CN110863035A - 一种检测dna直接修复通路有效性的探针库、检测方法和试剂盒 - Google Patents
一种检测dna直接修复通路有效性的探针库、检测方法和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种检测DNA直接修复通路有效性的探针库、检测方法和试剂盒，所述探针库由SEQ ID NO.1～32所示探针组成，将该探针库制备成检测试剂盒可用于与DNA直接修复通路相关的基因的检测。使用该探针库对待分析的目标DNA片段进行富集，然后再对富集后的DNA片段通过测序手段进行测序，从而实现对基因检测的有效性。与DNA直接修复通路相关的基因可用于预测肿瘤发生的倾向性、评估肿瘤恶性程度和临床预后、指导新药筛选与研发，因此，本发明对基因功能性的研究方向起到重要的指导意义。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种检测DNA直接修复通路有效性的探针库、检测方法和试剂盒。
背景技术
异常的DNA损伤修复通路与肿瘤发生倾向性及诱导DNA损伤类抗肿瘤药物对细胞的敏感性关系密切。DNA直接修复通路主要修复TMZ等烷化剂类药物、亚硝胺等对鸟嘌呤核苷酸错误甲基化修饰造成的DNA损伤，是DNA损伤最简单的修复方式，也是重要的途径之一。修复过程具体来说比较简单，主要是MGMT具有O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶活性，在ASCC3、ALKBH2/3的协助下直接将甲基从DNA链鸟嘌呤O6位上的甲基移到蛋白质的半胱氨酸残基上而修复损伤的DNA，完成DNA的损伤修复过程。
合成致死（Synthetic Lethality）的策略近年来在肿瘤的研究中得到广泛应用。合成致死在肿瘤研究中的概念为：当将两个不在同一修复通路中的重要基因的功能抑制掉其中之一时，细胞不会致死，但是将这两个基因的功能都抑制掉后，细胞死亡。在临床上，如果肿瘤细胞中存在其中之一的突变，而正常细胞中该基因正常，我们可以将另外一个基因作为靶点，并将其功能抑制住，达到特异性杀死肿瘤细胞，个体化治疗的目的。
前期研究发现，DNA直接修复通路参与的基因发生胚系遗传突变、特异组织中体细胞突变与肿瘤的发生、治疗效果高度相关。其中MGMT基因的突变与脑胶质瘤的发生高度相关，ALKBH2基因的多态性变异也与多种肿瘤的发生高度相关。这些基因的突变导致DNA直接修复通路有效性的改变（减弱或缺失），对肿瘤的发生、预后、治疗策略的制定都具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测DNA直接修复通路有效性的探针库、检测方法和试剂盒。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种用于检测DNA直接修复通路有效性的试剂盒，所述的试剂盒包括针对与DNA直接修复通路相关基因的如SEQ ID NO.1～32所示探针组成的探针库。
进一步的，与DNA直接修复通路相关的基因包括ASCC3、ALKBH2、ALKBH3、MGMT。
进一步的，所述基因ASCC3对应的探针序列如SEQ ID NO.1～21所示，所述基因ALKBH2对应的探针序列如SEQ ID NO.22～24所示，所述基因ALKBH3对应的探针序列如SEQID NO.25～28所示，所述基因MGMT对应的探针序列如SEQ ID NO.29～32所示。
一种检测与DNA直接修复通路相关的基因的方法，包括以下步骤：
（1）获得受试者的DNA样本库；
（2）将权利要求1所述的试剂盒中SEQ ID NO.1～32所示的全部探针与所述DNA样本库进行杂交；
（3）分离步骤（2）的杂交产物，并释放出与试剂盒中探针杂交的基因片段，采用测序技术对分离出的基因片段进行测序从而检测基因的突变情况。
进一步的，所述步骤（1）中的DNA样本库由双链DNA片段组成；
所述步骤（1）包括以下步骤：提取全基因组DNA，然后将其片段化；或者提取mRNA，将其片段化，然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA。
进一步的，所述步骤（2）中的探针进行选择性标记。
进一步的，所述步骤（2）中的探针进行生物素标记。
有益效果：本发明开发了一种检测DNA直接修复通路有效性的探针库、检测方法和试剂盒，其对DNA直接修复通路参与基因的变异情况进行整体检测分析，其主要具有以下几方面的意义：
1. 通过对DNA直接修复通路参与基因的变异情况分析，评估人体组织或细胞中DNA直接修复通路的有效性（减弱或缺失），预测肿瘤发生的倾向性，并指导患者采取相应的预防措施。
2. 通过对DNA直接修复通路参与基因的变异情况分析，评估肿瘤患者细胞中DNA直接修复通路的有效性（减弱或缺失），对肿瘤恶性程度、临床预后的评估具有重要的指导意义。
