KR101881817B1

KR101881817B1 - 운동 반응도 예측용 바이오마커

Info

Publication number: KR101881817B1
Application number: KR1020180050669A
Authority: KR
Inventors: 김양석; 유진호; 김수환; 안유리
Original assignee: 주식회사 대웅제약; 주식회사 바이오에이지
Priority date: 2018-05-02
Filing date: 2018-05-02
Publication date: 2018-07-25

Abstract

본 발명은 바이오마커로서 유산소 운동 반응도를 예측할 수 있는 단일 염기 다형성 마커; 상기 마커를 이용하여 유산소 운동 반응도를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법; 상기 마커에 대한 프로브 또는 프라이머를 포함하는 유산소 운동 반응도 예측용 조성물; 및 상기 마커에 대한 프로브 또는 프라이머를 포함하는 유산소 운동 반응도 예측용 키트를 제공한다. 본 발명은 또한, 바이오마커로서 무산소 운동 반응도를 예측할 수 있는 단일 염기 다형성 마커; 상기 마커를 이용하여 무산소 운동 반응도를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법; 상기 마커에 대한 프로브 또는 프라이머를 포함하는 무산소 운동 반응도 예측용 조성물; 및 상기 마커에 대한 프로브 또는 프라이머를 포함하는 무산소 운동 반응도 예측용 키트를 제공한다. 본 발명에 따르면 개체의 유/무산소 운동 반응도를 예측할 수 있어, 운동 시작 전 또는 운동 중에 개체의 특성에 적합한 운동 프로그램을 제시할 수 있다.

Description

운동 반응도 예측용 바이오마커 {Biomarker for predicting of training response}

본 발명은 바이오마커로서 유산소 운동 반응도를 예측할 수 있는 단일 염기 다형성 마커; 상기 마커를 이용하여 유산소 운동 반응도를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법; 상기 마커에 대한 프로브 또는 프라이머를 포함하는 유산소 운동 반응도 예측용 조성물; 및 상기 마커에 대한 프로브 또는 프라이머를 포함하는 유산소 운동 반응도 예측용 키트에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 바이오마커로서 무산소 운동 반응도를 예측할 수 있는 단일 염기 다형성 마커; 상기 마커를 이용하여 무산소 운동 반응도를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법; 상기 마커에 대한 프로브 또는 프라이머를 포함하는 무산소 운동 반응도 예측용 조성물; 및 상기 마커에 대한 프로브 또는 프라이머를 포함하는 무산소 운동 반응도 예측용 키트에 관한 것이다.

과학의 발달과 컴퓨터의 보급 등으로 현대인의 신체활동이 감소되어, 현대인은 운동부족에 시달리게 되었다. 운동부족은 체력저하뿐만 아니라, 면역력 저하를 일으키며, 고혈압, 당뇨, 비만 심장병, 고지혈증 등 모든 성인병의 중요한 위험요인이 되는 것으로 알려져 있다. 이에, 건강의 유지 및 증진을 위하여 운동의 중요성이 강조되기 시작하였고, 실제로 많은 현대인들이 체력 보강 등을 위하여 운동의 필요성을 느끼고 있다. 건강 증진뿐만 아니라, 아름다운 신체를 가꾸기 위해서도 운동이 중요시되고 있다. 실제로 체중 감량을 위하여 운동을 찾는 사람들이 증가하는 추세에 있다.

이러한 운동의 효과는 일정 기간 이상 꾸준히 운동을 수행함으로써 얻을 수 있는 것이기 때문에, 현대인들은 운동에 많은 시간과 비용을 투자하고 있다.

한편, 동일한 시간과 노력을 투자하는 경우에도, 운동자의 신체 특성에 따라 운동 효과가 달라질 수 있다. 따라서, 효과적인 운동 효과를 얻기 위해서, 각 운동자의 신체 특성에 따른 운동 반응도의 예측의 필요성이 대두되고 있다.

국제 공개 특허 제 2010-028256호는 이러한 최대 산소 섭취량으로 표현되는 운동 반응도를 예측하기 위한 바이오마커를 개시하고 있다.

WO

2010-028256

A

본 발명의 목적은 유/무산소 운동에 대한 운동 반응도를 효과적으로 예측할 수 있는 단일 염기 다형성 마커를 제공하기 위한 것이다.

본 발명자들은 개인의 유전적 특성에 따른 운동 효과를 사전에 예측할 수 있다면, 시간 및 비용 효율적으로 우수한 운동 효과를 달성할 수 있는 개인 맞춤형 운동 프로그램을 제시할 수 있으리라 가정하고 이를 연구한 결과, 유/무산소 운동 반응도와 유의적 상관관계를 갖는 특정 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism) 마커를 발굴하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 유/무산소 운동에 있어서, 운동 반응도를 예측할 수 있는 단일 염기 다형성 마커의 용도를 제공한다.

본 발명은 유/무산소 운동에 있어서, 운동 반응도를 예측할 수 있는 단일 염기 다형성 마커들 중에서 선택되는 하나 이상의 단일 염기 다형성 마커를 포함하는 운동 반응도 예측용 마커, 상기 마커를 이용하여 운동 반응도를 예측하는 방법, 상기 마커를 이용하여 운동 반응도를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법 및 상기 마커에 대한 프로브 또는 프라이머를 포함하는 유/무산소 운동 반응도 예측용 조성물, 및 상기 마커에 대한 프로브 또는 프라이머를 포함하는 유/무산소 운동 반응도 예측용 키트를 제공한다.

I. 유산소 운동 반응도 예측 방법

구체적으로, 본 발명은 개체로부터 분리한 핵산 시료로부터 본 발명의 단일 염기 다형성 마커들로부터 선택되는 하나 이상의 단일 염기 다형성 마커의 다형성 부위의 염기를 확인하는 것을 포함하는, 개체의 유산소 운동 반응도를 예측하기 위하여 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 개체로부터 분리한 핵산 시료로부터 본 발명의 단일 염기 다형성 마커들로부터 선택되는 하나 이상의 단일 염기 다형성 마커의 다형성 부위의 염기를 확인하는 것을 포함하는, 개체의 무산소 운동 반응도를 예측하기 위하여 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상적인 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

용어 '다형성(polymorphism)'은 엑손 및 인트론을 포함하는 핵산 또는 그 일부에 하나 이상의 형태가 공존하는 것을 일컫는다. '단일 염기 다형성(Single Nucleotide Polymorphism)' 또는 'SNP'는 유전자의 특정한 위치에서 두 가지 이상의 단일 염기가 존재는 경우를 말한다. 대부분의 SNP는 두 개의 대립유전자를 갖는다. 상기 다형성의 하나의 대립유전자에 대해, 2개의 동일한 대립유전자를 가지면 대립유전자에 대해 동형접합성(SNP 위치에서 동일한 염기를 가짐)이라고 하고, 2개의 상이한 대립유전자를 가지면 대립유전자에 대해 이형접합성(SNP 위치에서 상이한 염기를 가짐)이라고 한다. 바람직한 SNP는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 10% 또는 20% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다. 본 발명에서, SNP 명명은 rs ID 로 나타낸다. rs ID는 NCBI(the National Center for Biotechnological Information)에서 각각의 독특한 SNP에 부여한 공식적인 SNP(Reference SNP, rs) ID를 의미한다.

용어 '대립유전자(allele)'는 유전자 또는 그 일부와 관련된 인트론, 엑손, 인트론/엑손 접합(junction) 및 3' 및/또는 5' 비번역 영역을 포함하는 유전자의 대안적인 형태를 일컫는다. 일반적으로 대립유전자는 상동 염색체 상의 동일한 유전자 좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 특정 유전자의 대립유전자는 서로 단일 뉴클레오티드 또는 몇 개의 뉴클레오티드가 다를 수 있고 뉴클레오티드의 치환, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다.

용어 '마커(marker)', '다형성 마커' 또는 '단일 염기 다형성 마커'는 유전자의 다형성 부위(genomic polymorphic site)를 의미한다. 각 다형성 마커는 다형성 부위에서 특정한 대립유전자에 특징적인 두 개 이상의 서열 변이를 갖는다.

본 명세서에서, 서열목록은 대한민국 특허청 고시 제2013-01호 [핵산염기 서열목록 또는 아미노산 서열목록 작성 기준]에 따라 작성되었다. 핵산 서열에서, 기호 r은 g(guanine) 또는 a(adenine)를 나타내고, 기호 y는 t(thymine)/u(uracil) 또는 c(cytosine)를 나타낸다. 기호 m은 a 또는 c를 나타내고, k는 g 또는 t/u를 나타낸다. 기호 s는 g 또는 c를 나타내고, 기호 w는 a 또는 t/u를 나타낸다.

