KR102346185B1

KR102346185B1 - 피부 색소 침착 위험도 예측용 바이오마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102346185B1
Application number: KR1020190173479A
Authority: KR
Inventors: 황태순; 홍경원; 서인수; 고대승; 김수윤; 신진희
Original assignee: 주식회사 테라젠바이오; 재단법인 제주테크노파크; 피엔케이피부임상연구센타 주식회사; (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2022-01-03
Also published as: KR20210081189A

Abstract

일 양상에 따른 피부 색소 침착 위험도를 예측하기 위한 조성물, 마이크로어레이, 및 이를 이용하여 개체의 피부 색소 침착 위험을 예측하는 방법을 제공한다. 이에 의하면 명확한 기준을 바탕으로 개체의 피부색소 침착 위험도를 예측할 수 있을 뿐 아니라, 이를 바탕으로 개인 맞춤형 색소 침착 관리 방법을 제공할 수 있다.

Description

피부 색소 침착 위험도 예측용 바이오마커 및 이의 용도{Biomarker for predicting skin pigmentation risk and use thereof}

피부 색소 침착 위험도 예측용 바이오마커를 이용한 색소 침착 위험도를 예측하기 위한 조성물, 마이크로어레이, 및 이를 이용하여 개체의 피부색소 침착 위험을 예측하는 방법에 관한 것이다.

　피부 색소 침착은 피부의 표면 또는 점막 등에 멜라닌 증가에 의하여색이 검거나 갈색을 보이는 피부 증상을 의미한다.

피부 색소 침착은 유전질환, 약물, 염증, 외상, 태양광 노출, 과색소성 피부질환 등으로 발생할 수 있다. 특히, 생리적으로 체내에 있는 멜라토닌의 양이 비정상적인 경우 또는 나타나는 장소에 이상이 있을 경우, 생리적으로는 존재하지 않는 색소가 병적 조건 아래에서 발생하는 경우 등이 있다.　

현재 피부의 색소침착의 경우 색소침착연고를 통한 색소침착 증상을 개선시키는 경우가 있으며, 화장품의 경우 색조 화장이나 파운데이션 등으로 색소침착 부위를 가리는 것이 전부인 실정이다. 이러한 색소침착은 자외선, 임신, 유전질환, 피임약, 약물, 염증, 외상 등 다양한 원인에 의해서 발생할 수 있기 때문에 개개인의 유전자 정보와 라이프 스타일등에 따른 맞춤형 예측 서비스가 필요한 실정이다.

따라서, 본 발명자들은 약 1000여명의 대상자들의 피부 위치별 색소 침착 정도를 피부 멜라토닌과 피부 밝기를 통해 측정하고 측정값을 코드화하여 분석함으로서, 피부 색소 침착 위험도를 예측할 수 있는 명확한 기준을 제공하고 개인의 요구에 부합하는 형태의 맞춤 솔루션을 제공하는 방법을 개발하여 위와 같은 문제점을 해결하였다. 이러한 발명은 통합적인 삶의 질 향상에 도움이 되는 것이다.

바이오마커를 이용하여 피부 색소 침착 위험도를 측정하기 위한 조성물을 제공한다.

바이오마커를 이용하여 피부 색소 침착 위험도를 측정하기 위한 키트 또는를 마이크로어레이를 제공한다.

바이오마커를 검출하여 피부 색소 침착 위험을 예측하는 방법을 제공한다.

일 양상은 rs74653330, rs34466224, rs11685354, rs4653497, rs59784607 및 rs76548385로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일 염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism: SNP)을 검출하는 제제를 포함하는 색소 침착 생성 위험도를 측정하기 위한 조성물을 제공한다.

상기 다형성 부위(polymorphic site)는 핵산 서열 중 단일 염기 다형성을 나타내는 부위를 말한다. 용어 "단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)"은 핵산 서열에서 하나의 뉴클레오티드의 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이를 말한다. 집단에서 약 1% 이상 또는 약 5% 이상, 2% 내지 4.5%, 3 내지 4%, 2.5% 내지 3.4%의 빈도로 존재하는 2개 이상의 대립 염기서열이 발생하는 위치일 수 있다.

상기 rs74653330은 피부색소 침착에 대한 위험도와 연관성이 있는 것일 수 있다. rs74653330은 OCA2 유전자의 엑손 15에 존재하는 것일 수 있다. 또한, rs74653330은 인간 15번 염색체의 N-말단으로부터 27983407번째 염기가 T 또는 C일 수 있다. rs74653330은 상기 27983407번째 염기를 포함하는 5개 내지 100개, 10개 내지 100개, 10개 내지 80개, 10개 내지 60개, 10개 내지 40개, 10개 내지 20개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 상보적 뉴클리오티드일 수 있다.

상기 rs34466224은 피부색소 침착에 대한 위험도와 연관성이 있는 것일 수 있다. rs34466224은 NCLN 유전자의 다운 스트림에 존재하는 것일 수 있다. 또한, rs34466224은 인간 19번 염색체의 N-말단으로부터 3219644

번째 염기가 T 또는 C일 수 있다. rs34466224은 상기 3219644

번째 염기를 포함하는 5개 내지 100개, 10개 내지 100개, 10개 내지 80개, 10개 내지 60개, 10개 내지 40개, 10개 내지 20개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 상보적 뉴클리오티드일 수 있다.

