CN110331189B - 一种ntrk融合基因的检测方法、试剂盒以及探针库 - Google Patents
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Abstract
本发明开发了基于杂交选择而捕获特定NTRK融合基因序列的方法，采用该方法可以获得成几千倍富集的NTRK融合基因DNA片段，该经富集的NTRK融合基因片段样本可以选择性地应用于各种基因检测技术，特别是可以应用下一代测序技术进行基因突变、缺失、增加、和颠换等方面的检测，以取得高效且准确的结果。
Description
技术领域
本发明涉及一种NTRK融合基因的检测方法、试剂盒以及探针库，属于基因测序技术领域。
背景技术
神经营养受体酪氨酸激酶(Neurotrophic Receptor Tyrosine Kinase,NTRK)基因NTRK1、NTRK2和NTRK3分别编码原肌球蛋白受体激酶(Tropomyosin Receptor Kinase,TRK)家族的三种蛋白TRKA、TRKB和TRKC，这些蛋白通常在神经元组织中表达，促进神经细胞发育。这三种蛋白很少在神经组织外表达，但是NTRK基因融合导致的3个TRK受体结构激活被认为是泛癌种的致癌因素。NTRK基因融合(NTRK基因家族成员NTRK1、NTRK2、NTRK3与另一个不相关基因融合)是一类导致嵌合TRK融合蛋白持续激活的基因变异，在多种实体肿瘤中有检测到此类融合，发生此类基因融合的肿瘤细胞，其融合蛋白可作为致癌驱动因子促进肿瘤细胞的增殖和存活。TRK家族蛋白是酪氨酸激酶，如果能抑制激酶活性，就能抑制癌症生长。目前NTRK抑制剂Larotrectinib已获得FDA批准上市，针对NTRK融合的晚期实体瘤患者，这也是第一个泛癌种靶向药物，不限癌种，只针对特定基因变异。FDA批准Larotrectinib是基于3个多中心研究合并数据(LOXO-TRK-14001、SCOUT和NAVIGATE)，分别使用高通量测序技术(Next Generation Sequencing，NGS)和FISH进行NTRK基因状态的检测，总缓解率ORR达75％，其中22％的患者完全缓解，53％的患者部分缓解。
据统计，NTRK基因融合在成人肿瘤和儿童肿瘤中均有发生，发生频率分别约为0.31％和0.34％，其中常见癌症类型如软组织肉瘤、唾液腺癌、肺癌、甲状腺癌、结肠癌、婴儿纤维肉瘤、黑色素瘤等等。2018年ESMO大会上公布的一项研究发现大约0.3％的中国实体瘤患者中存在NTRK基因融合，且NTRK基因融合更常见于非小细胞肺癌(0.3％)和结直肠癌(1.4％)。2018年中国肿瘤学大会上，世和基因汪笑男博士公布了一项中国实体瘤大样本统计数据，数据显示NTRK1基因融合的伴侣基因非常多样，其中TPM3基因占21％，基因间隔区占20％，IRF2BP2基因占13％、LMNA基因占13％，TPR基因占13％等。
基于NGS检测NTRK融合相比于FISH等传统检测手段的检测优势在于，NGS技术不仅可以检测组织样本中的NTRK融合，同时可以通过血浆和胸水等液体样本检测NTRK融合状态；此外，NGS技术检测灵敏度也远高于目前传统检测技术，可以检出1％以下的NTRK融合；除了可以检测常见NTRK融合类型外，NGS技术还可以检测罕见NTRK融合类型；同时NGS相比于传统检测手段，还会可以明确融合伴侣基因，并能检测到许多其他的NTRK基因变异类型，辅助临床靶向治疗方案的制定。
发明内容
本发明的目的是：提供一种用于检测NTRK融合基因的探针库，利用本发明的探针库可以较好地检测到NTRK家族的融合基因，应用于二代测序过程中，能够具有高覆盖率、测序深度均一性好、灵敏度高的优点。
一种NTRK家族的融合基因突变的探针库，其中包括有核苷酸序列如SEQ ID NO.1～163所示的任意一条探针，或者与其具有相同功能的探针。
优选的：探针库中包括上述的全部探针。
优选的：所述的具有相同功能的探针，是指将SEQ ID NO.1～163任意一条探针经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同杂交捕获功能的探针。
优选的：所述的具有相同功能的探针与原探针具有80％以上相同的碱基，更优选是90％以上相同碱基，再优选是95％以上相同碱基。
本发明提供一种检测NTRK融合基因的方法，所述方法包括以下步骤：
1)获得受试者的DNA样本库；
2)获得所述的检测NTRK融合基因突变的探针；
3)使所述DNA探针库与所述DNA样本库进行杂交；
4)分离步骤3)的杂交产物，然后释放经杂交富集的NTRK融合基因DNA片段；
5)通过高通量测序的方法对NTRK融合基因DNA片段进行检测。
其中，所述步骤1)中的DNA样本库由双链DNA片段组成，并且，所述步骤1)包括：
1-1)提取全基因组DNA，然后将其片段化；或者