본 명세서에서, 용어 '유산소 운동(aerobic exercise)'은 비교적 낮은 강도로 지속하여 근육에 산소가 공급되도록 하는 운동을 의미한다. 유산소 운동의 예로는 걷기, 조깅, 에어로빅, 줄넘기, 수영, 자전거, 등산 등을 포함한다. '무산소 운동(anaerobic exercise)'은 산소가 충분하지 않거나 없는 상태에서 이루어져 젖산 형성을 촉발하기에 충분한 강도의 운동을 의미한다. 무산소 운동의 예로는, 팔굽혀펴기, 역도, 스쿼트 등을 포함한다.

용어 '운동 반응도(training response)'는 운동에 대한 반응과 관련된 생체의 능력을 말하는 것으로, 생체가 운동에 대하여 보이는 반응성, 즉 운동 민감도(training sensitivity)를 의미한다. 예를 들어, 운동 반응도가 높은 경우, 최대 산소 섭취량이나 근력 증가량 등 운동에 반응하여 일어나는 생체의 변화 수준이 높고, 이와 반대로 운동 반응도가 낮은 경우에는 운동에 반응하여 일어나는 생체의 변화 수준이 낮게 된다. '유산소 운동 반응도'란 유산소 운동에 대한 운동 반응도로, 이에 제한되는 것은 아니나, 유산소 능력 및/또는 최대 산소 섭취량으로 표현될 수 있다. '무산소 운동 반응도'란 무산소 운동에 대한 운동 반응도로, 이에 제한되는 것은 아니나, 무산소 능력 및/또는 근력 증가량으로 표현될 수 있다.

'유산소 능력(aerobic capacity)'은 에너지 전환 과정 중에서 유산소적으로 이루어지는 과정의 에너지 전환 능력을 의미하며, 호흡, 순환, 혈액 등의 산소 운반 능력이나 조직의 산소 이용과 관련되며, 전신 지구력과 밀접한 관계가 있다. 유산소 능력의 저하는 피로감, 허혈성 심장 질환 등을 야기할 수 있다. 유산소 능력은 유산소 운동을 통하여 기를 수 있으며, 일반적으로 최대 산소 섭취량으로 평가될 수 있다. '최대 산소 섭취량(maximal oxygen consumption; maximal oxygen uptake; V'O2max)'은 운동 중에 측정되는 단위 시간 내의 최대 산소 소비량을 의미한다. 최대 산소 섭취량은 유산소 능력 또는 심폐지구력을 판정하는 지표로 이용된다. 또한, '최대 산소 섭취량의 증가량'은 개체가 운동을 하기 전과 대비하여 소정의 운동기간 동안 운동한 후에 증가된 최대 산소 섭취량의 변화율(%)를 의미한다.

'무산소 능력(anaerobic capacity)'은 유산소 능력과 대비되는 개념으로, 산소를 이용하지 않고 무산소적으로 이루어지는 과정의 에너지 전환 능력을 의미한다. 무산소 능력은 무산소 운동을 통하여 기를 수 있으며, 근력 증가량으로 평가될 수 있다. '근력 증가량'은 근육 수축에 의하여 생기는 근육의 힘(근력)의 증가량을 의미하고, 피크 토크로 표시될 수 있다. 토크(torque)는 물체를 회전시키는 힘을 의미하고, '피크 토크(peak torque)'는 최대 토크 값을 의미한다. 또한, '피크 토크의 증가량'은 개체가 운동을 하기 전과 대비하여 소정의 운동기간 동안 운동한 후에 증가된 피크 토크의 변화율(%)를 의미한다.

용어 '개체'는 유/무산소 운동의 운동 반응도를 예측하기 위한 피험자를 의미하며, '핵산 시료(nucleic acid sample)'는 개체로부터 수득된 핵산(DNA 또는 RNA)을 포함하는 시료를 의미한다. 핵산 시료는, 개체로부터 채취한 혈액, 뇨, 머리카락, 양수액, 뇌척수액; 또는 피부, 근육, 구강 점막 또는 결막 점막; 태반, 위장관 또는 기타 기관으로부터의 조직 시료 등과 같은, 핵산을 포함하는 임의의 공급원(source)으로부터 수득될 수 있다. 개체로부터 핵산 시료를 수득하는 방법은 당업계에서 잘 알려져 있고, 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있다.

개체로부터 분리한 핵산 시료로부터, 단일 염기 다형성 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 단일 염기 다형성 마커를 검출할 수 있는 프로브와 혼성화하여 다형성 부위의 염기를 확인할 수 있다.

예를 들어, PCR, 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭(transcription amplification), 자가유지 서열 복제 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA)을 이용하여 다형성 부위를 증폭할 수 있다.

다형성 부위의 염기의 확인은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, SSCP, PCR-RFLP 분석, TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ 및 SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadChip (Illumina의 HumanOmni2.5-8) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, SNP 칩을 이용하여 다형성 부위의 염기를 확인할 수 있다. SNP 칩은 수십만개의 SNP의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다.

TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티드들의 유전체형을 결정하는 단계를 포함한다.

시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 SNP가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 SNP가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 SNP 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보결합할 수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.

PCR 연장 분석은 먼저 단일염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 SNP 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 SNP가 위치하는 염기의 5' 방향에 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 SNP를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 SNP를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.

이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 SNP를 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 SNP를 검출할 수 있다.

표1에 나타낸 단일 염기 다형성 마커는 유산소 운동에 있어서, 유산소 운동 반응군과 무반응군, 및 반응 강도에 따라, 유산소 운동 반응군을, 유산소 운동 보통 반응군과 유산소 운동 고반응군으로 분류할 수 있는 마커들이다.

[표 1]

구체적으로, 유산소 운동 반응도를 판별할 수 있는 단일 염기 다형성 마커는,

인간 12번 염색체의 rs11051548; 인간 18번 염색체의 rs2542729; 인간 2번 염색체의 rs1451462; 인간 2번 염색체의 rs11096663; 인간 6번 염색체의 rs6570913; 인간 3번 염색체의 rs13060995; 인간 2번 염색체의 rs12613181; 인간 6번 염색체의 rs1626492; 인간 12번 염색체의 rs2417760; 인간 5번 염색체의 rs10072122; 및 인간 2번 염색체의 rs1056233 로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

상기에서,

인간 12번 염색체의 rs11051548가 A;

인간 18번 염색체의 rs2542729가 C;

인간 2번 염색체의 rs1451462가 C;

인간 2번 염색체의 rs11096663가 G;

인간 6번 염색체의 rs6570913가 G;

인간 3번 염색체의 rs13060995가 G;

인간 2번 염색체의 rs12613181가 C;

인간 6번 염색체의 rs1626492가 G;

인간 12번 염색체의 rs2417760가 A;

인간 5번 염색체의 rs10072122가 G; 또는

인간 2번 염색체의 rs1056233가 C인 경우,

대립 유전자 상에 다른 염기를 갖는 경우와 비교할 때, 상기 염기는 유산소 운동 반응도가 높은 지표를 나타낸다.

앞서 설명한 바와 같이, 상기 유산소 운동 반응도는 최대 산소 섭취량으로 표현될 수 있다.

따라서, 본 발명은

개체로부터 분리한 핵산 시료로부터, 하기의 단일 염기 다형성 마커의 다형성 부위의 염기를 확인하는 것을 포함하는, 개체의 유산소 운동 반응도를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:

상기 단일 염기 다형성 마커는,

인간 12번 염색체의 rs11051548; 인간 18번 염색체의 rs2542729; 인간 2번 염색체의 rs1451462; 인간 2번 염색체의 rs11096663; 인간 6번 염색체의 rs6570913; 인간 3번 염색체의 rs13060995; 인간 2번 염색체의 rs12613181; 인간 6번 염색체의 rs1626492; 인간 12번 염색체의 rs2417760; 인간 5번 염색체의 rs10072122; 및 인간 2번 염색체의 rs1056233 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이며,

상기에서,

인간 12번 염색체의 rs2542729가 A;

인간 18번 염색체의 rs2542729가 C;

인간 2번 염색체의 rs1451462가 C;

인간 2번 염색체의 rs11096663가 G;

인간 6번 염색체의 rs6570913가 G;

인간 3번 염색체의 rs13060995가 G;

인간 2번 염색체의 rs12613181가 C;

인간 6번 염색체의 rs1626492가 G;

인간 12번 염색체의 rs2417760가 A;

인간 5번 염색체의 rs10072122가 G; 또는

인간 2번 염색체의 rs1056233가 C인 경우, 유산소 운동 반응도가 높은 지표이고,

상기 유산소 운동 반응도는 최대 산소 섭취량으로 표현된다.

