CN113943804A - Fgfr3基因突变检测在膀胱癌诊断中的应用及试剂盒 - Google Patents

Fgfr3基因突变检测在膀胱癌诊断中的应用及试剂盒 Download PDF

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CN113943804A CN202111229543.7A CN202111229543A CN113943804A CN 113943804 A CN113943804 A CN 113943804A CN 202111229543 A CN202111229543 A CN 202111229543A CN 113943804 A CN113943804 A CN 113943804A
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fgfr3 gene
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gene mutation
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王晓楠
钱祺
张亚楠
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Shanghai 3D Medicines Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种FGFR3基因突变检测在膀胱癌诊断中的应用及试剂盒。本发明通过对尿脱落肿瘤细胞的细胞核DNA进行FGFR3基因突变位点的检测，制备膀胱癌诊断试剂盒中。所述检测的FGFR3基因突变位点为R248C、S249C、Y375C其中至少一种。检测R248C突变位点的引物如SEQ ID NO：1～2所示、探针如SEQ ID NO：3所示；检测S249C突变位点的引物如SEQ ID NO：4～5所示、探针如SEQ ID NO：6所示；检测Y375C突变位点的引物如SEQ ID NO：7～8所示、探针如SEQ ID NO：9所示。本发明通过尿脱落肿瘤细胞细胞核DNA进行FGFR3的突变检测，为膀胱癌的辅助诊断提供一种无创的且灵敏度更高的检测方法。

Description

FGFR3基因突变检测在膀胱癌诊断中的应用及试剂盒
技术领域
本发明属于生物医学诊断技术领域，FGFR3基因突变检测在膀胱癌中诊断的应用及试剂盒。
背景技术
膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。膀胱恶性肿瘤细胞之间是存在异质性的，并表现出不同的生物学特性，这些特性通常是由遗传不稳定性引起的。FGFR3可导致酪氨酸激酶受体基因激活，触发几种下游激酶途径，导致细胞转化。超过65％的非肌肉浸润性膀胱癌和15％的肌肉浸润性膀胱癌携带FGFR3突变，总突变率为40-50％。FGFR3是尿路上皮癌的最常见的突变基因，为膀胱癌的诊断提供了目标靶点。
膀胱镜，影像学检查(超声，CT泌尿道成像，MRI检查，静脉尿路造影检查，全身骨显像，PET-CT检查)，脱落细胞学，尿液膀胱肿瘤标志物或者FISH检查是膀胱癌最常用的检测方法。然而，膀胱镜是有创检测，医从性不佳，同时容易引起出血、感染等并发症。影像学多数早期灵敏度不佳，不能作为早期肿瘤的检测。脱落细胞学需要专业的病理医生人工判断，且在低级别肿瘤中漏诊率高。尿液膀胱肿瘤标志物(NMP22)和FISH，分别存在灵敏度偏低，稳定性差和成本高等问题。
发明内容
本发明的目的是，提供一种FGFR3基因突变检测在膀胱癌中诊断的应用及试剂盒。旨在解决现有技术中膀胱癌的诊断方法灵敏度偏低，稳定性差和成本高等问题。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
本发明提供FGFR3基因突变检测在制备膀胱癌诊断试剂盒中的应用，通过对尿脱落肿瘤细胞的细胞核DNA进行FGFR3基因突变位点的检测制备膀胱癌诊断试剂盒。
作为优选实施方案，所述FGFR3基因突变位点为R248C、S249C、Y375C其中至少一种。
作为优选实施方案，检测R248C突变位点的引物如SEQ ID NO：1～2所示、探针如SEQ ID NO：3所示；检测S249C突变位点的引物如SEQ ID NO：4～5所示、探针如SEQ ID NO：6所示；检测Y375C突变位点的引物如SEQ ID NO：7～8所示、探针如SEQ ID NO：9所示。
作为优选实施方案，所述用于FGFR3点突变检测的探针5′端带有荧光基团，所述荧光基团可以是VIC、FAM、ROX或HEX任意一种或几种；优选的，所述用于FGFR3点突变检测的探针3′端带有淬灭基团，所述淬灭基团可以是MGB，也可以是BHQ1。
本发明还提供一种用于FGFR3基因突变检测的试剂盒，所述试剂盒包括细胞核DNA提取试剂和FGFR3基因突变检测试剂。
作为优选实施方案，所述试剂盒还包括细胞膜裂解试剂和细胞核分选装置。
作为优选实施方案，所述细胞核DNA提取试剂包括试剂Ⅰ、试剂Ⅱ、试剂Ⅲ、洗涤液I、洗涤液II、洗脱液；