3. 通过对DNA直接修复通路参与基因的变异情况分析，评估肿瘤患者细胞中DNA直接修复通路的有效性（减弱或缺失），对放射、化疗药物选择及治疗策略的制定（如，合成致死方案等）具有重要指导意义。
4. 通过对DNA直接修复通路参与基因的变异情况分析，评估肿瘤患者细胞中DNA直接修复通路的有效性（减弱或缺失），对新的治疗靶点选择、靶向药物研发等具有重要指导意义。
附图说明
图1 为本发明所述检测方法的流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明提供了一种与DNA碱基切除修复通路相关的基因的方法，主要包括以下步骤：
（1）获得受试者的DNA样本库；提取全基因组DNA，然后将其片段化；或者提取mRNA，将其片段化，然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA；
（2）针对要检测的基因片段设计与该基因杂交的DNA探针，从中筛选出多个探针作为DNA探针库；
（3）将DNA探针库与DNA样本库进行杂交，从DNA样本库中富集得到待检测基因的DNA片段；
（4）分离步骤（3）的杂交产物，并释放出与试剂盒中探针杂交的基因片段，采用测序技术对分离出的基因片段进行测序从而检测基因的突变情况。
在实施过程中，可以先将DNA探针库中的各个探针进行生物素标记，然后在杂交后用标记有链霉亲和素的磁珠吸附杂交产物，从磁珠上释放出富集的待检测基因片段，再对基因片段进行测序分析。
具体实验过程如下：
一、准备cDNA/DNA样本库
1. 制备DNA样本库
1.1 DNA提取
采用商品化DNA提取试剂盒提取人的基因组DNA，对提取的DNA使用分光光度定量仪以及凝胶电泳系统检测DNA模板质量和浓度。DNA模板260nm吸光率大于0.05以上，吸光率A260/A280比值在1 .8到2之间为合格。
1.2 DNA片段化
将10μg合格的基因组DNA用TE缓冲液稀释至100μL。使用组织匀浆机将DNA片段化，片段长度为150～200碱基。
采用商品化纯化试剂盒对DNA进行纯化。
1.3 DNA样本库质量检测
用生物分析仪进行DNA定性定量分析，确认DNA片段长度峰值合理。
2. 制备cDNA样本库
2.1 mRNA提取
采用商品化mRNA提取试剂盒提取人的mRNA，对提取的mRNA使用分光光度定量仪以及凝胶电泳系统检测mRNA质量和浓度。吸光率A260/A280比值在1 .8到2之间为合格。
2.2 mRNA片段化
采用商品化试剂盒对mRNA进行片段化；再用商品化试剂盒对mRNA进行过柱纯化。
2.3 用商品化试剂cDNA合成试剂盒合成mRNA的第一链以及第二链cDNA
再用商品化试剂盒对cDNA过柱纯化。
3. cDNA/DNA末端修复
利用Klenow片段、T4 DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶对DNA片段进行末端修复，由于Klenow片段具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’聚合酶活性，但缺少5’-3’外切酶活性。由此，能够方便准确地对DNA片段进行末端修复。将修复后的DNA片段进行过柱纯化。
利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断，对于cDNA/DNA 5 '突出粘末端补平以及3 ‘突出粘末端打平，产生平末端，用于后续的平端连接。反应在PCR扩增仪中进行，20℃，30min。
表1
4. 在cDNA/DNA样本3'末端加上碱基A
采用具有3’-5’外切酶活性的Klenow，在经末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A的DNA片段，反应在PCR扩增仪中进行，37℃，30min。将处理后的DNA片段进行过柱纯化。
表2
5. 在cDNA/DNA两端加上接头
表3
6. 分离出合适长度的cDNA片段
使用电泳凝胶对DNA片段进行分离，对照DNA分子量，在凝胶上剪切出150-250碱基的cDNA片段。
采用商品化试剂盒将含有cDNA样本库的凝胶样本过柱纯化。
7. cDNA片段样本库质量检测
使用生物分析仪，进行cDNA定性定量分析，并确认分离出的cDNA片断长度峰值合理。
PCR条件：置于PCR扩增仪中，95℃预变性10秒，95℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸1min，共循环20次（cDNA样本库）或者5-8次（DNA样本库），最后在72℃延伸5分钟。
采用商品化试剂盒对PCR扩增产物过柱纯化。
8. 扩增DNA模板