상기의 단일 염기 다형성 마커는 하나를 사용할 수도 있고, 마커들 중에서 1종 이상을 조합하여 사용할 수 있으며, 마커 모두를 조합하여 사용할 수도 있다. 조합하는 마커의 수가 증가할수록, 운동 반응도 예측의 판별력이 향상될 수 있다.

한 구체예에서, 상기의 유산소 운동 반응도 예측을 위한 단일 염기 다형성 마커를 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 모두를 조합하여 사용할 수 있다.

예를 들어, 유산소 운동 반응도 실험에서, 무반응군과 보통 반응군, 고반응군을 판별할 수 있는 다형성 마커 11개 중에서, 각각의 마커의 판별력은 최대 53%였으나, 11개를 모두 사용한 경우에는 약 91% 의 판별력을 얻을 수 있었다. 무산소 운동 반응도 실험에서도 결과는 유사하였다. 무산소 운동 반응도 실험에서, 무반응군과 보통 반응군, 고반응군을 판별할 수 있는 다형성 마커 8개 중에서, 각각의 마커의 판별력은 최대 54% 였으나, 8개를 모두 사용한 경우에는 약 82%의 판별력을 얻을 수 있었다.

본 발명의 한 구체예에서, 개체의 유산소 운동 반응도는 유산소 운동 무반응군, 유산소 운동 보통 반응군 또는 유산소 운동 고반응군으로 분류하여 나타낼 수 있다.

하기 실시예에서 기술하는 바와 같이, 본 발명의 개체의 유산소 운동 반응도를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법은 임상 실험을 통해 얻어진 유산소 운동 반응도 예측 모델에 근거하여 유산소 운동 반응도를 예측할 수 있는 단일 염기 다형성 마커를 선별해 낸 것에 근거한 것이다.

'유산소 운동 반응도 예측 모델'은 개인에서 관측되는 단일 염기 다형성의 차이에 따라 최대 산소 섭취량 증가 수준을 예측할 수 있는 수학적 모델을 의미한다.

'유산소 운동 반응도 예측 모델'은 도 1과 같은 예측 모델 구성 주요 SNP 추출 프로세스에 따라 구축된 것으로 실시예에 상세히 설명되어 있다.

미리 구축된 '유산소 운동 반응도 예측 모델'을 통해 개체의 유산소 운동 반응도를 예측하는 방법은 유산소 운동 반응도 예측 마커로 결정된 각 SNP의 유전자형에 대해 점수를 매기는 것으로부터 시작된다.

각 SNP의 유전체형은 2가지 대립 유전자의 조합으로 구성되므로, SNP당 3 종류의 유전체형이 존재한다. '유산소 운동 반응도 예측 모델'을 통해 유산소 운동 반응도가 낮게 나온 대립유전자를 A, 유산소 운동 반응도가 높게 나온 대립유전자를 B라고 정한 후, 예를 들어, 유산소 운동 반응도가 낮게 나온 대립유전자의 동형접합성인 경우(AA 유전체형)를 0점, 이형접합성인 경우(AB 유전체형)를 1점, 유산소 운동 반응도가 높게 나온 대립유전자의 동형접합성인 경우(BB 유전체형)를 2점으로 하여 점수를 매길 수 있다.

각 SNP마다 유산소 운동 반응도에 미치는 영향력이 동일한 경우, 각 개체의 유전체형 점수의 합(X)은 하기 [수학식 1]에 따라 구할 수 있다.

[수학식 1]

만일 각 SNP마다 유산소 운동 반응도에 미치는 영향력이 다른 경우, 각 개체의 유전체형 점수의 합(X)은 하기 [수학식 2]에 따라 구할 수 있다.

[수학식 2]

상기 수학식 1 및 2에서,

X는 개체에서 계산된 유전체형 점수 합계로서 0≤X≤2n 또는 0≤X≤2이고,

G_j는 개체의 j 번째 SNP 에서 관찰된 유전체형 점수 ∈ {0, 1, 2}이며,

W_j는 j번째 SNP 의 가중치를 나타내며,

n은 예측모델을 구성하는 SNP의 수를 나타낸다.

W_j는 multiple linear repression에서 계산된 각 SNP의 semi R2 사용이 기본이며, 만일 모든 SNP의 가중치가 동일하다면 W_j는 1이다.

[수학식 1] 또는 [수학식 2]에 따라 얻어진 각 개체의 유전체형 점수의 합(X)이 유산소 운동 반응도 예측 모델을 통해 미리 설정된 컷오프 구간 중 어디에 속하는지에 따라 개체가 유산소 운동 무반응군, 유산소 운동 보통 반응군, 유산소 운동 고반응군에 속하는 것으로 결정할 수 있다.

예를 들어, C0 및 C1이 각각 유산소 운동 반응도 예측 모델을 통해 미리 설정된 유산소 운동 유반응군과 유산소 운동 무반응군을 판별하기 위한 컷오프 값과 유산소 운동 보통 반응군과 유산소 운동 고반응군을 판별하기 위한 컷오프 값을 나타낸다고 할 때,

X≤C0인 경우 유산소 운동 무반응군,

C0<X<C1인 경우 유산소 운동 보통 반응군,

X≥C1인 경우 유산소 운동 고반응군에 속하는 것으로 결정할 수 있을 것이다.

개체의 유산소 운동 반응도를 유산소 운동 무반응군, 유산소 운동 보통 반응군 또는 유산소 운동 고반응군으로 분류하는 또 다른 방법으로는

상기 [수학식 1] 또는 [수학식 2]에 따라 개체의 유전체형 점수의 합(X)을 구하고,

하기 [수학식 3] 또는 [수학식 4]에 따라 최대산소섭취량의 예측된 증가율(Y)을 구하고,

Y≤Q0인 경우 유산소 운동 무반응군,

Q0<Y<Q1인 경우 유산소 운동 보통 반응군,

Y≥Q1인 경우 유산소 운동 고반응군에 속하는 것으로 결정하는 것을 포함하는 방법에 의해 수행될 수도 있다.

[수학식 3]

Y=a+bX

[수학식 4]

상기 수학식 3에서,

X는 개체에서 계산된 유전체형 점수 합계로서 0≤X≤2n 또는 0≤X≤2 이고,

Y는 최대산소섭취량의 예측된 증가율을 나타내며,

a 및 b는 예측모델을 통해 구해진 선형회귀식의 절편과 기울기 값으로서 a는 회귀상수를, b는 X가 Y에 주는 영향력을 나타낸다.

상기 수학식 4에서,

c 및 d_j는 예측모델을 통해 구해진 다중선형회귀식의 절편과 기울기 값으로서 c는 회귀상수를, d_j는 G_j가 Y에 주는 영향력을 나타낸다.

수학식 3 및 수학식 4의 절편과 기울기는 유전체 점수와 최대산소섭취증가량 간의 관계를 선형회귀의 방법을 통해 추정해 낼 수 있다.

Q0와 Q1은 앞서 설명한 유산소 운동 반응도 예측 모델을 통해 미리 구해진 소정의 컷오프 값으로서, 각각 Q0는 유산소 운동 무반응군과 유산소 운동 반응군을 구분하는 컷오프 값이고, Q1은 유산소 운동 보통 반응군과 유산소 운동 고반응군을 구분하는 컷오프 값이다.

각 개체의 유전체형 점수의 합(X)에 기한 개체의 유산소 운동 반응도 예측 결과와 최대산소섭취량의 예측된 증가율(Y)에 기한 개체의 유산소 운동 반응도 예측 결과를 종합하면 좀더 신뢰도 있는 유산소 운동 반응도 예측이 가능해질 수 있다.