1-2)提取mRNA，将其片段化，然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA；
其中，所述受试者为哺乳动物，优选人，且从受试者的细胞、组织或体液样本中提取全基因组DNA或mRNA。
优选地，所述DNA片段的长度为150～600bp；
进一步优选地，所述DNA片段的长度为150～200bp。
一种检测NTRK融合基因的试剂盒，包括有上述的探针库。
有益效果
本发明开发了基于杂交选择而捕获特定NTRK融合基因序列的方法，采用该方法可以获得成几千倍富集的NTRK融合基因DNA片段，该经富集的NTRK融合基因片段样本可以选择性地应用于各种基因检测技术，特别是可以应用下一代测序技术进行基因突变、缺失、增加、和颠换等方面的检测，以取得高效且准确的结果，对相关症状的后续治疗提供有意义的理论及临床指导。
并且，对于将通过本发明的方法富集得到的NTRK融合基因片段用于基于下一代测序技术的基因结构突变检测的应用而言，还具有以下有益效果：
使用本发明的基因富集方法及筛选得到的特定DNA探针库，能够成数千倍地富集NTRK融合基因片段，从而可以应用下一代测序技术、利用该NTRK融合基因片段的测序，而准确地获得NTRK融合基因的各种突变。并且，由于采用下一代测序技术，因此能够一次性检测多个基因的多种类型基因突变；准确性高，传统技术例如基因芯片技术，通常需要重复两次以上才能确定检测结果，而本发明在一次反应中，对单个碱基进行反复测序，保证了数据的精准度，并且缩短了检测周期；敏感性高，本发明提供的方法和试剂盒能够有效地使对于低突变丰度样本的检测灵敏性得到提高，和传统检测技术相比，本发明产生的数据能够达到碱基级的分辨率。
附图说明
图1为本发明技术方案的示例性工艺流程图，其中富集得到目标基因群，并用于基于下一代测序技术的基因融合检测。
图2为本发明的外显子临近内含子探针设计示意图。
图3是内含子区域探针设计与传统探针设计测序结果对比图。
图4是外显子临近内含子设计与传统探针设计测序结果对比图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
在本文中所使用的术语“DNA”为脱氧核糖核酸(英文：Deoxyribonucleicacid，缩写为DNA)是一种由脱氧核糖核苷酸组成的双链分子。可组成遗传指令，引导生物发育与生命机能运行，其碱基排列顺序构成了遗传信息，所以在遗传病的诊断中具有重要的作用。
在本文中所使用的术语“高通量测序技术”指的是第二代高通量测序技术及之后发展的更高通量的测序方法。第二代高通量测序平台包括但不限于Illumina-Solexa(Miseq、Hiseq-2000、Hiseq-2500、Hiseq X ten等)、ABI-Solid和Roche-454测序平台等。随着测序技术的不断发展，本领域技术人员能够理解的是还可以采用其他方法的测序方法和装置进行本检测。根据本发明的具体示例，可以将根据本发明实施例的核酸标签用于Illumina-Solexa、ABI-Solid和Roche-454测序平台等的至少一种进行测序。高通量测序技术，例如Miseq测序技术具有以下优势：(1)高灵敏度：高通量测序，例如Miseq的测序通量大，目前一个实验流程下来可以产生最多15G碱基数据，高的数据通量可以再测序序列数确定的情况下，使得每条序列获得高的测序深度，所以可以检测到含量更低的突变，同时因其测序深度高，其测序结果也更为可靠。(2)高通量，低成本：利用根据本发明实施例的标签序列，通过一次测序可以检测上万份样本，从而大大降低了成本。
本发明中的“突变”、“核酸变异”、“基因变异”可通用，本发明中的“SNP”(SNV)、“CNV”、“插入缺失”(indel)和“结构变异”(SV)同通常定义，但本发明中对各种变异的大小不作特别限定，这样这几种变异之间有的有交叉，比如当插入/缺失的为大片段甚至整条染色体时，也属于发生拷贝数变异(CNV)或是染色体非整倍性，也属于SV。这些类型变异的大小交叉并不妨碍本领域人员通过上述描述执行实现本发明的方法和/或装置并且达到所描述的结果。
本发明提供一种富集NTRK融合基因片段的方法。具体而言，本发明的方法包括：从哺乳动物例如人的细胞、体液或组织样本中提取基因组DNA或mRNA，经处理或合成cDNA，从而获得片段化的双链DNA作为DNA样本库；此外，针对要富集的NTRK融合基因片段，设计与该NTRK融合基因杂交的DNA探针，从中筛选出多个探针作为DNA探针库；然后，将该DNA样本库与DNA探针库进行杂交，从而从DNA样本库中富集得到NTRK融合基因DNA片段。根据本发明的具体实施方式，可以先将DNA探针库中的各个探针进行生物素化，然后在杂交后用链霉亲和素磁珠吸附杂交产物，再从磁珠上释放出富集的NTRK融合基因片段。经适应性处理，可以采用下一代测序基因对NTRK融合基因片段进行基因结构突变的检测，以确认NTRK融合基因的各类突变。