상기 rs11685354은 피부색소 침착에 대한 위험도와 연관성이 있는 것일 수 있다. rs11685354은 TNS 1 유전자의 인트론 1에 존재하는 것일 수 있다. 또한, rs11685354은 인간 2번 염색체의 N-말단으로부터 217996408

번째 염기가 A 또는 C일 수 있다. rs11685354은 상기 217996408

상기 rs4653497은 피부색소 침착에 대한 위험도와 연관성이 있는 것일 수 있다. rs4653497은 CDC42BPA 유전자의 업 스트림에 존재하는 것일 수 있다. 또한, rs4653497은 인간 1번 염색체의 N-말단으로부터 227355326

번째 염기가 T, A 또는 C일 수 있다. rs4653497은 상기 227355326

상기 rs59784607은 피부색소 침착에 대한 위험도와 연관성이 있는 것일 수 있다. rs59784607은 HS3ST4 유전자의 인트론 1에 존재하는 것일 수 있다. 또한, rs59784607은 인간 16번 염색체의 N-말단으로부터 25774628

번째 염기가 T 또는 G일 수 있다. rs59784607은 상기 25774628

상기 rs76548385은 피부색소 침착에 대한 위험도와 연관성이 있는 것일 수 있다. rs76548385은 UNCX 유전자의 다운 스트림에 존재하는 것일 수 있다. 또한, rs76548385은 인간 7번 염색체의 N-말단으로부터 1291682 번째 염기가 T 또는 C일 수 있다. rs76548385은 상기 1291682 번째 염기를 포함하는 5개 내지 100개, 10개 내지 100개, 10개 내지 80개, 10개 내지 60개, 10개 내지 40개, 10개 내지 20개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 상보적 뉴클리오티드일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 rs74653330, rs34466224, 또는 rs76548385 는 C 또는 T가 검출, rs11685354는 C 또는 A가 검출, rs4653497 T, C 또는 A가 검출 또는 rs59784607는 G 또는 T 검출되는 것일 수 있다.

상기 검출하는 제제는, 단일 염기 다형성을 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 것일 수 있다. 또한 상기 검출하는 제제는 프라이머, 프로브, 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 조합일 수 있다.

용어 "프라이머 (primer)"는 중합효소에 의한 뉴클레오티드의 중합반응에서, 개시점으로 작용할 수 있는 단일가닥의 폴리뉴클레오티드를 말한다. 예를 들면, 상기 프라이머는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건, 즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합효소의 존재 하에서 주형-지시(template-directed) DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일가닥의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예를 들어, 온도와 프라이머의 용도에 따라 달라질 수 있다. 상기 프라이머는 길이가 15 내지 30 뉴클레오티드인 것일 수 있다. 예를 들어, 프라이머의 길이가 짧을수록, 낮은 어닐링(annealing) 온도에서 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성할 수 있다. 상기 프라이머의 길이는 약 5 내지 약 100 뉴클레오티드(이하, 'nt'라고 함), 약 10 내지 약 80 nt, 약 10 내지 약 60 nt, 약 10 내지 약 50 nt, 약 10 내지 약 40 nt, 약 10 내지 약 30 nt, 또는 약 10 내지 약 20 nt일 수 있다.

용어 "프로브(probe)"는 표적 핵산에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프로브는 표지 물질에 결합된 것일 수 있다. 상기 프로브는 길이가 약 50 nt 내지 약 400 nt, 약 100 nt 내지 약 350 nt, 약 150 nt 내지 약 300 nt, 또는 약 200 nt 내지 약 250 nt일 수 있다.

용어 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는 유전자 검사 또는 연구에 사용되는 짧은 DNA, RNA 분자 또는 올리고머이다. 상기 올리고뉴클레오티드는 사용자가 지정한 서열을 갖는 단일 가닥 분자일 수 있다.

상기 프로브 올리고뉴클레오티드 또는 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

상기 피부 색소 침착 위험도는 피부 색소 침착이 생길 수 있는 위험도를 말한다. 상기 위험도는 스트레스, 염증, 지방대사, 당대사, 멜라닌 합성, 각질 생성, 피부 유분, 피부 색소 침착, 얼굴 표정 또는 이들의 조합과 연관된 유전자형을 분석하여 위험도를 산출할 수 있다.

다른 양상은 rs74653330, rs34466224, rs11685354, rs4653497, rs59784607 및 rs76548385로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일 염기 다형성(SNP)을 검출하는 제제를 포함하는 색소 침착 생성 위험도를 측정하기 위한 키트를 제공한다.

상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩 키트일 수 있고, 상기 키트는 중합 반응에 필요한 시약, 예를 들면 dNTP, 중합효소 및 발색제 등을 더 포함할 수 있다.

상기 키트는 SNP 다형성 마커를 증폭을 통해 확인하거나, SNP 다형성 마커의 발현 수준을 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 피부 색소 침착 위험도를 진단할 수 있다. 예를 들어, 피부 표현형별 진단용 마커의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 피부 표현형 별 진단용 마커의 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한 바람직하게는, 상기 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 피부 표현형 별 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화 (hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.