所述试剂Ⅰ的组成为：1～3mol/L的异硫氰酸胍、5～10mmol/L的柠檬酸钠、0.01～0.05g/ml的聚多卡醇、3～5mmol/L的β-巯基乙醇，溶剂为乙醇和水，其中乙醇的体积百分比为15～45％；
所述试剂Ⅱ的组成为：20～50mg/mL的蛋白酶K、10～20mmol/L的Tris-Hcl、0.1～0.5mg/ml的多聚腺苷酸(PolyA)、10～20mmol/LCaCl2，溶剂为水；
所述试剂Ⅲ的组成为：10～30mg/mL的硅羟基磁珠、体积百分比为30～50％的甘油，溶剂为水；
所述洗涤液I的组成为：1～5mol/L NaCl，1～10mmol/L的Tris-HCl，溶剂为水；
所述洗涤液II的组成为：5～20mmol/L的Tris-HCl、溶剂为乙醇和水，其中乙醇的体积百分比为70～80％；
所述洗脱液的组成为：5～20mmol/L的Tris-HCl，pH值8.2-8.8，溶剂为水。
作为优选实施方案，所述FGFR3基因突变检测试剂的组成为：检测FGFR3基因突变位点R248C、S249C、Y375C的引物探针，热启动DNA聚合酶，热敏UDG酶，牛血清白蛋白，dATP，dCTP，dGTP，dUTP，MgCl2，Tris；(NH4)2SO4，溶剂为水。
作为优选实施方案，所述FGFR3基因突变检测试剂的各组分在PCR反应体系中的组成为：
引物浓度：100～900nM
探针浓度：25～500nM
热启动DNA聚合酶：1～50U
热敏的UDG酶：0.1～10U
牛血清白蛋白1～5wt％
dATP0.1～10mM
dCTP0.1～10mM
dGTP0.1～10mM
dUTP0.1～10mM
MgCl20.1～10mM
Tris10～100mM
(NH4)2SO410～100mM
溶剂为水，pH7-9。
作为优选实施方案，所述细胞膜裂解试剂包括体积百分比0.01％-0.1％的Tween-20，溶剂为水。
作为优选实施方案，所述细胞核分选装置由微流控芯片组成，包括液体的入口、出口、细胞核分选孔、细胞核收集腔和活塞；所述细胞核分选孔的直径在1-10um之间。参见图1，为细胞核分选装置的示意图。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1，本发明提供的一种用于FGFR3基因突变检测的试剂盒，可通过肿瘤细胞细胞核DNA进行FGFR3的突变检测，为膀胱癌的辅助诊断提供一种新的方法。
2，相对于现有专利专利CN106967810B，本发明的阳性检出率更高。本发明试剂盒在15例初诊患者中可以检出10例，阳性检出率为66.67％，专利CN106967810B提供试剂盒在15例初诊患者中可以检出8例，阳性检出率为53.33％。本发明阳性检出率高的主要原因在于：专利CN106967810B提取的是尿脱落细胞的总DNA，本发明提取的是尿脱落肿瘤细胞的细胞核DNA。
附图说明
图1为本发明细胞核分选装置的示意图。
图2为本发明实施例1中R248C引物及探针特异性检测结果。
图3为本发明实施例1中S249C引物及探针特异性检测结果。
图4为本发明实施例1中Y375C引物及探针特异性检测结果。
图5为本发明实施例2中FGFR3S249C阳性细胞系测试的PCR扩增图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
实施例1FGFR3基因突变检测相关引物及探针特异性测试
1)包含有FGFR3突变基因序列的质粒合成
将表1的FGFR3基因突变序列送生工生物工程(上海)股份有限公司进行质粒合成，将合成的质粒使用无酶水稀释至1ng/uL，并用使用ddPCR进行定量，稀释至1copies/uL用于后续实验。
表1 FGFR3基因突变序列信息
Figure BDA0003315470490000041
Figure BDA0003315470490000051
2)FGFR3野生型基因组DNA制备
取一定量的RT4细胞，使用QIAGEN公司的QIAampDNAMicroKit(50)(货号：56304)进行提取，并使用浓度测定，定量后的模板稀释至1ng/uL用于后续实验。
3)引物探针特异性测试
将表2中包含的引物及探针序列送上海百力格生物技术有限公司进行合成，将合成的引物及探针按照要求使用无酶水进行稀释，检测R248C、S249C、Y375C的引物及探针各自配置为一个引物及探针的混合液，其中引物在混合液中的浓度均稀释为10uM，探针在混合液中的浓度均稀释为5uM。
表2检测FGFR3基因突变的引物及探针序列
Figure BDA0003315470490000052
检测FGFR3基因突变使用的PCR反应液的配制如下：
反应液A配制：500U的热启动DNA聚合酶，100U的热敏的UDG，配置在500uL 20wt％的BSA溶液中，溶剂为水；
反应液B配制：10mM dATP，10mM dCTP，10mM dGTP，20mM dUTP，20mM MgCl2，500mMTris，300mM(NH4)2SO4，配制为pH7.8的水溶液500uL；
