CN108998504A

CN108998504A - 一种提高基因突变检测灵敏度的方法

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Publication number: CN108998504A
Application number: CN201810899234.2A
Authority: CN
Inventors: 鲍伟胜; 王春雷
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-08-08
Filing date: 2018-08-08
Publication date: 2018-12-14

Abstract

本发明涉及基因突变检测技术，具体涉及一种提高基因突变检测灵敏度的方法，包括以下几个步骤：S1、靶向DNA序列的PCR扩增；S2、PCR产物的纯化；S3、突变型特异性引物的延伸；S4、突变型基因DNA片段的杂交和富集。与传统的用作基因突变检测的ASPE技术不同，本发明的突变型特异性引物的延伸反应体系中，只加入突变型的前向引物和未标记的dNTPs；并且在突变型基因DNA片段的杂交后，通过核酸的变性和复性过程，而富集突变型基因DNA片段。该方法除去测序体系中占有主要部分的野生型基因DNA片段，富集了突变型基因DNA片段，显著的提高Sanger和NGS测序的灵敏度，理论上的提高能够达到100倍的数量级。本发明既可以富集单个的突变基因位点，又可以同时富集多个突变基因位点。

Description

一种提高基因突变检测灵敏度的方法

技术领域

本发明涉及基因突变检测技术，具体涉及一种提高基因突变检测灵敏度的方法。

背景技术

癌症有许多原因，但最终所有这些原因都对一类称为癌症基因或原癌基因的特殊基因起作用。癌基因通常执行基本的细胞功能，与调节细胞分裂有关。然而，原癌基因也可转变为致癌基因。原癌基因可以转变成其致癌(基因)状态的主要方式之一是通过基因突变。自发或环境诱发的突变发生在单个细胞的原癌基因中，然后经历多个细胞分裂形成肿瘤。

在癌症患者中，凋亡和坏死的肿瘤细胞释放他们的DNA内容到血液里，这通常称为循环肿瘤DNA(ctDNA)。液态活检技术可以从人体血浆中获得ctDNA，使用DNA测序或分子基因分型检测以鉴定和定量测量ctDNA携带体细胞基因突变的分子，对ctDNA基因突变的检测有着重要的作用。特定的基因突变可能表明某些类型肿瘤的存在，从而减少了对侵入性的组织活检的需求。定量监测ctDNA中的基因突变可以提供有关肿瘤患者在治疗期间的肿瘤负载的信息。此外，根据特定基因的突变情况，为肿瘤患者提供治疗方案，如直肠癌患者，KRAS基因的突变预示该患者对抗表皮生长因子受体单克隆抗体治疗效果很差。

目前ctDNA基因突变的分析方法包括下一代靶向测序(Next GenerationSequencing,NGS)和荧光探针的ddPCR。无论采用何种方法，对ctDNA基因突变的检测均存在挑战。血液中的DNA高度分裂成低分子量的DNA，平均小于200bp。ctDNA与正常DNA混杂在一起，因而，肿瘤DNA被来自正常细胞的DNA严重稀释，其含量可能低至0.01％。更为严重的是，每个突变等位基因在数目上明显的不敌几乎相同的野生型等位基因，数量比超过1比10,000。过多的野生型基因易导致假阳性的出现，并且使低含量的突变信号与噪音无法区分。下一代靶向测序的灵敏度大约是0.1％，对于低于0.1％的基因突变NGS则不能准确的检测出。因此，需要一种新的技术，能够尽可能的把含量丰富的野生型等位基因从ctDNA或循环的无细胞DNA(cfDNA)中分离出来，从而富集和提高突变基因的含量，便于NGS准确的测序。