다른 양상은 rs74653330, rs34466224, rs11685354, rs4653497, rs59784607 및 rs76548385로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일 염기 다형성(SNP)을 검출하는 제제를 포함하는 색소 침착 생성 위험도를 측정하기 위한 마이크로어레이를 제공한다.

상기 마이크로어레이(microarray)는 기판 표면의 구분된 영역에 상기 폴리뉴클레오티드가 높은 밀도로 고정화되어 있는 것을 말한다. 상기 마이크로어레이는, 상기 영역이 예를 들면 400개/㎠ 이상, 103개/㎠ 이상, 또는 104개/㎠ 이상의 밀도로 기판 상에 배열되어 있는 것일 수 있다.

상기 마이크로어레이에 고정된 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드, 천연 뉴클레오티드의 유사체, 천연 뉴클레오티드의 당, 염기 또는 인산 부위가 변형되어 있는 뉴클레오티드, PNA(peptide nucleic acid), 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 검출가능한 표지(예를 들면, Cy3 또는 Cy5 형광성 물질)가 그의 3'-말단, 중간, 또는 5'-말단에 부착된 것일 수 있다.

상기 마이크로어레이에 고정되는 폴리뉴클레오티드는 길이가 약 5 내지 약 100 nt, 약 10 내지 약 80 nt, 약 10 내지 약 60 nt, 약 10 내지 약 50 nt, 약 10 내지 약 40 nt, 약 10 내지 약 30 nt, 또는 약 10 내지 약 20 nt일 수 있다.

다른 양상은 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계; 상기 생물학적 시료로부터 rs74653330, rs34466224, rs11685354, rs4653497, rs59784607 및 rs76548385로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일염기다형성(SNP)을 검출하는 단계를 포함하는 피부색소 침착 위험을 예측하는 방법을 제공한다.

상기 rs74653330, rs34466224, rs11685354, rs4653497, rs59784607, rs76548385 및 단일염기다형성은 상술한 바와 동일하다.

상기 생물학적 시료를 수득하는 단계는, 개체의 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 개체는 인간을 포함한 포유동물일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 생물로부터 수득된 시료를 말한다. 상기 생물학적 시료는 예를 들면 조직, 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈액, 혈장, 혈청, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계는 통상의 DNA 분리방법에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산을 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reactionL: PCR), 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction: LCR), 전사 증폭(transcription amplification), 또는 실시간-핵산 서열 기초 증폭(realtime-nucleic acid sequence based amplification: NASBA)을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다.

상기 검출하는 단계는 단일염기다형성을 증폭하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 검출에 사용되는 제제는 상기 제제는 프라이머, 프로브, 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 피부색소 침착 위험도를 예측하는 단계는 상기 단일염기다형성 유전자형(genotype)의 빈도를 분석하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 검출하는 단계는, 중합효소 연쇄 반응(polymerase chainreaction: PCR), 분자 비이콘(molecular beacon), 프라이머 신장법(primer extension) 등 일 수 있다.

상기 검출하는 단계는, rs74653330의 다형성 부위를 포함하는 핵산 서열과 동일 또는 상보적인 핵산 서열을 포함하는 프라이머, rs34466224의 다형성 부위를 포함하는 핵산 서열과 동일 또는 상보적인 핵산 서열을 포함하는 프라이머, rs11685354의 다형성 부위를 포함하는 핵산 서열과 동일 또는 상보적인 핵산 서열을 포함하는 프라이머, rs4653497의 다형성 부위를 포함하는 핵산 서열과 동일 또는 상보적인 핵산 서열을 포함하는 프라이머, rs59784607의 다형성 부위를 포함하는 핵산 서열과 동일 또는 상보적인 핵산 서열을 포함하는 프라이머 또는 rs76548385의 다형성 부위를 포함하는 핵산 서열과 동일 또는 상보적인 핵산 서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다.

상기 검출하는 단계는 rs74653330, rs34466224, rs11685354, rs4653497, rs59784607 및 rs76548385로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일염기다형성(SNP)에서 그의 다형성 부위를 포함하는 5개 이상의 연속 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드가 고정된 마이크로어레이에 상기 핵산 시료를 혼성화시키는 단계; 및 혼성화 결과를 분석하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 방법은 상기 단일염기다형성 검출 결과에 따라 각 단일염기다형성에 가중치를 계산함으로써, 피부색소 침착 위험도 점수를 환산하는 단계를 더 포함할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 피부색소 침착 위험도를 예측하는 단계는 상기 rs34466224 에서 G가 A보다 더 높은 빈도로 검출되는 경우 또는 rs4653497에서 C가 T보다 더 높은 빈도로 검출되는 경우, 피부색소 침착 위험도가 높은 것으로 예측하는 것일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 피부 색소 침착 위험도를 예측하는 단계는 상기 rs74653330, rs34466224, rs11685354, rs4653497, rs59784607 또는 rs76548385의 회귀분석 베타값(beta)이 양수인 경우 위험도가 높고, 음수인 경우 위험도가 낮은 것으로 예측하는 것일 수 있다.