取FGFR3阳性的质粒模板及阴性的gDNA模板各适量，按照表3体系配制PCR反应液，反应总体积为50uL。
表3
组份 上样体积(uL)
质粒(10copies)/gDNA(10ng) 10
引物探针混合液 1
反应液A 5
反应液B 5
H<sub>2</sub>O 29
将配制好的PCR反应液置于ABI7500上，按照表4中的程序运行：
表4
Figure BDA0003315470490000061
PCR扩增结果分别如图2、图3、图4所示，其中图2为R248C引物及探针特异性检测结果；图3为S249C引物及探针特异性检测结果；图4为Y375C引物及探针特异性检测结果。检测结果显示：R248C、S249C、Y375C三个突变位点在10copies左右均可检出，且使用阴性模板RT4gDNA测试均无阳性扩增，说明引物及探针的特异性均较好。
实施例2 FGFR3基因突变检测试剂盒测试
取FGFR3 S249C阳性细胞系97-7细胞2000个，使用本发明试剂盒进行测试，详细操作流程如下，重复测定10次。
1)细胞膜裂解：向上述细胞沉淀加入200uL细胞膜裂解试剂(0.05％Tween)，充分吹打均匀，室温放置30min，之后16000g，4℃，离心15min，弃上清，沉淀用200uL PBS重悬，所得重悬液即为细胞核重悬液；
2)将上述细胞核重悬液通过微量注射器注入分选孔经为8um的微流控芯片，进行细胞核的分选，分选结束后，使用200uL的PBS对芯片进行清洗；
3)细胞核DNA提取，取细胞核提取试剂中的试剂Ⅰ(2mol/L的异硫氰酸胍、10mmol/L的柠檬酸钠、0.03g/ml的聚多卡醇、25％的乙醇、5mmol/L的β-巯基乙醇)800uL与试剂Ⅱ(20mg/mL的蛋白酶K、10mmol/L的Tris-Hcl、0.5mg/ml的PolyA(多聚腺苷酸)、20mmol/LCaCl2)40uL，混匀，取200uL注入微流控芯片，室温孵育10min，使用注射器将液体全部推出，收集流出液；之后再使用200uL试剂Ⅰ与试剂Ⅱ的混匀液，注入芯片，室温孵育5min，收集流出液；使用剩余试剂混匀液对芯片进行冲洗，一并收集，并合并收集液；
向上述收集液中加入40uL试剂Ⅲ(20mg/mL的直径为200nm的硅羟基磁珠、体积百分比为50％的甘油)；
将离心管放置于磁力架上，静置1min使溶液变透明，弃溶液；
加入400uL洗涤液I(2mol/LNaCl，10mmol/L的Tris-HCl)，充分混匀，瞬时离心3s，将离心管放置于磁力架上，静置30s使溶液变透明，弃溶液；
加入500uL洗涤液II(20mmol/L的Tris-HCL、体积百分比为80％的乙醇)，充分混匀，瞬时离心3s，将离心管放置于磁力架上，静置30s使溶液变透明，弃溶液；
打开离心管盖，室温静置5min，使磁珠表面的醇类尽量挥发掉后加入50uL洗脱液(10mmol/L的Tris-HCl(pH＝8.5))，充分震荡混匀，50℃震荡孵育10min，然后使用移液器将含有DNA的溶液至新管，备用。
4)FGFR3基因突变检测用PCR模板用量10uL，PCR体系配置与运行程序设置如实施例1所示；
5)检测结果如图5所示，为FGFR3 S249C阳性细胞系测试的PCR扩增图。具体的检测Ct值如表5所示。检测结果显示：使用该检测试剂盒，可以检测到细胞核中的基因突变序列，且该检测重复性较好，10次重复检测的CV值经计算为0.019，说明体系具有较好的精密度。
表5
检测位点 检测Ct值
S249C 27.02
S249C 27.25
S249C 28.46
S249C 27.39
S249C 28.59
S249C 27.84
S249C 27.77
S249C 27.69
S249C 27.25
S249C 27.09
实施例3膀胱癌患者病例样本检测
收集15例初次诊断为非肌肉浸润性膀胱癌患者的术前尿液，离心，收集尿沉渣，均分为两份，一份使用该本发明提供试剂盒进行细胞核的分离及细胞核DNA的提取，以及点突变的检测，详细操作流程如实施例2所示。一份使用专利CN 106967810 B提供试剂盒对尿沉渣进行DNA的提取及后续检测，详细操作流程如专利CN 106967810 B所示。具体检测结果如表6所示。本发明试剂盒在15例初诊患者中可以检出10例，阳性检出率为66.67％，专利CN106967810 B提供试剂盒在15例初诊患者中可以检出8例，阳性检出率为53.33％。检测结果显示：本发明试剂盒对于膀胱癌的检出有更高的灵敏度，为膀胱癌的辅助诊断提供了一种新的方法。
表6
样本编号 本发明试剂盒 专利CN106967810B
B1 阴性 阳性
B2 阳性 阴性
B3 阳性 阳性
B4 阳性 阳性
B5 阴性 阴性
B6 阳性 阳性
B7 阴性 阴性
B8 阳性 阴性
B9 阳性 阳性
B10 阳性 阳性
B11 阳性 阴性
B12 阳性 阳性
B13 阴性 阴性
B14 阳性 阳性
B15 阴性 阴性
实施例4细胞核DNA和细胞总DNA的FGFR3基因突变检测对比
