KR102151713B1

KR102151713B1 - 탈모의 위험도를 예측하기 위한 조성물, 마이크로어레이, 및 키트, 및 이를 이용한 방법

Info

Publication number: KR102151713B1
Application number: KR1020190085202A
Authority: KR
Inventors: 황태순; 홍경원; 박병철; 김인영
Original assignee: 주식회사 테라젠바이오; 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2019-07-15
Filing date: 2019-07-15
Publication date: 2020-09-04

Abstract

일 양상에 따른 프라이머, 마이크로어레이, 키트, 및 이를 이용하여 개체의 탈모 질환, 예를 들어 남성형 탈모의 위험도를 예측하는 방법, 또는 탈모 질환의 위험도 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여 개체의 SNP를 분석하는 방법을 제공한다. 이에 의하면, 개체의 탈모 질환의 위험도를 정확하고 간편하게 결정할 수 있다.

Description

탈모의 위험도를 예측하기 위한 조성물, 마이크로어레이, 및 키트, 및 이를 이용한 방법{Composition, microarray, and kits for predicting risk of alopecia, and method using the same}

단일 염기 다형성의 유전자 분석을 통하여 탈모 질환의 위험도를 예측하기 위한 조성물, 키트, 및 마이크로어레이, 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다.

탈모는 정상적으로 모발이 존재해야 할 부위에 모발이 없는 상태를 말하며, 일반적으로 두피의 성모(굵고 검은 머리털)가 빠지는 것을 의미한다. 성모는 색깔이 없고 굵기가 가는 연모와는 달리 빠질 경우 미용상 문제를 일으킬 수 있다. 현재 탈모의 치료를 위해서 미녹시딜 등의 바르는 약, 피나스테라이드 등의 먹는 약, 모발 이식술 등이 이용되고 있다. 다만, 미녹시딜은 탈모가 진행되는 정수리에만 효과가 있으며, 이마의 헤어 라인에는 효과가 확인되지 않았고, 피나스테라이드는 성기능 장애의 부작용이 있으며, 모발이식술의 경우 비용이 비교적 고가이고 드물게 발생하는 합병증 등의 문제가 발생할 수 있다. 따라서, 탈모가 근본적으로 진행되기 전에 예방하는 것이 필요하다.

단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)은 인간 유전체상에 가장 많이 존재하는 형태의 유전적 다형성으로, 유전체 상의 특정 염기서열 하나의 변화를 말한다. 유전학적으로 SNP는 그 위치에 따라 각 개체에 큰 차이를 야기할 수 있다. 예를 들어, SNP가 단백질을 암호화하고 있는 위치에 존재할 경우, 단백질의 구조에 영향을 미쳐 단백질 기능이 달라질 수 있고, 질병과도 연관될 수 있다. SNP가 단백질을 암호화하지 않는 비암호화 영역에 존재할 경우, 즉 프로모터(promoter) 또는 인트론(intron)에 존재할 경우, 각각에 대하여 단백질의 발현 수준에 차이를 가져와 그 단백질의 전체적인 활성이 줄어들 수 있고, 선택적 이어맞추기(alternative splicing)를 통하여 비정상적 단백질이 발현될 수도 있다.

따라서, 탈모 질환의 위험도를 예측 또는 측정할 수 있는 SNP를 발굴하고 정확도 및 민감도 높게 탈모 질환의 위험도를 결정할 필요가 있다.

탈모 질환의 위험도 예측용 조성물, 마이크로어레이, 또는 키트를 제공한다.

개체의 탈모 질환의 위험도를 예측하는 방법 또는 탈모 질환의 위험도 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

일 양상은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 5개 내지 100개의 연속 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 탈모 질환의 위험도를 예측하기 위한 조성물을 제공한다.

상기 다형성 부위(polymorphic site)는 핵산 서열 중 단일 염기 다형성을 나타내는 부위를 말한다. 용어 "단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)"은 핵산 서열에서 하나의 뉴클레오티드의 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이를 말한다. 집단에서 1% 이상 또는 5% 이상의 빈도로 존재하는 2개 이상의 대립 염기서열이 발생하는 위치일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서, 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 5개 내지 100개, 10개 내지 100개, 10개 내지 80개, 10개 내지 60개, 10개 내지 40개, 10개 내지 20개, 또는 5개 내지 25개의 연속 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.