상기 회귀분석 베타값은, 적합한 결과 계수(the resulting coefficient)를 나타내는 것일 수 있다. 상기 SNP 대립 유전자의 표현형을 wildtype을 0, heterotype을 1, mutant type을 2로 코딩하는 단계를 포함하여 회귀 분석한 결과를 나타나는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 회귀분석 베타값은 minor allele의 수를 증가시킬 때 개체의 특성이 얼마나 변하는지 의미할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 피부색소 침착 위험도를 예측하는 단계는 하기 수학식에 의해 환산값을 도출하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

[수학식 1]

환산값 = 7.939+(rs74653330)*(-1.006)+(rs34466224)(0.532)+(rs11685354)*(-0.419)+(rs4653497)*(0.419)+(rs59784607)*(-0.462)+(rs76548385)*(0.712)

상기 수학식에서, 상기 (SNP)는 각 SNP의 유전자형이 WILDTYPE 이면 0, Heterotype 이면 1, Mutant type 이면 2의 값을 의미하는 것이다.

상기 Wild Type은 유전자의 major allele로 구성된 표현형, 상기 Heterotype은 유전자의 major 및 minor allele로 구성된 표현형, 상기 Mutant type은 유전자의 minor allele로 구성된 표현형을 의미하는 것일 수 있다.

상기 (rs74653330)은 rs74653330, C>T의 표현형이 CC이면 0, 표현형이 CT이면 1, 표현형이 TT이면 2의 값일 수 있다.

상기 (rs34466224)은 rs34466224 G>A의 표현형이 GG이면 0, GA이면 1, AA이면 2의 값일 수 있다.

상기 (rs11685354)은 rs11685354, C>A의 표현형이 CC이면 0, CA 이면 1, AA이면 2의 값일 수 있다.

상기 (rs4653497)은 rs4653497, C>T의 표현형이 CC이면 0, 표현형이 CT이면 1, 표현형이 TT이면 2의 값일 수 있다.

상기 rs59784607은 rs59784607, G>T의 표현형이 GG이면 0, 표현형이 GT이면 1, 표현형이 TT이면 2의 값일 수 있다.

상기 (rs76548385)은 rs76548385, C>T의 표현형이 CC이면 0, 표현형이 CT이면 1, 표현형이 TT이면 2의 값일 수 있다.

상기 방법은 상기 환산값에 따라 개체의 피부색소 침착 위험도를 피부색소 침착 위험도가 높은 군, 중간인 군 및 낮은 군 중 어느 한 등급으로 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 환산값이 높으면 높을수록 검사 항목의 위험도가 높은 것으로 결정하는 것일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 피부색소 침착 위험도를 예측하는 단계는 상기 환산값이 8.189 초과 내지 10.427이하인 경우에 피부색소 침착 위험도가 높은 것으로 예측하고,

상기 환산값이 7.547 초과 내지 8.189이하인 경우에 피부색소 침착 위험도가 중간인 것으로 예측하며, 및

상기 환산값이 0 이상 내지 7.547이하인 경우에 피부색소 침착 위험이 낮은 것으로 예측하는 것일 수 있다.

일 양상에 따른 색소 침착 생성 위험도를 예측하기 위한 조성물, 마이크로어레이, 및 이를 이용하여 개체의 피부색소 침착 위험을 예측하는 방법에 의하면, 개체의 피부색소 침착 위험을 예측할 수 있고, 이를 이용하여 색소 침착을 개선 또는 예방할 수 있다.

도 1a는 연령에 따른 피부 표현형의 분포를 나타낸 것으로, 미간의 색소 침착함량을 나타낸 것이다(A101).
도 1b는 연령에 따른 피부 표현형의 분포를 나타낸 것으로, 오른쪽 뺨 피부의 색소 침착 함량을 나타낸 것이다(A102).
도 1c는 연령에 따른 피부 표현형의 분포를 나타낸 것으로, 미간의 색소 침착함량을 나타낸 것이다(A101).
도 1d는 연령에 따른 피부 표현형의 분포를 나타낸 것으로, 오른쪽 뺨 피부의 색소 침착 함량을 나타낸 것이다(A102).
도 2a는 피부 색소 침착의 맨해튼 플롯을 나타낸 이미지이다.
도 2b는 상기 맨해튼 플롯을 바탕으로, 피부 색소 침착의 QQ 플롯을 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 피부 주름 측정 지표의 환산

1-1. 표본 모집단

표본 모집단은 2019 년 1 월부터 2019 년 11 월까지 P & K 피부 연구 센터 (서울)에서 모집된 총 1,079 명의 한국 여성으로 구성되었다. 모든 참가자는 피부 관련 질환이 없었으며 평균 연령은 40.81 세였다. 모든 참가자는 연구에 대해 서면으로 동의하였다. 상기 모집단은 the institutional review board of Theragen Etex Bio Institute (IRB No.: 700062-20190819-GP-006-01)에 의해 승인되었다.

1-2. 피부 측정 장비를 이용한 피부 표현형별 측정값의 도출

피부 특성을 측정하기 위해, 다양한 측정 장치가 사용되었다.

피부 주름의 경우, Primos CR (Canfield Scientific, Parsippany, NJ, USA) 장치를 사용하여 눈가 피부의 평균 거칠기, 눈가 피부의 최대 주름 깊이, 미간 피부의 평균 거칠기, 미간 피부의 최대 주름 깊이를 측정하였다.