본 발명은 또한, 인간 12번 염색체의 rs11051548를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드(예컨대, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드: TGTGAATGCA GTAGCCCTGCRACAATAGCTCTGATAACCAA);

인간 18번 염색체의 rs2542729를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드(예컨대, 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드: ATGGCTCAGT CAGTTGATGTYAGCCGGCCCTGGTCATTGGC);

인간 2번 염색체의 rs1451462를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드(서열번호 3의 폴리뉴클레오티드: TGGAGACTCCAGATCTTTCAYAGGGCATTTC ATCCTCAGAA);

인간 2번 염색체의 rs11096663를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드(예컨대, 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드: CCTAGAAATC TCCAAGGCCTRTGTTAAAACC ATCCCTTACC);

인간 6번 염색체의 rs6570913를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드(예컨대, 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드: TCCCGAATGA ATCAATTCACRATGATTATTCGCATTTTGAA);

인간 3번 염색체의 rs13060995를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드(예컨대, 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드: cacagccatg gaaccaaagcDaggcatctacaagccaaggc);

인간 2번 염색체의 rs12613181를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드(예컨대, 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드: AATCGAAAGC ATATAGAGAAYATGAGGAAGCATGAAAAGTC)

인간 6번 염색체의 rs1626492를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드(예컨대, 서열번호 8의 폴리뉴클레오티드: TCATGAACTA CTTCTGAGTTRTTTACTACTGATTTGTGGGG)

인간 12번 염색체의 rs2417760를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드(예컨대, 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드: AATCTCAGCT CTACTTGTAAMTCACTGTGATGCCTTAGGTG )

인간 5번 염색체의 rs10072122를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드(예컨대, 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드: GGGTCAAACACAGTAAATGARTGATTTCTGTAAGTATTAGA) 및

인간 2번 염색체의 rs1056233를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드(예컨대, 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드: ATGAAAATCAACCATGTTTTMTCTCACCCTCTCTCTTTTGT)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일 염기 다형성 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 상기 단일 염기 다형성 마커를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 개체의 유산소 운동 반응도 예측용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은

인간 12번 염색체의 rs11051548를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;

인간 18번 염색체의 rs2542729를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;

인간 2번 염색체의 rs1451462를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;

인간 2번 염색체의 rs11096663를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;

인간 6번 염색체의 rs6570913를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;

인간 3번 염색체의 rs13060995를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;

인간 2번 염색체의 rs12613181를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;

인간 6번 염색체의 rs1626492를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;

인간 12번 염색체의 rs2417760를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;

인간 5번 염색체의 rs10072122를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및

인간 2번 염색체의 rs1056233를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일 염기 다형성 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 상기 단일 염기 다형성 마커를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 개체의 유산소 운동 반응도 예측용 키트를 제공한다.

본 명세서에서, 용어 '프로브'는 유전자의 다형성 부위와 특이적으로 혼성화 반응을 하여 유/무산소 운동의 민감도를 예측할 수 있는 물질을 의미하며, 이와 같은 유전자 분석의 구체적 방법은 특별한 제한이 없으며, 이 발명이 속하는 기술분야에 알려진 모든 유전자 검출 방법에 의하는 것일 수 있다.

본 명세서에서, 용어 '프라이머'는 단일 염기 다형성 마커의 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 물질로, 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 운동 반응도를 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있고, 예를 들어 15 내지 30 뉴클레오티드일 수 있다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.

프로브 또는 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명에서, 키트는 단일 염기 다형성 마커를 검출하거나, 확인할 수 있는 키트이면 제한 없이 사용 가능하다. 예를 들어, 키트는 DNA 칩 키트 또는 RT-PCR(real time- polymerase chain reaction) 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 다형성 마커의 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. RT-PCR 키트를 이용하여, 단일 염기 다형성 마커의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써, 다형성 마커를 확인할 수 있다. DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지 않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.

본 발명의 키트는 또한 마이크로어레이를 포함한다. 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 다형성 마커의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다.

프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 프로브 폴리뉴클레오티드는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립유전자 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립유전자간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립유전자 중 하나에만 혼성화 하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립유전자 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다.

마이크로어레이는 공지된 마이크로어레이를 제한 없이 사용할 수 있으며, 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출 또한 당업계에 잘 알려져 있으다. 예를 들어, 핵산 시료를 형광 물질과 같은 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

II. 무산소 운동 반응도 예측 방법

표2에 나타낸 단일 염기 다형성 마커는 무산소 운동에 있어서, 무산소 운동 반응군과 무반응군, 및 반응 강도에 따라, 무산소 운동 반응군을, 무산소 운동 보통 반응군과 무산소 운동 고반응군으로 분류할 수 있는 마커들이다.

[표 2]

구체적으로, 무산소 운동 반응도를 판별할 수 있는 단일 염기 다형성 마커는,

인간 5번 염색체의 rs10072841; 인간 16번 염색체의 rs6564267; 인간 2번 염색체의 rs17044554; 인간 13번 염색체의 rs1341439; 인간 9번 염색체의 rs10756546; 인간 15번 염색체의 rs4522375; 인간 5번 염색체의 rs10045249; 및 인간 14번 염색체의 rs7154161로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

상기에서,

인간 5번 염색체의 rs10072841가 C;

인간 16번 염색체의 rs6564267가 G;

인간 2번 염색체의 rs17044554가 T;

인간 13번 염색체의 rs1341439가 A;

인간 9번 염색체의 rs10756546가 C;

인간 15번 염색체의 rs4522375가 T;

인간 5번 염색체의 rs10045249가 A; 또는

인간 14번 염색체의 rs7154161가 T인 경우, 대립 유전자 상에 다른 염기를 갖는 경우와 비교할 때, 상기 염기는 무산소 운동 반응도가 높은 지표일 수 있다.

앞서 설명한 바와 같이, 상기 무산소 운동 반응도는 피크 토크로 표현될 수 있다.

따라서, 본 발명은

개체로부터 분리한 핵산 시료로부터, 하기의 단일 염기 다형성 마커의 다형성 부위의 염기를 확인하는 것을 포함하는, 개체의 무산소 운동 반응도를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:

상기 단일 염기 다형성 마커는,

인간 5번 염색체의 rs10072841; 인간 16번 염색체의 rs6564267; 인간 2번 염색체의 rs17044554; 인간 13번 염색체의 rs1341439; 인간 9번 염색체의 rs10756546; 인간 15번 염색체의 rs4522375; 인간 5번 염색체의 rs10045249; 및 인간 14번 염색체의 rs7154161로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이며,

상기에서,

인간 5번 염색체의 rs10072841가 C;

인간 16번 염색체의 rs6564267가 G;

인간 2번 염색체의 rs17044554가 T;

인간 13번 염색체의 rs1341439가 A;

인간 9번 염색체의 rs10756546가 C;

인간 15번 염색체의 rs4522375가 T;

인간 5번 염색체의 rs10045249가 A; 또는

인간 14번 염색체의 rs7154161가 T인 경우, 무산소 운동 반응도가 높은 지표이고,

상기 무산소 운동 반응도는 피크 토크로 표현된다.

한 구체예에서, 상기의 무산소 운동 반응도 예측을 위한 단일 염기 다형성 마커를 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상 8개 모두를 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 개체의 무산소 운동 반응도는 무산소 운동 무반응군, 무산소 운동 보통 반응군 또는 무산소 운동 고반응군으로 분류하여 나타낼 수 있다.

하기 실시예에서 기술하는 바와 같이, 본 발명의 개체의 무산소 운동 반응도를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법은 임상 실험을 통해 얻어진 무산소 운동 반응도 예측 모델에 근거하여 무산소 운동 반응도를 예측할 수 있는 단일 염기 다형성 마커를 선별해 낸 것에 근거한 것이다.

'무산소 운동 반응도 예측 모델'은 개인에서 관측되는 단일 염기 다형성의 차이에 따라 예컨대, 피크 토크 증가량으로 나타낼 수 있는 근력 증가량 수준을 예측할 수 있는 수학적 모델을 의미한다.

'무산소 운동 반응도 예측 모델'은 도 2과 같은 예측 모델 구성 주요 SNP 추출 프로세스에 따라 구축된 것으로 구체적 사항은 하기 실시예에 상세히 설명되어 있다.

미리 구축된 '무산소 운동 반응도 예측 모델'을 통해 개체의 무산소 운동 반응도를 예측하는 방법은 무산소 운동 반응도 예측 마커로 결정된 각 SNP의 유전자형에 대해 점수를 매기는 것으로부터 시작된다.

각 SNP의 유전체형은 2가지 대립 유전자의 조합으로 구성되므로, SNP당 3 종류의 유전체형이 존재한다. '무산소 운동 반응도 예측 모델'을 통해 유산소 운동 반응도가 낮게 나온 대립유전자를 A, 무산소 운동 반응도가 높게 나온 대립유전자를 B라고 정한 후, 예를 들어, 무산소 운동 반응도가 낮게 나온 대립유전자의 동형접합성인 경우(AA 유전체형)를 0점, 이형접합성인 경우(AB 유전체형)를 1점, 무산소 운동 반응도가 높게 나온 대립유전자의 동형접합성인 경우(BB 유전체형)를 2점으로 하여 점수를 매길 수 있다.

이 때 각 SNP마다 무산소 운동 반응도에 미치는 영향력을 다를 수 있으므로, 각 개체의 유전체형 점수의 합(X)은 하기 [수학식 2]에 따라 구할 수 있다.

[수학식 1]

[수학식 2]

상기 수학식 1 및 2에서,

W_j는 j번째 SNP 의 가중치를 나타내며,

n은 예측모델을 구성하는 SNP의 수를 나타낸다.