용어 "프라이머 (primer)"는 중합효소에 의한 뉴클레오티드의 중합반응에서, 개시점으로 작용할 수 있는 단일가닥의 폴리뉴클레오티드를 말한다. 예를 들면, 상기 프라이머는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건, 즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합효소의 존재 하에서 주형-지시(template-directed) DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일가닥의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예를 들어, 온도와 프라이머의 용도에 따라 달라질 수 있다. 상기 프라이머는 길이가 15 내지 30 뉴클레오티드인 것일 수 있다. 예를 들어, 프라이머의 길이가 짧을수록, 낮은 어닐링(annealing) 온도에서 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성할 수 있다. 상기 프라이머의 길이는 약 5 내지 약 100 뉴클레오티드(이하, 'nt'라고 함), 약 10 내지 약 80 nt, 약 10 내지 약 60 nt, 약 10 내지 약 50 nt, 약 10 내지 약 40 nt, 약 10 내지 약 30 nt, 또는 약 10 내지 약 20 nt일 수 있다.

용어 "프로브(probe)"는 표적 핵산에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프로브는 표지 물질에 결합된 것일 수 있다. 상기 프로브는 길이가 약 50 nt 내지 약 400 nt, 약 100 nt 내지 약 350 nt, 약 150 nt 내지 약 300 nt, 또는 약 200 nt 내지 약 250 nt일 수 있다.

상기 서열번호 1의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 5개 내지 100개의 연속 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드는 SNP ID rs4642293의 유전자형을 검출하기 위한 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 rs4642293은 서열번호 1의 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위일 수 있다. 상기 rs4642293은 인간 유전체 hg19에서 4번 염색체 중 180039047번째 위치에 있는 SNP일 수 있다. 상기 rs4642293은 AA, AC, 또는 CC의 유전자형(genotype)을 가질 수 있다. rs4642293의 유전자형이 AA 또는 AC인 경우, 탈모 질환의 위험도가 높아질 것으로 예측될 수 있다.

상기 서열번호 2의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 5개 내지 100개의 연속 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드는 SNP ID rs3003643의 유전자형을 검출하기 위한 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 rs3003643은 서열번호 2의 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위일 수 있다. 상기 rs3003643은 인간 유전체 hg19에서 10번 염색체 중 36901640번째 위치에 있는 SNP일 수 있다. 상기 rs3003643은 GG, GA, 또는 AA의 유전자형을 가질 수 있다. rs3003643의 유전자형이 GG 또는 GA인 경우, 탈모 질환의 위험도가 높아질 것으로 예측될 수 있다.

상기 서열번호 3의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 5개 내지 100개의 연속 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드는 NPVF(Neuropeptide VF precursor, UniProtKB: Q9HCQ7) 유전자, 구체적으로 NPVF 유전자의 유전자 사이(intergenic)에 존재하는 SNP의 유전자형을 분석하기 위한 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 SNP ID rs929255의 유전자형을 검출하기 위한 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 rs929255는 서열번호 3의 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위일 수 있다. 상기 rs929255는 인간 유전체 hg19에서 7번 염색체 중 25272620번째 위치에 있는 SNP일 수 있다. 상기 rs929255는 CC, CT, 또는 TT의 유전자형을 가질 수 있다. rs929255의 유전자형이 CC 또는 CT인 경우, 탈모 질환의 위험도가 높아질 것으로 예측될 수 있다.

상기 서열번호 4의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 5개 내지 100개의 연속 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드는 NPVF(Neuropeptide VF precursor, UniProtKB: Q9HCQ7) 유전자, 구체적으로 NPVF 유전자의 유전자 사이(intergenic)에 존재하는 SNP의 유전자형을 분석하기 위한 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 SNP ID rs7089108의 유전자형을 검출하기 위한 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 rs7089108은 서열번호 3의 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위일 수 있다. 상기 rs7089108은 인간 유전체 hg19에서 10번 염색체 중 91476646번째 위치에 있는 SNP일 수 있다. 상기 rs7089108은 CC, CA, 또는 AA의 유전자형을 가질 수 있다. rs7089108의 유전자형이 CC 또는 CA인 경우, 탈모 질환의 위험도가 높아질 것으로 예측될 수 있다.

