperma pequeñas variaciones entre especies e incluso entre razas o animales de la misma raza para lograr una tinción uniforme sin sobreteñir una población de espermatozoides.
Además del tinte fluorescente selectivo del ADN, se puede aplicar un tinte de desactivación con el fin de penetrar los espermatozoides de membrana comprometida y desactivar las señales que producen. Un tinte de desactivación de los muertos puede entenderse que incluye tintes que se asocian de forma distinta con espermatozoides con membrana comprometida. Puede ser que estos tintes entren en los espermatozoides de membrana comprometida más fácilmente porque las membranas se están descomponiendo o, si no, porque son cada vez más porosas, pero también puede ser que los tintes de desactivación de los muertos entren fácilmente en todos los espermatozoides y que los espermatozoides sanos actúen bombeando tintes de desactivación de los muertos más rápidamente que los espermatozoides de membrana comprometida. En cualquier caso, los espermatozoides con los que se asocian los tintes de desactivación de los muertos incluyen una gran parte de espermatozoides muertos y moribundos, aunque no necesariamente todos los espermatozoides muertos y moribundos. Las señales desactivadas producidas a partir de espermatozoides de membrana comprometida que tienen una asociación con el tinte de desactivación son lo suficientemente distintas de las señales de espermatozoides sanos que pueden ser eliminados del análisis y clasificación del esperma viable.
En un ejemplo, el tinte de desactivación y el tinte selectivo de ADN se aplican juntos en un único tratamiento. En este ejemplo, el tinte de desactivación se incuba junto con el tinte selectivo de ADN a una temperatura elevada en el TALP modificado que puede estar a un pH de 7,4. En este ejemplo se cree que existe una sinergia cuando los espermatozoides se normalizan a un pH elevado de aproximadamente 7,2 antes de teñir a 7,4. De esta manera, el pH al que se expone el esperma permanece en un intervalo constante con variaciones mínimas. Debido a que tanto el tampón de tinción como el diluyente inicial tienen altas capacidades de amortiguación, se cree que se evitará la tendencia natural del esperma a volverse más ácido con el tiempo. Además, al minimizar los cambios en el pH percibidos por los espermatozoides, se cree que los espermatozoides están en un estado más saludable para hacer frente a las diversas presiones y tensiones que se soportan en el procedimiento de clasificación del sexo.
Clasificación de espermatozoides teñidos
La población de espermatozoides teñidos se puede clasificar por citometría de flujo. Haciendo referencia ahora a la Fig. 1, se ilustra un citómetro de flujo (10) de chorro de aire, aunque la clasificación se puede realizar con microprocesadores de microfluidos u otros tipos de citómetros de flujo. El citómetro de flujo (10) incluye una fuente (12) de células que suministra la muestra de espermatozoides teñidos para la clasificación. Los espermatozoides teñidos se depositan dentro de una tobera (14) y se introducen en una corriente de fluido (16) de fluido envolvente (18). El fluido envolvente (18) se puede suministrar mediante una fuente (20) de fluido envolvente de modo que como la fuente de células (12) suministra espermatozoides al fluido envolvente (18) se suministran simultáneamente a través de la tobera (14). De esta manera, el fluido envolvente (18) forma una corriente de fluido coaxial con la muestra que tiene espermatozoides teñidos. Dado que los diversos fluidos se proporcionan al citómetro de flujo (10) a cierta presión, fluyen fuera de la tobera (14) y salen por el orificio (22) de la tobera. Al proporcionar un oscilador (24) que puede ser controlado con precisión con un control (26) del oscilador, pueden crearse ondas de presión dentro de la tobera (14) y ser transmitidas a los fluidos que salen de la tobera (14) por el orificio (22) de la tobera. En respuesta a las ondas de presión, la corriente (16) de fluido que sale por el orificio (22) de la tobera forma finalmente gotas (28) regulares a intervalos exactos. Debido a que los espermatozoides teñidos están rodeados por la corriente (16) de fluido o el ambiente del fluido envolvente, las gotas (28) pueden contener espermatozoides aislados individualmente.