常见的NTRK融合伴侣基因包括ETV6、TPM3、LMNA、SQSTM1、IRF2BP2等等，另外还有CTRC、TRIM63等罕见融合伴侣，而这类罕见融合如果使用传统检测手段很可能出现漏检，此外，传统FISH和IHC检测融合，无法判别融合伴侣基因及融合形式。泛TRK的IHC诊断试剂盒尚处于临床研究阶段，NGS检测NTRK融合优势突出。目前，NTRK融合研究相对较少，融合断裂位点不固定，但常发生在基因激酶结构域前的几个内含子区域，传统探针覆盖形式对于内含子区域覆盖不完全，并且在内含子区域覆盖不均一，这样也可能造成NTRK基因的漏检。本研究设计的探针在传统探针的基础上进行优化，除了对基因外显子区域全面覆盖外，还对基因重要内含子区域进行了均一性全面覆盖，以避免常见及罕见融合漏检的情况。
下面以富集得到的NTRK融合基因片段用于基于下一代测序技术的基因突变检测为例，示例性地说明本发明。
一、准备mRNA/DNA样本库
1.准备基因组DNA样本(采用此种方式获得的DNA样本库称为“源自全基因组的DNA样本库”)
1.1 DNA提取
DNA提取，包括新鲜组织，新鲜血液和细胞，固定和石蜡样本，商业化公司提取试剂盒。以上均按说明书指示方法操作。
使用分光光度定量仪以及凝胶电泳系统检测DNA模板质量和浓度。DNA模板260nm吸光率大于0.05以上，吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。
1.2 DNA片段化
将3微克高质量的基因组DNA用低TE缓冲液稀释至120微升。按照组织匀浆机使用说明书，将DNA片段化，片段长度为150～200碱基。
DNA过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
1.3 DNA样本库质量检测
用生物分析仪进行DNA定性定量分析，确认DNA片段长度峰值合理。
2.准备cDNA样本(采用此种方式获得的DNA样本库称为“源自mRNA的DNA样本库”即cDNA样本库)
2.1 mRNA提取
mRNA提取，包括新鲜组织，新鲜血液和细胞，固定和石蜡样本，商业化公司提取试剂盒。以上均按说明书指示方法操作。
使用分光光度定量仪以及凝胶电泳系统检测mRNA质量和浓度，吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。
2.2 mRNA片段化
采用NEBNext RNA Fragmentation系统或者其他商业化公司mRNA片段化试剂盒。
mRNA过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
2.3用商业化公司cDNA合成试剂盒进行mRNA合成第一链以及第二链cDNA。
cDNA过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
3.cDNA/DNA末端修补
将DNA片段进行末端修复可以利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行，其中，所述Klenow片段具有5’-3”聚合酶活性和3’-5’聚合酶活性，但缺少5’-3’外切酶活性。由此，能够方便准确地对DNA片段进行末端修复。根据本发明的实施例，还可以进一步包括对经过末端修复的DNA片段进行纯化的步骤，由此能够方便地进行后续处理。
利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断，对于cDNA/DNA 5’突出粘末端补平以及3’突出粘末端打平，产生平末端，用于后续的平端连接。反应在PCR扩增仪中进行，20摄氏度，30分钟。
cDNA/DNA过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
4.在cDNA/DNA样本3’末端加上碱基A
在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A的DNA片段。根据本发明的一个实施例，可以利用Klenow(3’-5’exo-)，即具有3’-5’外切酶活性的Klenow，在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A。由此，能够方便准确地将碱基A添加到经过末端修复的DNA片段的3’末端。根据本发明的实施例，还可以进一步包括对具有粘性末端A的DNA片段进行纯化的步骤，由此能够方便地进行后续处理。
反应在PCR扩增仪中进行，37℃，30分钟。
cDNA/DNA过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
5.在cDNA/DNA两端加上接头
cDNA/DNA过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
如使用mRNA→cDNA，进行6和7；
如果是用基因组DNA，直接跳到8。
6.分离出合适长度的cDNA片段