상기 조성물은 상기 서열번호 5의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 5개 내지 100개의 연속 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 SNP ID rs6137444의 유전자형을 검출하기 위한 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 상기 rs6137444는 서열번호 5의 핵산 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위일 수 있다. 상기 rs6137444는 인간 유전체 hg19에서 20번 염색체 중 21785639번째 위치에 있는 SNP일 수 있다. 상기 rs6137444는 CC, CT, 또는 TT의 유전자형을 가질 수 있다. rs6137444의 유전자형이 CC 또는 CT인 경우, 탈모 질환의 위험도가 높아질 것으로 예측될 수 있다.

용어 "탈모(hair loss 또는 alopecia)"는 탈모는 정상적으로 모발이 존재해야 할 부위에 모발이 없는 상태를 말하며, 일반적으로 두피의 성모(굵고 검은 머리털)가 빠지는 것을 의미한다. 탈모 질환은 정상적인 범위를 넘어서 머리카락이 빠지는 증상일 수 있다. 상기 탈모는 남성형 탈모(androgenetic alopecia), 여성형 탈모, 원형 탈모증, 휴지기 탈모증, 또는 이들의 조합일 수 있다. 남성형 탈모는 대머리, 안드로겐성 탈모증, 또는 유전성 안드로겐성 탈모증으로도 불릴 수 있다. 남헝형 탈모는 유전과 남성 호르몬인 안드로겐에 의해 모발이 빠지는 것일 수 있다. 여성형 탈모는 빈혈, 에스트로겐의 감소 등에 의해 모발이 빠지는 것일 수 있다. 원형 탈모증은 일반적으로 원형의 모양으로 모발이 갑자기 빠지는 증상으로서, 일종의 자가 면역 질환에 해당한다. 휴지기 탈모증은 원인 자극 발생 후 2 내지 4개월 후부터 탈모가 시작되어 전체적으로 머리 숱이 감소하게 되며 원인 자극이 제거되면 수개월에 걸쳐 휴지기 모발이 정상으로 회복됨에 따라 모발 탈락은 감소하는 것일 수 있다.

다른 양상은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 5개 내지 100개의 연속 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 탈모 질환의 위험도를 예측하기 위한 마이크로어레이를 제공한다.

마이크로어레이(microarray)는 기판 표면의 구분된 영역에 상기 폴리뉴클레오티드가 높은 밀도로 고정화되어 있는 것을 말한다. 상기 마이크로어레이는, 상기 영역이 예를 들면 400개/㎠ 이상, 10³개/㎠ 이상, 또는 10⁴개/㎠ 이상의 밀도로 기판 상에 배열되어 있는 것일 수 있다.

상기 마이크로어레이에 고정된 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드, 천연 뉴클레오티드의 유사체, 천연 뉴클레오티드의 당, 염기 또는 인산 부위가 변형되어 있는 뉴클레오티드, PNA(peptide nucleic acid), 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 검출가능한 표지(예를 들면, Cy3 또는 Cy5 형광성 물질)가 그의 3'-말단, 중간, 또는 5'-말단에 부착된 것일 수 있다.

상기 마이크로어레이에 고정되는 폴리뉴클레오티드는 길이가 약 5 내지 약 100 nt, 약 10 내지 약 80 nt, 약 10 내지 약 60 nt, 약 10 내지 약 50 nt, 약 10 내지 약 40 nt, 약 10 내지 약 30 nt, 또는 약 10 내지 약 20 nt일 수 있다.

상기 마이크로어레이는 서열번호 5의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 5개 내지 100개의 연속 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.

다른 양상은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 5개 내지 100개의 연속 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 탈모 질환의 위험도를 예측하기 위한 키트를 제공한다.

상기 키트는 중합 반응에 필요한 시약, 예를 들면 dNTP, 중합효소 및 발색제 등을 더 포함할 수 있다.

상기 키트는 서열번호 5의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 5개 내지 100개의 연속 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.

다른 양상은 개체로부터 수득된 핵산 시료로부터 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위의 유전자형(genotype)을 검출하는 단계; 및

검출된 유전자형으로부터 개체의 탈모 질환 위험도를 산출하는 단계를 포함하는 탈모 질환의 위험도를 예측하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 개체의 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 개체는 인간을 포함한 포유동물일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 생물로부터 수득된 시료를 말한다. 상기 생물학적 시료는 예를 들면 조직, 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈액, 혈장, 혈청, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계는 통상의 DNA 분리방법에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산을 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR), 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction: LCR), 전사 증폭(transcription amplification), 또는 실시간-핵산 서열 기초 증폭(real time-nucleic acid sequence based amplification: NASBA)을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다.