发明内容

本发明的目的是解决上述现有技术的不足，提供一种提高基因突变检测灵敏度的方法。

ctDNA含量偏低和突变型基因被大量野生型基因所遮蔽是影响基因突变检测灵敏度的主要因素。ctDNA含量的高低取决于肿瘤的负载和患者的治疗情况。在同一个反应体系中分离出野生型基因，从而富集突变型基因，有利于NGS的准确测序。利用PCR技术对靶向DNA序列进行放大扩增，这样野生型和突变型基因DNA序列均得到信号的扩增。PCR产物纯化后，再进行第二次的PCR的扩增。但这次的扩增仅针对于突变型基因，利用突变型的引物来进行。只有该引物3′末端碱基与基因突变的SNP位点完全碱基配对后，引物才能与模板结合和延伸。同时，突变型引物的5′末端有用于杂交用的Tag片段序列或者生物素。羧基磁珠、DNA芯片或其它的固态物质的表面均有抗Tag的序列或者链霉亲和素。利用Tag和抗Tag的碱基配对作用或者链霉亲和素与生物素的天然亲和力作用，把扩增后的突变型与野生型的基因DNA片段分开，从而达到富集突变型基因DNA片段的作用。该富集的效率可达到几千倍。

该方法有以下几个步骤：

S1、靶向DNA序列的PCR扩增；靶向序列的选择是尽可能的把所有的基因突变的位点包括在内，这样一次的PCR扩增，产物就可以用于后续不同的突变基因序列的扩增反应；

S2、扩增后PCR产物的纯化；

S3、利用突变型特异性引物对纯化后扩增PCR产物进行延伸；

S4、对延伸后的突变型基因DNA片段进行杂交和富集。

优选地，步骤S2所述PCR产物的纯化方法为使用核酸外切酶I降解任何剩余的PCR引物或者使用市售PCR产物的纯化试剂盒。PCR产物一般都含有过量的引物，将直接影响到后续的PCR反应，因此有必要除去。

优选地，步骤S3中所述延伸反应体系中仅加入突变型的前向引物和未标记的dNTPs。突变型特异性引物的延伸是利用前向引物与DNA模板突变位点的相互作用来决定的。只有前向引物3′末端碱基与基因突变的SNP点完全配对后，引物才能与模板结合且延伸。因此，突变型的前向引物不与野生型基因的DNA模板结合，只与突变型基因的DNA模板结合和延伸。

在同一反应体系中，含有野生型和突变型基因的DNA扩增产物。但与传统的等位基因特异性引物延伸(Allele Specific Primer Extension,ASPE)技术所不同的是：①本发明的反应体系中仅加入突变的前向引物，当存在引物的3′末端碱基与模板DNA的突变位点相配对时，引导前向引物与DNA模板的结合和延长。同时，野生型的基因DNA片段则不能发生前向引物的结合和延伸。②本发明不需要引入任何的荧光染料如Cy5或生物素，只需加入未标记的dNTPs。传统的ASPE技术中用荧光染料如cy5或生物素(Biotin)标记的dNTPs，便于下一步的荧光扫描或化学发光/颜色反应方法对基因突变的检测。③本发明则是富集突变型基因DNA的含量，为Sanger和NGS的测序提供基础，而不是直接检测基因突变位点的存在。相对于ASPE测序的1～5％的灵敏度和NGS测序的0.1％的灵敏度，本发明能够100倍的提高NGS测序的灵敏度。

优选地，步骤S4中所述突变型基因DNA片段的杂交是指，将带有突变型引物的突变型基因DNA片段固定在固态物质上，不能固定的野生型的DNA片段则被冲洗掉。

更进一步地，所述杂交方式包括在突变型引物与待混合的固态物质上分别加Tag与抗-Tag片段序列；或者在突变型引物与待混合的固态物质上分别加生物素与链霉亲和素。利用Tag和抗Tag的碱基配对作用或者链霉亲和素与生物素的天然亲和力作用，把扩增后的突变型的DNA产物固定在固态物质上。

优选地，步骤S4中所述突变型基因DNA片段的富集是指，将杂交后的突变型基因DNA片段通过高温(90～100℃)解链变性从固态物质上解离，迅速提取溶液再缓慢降低温度，变性的单链DNA可恢复其双链结构。复性的DNA产物用于NGS的测序。

优选地，所述固态物质为羧基磁珠或DNA芯片。

本发明的有益效果在于：

本发明应用于肿瘤患者的ctDNA或cfDNA，在检测体系中除去野生型的基因DNA片段，富集了突变型基因DNA片段。既消除了野生型基因DNA对突变型基因DNA信号的干扰，与NGS结合又能显著的提高NGS测序的灵敏度，理论上NGS的灵敏度能够提高100倍数量级以上。由于ctDNA含量在整个cfDNA中占的比重极其的小，NGS测序的灵敏度的提高将推动ctDNA在肿瘤的早期诊断和个性化治疗方面的快速发展。