使用电泳凝胶，对照DNA梯度标准，在凝胶上剪切出150-250碱基cDNA片段。
将含有cDNA样本库的凝胶样本过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
7.cDNA片段样本库质量检测
使用生物分析仪，进行cDNA定性定量分析，并确认分离出的cDNA片断长度峰值合理。
PCR条件：置于PCR扩增仪中，98℃预变性30秒，98℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环15次(cDNA样本库)或者4-6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
PCR扩增产物过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
8.扩增DNA模板
在本发明的一个实施例中，样本为含微量游离DNA片段的血浆样本，包含极其微量的目标游离DNA片段，第一扩增使得核酸的量能满足芯片/探针杂交捕获的需求
聚合酶链反应(PCR)，在PCR扩增仪中进行。
PCR条件：置于PCR扩增仪中，98℃预变性30秒，98℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环15次(cDNA样本库)或者4-6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
PCR扩增产物过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
9.扩增后cDNA/DNA样本库质量检测
使用生物分析仪，进行cDNA/DNA定性定量分析，并确认纯化后片段长度峰值合理，约200bp。
对于得到的cDNA/DNA样本库，如果cDNA小于30纳克/微升，DNA浓度小于150纳克/微升，须将样品经过真空浓缩机低温干燥(低于45℃)，再用无核酸酶水溶解至所需浓度。
二、探针的设计
针对NTRK融合基因准备DNA探针库。
本领域技术人员知晓：捕获的特异性受各种因素影响，如捕获探针的设计不佳，捕获条件不理想，基因组DNA中重复序列的封闭不充分及基因组DNA与捕获探针的比例不合适等因素都会影响捕获的特异性、敏感性、测序覆盖率等诸多结果。为了实现目标基因的高度富集和低脱靶率，本领域技术人员需要对探针的类型、长度、序列、杂交条件等进行大量实验摸索，需要通过创造性的探索工作才能够获得最佳的参数组合，没有在相应的证据证明下，其是否能够达到相同的效果，是本领域技术人员无法预期的。同时，对于产生突变的样本进行检测时，由于突变样本在组织样本中所占的比例会因个体而不同，因此，如果突变样本的丰度较低时，较容易导致的问题是探针往往无法准确地与突变的片断杂交，而导致检测的灵敏度低，这也需要对探针序列进行试验进行摸索。
另外，探针捕获测序中探针的特异性和均一性与捕获后的测序质量密切相关：探针特异性过低可导致捕获大量无效区域，大量非目标区域的DNA序列被捕获测序，产生大量无效测序数据，浪费测序成本，而探针特异性过高可导致杂交错配容忍度低，在捕获测序中我们需要研究目标DNA片段中发生的突变、插入/缺失、融合等突变类型，对探针的杂交错配容忍度有一定要求，杂交错配容忍度低可能导致突变后的DNA序列无法捕获，导致突变漏检，导致假阴性结果；探针均一性差可导致不同区域DNA序列捕获效果差异显著，部分目标区域捕获效果较好，具有合格甚至过度的测序覆盖，部分目标区域捕获效果较差，测序覆盖较浅甚至不覆盖，引起部分区域漏检，导致假阴性结果。因此在探针设计过程中需要开展大量摸索试验，设计出特异性适中以及高度均一性的探针库。
探针特异性和均一性受多种因素影响，其中有些因素是所有基因探针设计中涉及的共同问题，包括探针长度、探针GC含量、探针overlap区域、杂交条件等因素。探针长度与探针特异性相关，在一定范围内探针长度越长探针特异性越高，探针长度太短可能导致无法将DNA片段捕获；探针GC含量与探针覆盖均一性相关，探针GC含量过高或差异过于显著，可能导致不同探针结合效率存在显著差异，导致捕获序列不均一；相邻探针间的overlap与探针覆盖均一性相关，探针与探针间不存在overlap的情况，探针间的Gap区域仅依靠探针的连带捕获效应覆盖，可能导致Gap区域覆盖度偏低，影响探针覆盖均一性；杂交条件与探针GC含量高度相关，不同的杂交条件可能导致探针结合效率存在差异，从而影响探针覆盖均一性。BRCA1/2探针设计综合参考了多次摸索试验结果以及本单位前期研究成果，采用了120bp长度的DNA探针，绝大部分探针与探针间存在5bp以上的overlap，所有探针GC含量控制在40-55％范围内，在一定程度上保证了探针合适的特异性和高度的均一性。