상기 방법은 개체로부터 수득된 핵산 시료로부터 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위의 유전자형을 검출하는 단계를 포함한다.

상기 유전자형을 검출하는 단계는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 핵산 서열과 동일 또는 상보적인 핵산 서열을 포함하는 프라이머 또는 프로브를 사용하여 수행될 수 있다.

상기 유전자형을 검출하는 단계는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR), 분자 비이콘(molecular beacon), 프라이머 신장법(primer extension) 등으로 수행될 수 있다.

상기 유전자형을 검출하는 단계는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 5개 이상의 연속 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드가 고정된 마이크로어레이에 상기 핵산 시료를 혼성화시키는 단계; 및 혼성화 결과를 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

상기 방법은 상기 핵산 시료로부터 서열번호 5의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위의 유전자형을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 방법은 상기 다형성 부위의 유전자형에 유전자형 점수를 부여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 유전자형 점수는 1 내지 3의 정수일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위에 대하여 유전자형 AA, AC, 및 CC에 각각 α₁, α₂, 및 α₃의 값을 부여할 수 있다. 상기 α₁, α₂, 및 α₃의 값은 1 내지 3의 정수일 수 있다. 예를 들어, 유전자형 AA의 점수는 3이고, 유전자형 AC의 점수는 2이고, 및 유전자형 CC의 점수는 1이다.

상기 방법은 분석된 유전자형으로부터 개체의 탈모 질환 위험도를 산출하는 단계를 포함한다.

개체의 탈모 질환 위험도를 산출하는 단계는 하기 수학식에 의해 탈모 질환 위험도를 산출할 수 있다:

탈모 질환 위험도 = b + ∑(유전자형 점수 * a).

상기 수학식에서, 상기 유전자형 점수는 개체에서 분석된 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위의 유전자형에 부여된 점수이다. 상기 유전자형 점수는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 다형성의 유전자형이 따라 부여된 α₁, α₂, 및 α₃의 값 중 어느 하나일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위에 대하여 유전자형 AA, AC, 및 CC 대하여 부여된 값일 수 있다. 예를 들어, 개체의 서열번호 1에 대한 유전자형이 AA인 경우, 상기 유전자형 점수는 α₁의 값 3이다.

상기 a는 로지스틱 회귀분석 모델에서 탈모 질환 환자군와 탈모 질환이 없는 대조군 간의 유전자형을 분석하여 산출된 상수일 수 있다. 상기 대조군은 남성형 탈모 및/또는 원형 탈모증으로 진단되지 않은 대조군일 수 있다. 상기 대조군은 원형 탈모증을 포함한 대조군일 수 있다. 상기 a는 로지스틱 회귀분석 모델에서 산출된 효과 크기(effect size) 값일 수 있다. 상기 a는 약 0.001 내지 약 1.5, 약 0.01 내지 약 1.4, 약 0.1 내지 약 1.3, 약 0.2 내지 약 1.3, 약 0.3 내지 약 1.3, 약 0.4 내지 약 1.3, 약 0.5 내지 약 1.3의 값일 수 있다.

상기 b는 로지스틱 회귀분석 모델에서 탈모 질환 환자군와 탈모 질환이 없는 대조군 간의 유전자형을 분석하여 산출된 상수일 수 있다. 상기 b는 로지스틱 회귀분석 모델에서 산출된 희귀계수 (또는 y 절편) 값일 수 있다. 상기 b는 약 -1.5 내지 약 1.5, 약 -1.0 내지 약 1.0, 약 -0.5 내지 약 0.5, 약 -0.4 내지 약 0.4, 약 -0.3 내지 약 0.3, 약 -0.2 내지 약 0.2, 약 -0.1 내지 약 0.1, 또는 약 0의 값일 수 있다.

상기 방법은 산출된 탈모 질환 위험도에 따라 개체의 탈모 질환의 위험도를 양호 및 위험 중 어느 한 등급으로 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 산출된 탈모 질환 위험도가 약 6 미만인 경우, 개체의 탈모 질환의 위험도를 양호 등급으로 결정할 수 있다. 산출된 탈모 질환 위험도가 약 6 이상인 경우, 개체의 탈모 질환의 위험도를 위험 등급으로 결정할 수 있다.