El citómetro de flujo (10) actúa clasificando las gotas en función de las características de los espermatozoides que se prevé que están dentro de las gotas. Esto se logra a través de un sistema (30) de detección de células. El sistema (30) de detección de células incluye al menos un detector (32) que responde a las células contenidas dentro de la corriente (16) de fluido. El sistema (30) de detección de células puede originar una acción dependiendo de la presencia relativa o de la ausencia relativa de una característica. Ciertas características, como el contenido relativo de ADN de los espermatozoides, se pueden detectar mediante excitación con una fuente (34) de radiación electromagnética, tal como un láser que genera un haz de irradiación al que responden los espermatozoides teñidos. La fuente de radiación electromagnética (34) puede ser un láser operado a la longitud de onda del UV, como a aproximadamente 355 nm. Un ejemplo de un láser de este tipo puede ser un Vanguard 350 (disponible de Spectra-Physics), que opera a 350 mW. Se pueden emplear varias ópticas para dar forma al perfil del haz del láser, dividir el haz en más de una corriente o reducir la potencia del haz a una corriente. Ejemplos no limitantes de estas ópticas se pueden encontrar en WO/2004/104178 y WO/2001/85913.
Las características de los espermatozoides individuales, en particular la presencia de un cromosoma X o de un cromosoma Y se pueden determinar a partir de la fluorescencia detectada producida en respuesta a la fuente (34) de radiación electromagnética. El tinte fluorescente selectivo del ADN se une estequiométricamente al ADN del espermatozoide. Debido a que los espermatozoides portadores del cromosoma X contienen más ADN que los espermatozoides portadores del cromosoma Y, el espermatozoide portador del cromosoma X puede unir una mayor cantidad de tinte fluorescente selectivo del ADN que los espermatozoides portadores del cromosoma Y. Por lo tanto, midiendo la fluorescencia emitida por el tinte unido tras la excitación, es posible diferenciar entre espermatozoides portadores de X y espermatozoides portadores de Y.
Con el fin de lograr la separación y el aislamiento en función de las características de los espermatozoides teñidos, la luz emitida puede ser detectada por el detector (32) y la información alimentada a un analizador (36) acoplado a un cargador de gotitas que carga diferencialmente cada gota (28) basado en las características de los espermatozoides teñidos contenidos dentro de esa gota (28). De esta manera, el analizador (36) actúa permitiendo que las placas (38) de deflexión electrostática desvíen las gotas (28) en función de si contienen o no la partícula o célula apropiada.
Como resultado, el citómetro de flujo (10) actúa separando los espermatozoides teñidos haciendo que las gotas (28) que contienen espermatozoides sean dirigidas a uno o más contenedores (40) de recogida. Por ejemplo, cuando el analizador diferencia los espermatozoides en función de una característica del espermatozoide, las gotitas que atrapan los espermatozoides portadores del cromosoma X pueden estar cargadas positivamente y, por lo tanto, ser desviadas en una dirección, mientras que las gotitas que atrapan los espermatozoides portadores del cromosoma Y pueden estar cargadas negativamente y, por lo tanto, ser desviadas de otra manera, y la corriente residual (es decir, las gotitas que no atrapan a una partícula o célula ni atrapan células no deseadas o que no se pueden clasificar) se pueden quedar sin carga y, por ello, se recogen en una corriente no desviada en un tubo de aspiración o similar, como se comenta en la solicitud de patente de los Estados Unidos 09/001.394. Naturalmente, pueden crearse y recogerse simultáneamente numerosas trayectorias de deflexión.
Ejemplo 1 - Normalizar muestras de esperma y una etapa de tinción
Recogida - El esperma se recogió de cinco toros diferentes en un programa de recogida de rutina utilizando una vagina artificial. De cada toro se recogieron dos o tres muestras en un día. De los cinco toros, 2 eran toros Jersey y tres eran toros Holstein. Todos los eyaculados contenían más del 60% de motilidad progresiva y la concentración de espermatozoides variaba de 857 millones de espermatozoides por ml a 2.480 millones de espermatozoides por ml. Los eyaculados recogidos del mismo toro se agruparon y luego se dividieron en nueve muestras de espermatozoides para los tratamientos de recogida y tinción.