收集10例初次诊断为膀胱癌患者的术前尿液(编号依次为C1-C10)，离心，收集尿沉渣，均分为两份样本，一份样本使用该本发明提供试剂盒对尿脱落细胞进行细胞核的分离及细胞核DNA的提取，以及点突变的检测，详细操作流程如实施例2所示。另一份样本直接对尿脱落细胞使用QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit(50)(货号51304)试剂盒进行细胞总DNA的提取，将提取后的DNA使用本发明中的突变位点和引物探针检测体系进行测试。具体检测结果如表7所示。本发明试剂盒在10例初诊患者中可以检出6例，阳性检出率为60％；针对尿脱落细胞总DNA的检测方法在10例初诊患者中可以检出4例，阳性检出率为40％。检测结果显示：本发明试剂盒针对细胞核DNA进行检测相对于尿脱落细胞总DNA检测方法，具有更高的检测灵敏度，为膀胱癌的辅助诊断提供了一种新的方法。
表7
样本编号 本发明试剂盒 尿脱落细胞
C1 阴性 阴性
C2 阳性 阴性
C3 阳性 阳性
C4 阳性 阳性
C5 阴性 阴性
C6 阴性 阴性
C7 阳性 阴性
C8 阳性 阳性
C9 阴性 阴性
C10 阳性 阳性
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
序列表
<110> 上海思路迪生物医学科技有限公司
<120> FGFR3基因突变检测在膀胱癌诊断中的应用及试剂盒
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 1
atctgccccc acagagt 17
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 2
ccttgctgcc attcacctcc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 探针(probe)
<400> 3
ggcggggctg ccggccaacc 20
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 4
gcccccacag agcgctg 17
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 5
ccttgctgcc attcacctcc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 探针(probe)
<400> 6
ggcggggctg ccggccaacc 20
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 7
gaggcgggca gtgtgtg 17
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 8
gttacctgtc gcttgagcgg 20
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 探针(probe)
<400> 9
ctacggggtg ggcttcttcc tgttcatcct 30
<210> 10
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tggacgtgct gggtgagggc cctggggcgg cgcgggggtg ggggcggcag tggcggtggt 60
ggtgagggag ggggtggccc ctgagcgtca tctgccccca cagagtgctc cccgcaccgg 120
cccatcctgc aggcggggct gccggccaac cagacggcgg tgctgggcag cgacgtggag 180
ttccactgca aggtgtacag tgacgcacag ccccacatcc agtggctcaa gcacgtggag 240
gtgaatggca gcaaggtggg cccggacggc acaccctacg ttaccgtgct caaggtgggc 300
<210> 11
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tggacgtgct gggtgagggc cctggggcgg cgcgggggtg ggggcggcag tggcggtggt 60
ggtgagggag ggggtggccc ctgagcgtca tctgccccca cagagcgctg cccgcaccgg 120
cccatcctgc aggcggggct gccggccaac cagacggcgg tgctgggcag cgacgtggag 180
ttccactgca aggtgtacag tgacgcacag ccccacatcc agtggctcaa gcacgtggag 240
gtgaatggca gcaaggtggg cccggacggc acaccctacg ttaccgtgct caaggtgggc 300
<210> 12
<211> 262