일 양상에 따른 프라이머, 마이크로어레이, 키트, 및 이를 이용하여 개체의 탈모 질환, 예를 들어 남성형 탈모의 위험도를 예측하는 방법, 또는 탈모 질환의 위험도 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여 개체의 SNP를 분석하는 방법에 의하면, 개체의 탈모 질환의 위험도를 정확하고 간편하게 결정할 수 있다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 탈모 질환의 위험도 평가

1. 핵산 시료의 준비

탈모의 BASP(Basic and specific) 분류법에 따라 남성형 탈모로 진단된 환자군(275명), 및 40세 이상으로서 남성형 탈모의 가족력이 없고 탈모가 없는 것으로 진단된 대조군(219명)으로부터 각 대상자의 혈액을 수득하였다(단국대 병원 제공).

환자군과 대조군의 시료 갯수 및 평균 연령을 하기 표 1에 나타내었다.

분류	환자군	대조군 1	대조군 2
시료의 갯수(개)	275	134	219
연령 (평균 ± SD; 년)	45.33 ± 15.57	53.90 ± 12.27	48.18 ± 14.69

(환자군: 탈모 환자군, 대조군 1: 남성형 탈모 및/또는 원형 탈모증으로 진단되지 않은 대조군, 대조군 2: 원형 탈모증을 포함한 대조군)

대상자의 수득된 혈액으로부터 Exgene™ Blood Kit(GeneAll, Seoul, Korea)를 사용하여 유전체(genomic) DNA를 분리하였다. 분리된 DNA는 사용 전까지 -20℃에서 보관하였다.

2. 단일 염기 다형성의 검출

1.에서 준비된 유전체 DNA는 증폭하고, 무작위적으로 25 내지 125 bp의 단편으로 분획한 다음, 정제 및 재현탁하고, Axiom Genome-Wide Human Array 플레이트(Affymetrix)에 혼성화시킨 후, 플레이트를 세척하였다.

Axiom Precision Medicine Research Array(Affymetrix)를 이용하여 총 902,527개의 SNP를 분석하였다. Axiom Precision Medicine Research Array는 GWAS(Genome-wide association study) 마커에 대해 0.90 내지 0.94의 대치법 정확도로 MAF(minor allele frequencies) >1% 내지 >5%인 5개 주요 집단에서 유전체 전체 커버리지(genome-wide coverage)를 제공한다.

뱃치(batch) 효과에 대한 잠재적인 문제와 거짓 연관성을 줄이기 위해, 환자와 대조군 데이터세트에서 사용하기 위해 SNP 선별하는데 엄격한 품질 관리를 수행하였다. 연관 분석을 수행하기 전에, 902K SNP 각각에 대해 품질 관리 절차를 수행하였다. SNP 세트는 유전자형 콜(call) 비율 (≥ 0.98) 및 MAF (≥ 0.01)를 기준으로 필터링하였다. 하디-바인베르그 평형(Hardy-Weinberg equilibrium: HWE)은 정확한 SNP를 사용하여 개별 SNP에 대해 계산하였다. 모든 SNP는 HWE p 값> 0.05를 나타냈다. 필터링 후, 1번 내지 22번 염색체에서 450,287 개의 다형성 SNP를 분석하고, 염색체 X와 Y 각각에 대해 6,416개 및 816개 SNP를 분석하였다.

494 개체에 대한 450,287개의 SNP를 포함하는 남성형 탈모 유전자형 데이터 세트를 1000 Genome East Asian 패널(phase 3)의 유전체형과 병합시켰고, 남성형 탈모 데이터세트의 유전자형은 소프트웨어 MINIMAC3을 사용하여 대치시켰다. 1000 Genomes Project (www.1000genomes.org) 유래 2,504 개 샘플의 단계별 데이터를 참조 데이터세트로 사용하였다. 또한, 대치법 서비스 도구 중에서 가장 높은 성능을 보이는 MINIMAC3을 이용하였고, 단계화 단계에서 SHAPEIT2를 사용하였다. 정보 R²> 0.8 및 MAF≥1% 이상인 SNP를 선별하였다. 최종 GWAS 분석은 7,229,558개의 SNP를 포함하였다.