Teñido. Se tiñeron porciones de cada eyaculación de toro con nueve procedimientos diferentes.
(A) Control (sin normalización, tinción de dos etapas) - Se estableció un control que no incluía la etapa de normalización de los eyaculados recogidos y en la que el esperma se tiñó en dos pasos. Antes de la tinción, las muestras de espermatozoides se concentraron a entre 1.700 millones de espermatozoides por ml y 1.800 millones de espermatozoides por ml por centrifugación o por la adición de un tampón tris-yema de huevo con un pH de 6,8, dependiendo de la concentración de partida de las muestras.
Los espermatozoides en el grupo de control se diluyeron a 160 x 106 espermatozoides por ml en un tampón TALP modificado, como se describe en la Tabla 1, a un pH de 7,4. Cada muestra de espermatozoides en el grupo de control se incubaba con 16-17 pl de Hoechst 33342 por ml (64-68 pM) de muestra durante 45 minutos a 34 °C. Después de la incubación, se añadió un volumen igual de un segundo TALP modificado reduciendo la concentración a 80 x 106 espermatozoides por ml. El segundo TALP modificado incluye los componentes descritos en la Tabla 1 con la adición de 4% de yema de huevo, 50 pM de tinte alimentario amarillo n.° 6 (20 g/l) y el pH se bajó a 5,5 con la adición de HCl.
(B) Diluido (sin normalización, tinción de dos etapas) - En el segundo grupo, los espermatozoides no estaban normalizados, pero se diluyeron con un tampón y 20% de yema de huevo. Los espermatozoides se concentraron después a entre 1.700 millones de espermatozoides por ml y 1.800 millones de espermatozoides por ml de la misma manera descrita con respecto al grupo (A). Los espermatozoides se diluyeron después a 160 x 106 espermatozoides por ml en un tampón TALP modificado, y se tiñeron de la misma manera en las dos etapas descritas en el grupo (A).
(C) Una Etapa I (sin normalización, una etapa de tinción con 1% de yema de huevo) - En un tercer grupo se recogieron espermatozoides y la concentración se ajustó de la misma manera que el grupo (A) de control. Cada muestra de espermatozoides se diluyó después a 160 x 106 espermatozoides por ml en un tampón TALP modificado a un pH de 7,4. El tampón TALP modificado era sustancialmente idéntico al tampón descrito en la Tabla 1, excepto que incluía además un 1% de yema de huevo y colorante alimentario amarillo n.° 6 a una concentración de 25 pM. Cada muestra de espermatozoides en este grupo se incubó después con 14-15 pl de Hoechst 33342 por ml (46-60 pM) durante 45 minutos a 34 °C. Después de la incubación, los espermatozoides permanecieron en una concentración de 160 x 106 espermatozoides por ml.
(D) Normalizado I (normalizado con tampón con 3% de yema de huevo, tinción de dos etapas) - En este grupo se normalizaron los espermatozoides ajustando tanto el pH como la concentración de espermatozoides antes de la tinción y la clasificación. Después de la recogida, el esperma se diluyó 1:3 en un tampón inicial con un pH de 7,2, así como una gran capacidad de amortiguación del pH. El tampón de gran capacidad se complementó con 3% de yema de huevo. Todas las muestras se centrifugaron después para reducir la concentración de espermatozoides a entre 1.700 millones de espermatozoides y 1.800 millones de espermatozoides por ml. Los espermatozoides normalizados se tiñeron después según el procedimiento de dos etapas descrito en (A).
(E) Normalizado II (normalizado con tampón de 10% de yema de huevo, tinción de dos etapas) - En este grupo el esperma se normalizó ajustando tanto el pH como la concentración de espermatozoides antes de la clasificación de la misma manera descrita en el grupo (D), excepto que el tampón inicial era 10% yema de huevo.