采用PCR扩增仪对处理后的DNA样本进行聚合酶链反应增加DNA的含量，以满足与探针进行杂交的需求。
表4
PCR条件：95℃预变性30秒，95℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环15次（cDNA样本库）或者4-6次（DNA样本库）。最后在72℃延伸5分钟。采用商品化试剂盒对PCR扩增产物进行过柱纯化。
9. 扩增后cDNA/DNA样本库质量检测
使用生物分析仪，进行cDNA/DNA定性定量分析，并确认纯化后片段长度峰值合理，约200bp。
二、探针的设计原则
根据人类参考基因组HG19，结合Ensembl、CCDS、Gencode、 VEGA、SNP以及CytoBand数据库，获取本发明所述的与DNA碱基切除修复通路相关的基因及其所有编码序列。
探针的设计主要有以下几个考虑因素：
（1）特异性
严格的特异性参数可以有效的降低非目标区域上的探针结合，但也限制了部分外显子上有较低程度重复性的区域，导致探针设计的覆盖率降低。过于宽松的特异性参数会直接降低目标区域上的数据量，导致捕获效率降低，测序成本上升。因此，一个合理的特异性参数是平衡覆盖率和捕获效率的关键。我们认为一条探针在基因组上的相似性序列不超过3是最佳的特异性参数阈值。
（2）结合稳定性
探针与模板结合能力的指标是最小自由能（ΔG）和解链温度（Tm），由于这两个参数计算起来稍显复杂，一般用更为直接和简便的GC含量来间接表示探针与模板的结合能力。一般来说，GC含量越大，结合稳定性越高。实际上，GC含量越接近50%的探针，其捕获效果越好。GC含量越高，虽然探针与目标DNA片段的结合能力很好，但是与目标DNA片段结合能力最好的是其原始的互补片段（一方面长度一致，另一方面是无突变错配），因此，探针需要更高的浓度来促使其在与DNA互补片段结合的竞争中取得一定优势。
我们会优先设计GC含量接近50% 的探针，对于无法避免的GC极端情况下的探针设计，我们会在探针上增加修饰碱基从而改变GC极端情况。
（3）探针浓度
由上面的结合稳定性可知，不同结合能力的探针，其捕获效果有较大的差异。结合能力太高和太低都不利于捕获，因此，为了达到捕获效率最大程度的均一，需要对于不同GC含量的探针设定不同的浓度。通过对历史捕获数据的归纳总结，我们对不同GC含量的探针设定了不同的探针浓度参数，设定GC含量在40-60%的探针浓度基数为1，那么GC含量在30-40%和60-70%的探针，其浓度基数为1 x 22，GC含量在20-30%和70-80%的探针，其浓度基数为1 x24。
（4）探针位置
1、最佳的探针摆放位置是和目标区域100%重合，但是由于随机打断的文库、序列重复性、GC含量、突变类型等的影响，实际的探针设计策略如下：
2、由于文库一般是通过随机打断的方式产生的，为了最大限度的捕获目标文库，一般会采取tiling的方式来设计探针；
3、如果目标区域上有重复序列区域，那么设计时会在保证目标区域覆盖的情况下，向两侧延伸搜索特异性更好的区域设计探针；
4、如果目标区域上是极端GC区域，那么设计时会在保证目标区域覆盖的情况下，向两侧延伸搜索GC含量更合适的区域设计探针；
对于不同的突变类型，也需要有不同的设计思路：
1、对于超过60bp的插入或者缺失，除了需要覆盖其上的探针之外，还需要在突变断点两侧设计探针，越接近断点越好；
2、对于超过10k bp的CNV区域，最佳的探针设计策略是间隔放置稀疏探针，这样做一方面可检测CNV，另外一方可以降低测序成本；
3、对于融合发生的内含子区域，如果融合位点不确定，那么需要整个内含子全部覆盖；如果融合位点确定，那么需要在融合位点两侧设计探针。
4、对于MSI，STR等短串重复区域，除了覆盖其上的探针之外，还需要在其两侧延伸60bp设计探针。
三、DNA捕获探针杂交
1. 将DNA样本库与生物素化的DNA探针库杂交
将cDNA/DNA样本库与杂交缓冲液混合，反应条件为95℃ 5分钟，之后保持在65℃。反应在PCR扩增仪中进行。
然后将该混合物与探针库混合，反应条件为65℃ 5分钟。将杂交反应置于PCR扩增仪中，65℃孵育24小时。
四、得到经杂交的基因片段
1. 准备链霉亲和素磁珠
使用Dynabeads链霉亲和素磁珠进行杂交产物的分离。将磁珠置于混匀仪上混匀，每个样本需要50μL磁珠。
磁珠洗涤：将混合50μL磁珠和200μL结合缓冲液在混匀仪上混匀，通过外界磁场将磁珠与缓冲液分离纯化，弃掉缓冲液，重复三次。
2. 分离杂交产物
将杂交产物与链霉亲和素磁珠进行充分混合，在室温下振摇30分钟。通过外界磁场将磁珠分离纯化。
向磁珠中加入500μL洗涤缓冲液，在65℃孵育10分钟，通过外界磁场将磁珠分离纯化。以上步骤重复三次。
3. cDNA/DNA富集样本释放
将磁珠与50μL洗脱缓冲液混合，室温孵化10分钟，通过外界磁场将磁珠分离弃掉，收集上清液，上清液即为富集的与DNA碱基切除修复通路相关的基因片段。