환자-대조군 분석에는 PLINK 1.9 프로그램(www.cog-genomics.org/plink2)을 이용하였다. 환자-대조군 분석을 통해 남성형 탈모에 유의한 상관성(P < 0.00001)을 갖는 것으로 확인된 SNP를 선별하였다. 일반적이고 위험도가 높은 SNP를 선별하기 위해, MAF < 0.05이고, 한국인 참조 유전체와의 대립유전자 빈도 차이가 > 0.04인 경우에는 배제하였다.

대조군 1(남성형 탈모 및/또는 원형탈모증로 진단되지 않은 대조군)와 비교하여 환자군에서 유의한 상관성이 있는 10개의 SNP를 표 2에 나타내고, 대조군 2(원형탈모증을 포함한 대조군)와 비교하여 환자군에서 유의한 상관성이 있는 9개의 SNP를 표 3에 나타내었다(CHR: 염색체 번호, BP: 염색체 중 위치, EAF: 효과 대립유전자 빈도(effector allele frequency), E: 효과 대립유전자(effector allele), O: 기타 대립유전자(Other allele), OR: 승산비(odd ratio), CI: 신뢰구간(confidence interval)).

표 2 및 표 3에 나타난 바와 같이, 남성형 탈모와 유의한 상관성을 갖는 총 19개의 SNP를 확인하였다. 표 2에서, 2개의 SNP(rs4642293 및 rs3003643)가 남성형 탈모 위험성이 증가하였다(각각 OR = 2.39. 95% C.I. = 1.64 내지 3.47; 및 OR = 3.40, 95% C.I. = 2.04 내지 5.68). 또한, 표 3에서, 2개의 SNP(rs929255 및 rs7089108)가 남성형 탈모 위험성이 증가하였다(각각 OR = 2.03, 95% C.I. = 1.48 내지 2.77; 및 OR = 2.09, 95% C.I. = 1.53 내지 2.85).

3. 남성형 탈모 위험도 평가를 위한 유전자 위험도 점수 산출

남성형 탈모 위험도 평가를 위해, 유전자 위험도 점수(genetic risk score: GRS)는 5개의 SNP(rs4642293, rs929255, rs3003643, rs7089108, 및 rs6137444)를 이용하여 다중 로지스틱 회귀분석으로 산출하였다.

식 1 : 대조군 1에 대한 위험도 = 0.962 x rs4642293 + 0.586 x rs929255 + 1.262 x rs3003643 + 0.726 x rs7089108 + 0.734 x rs6137444

식 2 : 대조군 2에 대한 위험도 = 0.537 x rs4642293 + 0.675 x rs929255 + 0.831 x rs3003643 + 0.804 x rs7089108 + 0.647 x rs6137444

5개의 SNP에 대해 SNP 유전자형에 따라 0, 1 또는 2의 점수를 부여하였다. 각각의 유전자형이 비위험/비위험(non-risk/non-risk)인 경우 1점을 부여하고, 비위험/위험(non-risk/risk)인 경우 2점을 부여하고, 위험/위험(risk/risk)인 경우 3점을 부여하였다. GRS 분포를 표 4에 나타내었다.

위험 등급	점수	대조군	환자군	환자군의 비율
*대조군 1 대비*
4	4 이상 5 미만	9	2	0.18
5	5 이상 6 미만	40	33	0.45
6	6 이상 7 미만	38	72	0.65
7	7 이상 8 미만	23	73	0.76
8	8 이상 9 미만	4	57	0.93
9	9 이상 10 미만	1	19	0.95
10	10 이상	0	5	1.00

*대조군 2 대비*
3	3 이상 4 미만	7	0	0.00
4	4 이상 5 미만	85	39	0.31
5	5 이상 6 미만	72	73	0.50
6	6 이상 7 미만	42	116	0.73
7	7 이상 8 미만	7	40	0.85
8	8 이상	0	6	1.00

표 4에 나타난 바와 같이, GRS 6 내지 10인 환자군이 대조군에 비해 더 높은 비율을 나타내었고, GRS 6은 대조군 1에 대해 가장 높은 예측 정확도 73.1%(민감도 86.6%, 특이도 42.6%)를 보였고, 대조군 2에 대해 예측 정확도 67.1%(민감도 85.8%, 특이도 43.2%)를 보였다.