[수학식 2]에 따라 얻어진 각 개체의 유전체형 점수의 합(X)이 무산소 운동 반응도 예측 모델을 통해 미리 설정된 컷오프 구간 중 어디에 속하는지에 따라 개체가 무산소 운동 무반응군, 무산소 운동 보통 반응군, 무산소 운동 고반응군에 속하는 것으로 결정할 수 있다.

예를 들어, R0 및 R1이 각각 무산소 운동 반응도 예측 모델을 통해 미리 설정된 무산소 운동 유반응군과 무산소 운동 무반응군을 판별하기 위한 컷오프 값과 무산소 운동 보통 반응군과 무산소 운동 고반응군을 판별하기 위한 컷오프 값을 나타낸다고 할 때,

X≤R0인 경우 무산소 운동 무반응군,

R0<X<R1인 경우 무산소 운동 보통 반응군,

X≥R1인 경우 무산소 운동 고반응군에 속하는 것으로 결정할 수 있을 것이다.

개체의 무산소 운동 반응도를 무산소 운동 무반응군, 무산소 운동 보통 반응군 또는 무산소 운동 고반응군으로 분류하는 또 다른 방법으로는

하기 [수학식 5] 또는 [수학식 6]에 따라 피크 토크의 예측된 증가율(Z)을 구하고,

Z≤S0인 경우 무산소 운동 무반응군,

S0<Z<S1인 경우 무산소 운동 보통 반응군,

Z≥S1인 경우 무산소 운동 고반응군에 속하는 것으로 결정하는 것을 포함하는 방법에 의해 수행될 수도 있다.

[수학식 5]

Z=e+fX

[수학식 6]

상기 수학식 5에서,

e 및 f는 예측모델을 통해 구해진 선형회귀식의 절편과 기울기 값으로서 e는 회귀상수를, f는 X가 Z에 주는 영향력을 나타낸다.

상기 수학식 6에서,

g 및 h_j는 예측모델을 통해 구해진 다중선형회귀식의 절편과 기울기 값으로서 g는 회귀상수를, h_j는 G_j가 Z에 주는 영향력을 나타낸다.

수학식 5 및 수학식 6의 절편과 기울기는 유전체 점수와 피크 토크 증가량 간의 관계를 선형회귀의 방법을 통해 추정해 낼 수 있다.

S0와 S1은 앞서 설명한 무산소 운동 반응도 예측 모델을 통해 미리 구해진 소정의 컷오프 값으로서, 각각 S0는 무산소 운동 무반응군과 무산소 운동 반응군을 구분하는 컷오프 값이고, S1은 무산소 운동 보통 반응군과 무산소 운동 고반응군을 구분하는 컷오프 값이다.

각 개체의 유전체형 점수의 합(X)에 기한 개체의 무산소 운동 반응도 예측 결과와 피크 토크의 예측된 증가율(Z)에 기한 개체의 무산소 운동 반응도 예측 결과를 종합하면 좀더 신뢰도 있는 무산소 운동 반응도 예측이 가능해질 수 있다.

본 발명은 또한,

인간 5번 염색체의 rs10072841를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드(예컨대, 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드: CTAGTAATACAACTGTTTAGYACCTGGCTTATACTATTAAC);

인간 16번 염색체의 rs6564267를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드(예컨대, 서열번호 13의 폴리뉴클레오티드: CTTTTGCCCAGGCTGTCAGCKCTTTGGCCCCAGTTAATGAC);

인간 2번 염색체의 rs17044554를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드(예컨대, 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드: GAGGACACCACAGAGGAGCTKAGAGCTTGTCAGCTACCACC);

인간 13번 염색체의 rs1341439를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드(예컨대, 서열번호 15의 폴리뉴클레오티드: AATAGTTGTT TCTATTTCRTAGAGGTGTTGTGAAGAGTA);

인간 9번 염색체의 rs10756546 를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드(예컨대, 서열번호 16의 폴리뉴클레오티드: TTACAGCATCAGAATGTTTAYATCTGCACAATTCTTTGATT);

인간 15번 염색체의 rs4522375 를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드(예컨대, 서열번호 17의 폴리뉴클레오티드: aaattatCtttggggatacaYatgcaggttcattacttagg);

인간 5번 염색체의 rs10045249 를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드(예컨대, 서열번호 18의 폴리뉴클레오티드: CTGGCAAGTCCAAAATCAGCRGGGTAGGCTAGTAGGCTGGA); 및

인간 14번 염색체의 rs7154161 를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드(예컨대, 서열번호 19의 폴리뉴클레오티드: GCTGCATCCTCCTCGCTGTGYGAAAGAGACCGTAGATTTTA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일 염기 다형성 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 상기 단일 염기 다형성 마커를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 개체의 무산소 운동 반응도 예측용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은

인간 5번 염색체의 rs10072841를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;

인간 16번 염색체의 rs6564267를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;

인간 2번 염색체의 rs17044554를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;

인간 13번 염색체의 rs1341439를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;

인간 9번 염색체의 rs10756546를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;

인간 15번 염색체의 rs4522375를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;

인간 5번 염색체의 rs10045249를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드 및

인간 14번 염색체의 rs7154161를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일 염기 다형성 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 상기 단일 염기 다형성 마커를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 개체의 무산소 운동 반응도 예측용 키트를 제공한다.

기타, 무산소 운동 반응도 예측을 위한 정보를 제공하는 방법, 개체의 무산소 운동 반응도 예측용 조성물, 개체의 무산소 운동 반응도 예측용 키트와 관련한 설명은 앞서 유산소 운동 반응도 예측 방법에서 기술한 사항을 준용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 운동 반응도 예측을 위한 정보의 제공은 컴퓨터 프로그램을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 대상 개체의 상기 단일 염기 다형성 마커의 다형성 부위의 염기 확인 결과를 컴퓨터로 판독 가능한 프로그램을 통하여 출력하고, 그 결과, 유산소 운동 반응도가 높은 개체의 경우 적합한 유산소 운동 프로그램을 제시할 수 있고, 무산소 운동 반응도가 높은 개체의 경우 적합한 무산소 운동 프로그램을 제시할 수 있다. 이에 따라, 각 개체의 유전적 특성에 따라 개인별 맞춤 운동 프로그램을 제시하여, 운동 효과를 극대화할 수 있다.

본 발명에 따라, 유/무산소 운동 반응도에 대한 주요 평가 변수인 최대 O₂ 섭취량 (V'O₂max) 및 무릎 피크 토크(knee peak torque)에 유의하게 영향을 미치는 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphisms, SNPs)이 규명되었다. 이들 단일 염기 다형성을 이용하면 개체의 유/무산소 운동 반응도를 예측할 수 있으므로, 운동 시작 전 또는 운동 중에 개체의 특성에 적합한 운동 프로그램을 제시하는 것이 가능하다.

도 1 및 도 2는 각각 '유산소 운동 반응도 예측 모델'과 '무산소 운동 반응도 예측 모델' 의 주요 SNP 추출 프로세스를 보여준다.
도 3은 9주간의 HIT 프로그램의 완료 후, V'O₂max에서의 % 변화 및 무릎 피크 토크 에서의 % 변화의 샘플 분포를 나타낸다.
도 4는 22개의 상염색체에 걸친 유의한 SNP(p-value < 0.01)의 맨하탄 플롯을 나타낸다. X 축은 염색체를, Y축은 -log 10으로 변환된 p-values를 나타낸다. 도 4a의 SNP는 V'O₂max에서의 % 변화에 대한 선형 회귀분석에서 유의하고, 도 4b의 SNP는 무릎 피크 토크에서의 % 변화에 대한 선형 회귀분석에서 유의하다.
도 5는 11개의 SNP의 지노타입에서 관찰된 V'O₂max에서의 % 변화의 평균값과 상위 95% 신뢰구간을 보여준다.
도 6은 8개의 SNP의 지노타입에서 관찰된 무릎 피크 토크 에서의 % 변화의 평균값과 상위 95% 신뢰구간을 보여준다.
도 7은 운동 반응도(Y 축)에서의 % 변화의 평균값과 상위 95% 신뢰구간을 나타낸다. X 축은 총 지노타입 스코어의 컷오프에 의해 결정된 3개의 상이한 레인지를 나타낸다. 각 스코어 범위 내의 대상체의 숫자는 상기 도표에 n으로 표시되어 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

[ 실시예 ]

79명의 건강한 자원자들이 HIT 프로그램에 참여하였다. 2,391,739개의 SNP에 기초한 전장유전체연관분석연구(genome-wide association study, GWAS)가 9주간의 HIT 프로그램 수행 후 V'O₂max 및 무릎 피크 토크에서의 증가와 유의하게 관련된 SNP를 규명하기 위해 수행되었다. 2종의 운동 반응도를 예측하기 위해, 선형 회귀분석과 반복 binary 로지스틱 회귀분석을 이용하여 2개의 독립적인 SNP 세트를 결정하였다. false-positive finding을 피하기 위해 False discovery rate analysis과 순열 검증을 수행하였다.