五、PCR扩增与纯化
将富集的基因片段进行进一步扩增，为测序仪器上样做准备。
表5
| 反应材料 | 体积（μL） |
| 加上接头后cDNA/DNA样本库 | 20 |
| 10×DNA聚合酶缓冲液 | 5 |
| DNA聚合酶 | 1 |
| 接头正引物 | 1 |
| 接头反引物 | 1 |
| 超纯水 | 总体积补至50μL |
PCR条件：置于PCR扩增仪中，95℃预变性10秒，95℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸1min，共循环20次（cDNA样本库）或者5-8次（DNA样本库），最后在72℃延伸5分钟。
采用商品化试剂盒对PCR扩增产物过柱纯化。
六、采用下一代测序技术检测基因的突变
使用下一代商业化的测序仪器进行测序，测序结果用已有的测序软件分析包进行分析。
实施例1 检测ASCC3、ALKBH2、ALKBH3、MGMT基因的突变
一、构建样本库
1. DNA的提取
按照常规的组织样本的DNA提取方法采用商品化试剂盒提取样本DNA。
2. DNA片段化
使用DNA破碎仪将DNA样本片段化，使片段长度为150-200bp。
3. DNA样本库质量检测
用生物分析仪进行DNA定性定量分析，确认DNA片段长度峰值合理。
4. DNA末端修补
利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断，对于DNA 5 '突出粘末端补平以及3 '突出粘末端打平，产生平末端，用于后续的平端连接。反应体系见表1所示，反应在PCR扩增仪中进行，20℃，30min。
5. 在DNA样本3 '末端加上碱基A
反应在PCR扩增仪中进行，37℃，30分钟，反应体系见表2所示。
6. 在DNA两端加上接头
反应体系见表3所示。
7. 扩增获得的DNA片段样本库
聚合酶链反应（PCR），在PCR扩增仪中进行，反应体系见表4所示。
PCR条件：置于PCR扩增仪中，95℃预变性10秒，95℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸1min，共循环20次（cDNA样本库）或者5-8次（DNA样本库），最后在72℃延伸5分钟。
8. 扩增后DNA样本库的质量检测
使用生物分析仪，进行DNA定性定量分析，并确认纯化后片段长度峰值合理，约200bp。
若得到的DNA样本库的浓度较低，须将样品经过真空浓缩机低温干燥（低于45℃），再用无核酸酶水溶解至所需浓度。
二、制备ASCC3、ALKBH2、ALKBH3、MGMT基因的DNA探针库
根据上述的探针设计方法和思路，设计并合成探针进行试验，在5’端有生物素（Biotin）。
三、将DNA样本库与生物素化的DNA探针库杂交
将DNA样本库与杂交缓冲液（10mM Tris-HCl , 2%牛血清白蛋白, pH8.0）混合（混合后，DNA样本库浓度至多不超过50ng/μL），反应条件为95℃ 5分钟，之后保持在65℃。反应在PCR扩增仪中进行。
然后以DNA样本库：探针库为1:100的摩尔比，将探针库加入上述混合物，反应条件为65℃ 5分钟。将杂交反应置于PCR扩增仪中，65℃孵育24小时。
四、得到经杂交富集的ASCC3、ALKBH2、ALKBH3、MGMT基因片段
1. 准备链霉亲和素磁珠
使用Dynabeads链霉亲和素磁珠置于混匀仪上混匀，混合50μL磁珠和200μL结合缓冲液（10mM Tris-HCl，2%牛血清白蛋白，pH8.0），在混匀仪上混匀，使用外界磁场将磁珠与缓冲液分离纯化，弃掉缓冲液，重复三次，每次加入200μL结合缓冲液。
2. 分离杂交产物
将步骤三中的杂交反应混合物与步骤四的处理后的链霉亲和素磁珠进行混合，在室温下振摇30分钟。使用外界磁场将磁珠与缓冲液分离纯化，然后向磁珠中加入500微升洗涤缓冲液（磷酸缓冲液，0.1% Tween-20，0.1% SDS，pH7.4），在65℃孵育10分钟，每隔5分钟混匀一次。使用外界磁场将磁珠与缓冲液分离纯化，以上步骤重复三次。
3. 释放富集的DNA样本
将磁珠与50微升洗脱缓冲液（10mM氢氧化钠溶液）混合，室温孵化10分钟，每隔5分钟混匀一次。使用外界磁场将磁珠与缓冲液分离纯化，保留上清液，弃掉磁珠，上清液中即含有富集过的ASCC3、ALKBH2、ALKBH3、MGMT基因片段DNA样本库。
五、PCR扩增与纯化
将富集DNA样本库进一步扩增，为测序仪器上样做准备，反应体系见表5所示。
PCR条件：置于PCR扩增仪中，95℃预变性10秒，95℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸1min，共循环20次（cDNA样本库）或者5-8次（DNA样本库），最后在72℃延伸5分钟。
六、检测灵敏度的验证