피부 수분의 경우, Corneometer® CM-825 (EnviroDerm Services Ltd., Hedworth, Grange Court, UK) 장치를 사용하여 미간 및 오른쪽 뺨 피부의 수분 함량을 측정하였다.

색소 침착의 경우, Mexameter 및 CM-700d 장치를 각각 사용하여 멜라토닌과 피부 밝기를 측정하였다.

피부 오일 함량의 경우, Sebumeter® SM 815 (Courage+Khazaka electronic GmbH., Kφln, Germany) 장치를 이용하여 미간 및 오른쪽 뺨 피부의 오일 함량을 측정하였다.

피부 민감도의 경우, 측정 장치 없이 피부에 10%(v/v) 락트산(lactic acid)을 처리하여 반응 정도에 따라 측정하였다.

그 결과, 표본 모집단의 피부 측정치의 raw data를 수득할 수 있었다.

더불어, 표 1에 나타낸 것과 같이, 피부 측정치 데이터를 바탕으로 각 피부측정치에 대한 변수명, 측정 부위, 변수값 설명 등을 코드북화 하여 정리하였다.

1-3. 측정 지표의 환산

상기 1-2에 따른 표현형별 측정의 경우, 각 표현형별로 다른 측정 장비를 사용하였기 때문에, GWAS 분석을 수행하기 이전에 각 측정값을 균일하게 변환할 필요가 있었다.

따라서, 본 발명자들은 각 측정 항목에 코드를 부여하였고, 각 측정값의 크기에 따라 1, 2,및 3의 세 그룹으로 나누고, 각 그룹에 대해 1점, 2점 3점의 점수를 부여하였다.

그 결과, 표 2에 나타낸 것과 같이, 각 측정 부위에 대해 코드를 부여하였다.

또한, 표 3에 나타낸 것과 같이, 각 코드별 상위 그룹, 중간 그룹 및 하위 그룹으로 나누어 상위 그룹에 3점, 하위 그룹에 1점을 순차적으로 부여하여 정량화하였다.

정량화 결과, 피부 주름의 경우, 측정값에 따라 총 4 내지 총 12점으로 환산되었고, 4 내지 6점을 낮은 그룹으로, 7 내지 9점을 중간 그룹으로, 10 내지 12점을 높은 그룹으로 분류하여 측정값을 정량화할 수 있었다.

정량화 결과, 피부 보습의 경우, 측정값에 따라 총 2 내지 총 6점으로 환산되었고, 2점을 낮은 그룹으로, 3 내지 5점을 중간 그룹으로, 6점을 높은 그룹으로 분류하여 측정값을 정량화할 수 있었다.

정량화 결과, 피부 색소의 경우, 측정값에 따라 총 4 내지 총 12점으로 환산되었고, 4 내지 6점을 낮은 그룹으로, 7 내지 8점을 중간 그룹으로, 9 내지 12점을 높은 그룹으로 분류하여 측정값을 정량화할 수 있었다.

정량화 결과, 피부 오일의 경우, 측정값에 따라 총 2 내지 총 6점으로 환산되었고, 2점을 낮은 그룹으로, 3 내지 4점을 중간 그룹으로, 5 내지 6점을 높은 그룹으로 분류하여 측정값을 정량화할 수 있었다.

정량화 결과, 피부 민감도의 경우, 측정값에 따라 총 1 또는 2점으로 환산되었고, 1점을 낮은 그룹으로, 2점을 중간 그룹으로 분류하여 측정값을 정량화할 수 있었다.

1-4. 나이에 따른 분포 측정

더불어, 본 발명자들은 나이에 따른 피부 표현형 변화의 경향을 파악하기 위해 각 코드의 측정 분포를 확인하였다.

그 결과, 연령에 따른 변화의 차이를 나타내는 피부 표현형은 주름 및 피부의 색소로 밝혀졌다. 보다 구체적으로, 도 1a 내지 h에 나타낸 것과 같이, 피부 주름 표현형에서, '눈가 피부 평균 거칠기(코드: W101)'와 '눈가 주름 최대 깊이(코드: W102)'는 연령에 따라 차이가 증가했으며 미간의 평균 거칠기 및 미간 주름 최대 깊이의 경우도 비슷한 경향을 보였다(코드: W103, W104). 피부 색소의 경우 '피부 밝기 착색 지점(코드: R201)'와 '비 피부 밝기 착색 지점(코드 : R202)' 간 나이에 유의적인 차이가 있었다. 또한, 미간과 뺨의 오일 함량은 나이에 따라 감소하는 유의적인 상관관계가 있었다. 한편, 피부 수분 함량의 경우, 개별 분산은 연령에 따른 차이보다 더 컸으며, 색소 침착도 연령에 따라 증가하는 경향이 있지만, 개체의 분산 또한 큰 것으로 확인되었다.