본 연구의 프로토콜은 경희대학교병원의 IRB(Institutional Review Board)에서 승인 받았다. 본 연구의 방법 및 과정은 Good Clinical Practice Guidelines와 헬싱키 선언에 따른 것이다.

<운동 반응도 예측 모델의 구축 방법>

임상시험 참여자 및 HIT 프로그램

총 123명, 30-60세의 대한민국 남성 및 여성이 본 임상시험의 참여를 위해 모집되었다. 모든 참여자는 이전 3달 내 보통의 운동에 대한 경험이 없었으며, 16-32 kg/m²의 체질량지수(BMI)를 가지고 있었다. 우리는 그들의 병력, 바이탈 사인(수축기 및 이완기 혈압, 및 맥박수), 12-리드 심전도(ECG)를 조사하고, 통상적인 실험실적 테스트(혈액분석, 임상 화학, 및 뇨분석)을 수행하였다.

9주간의 HIT 프로그램을 수행하기 위해 ergometer bike (Aerobike 75XL-II, COMBI, Japan)가 사용되었다. 이 운동의 강도는 그들의 기초 특성 테스트에서 측정된 HR과 V'O₂max에 근거하여 각 참여자들에 맞게 조정되었다. 각 참여자들은 그들의 기초 V'O₂max의 60-84%로 맞춰진 HR에서 세션당 3분 40초 동안 9주 간 운동하였다. 1회의 트레이닝 세션은 웜업 40초, HIT 20초, 휴식 40조, HIT 20초, 휴식 40초, HIT 20초, 마지막으로 쿨 다운 40초로 이루어져 있다. 모든 참여자들이 주 3회 이 트레이닝을 수행하였으며(1세션/일, 3세션/주), 트레이닝의 완료 후 즉시 운동 다이어리에 그들의 성과를 기록하였다. 참여자들은 언제든 자발적으로 이 프로그램을 철회할 수 있었다. 21 세션 미만으로 수행한 참여자들은 본 연구에서 탈락되었다. 기초 테스트, 6주 테스트, 최종 9주 테스트 때, 참여자들은 national fitness center(NFC, Korea)를 방문하여, 그들의 운동 반응도와 관련한 운동 반응도에 대한 하기 평가 변수를 측정하였다: V'O₂max, 무산소성 역치(anaerobic threshold), 1회 호흡량(tidal volume), 산소 섭취량(V'O₂), 이산화탄소 배출량(V'CO₂), 및 참여자들의 호흡교환율(respiratory exchange ratio). 추가로, 근육 강도 테스트의 일환으로, 무릎에서의 굴근 및 신근 피크 토크(flexor and extensor peak torque), 및 아고니스트/안타고니스트 비율(agonist/antagonist ratio)을 측정하였다. 각 개체의 무릎의 굴근 및 신근 피크 토크는 Biodex System 3 (Biodex Medical Systems, USA)를 이용하여 60°/sec에서 측정하였으며; 왼편과 오른편 무릎에서 측정하여 평균을 내었다. 운동 반응도에 대한 주된 평가 변수는 V'O₂max (unit: ml/min/kg)와 무릎 굴근 피크 토크(unit: N.M/kg)로 결정되었다. 참여자들은 HIT 프로그램을 수행하기 전에 전문적인 트레이너들에게 지도 받았다.

운동 반응도에 대한 실제 서브그룹의 정의

운동 반응도의 정량은 기초선(베이스라인)으로부터 9주간의 HIT 프로그램 종료시까지의 V'O₂max의 부피 변화율(V'O₂max에서의 % 변화), 및 무릎 굴근 피크 토크의 증가 % (무릎 피크 토크의 % 변화)로 정의하였다. 비반응군, 보통 반응군, 고반응군의 3개의 상이한 운동 반응도를 나타내는 3개의 서브그룹을 정의하기 위해 클러스터링 분석이 사용되었다. 운동 반응도의 % 변화가 ≤ 0%인 개체들은 비반응군 서브그룹에 포함시켰다. 남은 개체들은 2-means clustering algorithm을 이용하여 보통-반응군 또는 고반응군으로 구분하였다: 2개의 서브그룹의 최초 센터는 운동 반응도의 % 변화의 최소(S1) 및 최대(S2)였다. 그에 따라, 개체들은 S1과 S2 주변으로 클러스터링하였고, 그에 따라 보통 반응군과 고반응군으로 각각 정의되었다.

SNP 지노타이핑 및 GWAS에 대한 데이터 전가공

제조사의 지시에 따라 High Pure PCR Template Preparation kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 이용하여 전혈 샘플로부터 템플릿 DNA를 준비하였다. 전혈 세포들을 바인딩 버퍼와 프로테아제 K를 이용하여 용해하고, 이소프로판올과 저해제 제거 버퍼를 이용하여 지노믹 DNA를 추출하였다. 전체 DNA를 40uL의 용출 버퍼로 용출한 다음, SNP 지노타이핑 때까지 70℃에서 보관하였다. GWAS SNPs는 HumanOmni2.5-8 BeadChips (Illumina, Inc., USA)를 이용하여 지노타이핑하였다. 지노타입 콜링(Genotype calling)은 GenomeStudio software (Illumina, Inc., USA)을 이용하여 수행하였고, logR 비율 및 파형(waviness)를 확인 후, 콜 레이트가 > 0.99인 지노타입을 선택하였다. 총 2,391,739개의 SNPs 중 41.8%를 차지하는 Monomorphic SNPs를 걸러내었다. missing genotypes이 ≥ 10%인 7,270 (0.3%)개의 SNPs와, minor allele frequency (MAF)가 < 5% (9.4%)인 225,440 SNPs를 걸러내었다. Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) 테스트를 남아있는 SNP에 대해 수행하였고, p-value 가 < 0.001 (1.1%)인 26,588 개의 SNPs를 걸러내었다. 데이터 전가공 수행 후, 1,131,703개의 SNPs (47.3%)가 남았으며, 이들을 GWAS 연구를 수행하기 위해 사용하였다. 이들 SNPs에 대한, 크로모좀 상의 위치 및 유전자 정보과 같은 Annotation information 는, human genome version 19로부터 얻었으며, annotation, visualization 및 integrated discovery (DAVID)에 대한 데이터베이스는 관련된 유전자의 functional annotation을 위해 사용되었다 (Huang et al. 2009a; Huang et al. 2009b).

정량적 스코어에 대한 SNP 지노타입의 코딩

대립유전자와 운동 반응도 간의 관련도 분석을 수행하였다; 운동 반응도에 유익한 대립유전자로 이루어진 동형접합성 유전자형은 2점, 운동 반응도에 불리한 대립유전자로 이루어진 동형접합성 유전자형은 0점으로 코딩하였다. 이형접합성 유전자형은 1점으로 코딩하였다. 이들 코딩된 값을 이용하여, 우리는 운동 반응도에 대한 SNP의 추가적인 유전자 영향을 분석하였다.

통계학적 분석

측정치의 기초 특성은 평균±표준편차(SD), 및 N (%)로 표현하였다. 이들은 각각 연속적이고 카테고리적 변수를 나타낸다. 2 sample t-tests, 또는 Wilcoxon signed rank tests를 수행하여 최초의 기초 측청치와, 9주간의 HIT 프로그램 후 측정된 측정치 간의 차이를 테스트하였다. 도 1 및 도 2는 데이터 전처리부터 유산소 및 무산소 운동 반응도 예측 모델을 구성하는데 사용되는 유전자 마커의 선택까지의 전체적인 분석 과정을 나타낸다. 우리는 continuous, and categorical training responses 모두와 유의하게 관련된 SNP를 규명하고자, GWAS SNP에 대해 선형 회귀 분석과 로지스틱 회귀 분석을 연속적으로 실시하였다. V'O₂max의 % 변화, 및 무릎 피크 토크의 % 변화를 연속적인 운동 반응도로서 사용하였고, 3개의 서브그룹인 무반응군, 보통 반응군, 고반응군을 카테고리적 운동 반응도로서 사용하였다. 모든 분석은 성별, 나이 및 V'O₂max와 무릎 피크 토크의 기초 정량값에 의해 보정하였다. 운동 반응도에서의 정량적 증가에 대한 SNP 유전자형의 영향력을 평가하기 위해 선형 회귀 분석을 수행하였다. 또한, 대상체를 상이한 운동 반응도를 갖는 서브그룹으로 구분하는 SNP 지노타입의 힘을 평가하기 위해 로지스틱 회귀 분석을 사용하였다. 이분형 로지스틱 회귀 분석을 첫번째는 반응군 vs. 비반응군에 대해, 2번째는 고반응군 vs. 보통 반응군에 대해 적용하였다. p-value에 대한 유의 수준은 선형 회귀 분석과 로지스틱 회귀 분석 모두에 대해 0.01로 잡았다. FDR(False Discovery Rate)에 대한 q-value 컷오프와 permutation test (n=2,000)에 대한 p-value 컷오프는 각각 0.1 및 0.01로 설정하여, false positives를 최소화하였다. 후보 마커들 중 회귀 모델에 가장 잘 맞는 SNP를 규명하기 위해, Akaike Information Criterion (AIC)에 기초하여 후진변수 선택법과 전진변수 선택법을 연속적으로 적용하였다. 또한, 후진변수, 전진변수 선택법에서 낙오된 SNP 을 하나씩 회귀 모델에 추가로 포함시켜 가면서 분류 정확도를 최대화 하는 SNP 들을 추가로 발굴하였다. 그에 따라, 우리는 대상체를 상이한 운동 반응도의 3개의 서브그룹으로 구분하기 위한 최종적인 유전적 마커로서 이들 SNP를 선택하였다.