附图说明

图1为靶向DNA序列的PCR扩增图；其中，A为扩增前，B为扩增后；直线代表ctDNA或其它来源的DNA条带，点代表基因突变位点；

图2为突变型的前向引物不与野生型基因的DNA模板结合；

图3为突变型的前向引物与突变型基因的DNA模板结合；

图4为突变型的前向引物在突变型基因的DNA模板上的延伸；

图5为突变型基因DNA片段在DNA芯片上的杂交；

图6为实施例1扩增后的PCR片段在1.5％琼脂糖凝胶上的电泳图；

图7为实施例2扩增后的PCR片段在1.5％琼脂糖凝胶上的电泳图；

图8为突变型基因DNA片段与羧基磁珠的杂交结合。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述，以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。

本发明的验证是通过对加入参考野生型基因组DNA中人工合成的基因突变DNA突变位点的检测来实现的。该参考野生型基因组DNA代表从许多健康供体的血液中提取的DNA的混合物(从Roche Diagnostics，美国购买)。即不同组个体的DNA产生不同批次的参考野生型基因组DNA，并且已通过技术证实这些参考野生型基因组DNA中无任何基因突变。

KRAS基因来源：人工合成含有密码子12和13突变位点的KRAS DNA片段(180bp)，并稀释至10⁵cp/μL的标准浓度。然后将该浓度进一步稀释至100cp/μL，并储存直至进一步使用。

BRAF基因来源：人工合成含有V600E突变位点的BRAF DNA片段(180bp),并稀释至10⁵cp/μL的标准浓度。然后将该浓度进一步稀释至100cp/μL，并储存直至进一步使用。

在每300ng野生型基因组DNA中，加入不同量的人工合成的突变的DNA，形成含有突变基因的0(野生型)、10、50或100个拷贝数(cp)的样品。这些样品被用来验证本发明对基因突变的检测。

本发明检测灵敏度(LOD)的测定是基于平均背景信号(参考野生型样品中多次运行中观察到的信号)加上3个标准差。

实施例1 以KRAS基因为例的单个基因突变位点的检测

对带有基因突变位点的靶DNA序列进行PCR扩增，如图1所示，是对不同基因的单个突变位点DNA的扩增，扩增后的PCR产物的大小大约是100～200bp。由于使用了正常的PCR引物对，所以PCR扩增的产物有野生基因的DNA片段和突变基因的DNA片段；并且野生型基因的DNA片段占主要的部分。扩增后的PCR产物需要做纯化处理，主要是剩余的PCR引物会干扰下一个PCR反应。用核酸外切酶I失活剩余的PCR引物，纯化后的PCR产物用于突变型特异性引物的延伸。

只用突变型的前向引物，利用引物3′末端的碱基与DNA模板上基因突变位点相互配对的原则，推动引物与DNA模板的结合和延伸。只有前向引物3′末端碱基与基因突变的SNP点完全配对后，引物才能与模板结合且延伸。因此，突变型的前向引物不与野生型基因的DNA模板结合，只与突变型基因的DNA模板结合和延伸，如图2～4所示。

在突变型前向引物的5′端连接有Tag序列，长度约为30～100个碱基对的大小。在DNA芯片的表面连接有抗-Tag的序列。通过Tag/抗-Tag的碱基配对作用，把带有突变基因的DNA片段固定在DNA芯片的表面，如图5所示。野生型的基因DNA片段由于没有固定则被冲洗掉。这样，达到富集突变型基因DNA片段的目的。

利用高温(90～100℃)来解链，把突变型基因DNA片段从杂交中释放出来，迅速提取溶液再缓慢降低温度，变性的单链DNA可恢复其双链结构，复性后的突变型基因DNA片段用于Sanger或NGS的测序。

以人的KRAS基因为例(SEQ NO.1)，四个碱基34G、35G、37G、38G是KRAS基因密码子12、13上常见的基因突变位点。

1.靶向DNA序列的PCR扩增(以34G>T，G12C为例)