2. 유전형 분석을 통한 비만 위험도 분석 방법

2-1. 유전자 다형성 마커의 선별 준비

상기 실시예 1에서 측정 및 정량화한 피부 표현형에 대해 유전자 다형성 마커를 선별하기 위해, 본 발명자들은 표본 모집단의 구강에서 면봉으로 샘플을 수득하고, ExgeneTM Tissue SV (GeneAll, Seoul, Korea)을 이용하여 DNA를 검출하였다. 모든 DNA 샘플은 25-125 bp 단편으로 증폭되었고, 무작위로 분획되었으며, 상기 DNA는 the Asian Precision Medicine Research Array (Thermofisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)에 기반한 맞춤형 분석인 Theragen Precision Medicine Research Array (Theragen PMRA 분석)을 이용하여 차례로 순화, 재현탁 및 혼성화하였다. 혼성화 후, DMA를 엄격한 조건 하에서 세척하여 노이즈를 최소화할 수 있도록 배경을 제거하였다. 그 다음으로, Thaeragen PMRA 분석을 사용하여 지침대로 82만개의 SNP를 분석하였다. 연관 등으로 발생할 수 있는 오차를 줄이기 위하여, 엄격한 품질 관리 방법을 적용하여 발명에 이용될 SNP를 선택하고 데이터 세트를 제어하였다. 더불어, 82만개의 SNP에 대해 품질 관리 절차를 수행하였다. SNP 세트는 the genotype call rates(≥ 0.95) 및 MAF(≥0.10)을 기반으로 필터링되었으며, 개별 SNP에 대해 Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) 이 계산되었다.

결과적으로, 모든 SNP는 HWE p values > 0.01을 나타내었으며, 상기 필터링 후, 염색체 1 내지 22 내에서 560,795개의 다형성 SNP가 분석되었다.

2-2. 피부 표현형의 GWAS 분석

상기 표본 모집단에 대해 GWAS(genome-wide association study)분석을 수행하였다. 그 결과 총 23개의 SNP를 선별하였으며, 상기 SNP는 기준 데이터베이스(KRGDB, http : //coda.nih go.kr/coda/KRGDB/index.jsp; Ensembl DB, https://asia.ensembl.org)의 마이너 대립 유전자 빈도(minor allele frequency: MAF)와 일치하는 피부 표현형(도 2)을 사용한 GWAS 분석에 의해 유의미한 p- 값(P<1.0x10^-5)을 나타내었다.

그 결과, 도 2a 내지 b에 나타낸 것과 같이, SNP 분석에 대한 맨해튼 플롯 및 그래프를 도출하였다.

보다 구체적으로, 피부 주름 표현형에서, 우리는 rs117381658, rs1961184, rs1929013 및 rs7042102와 같은 4 개의 SNP를 발견했으며, 그 중에서 rs117381658은 주름에 대한 피부 표현형 변화와 가장 높은 상관 관계(β = 0.952, P = 1.52x10-8)를 보였으며 ± 100kb 부근의 5 개의 SNP는 GWAS 분석에서 P <0.05의 유의 적인 상관 관계를 나타냈다.

또한, 피부 색소 침착 표현형에서 6 개의 SNP를 발견하였다. 특히, rs74653330은 GWAS 데이터에서 높은 유의성(β = -1.092, P = 1.04x10-8)의 상관 관계를 보여주었고, SNP 클러스터에 해당하는 P <0.05 인 6 개의 SNP도 발견되었다.

수분 함량 표현형에서, 6 개의 SNP가 확인되었고, 이 중에서 rs9873353은 높은 상관관계를 나타냈다(β = -0.567, P = 1.47x10-6).

또한 오일 함량 표현형에서 5 개의 SNP를 발견했으며, 피부 민감도에서 2 개의 SNP를 발견하였다. rs308971 (β = -0.325, P = 4.60x10-6) 및 rs7334780 (OR = 0.635, P = 2.82x10-6)은 각각 오일 함량 및 피부 민감도와 관련성이 있는 것으로 나타났다.

2-3. GTEx 포털의 SNP에 대한 피부 조직 eQTL

GWAS 분석을 통해 발견된 피부 표현형과 관련된 SNP를 eQTL 데이터베이스(GTEx Portal, https://gtexportal.org/)에서 검색 한 결과, 피부 조직의 유전자형에 따른 발현 수준 차이가 5개의 SNP에서 발견되었음을 확인하였다. 이는 rs7042102 C> T, rs34466224 G> A, rs4653497 T> C, rs308971 G> A 및 rs9577919 C> T를 포함하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 태양에 노출되지 않은 피부 조직에서, rs7042102 C> T (P = 5.2x10-12), rs34466224 G> A (P = 1.1x10-7) 및 rs308971 G> A (P = 1.0x10-13)는 유의적인 유전자형에 따른 발현 차이를 보였으며, rs4653497 T> C (P = 1.7x10-4) 및 rs9577919 C> T (P = 4.9x10-5)는 태양에 노출되지 않은 피부 조직에서 유전자형의 발현 수준이 차이 나는 것을 확인하였다.

각각의 SNP에 대한 eQTL 발현 수준은 마이너 대립 유전자 동형 접합 유전자형(minor allele homozygous genotype)에 따라 점진적으로 변하였다. rs7042102 C> T, rs308971 G> A 및 rs9577919 C> T는 발현이 서서히 증가하였고, rs4653497 T> C는 발현이 서서히 감소하였다. rs34466224 G> A는 편차가 있지만 유전자형에 따라 발현 변화에 차이가 있기 때문에 통계적으로 유의한 것으로 보인다.

2-4. SNP의 유전자의 확인

각각의 분석에서 SNP 연관성의 최고 p- 값에 상응하는 유전자를 확인하기 위해, SNP 유전자좌 데이터를 UCSC 게놈 브라우저 (Genome Bioinformatics Group, UCSC, USA)로부터 수득하였다.