除了所有基因探针设计涉及共性因素外，NTRK融合基因自身的特征导致了其探针设计的过程需要进行更多的考量。根据纪念斯隆-凯特琳癌症中心统计数据显示，非小细胞肺癌NTRK融合基因中，NTRK1融合占比近50％，其中NTRK1基因融合断裂位点主要位于exon8-exon12区间，我们在保证探针特异性的基础上，增加对NTRK1基因exon8-exon12区域的探针覆盖，区间中的内含子部分也同样进行全面覆盖，同时保证该区间内探针覆盖的均一性，增加NTRK融合基因的检出率。
使用每个探针分别对全基因组进行了富集和扩增并根据结果进行筛选。通过IDTDNA Technologies，单独合成了每一个探针并用质谱分析保证质量，在5’端有生物素(Biotin)。
三、DNA捕获探针杂交
1.将DNA样本库与生物素化的DNA探针库杂交
将cDNA/DNA样本库与杂交缓冲液混合，反应条件为95℃5分钟，之后保持在65℃。反应在PCR扩增仪中进行。
然后将该混合物与探针库混合，反应条件为65℃5分钟。将杂交反应置于PCR扩增仪中，65℃孵育24小时。
四、得到经杂交富集的NTRK融合基因片段
1.准备链霉亲和素(Streptavidin-Coated)磁珠
使用Dynabeads链霉亲和素磁珠或者其它商业化公司链霉亲和素磁珠。将磁珠置于混匀仪上混匀，每个样本需要50微升磁珠。
磁珠洗涤：混合50微升磁珠和200微升结合缓冲液，在混匀仪上混匀，使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠与缓冲液分离纯化，缓冲液弃掉不用。重复三次，每次加入200微升结合缓冲液。
2.分离杂交产物
混合1中的杂交反应混合物与2中的链霉亲和素磁珠，反复颠倒试管5次。在室温下振摇30分钟。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠分离纯化。
然后向磁珠中加入500微升洗涤缓冲液，在65℃孵育10分钟，每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠分离纯化。
以上步骤重复三次。
3.cDNA/DNA富集样本释放
将磁珠与50微升洗脱缓冲液混合，室温孵化10分钟，每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠分离弃掉。此时上清液中即含有富集过的NTRK融合基因片段cDNA/DNA样本库。
将样本库过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
五、PCR扩增与纯化
因杂交捕获会损耗一定量的核酸，第二扩增能使捕获下的目标片段获得再次扩增以满足上机测序和质控检测的要求。本发明的这一文库构建方法特别适用于总游离核酸不低于10ng或者常规组织基因组DNA不低于1μg的样本的测序文库构建。
将富集cDNA/DNA样本库进一步扩增，为测序仪器上样做准备。
PCR条件：置于PCR扩增仪中，98℃预变性30秒，98℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环15次(cDNA样本库)或者4-6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
PCR扩增产物过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。
六、采用下一代测序技术检测NTRK融合基因的突变
使用下一代商业化的测序仪器进行测序，如Roche 454、Illumina Hiseq等。测序结果用已有的测序软件分析包进行分析。
示例性地，使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS，使用桥式PCR对DNA样本库模板进行扩增：每个DNA样本片段将会在芯片上形成克隆簇，每条泳道上产生数百万这样的克隆簇。使用Illumina HiSeq2000下一代测序系统。和传统Sanger方法相比，利用“可逆性末端终结反应”技术，四种dNTP碱基末端被保护基团封闭，并分别以不同颜色荧光标记。
经过QC筛选后，对测序结果使用了Bowtie对所得片段进行序列映射，利用Bioconductor软件，成功映射片段进行突变分析。
实施例1富集并检测NTRK融合基因
一、构建样本库
1.DNA的提取
按照常规的组织样本的DNA提取方法提取样本DNA。
2.DNA片段化
按照DNA破碎仪使用说明书，将DNA样本片段化，使片段长度为150-200碱基。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号：A63880)将DNA过柱纯化。
3.DNA样本库质量检测
用生物分析仪进行DNA定性定量分析，确认DNA片段长度峰值合理。
4.DNA末端修补