(F) Una Etapa y Normalizado I (normalizado con tampón con 3% de yema de huevo, tinción en una etapa con 1% yema de huevo) - En este grupo el esperma se normalizó ajustando tanto el pH como la concentración del esperma antes de clasificar de la misma manera descrita en el grupo (D). La muestra normalizada se tiñó después con un procedimiento de tinción de una etapa como se describe en el grupo (C).
(G) Una Etapa y Normalizado II (normalizado con tampón con 10% de yema de huevo, tinción en una etapa con 1% yema de huevo) - En este grupo el esperma se normalizó ajustando tanto el pH como la concentración de esperma antes de la tinción de la misma manera descrita en el grupo (E). La muestra normalizada se tiñó después con un procedimiento de tinción de una etapa como se describe en el grupo (C).
(H) Una Etapa y Normalizado III (normalizado con tampón con 3% de yema de huevo, tinción en una etapa sin yema de huevo) - En este grupo el esperma se normalizó ajustando tanto el pH como la concentración de esperma antes de la tinción de la misma manera descrita en el grupo (D). La muestra normalizada se tiñó después con un procedimiento de tinción de una etapa como se describe en el grupo (C), excepto que no se añadió ninguna yema de huevo al TALP de tinción de una etapa.
(I) Una Etapa y Normalizado IV (normalizado con tampón con 10% de yema de huevo, tinción en una etapa sin yema de huevo) - En este grupo el esperma se normalizó ajustando tanto el pH como la concentración de esperma antes de clasificar de la misma manera descrita en el grupo (E). La muestra normalizada se tiño después con un procedimiento de tinción de una etapa como se describe en el grupo (C) excepto que no se añadió ninguna yema de huevo al TALP de tinción de una etapa.
Clasificación y adquisición de datos - Cada una de las muestras teñidas se clasificó en un MoFlo SX (Beckman Coulter, EE.UU.). Las muestras que se tiñeron en un procedimiento de dos etapas se clasificaron a la concentración de 80 x 106 espermatozoides por ml, y las muestras que fueron teñidas mediante el procedimiento de una etapa se clasificaron a la concentración de 160 x 106 espermatozoides por ml. Los datos registrados por el citómetro de flujo se registraron, incluyendo información relacionada con las tasas de clasificación y separando en portales las subpoblaciones de espermatozoides. Por ejemplo, el porcentaje de espermatozoides medidos como muertos, así como los porcentajes de espermatozoides separados como vivos-orientados y por encima de los intervalos se registraron y promediaron para los cinco toros.
Resultados - En la siguiente Tabla 2 se resumen una comparación del porcentaje de espermatozoides que estaban orientados, desorientados y muertos según lo determinado por los parámetros de clasificación establecidos en el citómetro de flujo.
Tabla 2
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En comparación con el control (A), los grupos Una Etapa I (C), Normalizado I (D) y Normalizado II (E), mostró cada uno de ellos poblaciones muertas significativamente menores con reducciones de 4,58%, 7,18% y 10,85%, respectivamente. En función de estas mejoras, las etapas de normalizar las muestras de esperma antes de la tinción y modificar el procedimiento de tinción a una solo etapa mejoran de forma independiente la capacidad de los espermatozoides para sobrevivir al procedimiento de clasificación. Además, Una Etapa y Normalizado I (F), Una Etapa y Normalizado II (G), Una Etapa y Normalizado III (H), y Una Etapa y Normalizado IV (I), muestran una sinergia por la que el efecto combinado de normalizar una eyaculación y teñir la eyaculación en una sola etapa es mayor que cualquier mejora de forma individual.
Haciendo referencia a la Tabla 2, se puede ver que Normalizado I (D), Normalizado II (E), Una Etapa y Normalizado I (F), y Una Etapa y Normalizado II (G), parecía cada uno proporcionar beneficios significativos en términos de reducir el número de espermatozoides muertos, pero el porcentaje de espermatozoides orientados no mejoró. Esto puede estar relacionado con la columna indicada como por encima del intervalo. Si bien más espermatozoides fueron separados como vivos para su clasificación parece haber un aumento en las señales dispersas por encima de los intervalos de los portales de clasificación. Esta señal puede representar espermatozoides que están pegados entre sí o pueden representar espermatozoides que están unidos a lípidos de la yema de huevo. En cualquier caso, surge el modelo general de que mayores cantidades de yema de huevo reducen los números de espermatozoides muertos, pero puede introducir un nuevo problema y, por lo tanto, puede ser necesario un equilibrio.