UCSC 데이터베이스 및 GTEx 데이터베이스 (GTEx Analysis Release v.8, http://www.gtexportal.org/)의 유전자 주석(gene annotations)도 전사체에 대한 변이의 영향을 예측하는 데 사용되었다.

그 결과, 하기 표 5에 나타낸 것과 같이, GWAS 분석 결과 각 표현형에 연관이 있는 SNP와 이의 정보들을 수득할 수 있었다. SNP 클러스터는 GWAS 분석에서 최고 신호를 보인 SNP 주변 ±100 kb에서 P<0.05을 만족하는 SNP의 수이다.

2-5. 통계적 분석

상기 실시예 1-3에서 나타낸 것과 같이, 각 피부 표현형에 대해 정량적으로 점수를 부여하였고, 정량적 점수를 통합하여 총 점수를 계산하여 그룹을 분류하였다. 다음으로, 'GWAS의 대상 표현형'에 대한 총 점수와 유전자 변이 간의 선형 회귀에 의한 연관 분석을 수행하였으며, 이 분석 결과는 연령에 따라 조정되었다. 대부분의 통계 분석은 PLINK 버전 1.9 및 SPSS 프로그램을 사용하여 수행되었다. P-값은 여러 테스트에 대해 조정되지 않았다. 통계적 유의성은 P <1.0 x 10^-5를 기준으로 결정되었다.

3. 피부 표현형별 유전자 다형성

3-1. 피부주름 관련 유전자 다형성

피부 주름과 관련하여, rs117381658, rs1961184, rs1929013, 및 rs7042102의 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 선별하였으며, 선별된 단일염기다형성을 하기 표 4에 나타내었다.

노화는 B-세포 수용체를 축적하고 이들을 통해 만성 염증을 유발할 위험이 더 커지며, 이는 염증 반응을 유발하는 FCRL5의 전사를 유도하는 것으로 알려져 있다(Damdinsuren et al. 2016).

결과적으로, rs117381658의 경우 FCRL5 유전자의 다운스트림에 존재하며 만성 염증 상태 주위에 상당한 SNP 클러스터를 형성함으로써 FCRL5에 영향을 줄 수 있었다. 더불어, FCRL5의 발현은 염증 반응 및 NF-κb 경로에 영향을 줄 수 있으며, 이는 조직 불변성 조절제(tissue constancy modulators)를 파괴하고 피부 노화에 영향을 줄 수 있음을 시사하는 것이다.

또한, 또 다른 SNP인 rs7042102는 SPTLC1 유전자의 다운 스트림에 존재하는 변이이며, 피부 조직의 유전자형에 따른 발현 차이가 eQTL 데이터베이스에 나타나는 것을 확인하였다.

3-2. 피부보습 관련 유전자 다형성

피부 보습과 관련하여, rs9873353, rs34567709, rs1362404, rs7853290, 및 rs143938096의 단일 염기 다형성을 선별하였으며, 선별된 단일염기다형성을 하기 표 4에 나타내었다.

피부 수분 함량과 관련된 내부 요인은 각질층의 유분, 천연 보습 인자 및 외부 요인으로 인한 수분 함량으로서, 상기와 같은 요인에 의해 차이가 나타나는 것으로 알려져 있다(Iizaka 2017).

상기 표 4에 따르면, 피부 수분 함량과 관련이 있는 rs9873353, rs34567709, rs1362404, rs7853290, rs143938096 및 rs12955989의 6 가지 SNP가 확인되었다. 상기 SNP들은 각각 CEMIP2 (TMEM2) 및 CTSH 유전자와 관련되어 있는 것으로 시사한다.

eQTL 데이터베이스에서 SNP에 따른 발현 차이는 지방 조직만이 단일 조직 eQTL에 제공된다는 것을 보여 주지만, 다중 조직 eQTL은 rs7853290의 유전자형에 의해 CEMIP2의 발현 차이가 피부 조직에도 나타난다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 상기 SNP가 장벽을 보습하고 기능적으로 제어할 수 있음을 시사하는 것이다.

3-3. 피부색소 관련 유전자 다형성

피부 색소와 관련하여, rs74653330, rs34466224, rs11685354, rs4653497, rs59784607, 및 rs76548385의 단일 염기 다형성을 선별하였고, 하기 표 4에 나타내었다.

결과적으로, 본 발명자들은 중요 유전자인 OCA2뿐만 아니라 후보 유전자, TSN1, RUFY4, NCLN 및 CDC42BPA를 발견했다.

　특히, 아시아 인종에서 아미노산 치환(His615Arg)은 피부 미백 및 색소 변화와 관련성이 높고, 상기 rs74653330은 미스센스 돌연변이의 일봉으로써(Ala481Thr), 동아시아 인구의 색소 침착과 관련이 있었다.

3-4. 피부오일 관련 유전자 다형성

피부 오일 함량과 관련하여, rs308971, rs151209785, rs9577919, rs147804495, rs8107564 및 rs6490805의 단일 염기 다형성을 분석하고, 하기 표 4에 나타내었다.