针对通路中ASCC3（c.176A>G）、ALKBH2（c.608G>C）、ALKBH3（c.684C>G）、MGMT（c.88G>A）突变构建了突变型和野生型的质粒，按照突变型在野生型中拷贝数比例混合而不同丰度的样品，采用上述的探针库进行捕获、测序考察灵敏性，每个样本重复测试3次，结果如下：
表6
| 待测基因 | 5%质粒 | 1%质粒 | 0.5%质粒 |
| ASCC3 | 4.96% | 1.12% | 0.55% |
| ALKBH2 | 4.99% | 0.95% | 0.52% |
| ALKBH3 | 5.10% | 1.03% | 0.47% |
| MGMT | 5.07% | 1.15% | 0.48% |
从表中可以看出，本发明提供的检测探针库和检测方法能够对低丰度的样本也具有较好的检测灵敏度，能够达到0.5%左右的检测灵敏度水平。
采用优化后的探针库对10例肺癌患者肿瘤样本进行4个通路相关基因的检测，其中1例患者在至少1个通路相关基因中发生外显子区域错义突变（10%），其中0例患者在大于5个通路相关基因中发生外显子区域错义突变（0%）。
序列表
<110> 苏州卫生职业技术学院
<120> 一种检测DNA直接修复通路有效性的探针库、检测方法和试剂盒
<141> 2019-12-04
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 13
cacttcactg cttcttccac attagtaact gttcccagag caatctgcaa atcaaaaaga 60
tgacagaaat taatgtatta aagttgaaca taaacattac 100
<210> 14
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 14
tgccgaagca ttcctgcatg atgaatacta aaaccatctg ggaataattc tcgtacttgc 60
ttatttctcg acctttgtac ctagatacca agaaagcgta 100
<210> 15
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 15
actgctgcat cttgaagatt ttaaaacata aaaaaaatca tgtgaaacaa ttataaactt 60
tctaactaca aataaaattt tgccaattac aatgcatttt 100
<210> 16
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 16
agccttacaa tctgggaaag agctacatcc ccaacactct ttcttgtcac tacatcccat 60
ttttctggtg tggtcacaag catctataag agaagacaca 100
<210> 17
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 17
ttgactggat tctattgagt ctcttcattc ctttaaaagc cagctgtccg atctaaaaaa 60
aaaaggcatc acccattata aatagtaaca atgtgaagga 100
<210> 18
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 18
atctctctgc ctgctcagaa ttggaacact tctagcattc agaagtgcct gttctctgta 60
aacataaaaa taggcctaat ttgaaatgtt tatcttgaaa 100
<210> 19
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 19
cagttcaaat agcttataaa aagagaaaaa agtaacaaac atcagttatc tcaaagttta 60
actttttcaa gttattaaca acctattcaa cagaggtgta 100
<210> 20
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 20
caagtgaaat gtcatgaaga gaaatgcagc cccactttca attgcttctc tcccattatc 60
agttccaact attcaaagac aaaagaaaca gtattagctc 100
<210> 21
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 21