모든 마커 SNP의 코딩된 유전자형 점수를 합산하여 총 유전자형 점수를 계산하고, 이를 대상체의 운동 반응도 서브그룹을 예측하는데 사용하였다. 3개의 상이한 서브그룹 간을 구분하는 총 유전자형 점수의 컷오프는 실제 운동 반응도 서브그룹과 예측된 운동 반응도 서브그룹으로 이루어진 3x3 contingency tables로 분류 에러를 최소화하는 반복 과정을 통해 계산되었다(하기 표 3 및 분류 정확도 수식 참조). 계산된 최소 유전자형 점수 ~ 최대 유전자형 점수에서 나올 수 있는 모든 2개 점수 조합을 유전자형 점수 컷오프 후보군으로 이용하였다. 예를 들어, 설정된 컷오프가 각각 C1, C2 라고 한다면, 최소 유전자 점수 ~ C1 인 사람은 무반응 군, C1 ~ C2 인 사람은 보통 반응군, C2 ~ 최대 유전자 점수 인 사람은 고반응군으로 예측하게 되며, 이렇게 예측된 3종의 반응군은 실제 반응군 3종과의 비교를 통해 분류 정확도, 즉 판별력(판별 정확도 또는 예측 정확도라도고 표현됨)를 계산하게 된다. 모든 컷오프 조합에 대해서 분류 정확도 계산이 완료되면 이들 중 분류 정확도가 가장 높게 나오는 컷오프를 운동 반응도를 예측하는데 최종적으로 사용하게 된다.

[표 3]

예측 결과의 신뢰도는 leave-one-out cross-validation (LOOCV) procedure, bootstrapping (n=1,000), 및 randomization testing (n=1,000)를 통해 추정되었다. 모든 총계학적 분석은 R language ver. 3.1.1 (R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria)을 이용하여 수행되었다.

<운동 반응도 예측 모델의 구축 결과>

HIT 프로그램 측정의 기초 특성

최종 분석 데이터 세트는 21 세션 이상의 임상 시험을 완료한 참여자들을 포함한다; 이 분류기준을 충족하는 참여자는 전체 128 명의 대상체 중 79명(51명의 남성 및 28명의 여성)이었다. 표 4는 이들 79명의 대상체의 기초 특성을 요약한 것이다.

[표 4]

V'O₂max, 무릎 피크 토크, 수축기 혈압(SBP), 이완기 혈압(DBP), 및 베타 세포 기능의 항상성 모델 평가 (HOMA)와 같은 여러가지의 측정치가 9주간의 HIT 프로그램 후 기초치보다 유의하게 달랐다(p-value < 0.05, 표 5).

[표 5]

단일 SNP 분석

도 3은 9주간의 HIT 프로그램의 완료 후, V'O₂max에서의 % 변화 및 무릎 피크 토크에서의 % 변화의 샘플 분포를 나타낸다. V'O₂max 및 무릎 피크 토크에서 각각 대략 24% (n=19) 및 15% (n=12)의 대상체가 제로 또는 네거티브의 변화를 나타냈다. 반면, 대략 29% (n=23)의 대상체들은 V'O₂max 및 무릎 피크 토크에서 각각 18% 및 24% 변화를 넘어서는 결과를 나타내었다. V'O₂max 및 무릎 피크 토크의 평균 % 변화는 각각 9.5% 및 15.2%였다(데이터 미도시).

선형 회귀 분석은 각각의 GWAS SNP에 대해 실시하고, 나이, 성별 및 V'O₂max 또는 무릎 피크 토크의 기초 측정치에 대해 보정하였다. 데이터 전가공 수행 후 남은 총 1,131,703개의 SNP로부터 우리는 11,773개의 SNP와 11,258개의 SNP가 각각 V'O₂max의 % 변화 및 무릎 피크 토크의 % 변화와 유의하게 연관되어 있음을 발견하였다 (p value < 0.01). 분석 결과의 분포를 도 4의 맨하탄 플롯에 나타내었다. 이들 SNP를 이용하여, FDR 분석을 포함하여 이분형 로지스틱 회귀 분석을 수행하였다. V'O₂max에서의 % 변화와 선형적으로 연관된 11,773개의 SNP로부터, 의존 변수가 반응군 대 비반응군, 고반응군 대 보통 반응군일 때 259개의 SNP와 650개의 SNP가 각각 이분형 반응과 유의하게 연관되어 있었다 (p value < 0.01, and q value < 0.1). 선택된 SNP에 대한 완전한 정보는 상기 표 1 및 2에 기재한 바와 같다.

다중 SNP 분석 및 운동 반응도 예측 모델을 위한 유전적 마커

false positives를 추가적으로 감소시키기 위해 단일 SNP 분석에서 선택된 SNP에 대한 순열검정을 수행하였고(n=2,000, and p value < 0.01), 필터링된 SNP를 다변 로지스틱 회귀 분석을 위해 사용하였다. 전진변수선택법 및 후진변수선택법을 순차적으로 적용한 후, 11개의 SNP가 V'O₂max에서의 % 변화를 예측하는 최종적인 마커로 선별되었다. 이 경우에서, 6개의 SNP는 반응군 대 비반응군을 식별하기 위해 선택된 반면, 나머지 5개의 SNP는 고반응군 대 보통반응군을 식별하기 위해 선택되었다. 표 1은 이들 SNP에 대한 상세 정보를 제공한다.

V'O₂max에서의 % 변화를 예측하기 위해 선택된 11개의 SNP는 관찰된 전체 변량(total variance)의 20.3%를 차지하였다: 각 단일 SNP의 기여도는 0.6% 내지 5.2%로 다양하다(기여도는 표 1의 partial R2 값에 100을 곱한 값이다). 도 5 및 표 6은 각 유전자형에 대한 V'O₂max에서의 % 변화의 평균값과 95% 신뢰 구간을 나타내며; 모든 SNP가 유전자형에 따라 V'O₂max에서의 % 변화가 유의하게 상이하였다(a = 0.05).

[표 6]

V'O₂max에서의 % 변화와 가장 강하게 연관되어 있는 SNP는 rs11051548였다. 이 SNP는 antagonist of mitotic exit network 1 homolog(AMN1) 유전자의 인트론에 위치한다. rs2542729는 18번 염색체의 30568418번째 서열을 중심으로 앞뒤 20개 염기서열을 포함한다. rs1451462는 LOC105369165 유전자 부위에 위치한다. rs13060995는 2개의 유전자의 유전자간 부위에 위치한다: SLIT-ROBO Rho GTPase activating protein 3 (SRGAP3) 및 LOC100288831. rs6570913는 uronyl-2-sulfotransferase (UST) 유전자의 인트론에 위치한다. rs11096663은 LOC105373465 유전자 부위에 위치한다. rs12613181은 potassium channel, voltage gated eag related subfamily H, member 7 (KCNH7) 유전자의 인트론에 위치한다.

한편, 표 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 무릎 피크 토크에서의 % 변화를 예측하기 위해 선택된 8개의 SNP는 관찰된 총변량의 21.8%를 차지하였다. 각 단일 SNP의 기여도는 1.1% 내지 7.9%로 다양하였다(기여도는 표 2의 partial R2 값에 100을 곱한 값이다). 각 유전자형에 대한 무릎 피크 토크에서의 % 변화의 평균값과 95% 신뢰 구간은 도 6 및 표 7에 나타낸 바와 같다.