Ejemplo 2 - Normalización de muestras de espermatozoides y tinción de una etapa
Recogida - El esperma se recogió de seis toros Jersey diferentes en un programa de recogida de rutina utilizando una vagina artificial. Todos los eyaculados contenían más del 65% de motilidad progresiva y la concentración de espermatozoides varió de 765 millones de espermatozoides por ml a 1.710 millones de espermatozoides por ml. Cada muestra de esperma se dividió en dos partes en tubos de 15 ml para dos tratamientos de recogida y tinción. Las mediciones de pH se tomaron en la recogida, y en cada etapa de tratamiento posterior.
Tinción - Control (sin normalización, tinción de dos etapas) - Se estableció un control que no incluía la etapa de normalización de eyaculados recogidos y en el que el esperma se tiñó en dos etapas. Antes de la tinción, las muestras de esperma se concentraron entre 1.700 millones de espermatozoides por ml y 1.800 millones de espermatozoides por ml por centrifugación o por la adición de un tampón tris-yema de huevo con un pH de 6,8, dependiendo de las muestras de concentración inicial.
Los espermatozoides en el grupo de control se diluyeron a 160 x 106 espermatozoides por ml en un tampón TALP modificado, como se describe en la Tabla 1, a un pH de 7,4. Cada muestra de esperma en el grupo de control se incubó después con 16-17 pl de Hoechst 33342 por ml (64-68 pM) de muestra durante 45 minutos a 34 °C. Después de la incubación, se añadió un volumen igual de un segundo TALP modificado reduciendo la concentración a 80 x 106 espermatozoides por ml. El segundo TALP modificado incluye los componentes descritos en la Tabla 1 con la adición de 4% de yema de huevo, 50 pM de colorante alimentario rojo n.° 40 (20 g/l) y el pH se redujo a 5,5 con la adición de HCl.
Una Etapa y Normalizado (normalizado con 10% de yema de huevo, tinción de una etapa con uno por ciento de yema de huevo) - El esperma se normalizó ajustando tanto el pH como la concentración de esperma antes de la tinción. Después de la recogida, el esperma se diluyó 1:3 en un tampón inicial con un pH de 7,2, así como una gran capacidad para amortiguar el pH. El tampón de gran capacidad se complementó con 3% de yema de huevo. Todas las muestras se centrifugaron después para reducir la concentración de espermatozoides a entre 1.700 millones de espermatozoides y 1.800 millones de espermatozoides por ml.
Las muestras de espermatozoides se diluyeron después a 160 x 106 espermatozoides por ml en un tampón TALP modificado a un pH de 7,4. El tampón TALP modificado era sustancialmente idéntico al tampón descrito en la Tabla 1, excepto que además incluía un 1% de yema de huevo y colorante alimentario amarillo n.° 6 a una concentración de 25 pM. Cada muestra de esperma en este grupo se incubó después con 16-17 pl de Hoechst 33342 por ml (64­ 68 pM) durante 45 minutos a 34 °C. Después de la incubación, el esperma permaneció a una concentración de 160 x 106 espermatozoides por ml.
Clasificación y adquisición de datos - Cada muestra se clasificó en un MoFlo SX (Beckman Coulter, EE. UU.). El control se clasificó a la concentración de 80 x 106 espermatozoides por ml, mientras que el esperma normalizado se clasificó según 160 x 106 espermatozoides por ml. Los datos fueron registrados por el citómetro de flujo y después promediados para los 6 toros.
Resultados - La Fig. 3 ilustra el pH registrado tanto del control (A) como del eyaculado normalizado (B). Estos valores se reflejan en la Tabla 3 a continuación. Si bien la eyaculación normalizada está sometida a un aumento inicial, un aumento posterior se evita durante la tinción y también se evita la siguiente disminución. Además, la Tabla 4 ilustra beneficios similares en la reducción de espermatozoides muertos que se vio en el Ejemplo 1. Específicamente, la muestra normalizada que se tiñó en una etapa tenía 5,67% menos de espermatozoides muertos.