cattcaaaaa ttttattatc ttcttccatg tcaggcccaa atctaaaact tgttcatgaa 60
gtttagatcg ctttatctga aacagagatt ataatgtaga 100
<210> 22
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 22
ccttatgccg gaagacaaag tctctgcagg caccgaagga gacagaggca atggggctcc 60
caggggccag ttctctttca tcatctcggt gctccccgat 100
<210> 23
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 23
cttcctgggc acactgtgcc acttcccgaa tacctggact ctggccagtg ctcctgtgca 60
gaggaaacat ggcagttcct ttctacctga cccccatcta 100
<210> 24
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 24
cccaacacag ctggctcttc tccagttggc tcttgctcct cctgcttcct caaaaggccc 60
ccttgagccc ctttcaccag gaatctgtcc atcctgtccc 100
<210> 25
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 25
gaggactggc atcagagagg gtaagtagat cccagaggtc acagttggtg ctgcgtgttc 60
tccctctctg gaatgtttcc tagtaccatc acttctgctc 100
<210> 26
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 26
atgaaccctc actagggagg tgccccatta ttgcttcact aagttttggt gccacacgca 60
catttgagat gagaaagaag ccaccaccag tgagtattct 100
<210> 27
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 27
atcatgggac cttgttaatc atggaaggag cgacacaagc tgactggcag gtgaggatct 60
gcaagtaata tgaatctgct ttcatgtgga ggcagtttcc 100
<210> 28
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 28
tgacctttcg gacagtctat ccagaccctc gaggggcacc ctggtgacgt cagagctttg 60
agagagaagc ttcactgaaa cggagcaaac cttccactga 100
<210> 29
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 29
aaggggacgt ctgcagctga gtaagtatga gcccacgtga tcctgtatac cgcacatgct 60
gaagcaaccg aggagtatat gtgataacgg catgttttcc 100
<210> 30
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 30
atgcctattt ccaccagccc gaggctatcg aagagttccc cgtgccggct cttcaccatc 60
ccgttttcca gcaaggtcgg taactaagcc atctgcggtg 100
<210> 31
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 31
gcaggcaacc ccaaagccgc gcgagcagtg ggaggagcaa tgagaggcaa tcctgtgagt 60
tctcatggcg caagcatggc tgtgggtggc gggtgcgtgc 100
<210> 32
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 32
caggcttggg agggagctca ggtctggcag gggcctggct caagggagcg ggagctacct 60