[표 7]

8개의 모든 SNP가 유전자형에 따른 무릎 피크 토크에서의 % 변화에서 유의한 차이를 보였다 (a = 0.05). rs10072841가 무릎 피크 토크에서의 % 변화와 가장 강하게 연관되어 있었으며, 이 SNP는 FAT atypical cadherin 2 (FAT2) 유전자의 인트론에 위치한다. 강하게 연관되어 있는 다른 SNP로는 다음을 포함한다. rs6564267는 GABA(A) receptor-associated protein like 2 (GABARAPL2) 유전자의 인트론에 포함된다. rs17044554는 2번 염색체의 22995383번째 염기서열을 중심으로 앞뒤 20개의 염기서열을 포함한다. rs1341439는 13번 염색체의 103706322번째 염기서열을 중심으로 앞뒤 20개의 염기서열을 포함한다. rs4522375는 15번 염색체의 23957540번째 염기서열을 중심으로 앞뒤 20개의 염기서열을 포함한다. rs7154161는 14번 염색체의 51387550번째 염기서열을 중심으로 앞뒤 20개의 염기서열을 포함한다.

운동 반응도 서브그룹의 예측을 위한 SNP 유전자형 스코어링 시스템의 구축

V'O₂max에서의 % 변화 및 무릎 피크 토크에서의 % 변화에 대한 2가지 유형의 SNP 유전자형 스코어링 시스템을 각각 구축하였다. 표 1 및 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 선택된 SNP들을 대상자들을 세 가지 서브그룹으로 구분하는 예측 마커로서 사용하였다. 운동 반응도에 대한 유전자형의 정량적인 기여도를 반영하기 위해, 방법 부분에서 기술한 과정에 따라 각 SNP의 개별적인 유전자형을 0, 1, 또는 2로 코드하였다. 그런 다음, 유전자형 스코어의 합(즉, 총 유전자형 스코어)를 이용하여 대상체의 운동 반응도 서브그룹을 예측하는데 사용하였다. V'O₂max에서의 % 변화 및 무릎 피크 토크에서의 % 변화를 측정하는데 사용한 유전자 스코어링 시스템은 대상체의 운동 반응도 서브그룹을 비반응군, 보통 반응군 또는 고반응군으로 구분한다.

세 가지의 서브그룹을 식별하기 위한 총 유전자형 스코어의 컷오프는 방법 부분에서 설명된 바와 같이 결정하였다. 대상체의 운동 반응도에서의 % 변화의 분포를 도 7에 나타내었다. 여기에서 V'O₂max의 % 변화의 평균값은 총 유전자형 스코어의 각 서브레인지에 대해 -4.2%, 8.0%, 및 28.0%였다. 피크 토크 % 변화의 평균값은 총 유전자형 스코어의 각 서브레인지에 대해 -2.7%, 15.7%, 및 42.7% 였다.

예측 모델에 대한 정확도 추정 및 내부 검증

[표 8]

유산소 운동 반응도 예측 모델

[표 9]

무산소 운동 반응도 예측 모델

표 8 및 9은 추정된 예측 정확도와 내부 검증의 전반적인 결과를 보여준다. 예측 정확도는 V'O₂max에서의 %변화 및 무릎 피크 토크의 % 변화 각각에 대해 91.1% 및 82.3%로 추정되었다. 동일한 결과를 LOOCV 분석을 이용하여 얻었다. Bootstrapping analysis (n=1,000)는 V'O₂max에서의 % 변화에 대해 평균 예측 정확도가 91.0% (95% 신뢰구간은 84.8 - 97.4%)이고, 무릎 피크 토크에서의 % 변화에 대해 평균 예측 정확도가 82.3% (95% 신뢰구간은 75.6% - 91.3%)임을 보여준다. 한편, 대상체의 실제 운동 반응도를 무작위로 배치한 후 테스트를 한 randomization test 에서는, n=1,000 세트를 이용했을 때 평균적으로 50% 정도의 예측 정확도를 보이는 것으로 나타났다. 이것은, 구축된 예측 모형의 예측 정확도가 신뢰성 있음을 나타낸다.

<유산소 운동 반응도 예측 예>

앞서 구축한 예측 모델에 의해 임상 시험 대상자 중 1인의 유산소 운동에 대한 운동 반응도를 예측해 보면 다음과 같다.

우선, 상기 대상자의 유전자 형에 대해 유전자형에 따른 스코어를 매기면 아래와 같이 나타난다(이 예에서는 각 SNP 의 가중치를 고려하지 않은 수식을 이용하였음).

유전자형 스코어의 총합은 12점이므로, 유전자형 스코어를 이용한 운동 반응도 예측 결과는 보통 반응군으로 예측된다(앞서 구축한 예측 모델에 따르면, 무반응군으로 예측되는 점수: 10점 이하, 보통반응군으로 예측되는 점수: 11 ~14점, 고반응군으로 예측되는 점수: 15점 이상).

또한, 선형 회귀식을 이용한 예측 결과를 살펴보면, 앞서 설명한 예측 모델에서 Y=a+bX에서 a=-34.667, b=3.632 였고, 본 대상자의 유전자형 스코어 총합인 X=12이므로, Y = 8.917 이라는 값이 구해진다. 상기 예측 모델을 통해 설정된 컷오프 값에 따르면, 무반응군으로 예측되는 수치: Y가 0 이하, 보통 반응군으로 예측되는 수치: 0<Y<18, 고반응군으로 예측되는 수치: Y가 18 이상이므로, 상기 대상자는 보통 반응군으로 예측할 수 있었다.

두 가지 방법론에 의한 결과를 종합할 때 상기 대상자는 보통 반응군으로 예측되었다.

<무산소 운동 반응도 예측 예>

앞서 설명한 예측 모델에 의해 임상 시험 대상자 중 1인의 무산소 운동에 대한 운동 반응도를 예측해 보면 다음과 같다.

유전자형 스코어의 총합은 6점이므로, 유전자형 스코어를 이용한 운동 반응도 예측 결과는 무반응군으로 예측된다(앞서 구축한 예측 모델에 따르면, 무반응군으로 예측되는 점수: 7점 이하, 보통반응군으로 예측되는 점수: 8 ~12점, 고반응군으로 예측되는 점수: 13점 이상).

또한, 선형 회귀식을 이용한 예측 결과를 살펴보면, 앞서 설명한 예측 모델에서 Z=e+fX에서 e=-46.994, f=5.823 였고, 본 대상자의 유전자형 스코어 총합인 X=6이므로, Z = -12.056 이라는 값이 구해진다. 상기 예측 모델을 통해 설정된 컷오프 값에 따르면 무반응군으로 예측되는 수치: Z가 0 이하, 보통 반응군으로 예측되는 수치: 0<Z<24, 고반응군으로 예측되는 수치: Z가 24 이상이므로, 상기 대상자는 무반응군으로 예측할 수 있었다.

두 가지 방법론에 의한 결과를 종합할 때 상기 대상자는 무반응군으로 예측되었다.

SEQUENCE LISTING <110> DAEWOONG PHARMACEUTICAL CO., LTD. BIO AGE CO., LTD. <120> BIOMARKER FOR PREDICTING TRAINING RESPONSE <130> P16C24C1548 <160> 19 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tgtgaatgca gtagccctgc racaatagct ctgataacca a 41 <210> 2 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atggctcagt cagttgatgt yagccggccc tggtcattgg c 41 <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tggagactcc agatctttca yagggcattt catcctcaga a 41 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 cctagaaatc tccaaggcct rtgttaaaac catcccttac c 41 <210> 5 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 tcccgaatga atcaattcac ratgattatt cgcattttga a 41 <210> 6 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 cacagccatg gaaccaaagc daggcatcta caagccaagg c 41 <210> 7 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 aatcgaaagc atatagagaa yatgaggaag catgaaaagt c 41 <210> 8 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 tcatgaacta cttctgagtt rtttactact gatttgtggg g 41 <210> 9 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 aatctcagct ctacttgtaa mtcactgtga tgccttaggt g 41 <210> 10 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gggtcaaaca cagtaaatga rtgatttctg taagtattag a 41 <210> 11 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 atgaaaatca accatgtttt mtctcaccct ctctcttttg t 41 <210> 12 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 ctagtaatac aactgtttag yacctggctt atactattaa c 41 <210> 13 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 cttttgccca ggctgtcagc kctttggccc cagttaatga c 41 <210> 14 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 gaggacacca cagaggagct kagagcttgt cagctaccac c 41 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 aatagttgtt tctatttcrt agaggtgttg tgaagagta 39 <210> 16 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 ttacagcatc agaatgttta yatctgcaca attctttgat t 41 <210> 17 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 aaattatctt tggggataca yatgcaggtt cattacttag g 41 <210> 18 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 ctggcaagtc caaaatcagc rgggtaggct agtaggctgg a 41 <210> 19 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 gctgcatcct cctcgctgtg ygaaagagac cgtagatttt a 41