상기 rs308971, rs9577919, rs8107564 및 rs6490805의 잠재적 기능으로 피부가 변할 수 있다. 보다 구체적으로, rs9577919는 염증 반응을 매개하고 건선의 발달에 영향을 미치는 유전자인 GAS6 유전자의 인트론 1에 위치하고 있었다. 또한, rs8107564는 INSR 유전자의 다운 스트림에 위치하였다. 더불어, rs308971 및 rs6490805도 분석 결과, 피부 오일 함량과의 상관 관계를 시사하였다.

3-5. 피부민감성 관련 유전자 다형성

피부 민감도와 관련하여, rs7334780 및 rs41308의 단일 염기 다형성을 선별하였고, 선별된 SNP를 하기 표 5에 나타내었다.

실시예 4. 피부 표현형별 유전자 다형성 환산식 도출

4-1. 피부 표현형 예측 유전자 지표 알고리즘

상기 실시예 3에서 도출된 표현형별 SNP 바이오마커를 SPSS 통계 프로그램을 이용해 선형회귀분석을 실시하였다. 선형상관분석의 종속변수는 각 피부의 표현형이고, 독립 변수는 각 표현형의 SNP 마커, 개체의 나이, 성별 등이다. 상기 선형회귀분석을 통하여 각 표현형 마커별 가중치 상수를 도출하였다.

4-2. 표현형별 환산식

그 결과, 표 6에 나타낸 것과 같이, 피부 주름 표현형의 환산식을 도출할 수 있었다.

표 7에 나타낸 것과 같이, 피부 보습 표현형의 환산식을 도출할 수 있었다.

표 8에 나타낸 것과 같이, 피부 색소침착 표현형의 환산식을 도출할 수 있었다.

Claims

rs34466224의 단일 염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism: SNP)을 검출하는 제제를 포함하는 피부 색소 침착 위험도를 예측하기 위한 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 rs34466224는 G 또는 A가 검출되는 것인, 조성물.
청구항 1에 있어서, rs74653330, rs11685354, rs4653497, rs59784607 및 rs76548385로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일 염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism: SNP)을 검출하는 제제를 더 포함하는 조성물.
청구항 3에 있어서, 상기 rs74653330, rs4653497, 또는 rs76548385는 C 또는 T가 검출, rs11685354는 C 또는 A가 검출, rs34466224는 G 또는 A가 검출 또는 rs59784607는 G 또는 T 검출되는 것인 조성물.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 프라이머, 프로브, 또는 올리고뉴클레오티드인 것인 조성물.
rs34466224의 단일염기다형성(Single Nucleotide polymorphism: SNP) 마커를 검출하는 제제를 포함하는 피부 색소 침착 위험도 예측용 마이크로어레이.
청구항 6에 있어서, rs74653330, rs11685354, rs4653497, rs59784607 및 rs76548385로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일염기다형성(Single Nucleotide polymorphism: SNP) 마커를 검출하는 제제를 더 포함하는 피부 색소 침착 위험도 예측용 마이크로어레이.
개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
상기 생물학적 시료로부터 rs34466224의 단일염기다형성(SNP)을 검출하는 단계를 포함하는 피부 색소 침착 위험도를 예측하는 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 피부색소 침착 위험도를 예측하는 방법은 상기 rs34466224 에서 G가 A보다 더 높은 빈도로 검출되는 경우, 피부색소 침착 위험도가 높은 것으로 예측하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 단일 염기 다형성을 검출하는 단계는 상기 생물학적 시료로부터 rs74653330, rs11685354, rs4653497, rs59784607 및 rs76548385로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 단일 염기 다형성을 추가적으로 검출하는 것인, 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 피부색소 침착 위험도를 예측하는 방법은 상기 rs34466224 에서 G가 A보다 더 높은 빈도로 검출되는 경우 또는 rs4653497에서 T가 C보다 더 높은 빈도로 검출되는 경우, 피부색소 침착 위험도가 높은 것으로 예측하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
청구항 8 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출하는 단계는 단일염기다형성을 증폭하는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 8 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 색소 침착 위험도를 예측하는 방법은 상기 단일염기다형성(SNP)의 빈도를 분석하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
청구항 10에 있어서, 피부 색소 침착 위험도를 예측하는 방법은 하기 수학식에 의해 환산값을 도출하는 단계를 포함하는 것인 방법으로서,
[수학식 1]
환산값 = 7.939 + (rs74653330)*(-1.006) + (rs34466224)(0.532) + (rs11685354)*(0.419) + (rs4653497)*(0.419) + (rs59784607)*(-0.462) + (rs76548385)*(0.712)
상기 수학식에서, 상기 (SNP)는 각 SNP의 유전자형이 WILDTYPE 이면 0, Heterotype 이면 1, Mutant type 이면 2의 값을 의미하는 것인 방법.
청구항 14에 있어서, 상기 환산값을 도출하는 단계는 상기 환산값이 8.189 초과 내지 10.427 이하인 경우 피부 색소 침착 위험도가 높은 것으로 예측하고,
상기 환산값이 7.547 초과 내지 8.189 이하인 경우에 피부 색소 침착 위험도가 중간인 것으로 예측하며, 및
상기 환산값이 0 이상 내지 7.547 이하인 경우에 피부 색소 침착 위험도가 낮은 것으로 예측하는 것인 방법.