cgggctcccc gcctgctggc cgaaactgag tatgtgcagt 100
Claims (7)
1. 一种用于检测DNA直接修复通路有效性的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括针对与DNA直接修复通路相关基因的如SEQ ID NO.1～32所示探针组成的探针库。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测DNA直接修复通路有效性的试剂盒，其特征在于，与DNA直接修复通路相关的基因包括ASCC3、ALKBH2、ALKBH3、MGMT。
3. 根据权利要求1所述的一种用于检测DNA直接修复通路有效性的试剂盒，其特征在于，所述基因ASCC3对应的探针序列如SEQ ID NO.1～21所示，所述基因ALKBH2对应的探针序列如SEQ ID NO.22～24所示，所述基因ALKBH3对应的探针序列如SEQ ID NO.25～28所示，所述基因MGMT对应的探针序列如SEQ ID NO.29～32所示。
4.一种检测与DNA直接修复通路相关的基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）获得受试者的DNA样本库；
（2）将权利要求1所述的试剂盒中SEQ ID NO.1～32所示的全部探针与所述DNA样本库进行杂交；
（3）分离步骤（2）的杂交产物，并释放出与试剂盒中探针杂交的基因片段，采用测序技术对分离出的基因片段进行测序从而检测基因的突变情况。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的DNA样本库由双链DNA片段组成；
所述步骤（1）包括以下步骤：提取全基因组DNA，然后将其片段化；或者提取mRNA，将其片段化，然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的探针进行选择性标记。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的探针进行生物素标记。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN201911240484.6A CN110863035A (zh) | 2019-12-06 | 2019-12-06 | 一种检测dna直接修复通路有效性的探针库、检测方法和试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110863035A true CN110863035A (zh) | 2020-03-06 |
Family
ID=69657835
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN115820632A (zh) * | 2022-08-15 | 2023-03-21 | 南通市肿瘤医院 | 抑制ascc3表达的小干扰rna及其在抑制膀胱癌转移中的应用 |
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| CN103667254A (zh) * | 2012-09-18 | 2014-03-26 | 邵阳 | 目标基因片段的富集和检测方法 |
| CN106834515A (zh) * | 2017-02-22 | 2017-06-13 | 南京世和基因生物技术有限公司 | 一种检测met基因14外显子突变的探针库、检测方法和试剂盒 |
| CN108148891A (zh) * | 2018-03-05 | 2018-06-12 | 重庆市肿瘤研究所 | 肿瘤细胞dna损伤修复相关基因捕获测序的探针制备方法 |
-
2019
- 2019-12-06 CN CN201911240484.6A patent/CN110863035A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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| CN115820632A (zh) * | 2022-08-15 | 2023-03-21 | 南通市肿瘤医院 | 抑制ascc3表达的小干扰rna及其在抑制膀胱癌转移中的应用 |
| CN115820632B (zh) * | 2022-08-15 | 2023-07-18 | 南通市肿瘤医院 | 抑制ascc3表达的小干扰rna及其在抑制膀胱癌转移中的应用 |
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