Tabla 3
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Tabla 4
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Debe entenderse que todas las etapas de un procedimiento pueden divulgarse como una acción, un medio para emprender esa acción o como un elemento que causa esa acción. Del mismo modo, cada elemento de un aparato puede divulgarse como el elemento físico o la acción que facilita ese elemento físico. Solo a título de ejemplo, debe entenderse que la divulgación de "clasificador" abarca la divulgación del acto de "clasificar" - ya sea explícitamente discutido o no - y, por el contrario, de estar ahí de forma efectiva la divulgación del acto de "clasificación", debería entenderse que tal divulgación abarca la divulgación de un "clasificador" e incluso un "medio para clasificar". Debe entenderse que tales términos alternativos para cada elemento o etapa están incluidos explícitamente en la descripción.
Además, en cuanto a cada término utilizado debe entenderse que, a menos que su utilización en esta aplicación sea incompatible con dicha interpretación, debe entenderse que las definiciones normales de diccionario están incluidas en la descripción de cada término que figura en el Random House Webster’s Unabridged Dictionary, segunda edición.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de clasificación de esperma que comprende las etapas de:
ajustar la concentración de una muestra de esperma a un intervalo de concentración predeterminado entre 1.400 millones de espermatozoides por ml y 2.100 espermatozoides por ml diluyendo la muestra de esperma en un diluyente inicial que tiene un pH entre 7,1 y 7,6 a una relación entre de muestra de esperma y diluyente inicial entre 1:1 y 1:10, centrifugar la muestra de esperma diluida y eliminar el sobrenadante hasta que se alcance la concentración predeterminada;
seguir la etapa de ajuste de la concentración de una muestra de esperma, tiñendo la muestra de esperma con un tampón de tinción individual que tiene un tinte selectivo de ADN y un tinte de desactivación en un volumen de un tampón de tinción individual que proporciona una concentración adecuada para la clasificación; y
clasificar la muestra de esperma teñida.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el tampón de tinción individual comprende TALP modificado con un pH de aproximadamente 7,4.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el tampón de tinción individual es aplicado en un volumen para llegar a una concentración de esperma teñida de entre aproximadamente 640 millones de espermatozoides por ml y aproximadamente 80 millones de espermatozoides por ml.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el tinte de desactivación comprende colorante alimentario amarillo n.° 6.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde la etapa de clasificar la muestra de esperma teñida comprende además la recogida de espermatozoides viables portadores del cromosoma X y/o espermatozoides viables portadores del cromosoma Y por clasificación con citómetro de flujo.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el pH de la muestra de esperma se mantiene a un nivel predeterminado a través de las etapas de tinción y clasificación.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en donde el pH de la muestra de esperma se mantiene dentro de 0,5 del pH predeterminado a través de las etapas de tinción y clasificación.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el pH de la muestra de esperma se mantiene entre 6,75 y 7,3 a través de las etapas de tinción y clasificación.
9. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de congelación de los espermatozoides clasificados.
10. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el pH de la muestra de esperma se mantiene a un nivel predeterminado a través de las etapas de tinción, clasificación y congelación.
11. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el diluyente inicial comprende un diluyente de amortiguación del pH con una gran capacidad de amortiguación.
12. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el diluyente inicial comprende uno o más seleccionados del grupo de: bicarbonato sódico, TRIS-citrato, citrato de sodio, HEPES, TRIS, TEST, MOPS, KMT, TALP y combinaciones de los mismos.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en donde el diluyente inicial comprende además entre el 1 por ciento y el 10 por ciento de yema de huevo.
14. El procedimiento de la reivindicación 12, en donde el diluyente inicial comprende además ácido cítrico o citratos.
15. El procedimiento de la reivindicación 12, en donde el diluyente inicial comprende además uno o más antioxidantes.
16. El procedimiento de la reivindicación 12, en donde el diluyente inicial tiene un pH de 7,2.
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