所有PCR反应均在25μL体积中进行，1×PCR缓冲液，10mM dNTPs，正向和反向引物各10pmol，1U/μL Taq DNA聚合酶。DNA的量是10～20ng。

前向引物序列：TAAACTTGTGGTAGTTGGAGC

后向引物序列：TGCTGTGTCGAGAATATCCAA

PCR反应条件是：95℃5分钟，然后95℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，30个循环，最后，72℃5分钟。反应结束后，冷却到4℃。

扩增的PCR产物的大小是166bp，包含了KRAS基因密码子12上所有的基因突变位点。扩增后的PCR片段在1.5％琼脂糖凝胶电泳上的图像如图6所示。

2.核酸外切酶I反应：

靶向DNA序列的PCR扩增结束后，需要把反应体系中多余的引物除去，以避免引物对后续PCR反应的影响。在25μL PCR反应中，直接加入0.5μL外切核酸酶I(5U)。然后将样品在37℃下孵育30分钟，随后通过在99℃孵育15分钟来灭活酶。反应结束后，冷却到4℃，用于Tag突变型前向引物延伸反应。

3.Tag突变型前向引物延伸反应

所有PCR反应均在20μL体积中进行，5μL步骤2中纯化的PCR产物，1×PCR缓冲液，10mM dNTPs，Tag突变型前向引物10pmol，1U/μL Taq DNA聚合酶。

引物延伸反应的条件是：95℃5分钟，然后95℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟，30个循环。

突变型前向引物：TAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTT(34G>T突变导致KRAS中第12位氨基酸从甘氨酸(G)转变成半胱氨酸(C))。

Tag-突变型前向引物:5’GTAGCGCGACGGCCAGTCAGGCCAAGTCT-TAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTT 3’

Tag-突变型前向引物延伸反应的条件是：95℃2分钟，然后95℃30秒，58℃30秒，74℃60秒，40个循环。

4.Tag/Anti-Tag的杂交反应

Anti-Tag序列：5’AGACTTGGCCTGACTGGCCGTCGCGCTAC 3’；

将20μL的引物延伸反应产物悬浮于50μL杂交缓冲液中(5X SSC，0.1％SDS，25mg/mL鲑鱼精DNA，25％甲酰胺，0.5mg/mL多聚A，10％硫酸葡聚糖)。加入到DNA芯片中，45℃下杂交30分钟。在室温下用0.1X SSC洗涤4次，每次1分钟。野生型的基因DNA没有参与到引物延伸反应，Tag序列不能被整合到DNA双链上。所以，不能与DNA芯片上Anti-Tag进行杂交反应，因而在洗涤阶段被去掉。

5.突变型DNA的收集

加入100μL去离子水到DNA芯片上，95℃加热5分钟，主要使Tag/Anti-Tag杂交解链，迅速提取芯片上的液体，再缓慢降低温度，变性的单链DNA可恢复其双链结构。

6.DNA测序文库的制备和测序

使用铂的DNA聚合酶和含有5'MiSeq衔接子标签的通用引物，通过35个PCR循环扩增产物并用MiSeq衔接子标记。然后使用相关的试剂盒纯化该步骤的PCR输出。然后使用KAPA文库定量试剂盒通过qPCR定量样品，并标准化至2nM的浓度。然后将标准化的样品合并成六组，并在MiSeq平台上对配对末端131bp读数进行测序。

7.结果

KRAS G12C的检测灵敏度(LOD)是0.005％。

实施例2 以KRAS,BRAF基因为例的多基因突变位点的检测

同一个基因内针对多个不同突变位点的靶DNA序列进行PCR扩增，扩增后的PCR产物的大小大约是100～200bp。由于使用了正常的PCR引物对，所以PCR扩增的产物有野生基因的DNA片段和突变基因的DNA片段；并且野生型基因的DNA片段占主要的部分。扩增后的PCR产物需要做纯化处理，主要是剩余的PCR引物会干扰下一个PCR反应。用核酸外切酶I失活剩余的PCR引物，纯化后的PCR产物用于突变型特异性引物的延伸。