따라서, 특정 유전자 SNP를 로지스틱 회귀분석 모델을 통해 남성형 탈모 위험도를 판별함으로써, 개인에 대하여 보다 정확한 남성형 탈모 위험도에 대한 정보를 제공할 수 있음을 확인하였다.

<110> Theragen Etex Co., Ltd. <120> Composition, microarray, and kits for predicting risk of alopecia, and method using the same <130> GN-124793-KR <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs4642293 <220> <221> variation <222> (51) <223> single nucleotide polymorphism [A/C] <400> 1 ctcactctgt cacccaggct ggagtgcagt ggcatgattt tggctcactg aaacctctgc 60 ctcctgggtt ggagcaattc tcctgcctca gcctcccgag t 101 <210> 2 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs3003643 <220> <221> variation <222> (51) <223> single nucleotide polymorphism [G/A] <400> 2 gagctcttca ggctgttcat gagtcaaaaa agccaacaaa cagctgtgat gggctcattt 60 ctttctttct tttttaattt ttttttggag atggagtctc g 101 <210> 3 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs929255 <220> <221> variation <222> (51) <223> single nucleotide polymorphism [C/T] <400> 3 ttatgggaaa taggagttaa aactgaagtt gtttagttat ttttccccag cgttggccta 60 ggtttgtggc ttgtcgtgaa atcacaatgt cttaacatta t 101 <210> 4 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs7089108 <220> <221> variation <222> (51) <223> single nucleotide polymorphism [A/C] <400> 4 tctgggtctt tctcacttat cccctgaata ctatataaat atactcagtg agggtataat 60 ctcaaggggt taaggaagga agttttgatg ggattggggg a 101 <210> 5 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs6137444 <220> <221> variation <222> (51) <223> single nucleotide polymorphism [C/T] <400> 5 gagacattct gcagggaagc agaaacaaca taattgccta taaaaacatc ctttaaaaag 60 ttagcagtct aatccataaa aatgaatttt ggcaggtgca a 101

Claims

서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 5개 내지 100개의 연속 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 탈모 질환의 위험도를 예측하기 위한 조성물.
청구항 1에 있어서, 서열번호 5의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 5개 내지 100개의 연속 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 탈모 질환은 남성형 탈모(androgenetic alopecia), 여성형 탈모, 원형 탈모증, 휴지기 탈모증, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 5개 내지 100개의 연속 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 탈모 질환의 위험도를 예측하기 위한 마이크로어레이.
서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 5개 내지 100개의 연속 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 탈모 질환의 위험도를 예측하기 위한 키트.
개체로부터 수득된 핵산 시료로부터 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위의 유전자형(genotype)을 검출하는 단계; 및
검출된 유전자형으로부터 개체의 탈모 질환 위험도를 산출하는 단계를 포함하는 탈모 질환의 위험도를 예측하는 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 유전자형을 검출하는 단계는
서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 핵산 서열과 동일 또는 상보적인 핵산 서열을 포함하는 프라이머 또는 프로브를 사용하여 수행되는 것인 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 유전자형을 검출하는 단계는
서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 5개 이상의 연속 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드가 고정된 마이크로어레이에 상기 핵산 시료를 혼성화시키는 단계; 및
혼성화 결과를 분석하는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 방법은 상기 핵산 시료로부터 서열번호 5의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 그의 5'-말단으로부터 51번째 뉴클레오티드의 다형성 부위의 유전자형을 검출하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 다형성 부위의 유전자형에 유전자형 점수를 부여하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 유전자형 점수는 1 내지 3의 정수인 것인 방법.
청구항 6에 있어서,
개체의 탈모 질환 위험도를 산출하는 단계는 하기 수학식에 의해 탈모 질환 위험도를 산출하는 것인 방법:
탈모 질환 위험도 = b + ∑(유전자형 점수 * a)
상기 수학식에서,
상기 유전자형 점수는 개체에서 분석된 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위의 유전자형에 부여된 점수로서,
서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 다형성의 유전자형에 따라 부여된 유전자형 점수이고,
상기 a는 0.001 내지 1.5의 값이고, 및
상기 b는 -1.5 내지 1.5의 값이다.
청구항 12에 있어서, 산출된 탈모 질환 위험도에 따라 개체의 탈모 질환의 위험도를 양호 등급 또는 위험 등급으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.