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccaggccagg cctcaacgcc catgtctttg cagccgagga ggagctggtg gaggctgacg 60
aggcgggcag tgtgtgtgca ggcatcctca gctacggggt gggcttcttc ctgttcatcc 120
tggtggtggc ggctgtgacg ctctgccgcc tgcgcagccc ccccaagaaa ggcctgggct 180
cccccaccgt gcacaagatc tcccgcttcc cgctcaagcg acaggtaaca gaaagtagat 240
accaggttct gagctgcctg cc 262

Claims (10)

1.FGFR3基因突变检测在制备膀胱癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于：对尿脱落肿瘤细胞的细胞核DNA进行FGFR3基因突变位点的检测。
2.如权利要求1所述的FGFR3基因突变检测在制备膀胱癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述FGFR3基因突变位点为R248C、S249C、Y375C其中至少一种。
3.如权利要求2所述的FGFR3基因突变检测在制备膀胱癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于：检测R248C突变位点的引物如SEQ ID NO：1～2所示、探针如SEQ ID NO：3所示；检测S249C突变位点的引物如SEQ ID NO：4～5所示、探针如SEQ ID NO：6所示；检测Y375C突变位点的引物如SEQ ID NO：7～8所示、探针如SEQ ID NO：9所示。
4.一种用于FGFR3基因突变检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括细胞核DNA提取试剂和FGFR3基因突变检测试剂。
5.如权利要求4所述的用于FGFR3基因突变检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括细胞膜裂解试剂和细胞核分选装置。
6.如权利要求4所述的用于FGFR3基因突变检测的试剂盒，其特征在于：所述细胞核DNA提取试剂包括试剂Ⅰ、试剂Ⅱ、试剂Ⅲ、洗涤液I、洗涤液II、洗脱液；
所述试剂Ⅰ的组成为：1～3mol/L的异硫氰酸胍、5～10mmol/L的柠檬酸钠、0.01～0.05g/ml的聚多卡醇、3～5mmol/L的β-巯基乙醇，溶剂为乙醇和水，其中乙醇的体积百分比为15～45％；
所述试剂Ⅱ的组成为：20～50mg/mL的蛋白酶K、10～20mmol/L的Tris-Hcl、0.1～0.5mg/ml的多聚腺苷酸、10～20mmol/L CaCl2，溶剂为水；
所述试剂Ⅲ的组成为：10～30mg/mL的硅羟基磁珠、体积百分比为30～50％的甘油，溶剂为水；
所述洗涤液I的组成为：1～5mol/LNaCl，1～10mmol/L的Tris-HCl，溶剂为水；
所述洗涤液II的组成为：5～20mmol/L的Tris-HCl、溶剂为乙醇和水，其中乙醇的体积百分比为70～80％；
所述洗脱液的组成为：5～20mmol/L的Tris-HCl，pH值8.2-8.8，溶剂为水。
7.如权利要求4所述的用于FGFR3基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述FGFR3基因突变检测试剂的组成为：检测FGFR3基因突变位点R248C、S249C、Y375C的引物和探针，热启动DNA聚合酶，热敏UDG酶，牛血清白蛋白，dATP，dCTP，dGTP，dUTP，MgCl2，Tris；(NH4)2SO4，溶剂为水。
8.如权利要求7所述的用于FGFR3基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述FGFR3基因突变检测试剂的各组分在PCR反应体系中的组成为：
引物浓度：100～900nM
探针浓度：25～500nM
热启动DNA聚合酶：1～50U
热敏的UDG酶：0.1～10U
牛血清白蛋白1～5wt％
dATP 0.1～10mM
dCTP 0.1～10mM
dGTP 0.1～10mM
dUTP 0.1～10mM
MgCl20.1～10mM
Tris 10～100mM
(NH4)2SO4 10～100mM
溶剂为水，pH7-9。
9.如权利要求5所述的用于FGFR3基因突变检测的试剂盒，其特征在于：所述细胞膜裂解试剂包括体积百分比为0.01％-0.1％的Tween-20，溶剂为水。
10.如权利要求5所述的用于FGFR3基因突变检测的试剂盒，其特征在于：所述细胞核分选装置由微流控芯片组成，包括液体的入口、出口、细胞核分选孔、细胞核收集腔和活塞；所述细胞核分选孔的直径在1-10um之间。
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