只用突变型的前向引物，利用引物3′末端的碱基与DNA模板上基因突变位点相互配对的原则，推动引物与DNA模板的结合和延伸。只有前向引物3′末端碱基与基因突变的SNP点完全配对后，引物才能与模板结合且延伸。因此，突变型的前向引物不与野生型基因的DNA模板结合，只与突变型基因的DNA模板结合和延伸。

在突变型前向引物的5′端连接有Tag序列，长度约为30～100个碱基对的大小。在DNA芯片的表面连接有抗-Tag的序列。通过Tag/抗-Tag的碱基配对作用，把带有突变基因的DNA片段固定在DNA芯片的表面。野生型的基因DNA片段由于没有固定则被冲洗掉。这样，达到富集突变型基因DNA片段的目的。

以人的KRAS基因(SEQ NO.1)34G>T(G12C)、BRAF(SEQ NO.2)c.1799T>A(V600E)(碱基1799T突变)为例。

1.靶向DNA序列的PCR扩增

所有PCR反应均在25μL体积中进行，1×PCR缓冲液，10mM dNTPs，KRAS和BRAF的正向/反向引物各10pmol，1U/μL Taq DNA聚合酶。DNA的量是1～10ng。

KRAS的引物

前向引物序列：TAAACTTGTGGTAGTTGGAGC

后向引物序列：TGCTGTGTCGAGAATATCCAA

KRAS PCR产物的大小：166bp。

BRAF的引物

前向引物序列：CGCCAAGTCAATCATCCACA

后向引物序列：TGGCACCAGAAGTCATCAGA

KRAS PCR产物的大小：175bp。

将KRAS和BRAF的两对引物放在同一个PCR反应体系内，有助于节约了反应的时间，加快整个实验的过程。

取5μL的PCR产物用在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，结果如图7所示。

2.核酸外切酶I反应：

靶向DNA序列的PCR扩增结束后，需要把反应体系中多余的引物除去，以避免引物对后续PCR反应的影响。

在25μL PCR反应中，直接加入0.5μL外切核酸酶I(5U)。37℃下孵育30分钟，随后99℃孵育15分钟来灭活酶。反应结束后，冷却到4℃，用于Tag突变型前向引物延伸反应。

3.Tag突变型前向引物延伸反应

所有PCR反应均在20μL体积中进行，5μL步骤2中纯化的PCR产物，1×PCR缓冲液，10mM dNTPs，KRAS和BRAF的Tag突变型前向引物分别为10pmol，1U/μL Taq DNA聚合酶。

KRAS突变型前向引物：TAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTT。

BRAF突变型前向引物：AGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGA

KRAS-Tag1-突变型前向引物：

5’GTAGCGCGACGGCCAGTCAGGCCAAGTCT-TAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTT 3’

BRAF-Tag2-突变型前向引物：

5’GTGCCGGTACTTGCAGACAGGCCAAGTCT-AGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGA 3’

4.Tag/Anti-Tag的杂交反应

KRAS Anti-Tag1序列：5’AGACTTGGCCTGACTGGCCGTCGCGCTAC 3’；

BRAF Anti-Tag2序列：5’AGACTTGGCCTGTCTGCAAGTACCGGCAC 3’。

将20μL的引物延伸反应产物悬浮于50μL杂交缓冲液中(5X SSC，0.1％SDS，25mg/mL鲑鱼精DNA，25％甲酰胺，0.5mg/mL多聚A，10％硫酸葡聚糖)。加入到DNA芯片中，45℃下杂交30分钟。在室温下用0.1X SSC洗涤4次，每次1分钟。野生型的基因DNA没有参与到引物延伸反应，Tag序列不能被整合到DNA双链上。所以，不能与DNA芯片上Anti-Tag进行杂交反应，而在洗涤阶段被除掉。

5.突变型DNA的收集

6.DNA测序文库的制备和测序

7.结果

KRAS G12C和BRAF V600E的检测灵敏度(LOD)分别是0.005％和0.002％。

实施例3

同一个基因内针对多个不同突变位点的靶DNA序列进行PCR扩增，扩增后的PCR产物的大小大约是100～200bp。由于使用了正常的PCR引物对，所以PCR扩增的产物有野生基因的DNA片段和突变基因的DNA片段；并且野生型基因的DNA片段占主要的部分。扩增后的PCR产物需要做纯化处理，主要是剩余的PCR引物会干扰下一个PCR反应。使用市售PCR纯化试剂盒，试剂盒能够纯化>100bp的PCR产物，且纯化后PCR的回收率均大于90％，纯化后的PCR产物用于突变型特异性引物的延伸。

在突变型前向引物的5′端连接有Tag序列，长度约为30～100个碱基对的大小。在羧基磁珠的表面连接有抗-Tag的序列。通过Tag/抗-Tag的碱基配对作用，把带有突变基因的DNA片段固定在羧基磁珠的表面，如图8所示。野生型的基因DNA片段由于没有固定则被冲洗掉。这样，达到富集突变型基因DNA片段的目的。

实施例4

在突变型前向引物的5′端连接生物素，在磁珠的表面连接链霉亲和素。利用生物素和链霉亲和素的天然亲和力作用，把带有突变基因的DNA片段固定在磁珠的表面。野生型的基因DNA片段由于没有固定则被冲洗掉。这样，达到分离和富集突变型基因DNA片段的目的。

在高于70℃的温度下在非离子水溶液中短暂孵育可以有效地破坏生物素和链霉亲和素之间的连接而不会使链霉抗生物素蛋白四聚体变性，因此可以把突变型基因DNA片段从杂交中释放出来，再缓慢降低温度，变性的单链DNA可恢复其双链结构，复性后的突变型基因DNA片段由于Sanger或NGS的测序。

以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，如利用不同的机制把突变型基因DNA片段固定在其它不同的固体的表面而分离和富集突变型基因DNA的方法，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 鲍伟胜；王春雷

<120> 一种提高基因突变检测灵敏度的方法

<130> 2018

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 570

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctggtggcg taggcaagag tgccttgacg 60

atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120

aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt 180

caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt 240

gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300

aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360

ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420

tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag agagtggagg atgcttttta tacattggtg 480

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<212> DNA

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gaccgatcct catcagctcc caatgtgcat ataaacacaa tagaacctgt caatattgat 1140

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aacagggacc agataatttt tatggtggga cgaggatacc tgtctccaga tctcagtaag 2040

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ttgccaaaaa ttcaccgcag tgcatcagaa ccctccttga atcgggctgg tttccaaaca 2220

gaggatttta gtctatatgc ttgtgcttct ccaaaaacac ccatccaggc agggggatat 2280

ggtgcgtttc ctgtccactg a 2301

Claims

1.一种提高基因突变检测灵敏度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、靶向DNA序列的PCR扩增；

S2、扩增后PCR产物的纯化；

S3、利用突变型特异性引物对纯化后扩增PCR产物进行延伸；

S4、对延伸后的突变型基因DNA片段进行杂交和富集。

2.根据权利要求1所述的一种提高基因突变检测灵敏度的方法，其特征在于：步骤S2所述PCR产物的纯化方法为使用核酸外切酶I降解任何剩余的PCR引物或者使用市售PCR产物的纯化试剂盒。

3.根据权利要求1所述的一种提高基因突变检测灵敏度的方法，其特征在于：步骤S3中所述延伸反应体系中仅加入突变型的前向引物和未标记的dNTPs。

4.根据权利要求1所述的一种提高基因突变检测灵敏度的方法，其特征在于：步骤S4中所述突变型基因DNA片段的杂交是指，将带有突变型引物的突变型基因DNA片段固定在固态物质上。

5.根据权利要求4所述的一种提高基因突变检测灵敏度的方法，其特征在于：所述杂交方式包括在突变型引物与待混合的固态物质上分别加Tag与抗-Tag片段序列；或者在突变型引物与待混合的固态物质上分别加链霉亲和素与生物素。

6.根据权利要求1或4所述的一种提高基因突变检测灵敏度的方法，其特征在于：步骤S4中所述突变型基因DNA片段的富集是指，将杂交后的突变型基因DNA片段通过高温变性从固态物质上解离，迅速提取溶液再缓慢降低温度复性。

7.根据权利要求4所述的一种提高基因突变检测灵敏度的方法，其特征在于：所述固态物质为羧基磁珠或DNA芯片。