利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断，对于cDNA/DNA 5’突出粘末端补平以及3’突出粘末端打平，产生平末端，用于后续的平端连接。反应在PCR扩增仪中进行，20摄氏度，30分钟。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号：A63880)将cDNA/DNA过柱纯化。
5.在DNA样本3’末端加上碱基A
反应在PCR扩增仪中进行，37℃，30分钟。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号：A63880)将cDNA/DNA过柱纯化。
6.在DNA两端加上接头
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号：A63880)将cDNA/DNA过柱纯化。
7.扩增6获得的DNA片段样本库
聚合酶链反应(PCR)，在PCR扩增仪中进行。
PCR条件：置于PCR扩增仪中，98℃预变性30秒，98℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环15次(cDNA样本库)或者4～6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号：A63880)将PCR扩增产物过柱纯化。
8.扩增后DNA样本库的质量检测
使用生物分析仪，进行DNA定性定量分析，并确认纯化后片段长度峰值合理，约200bp。
对于得到的DNA样本库，如果DNA浓度小于150纳克/微升，须将样品经过真空浓缩机低温干燥(低于45℃)，再用无核酸酶水溶解至所需浓度。
二、针对NTRK融合基因准备DNA探针库
根据上述的探针设计方法和思路，设计并合成探针进行试验，在5’端有生物素(Biotin)。
三、将DNA样本库与生物素化的DNA探针库杂交
将DNA样本库与杂交缓冲液(10mM Tris-HCl,2％牛血清白蛋白,pH8.0)混合(混合后，DNA样本库浓度至多不超过50ng/ul)，反应条件为95℃5分钟，之后保持在65℃。反应在PCR扩增仪中进行。
然后以DNA样本库：探针库为1:100的摩尔比，将探针库加入上述混合物，反应条件为65℃5分钟。将杂交反应置于PCR扩增仪中，65℃孵育24小时。
四、得到经杂交富集的NTRK融合基因片段
1.准备链霉亲和素磁珠
使用Dynabeads(Life technologies,货号：11206D)链霉亲和素磁珠或者其它商业化公司链霉亲和素磁珠。将磁珠置于混匀仪上混匀。
磁珠洗涤：混合50微升磁珠和200微升结合缓冲液(10mM Tris-HCl,2％牛血清白蛋白,pH8.0)，在混匀仪上混匀，使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠与缓冲液分离纯化，缓冲液弃掉不用。重复三次，每次加入200微升结合缓冲液。
2.分离杂交产物
混合步骤三中得到的杂交反应混合物与步骤四的1中得到的链霉亲和素磁珠，反复颠倒试管5次。在室温下振摇30分钟。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠分离纯化。
然后向磁珠中加入500微升洗涤缓冲液(磷酸缓冲液，0.1％Tween-20,0.1％SDS,pH7.4)，在65℃孵育10分钟，每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠分离纯化。以上步骤重复三次。
3.DNA富集样本释放
将磁珠与50微升洗脱缓冲液(10mM氢氧化钠溶液)混合，室温孵化10分钟，每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠分离弃掉。此时上清液中即含有富集过的NTRK融合基因片段DNA样本库。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号：A63880)将样本库过柱纯化。
五、PCR扩增与纯化
将富集cDNA/DNA样本库进一步扩增，为测序仪器上样做准备。
PCR条件：置于PCR扩增仪中，98℃预变性30秒，98℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环15次(cDNA样本库)或者4-6次(DNA样本库)。最后在72℃延伸5分钟。
使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒(货号：A63880)将PCR扩增产物过柱纯化。
六、采用下一代测序技术检测NTRK融合基因的基因结构突变
使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS，使用桥式PCR对DNA样本库模板进行扩增：每个DNA样本片段将会在芯片上形成克隆簇，每条泳道上产生数百万这样的克隆簇。使用Illumina HiSeq2000下一代测序系统，其原理是边合成边测序。和传统Sanger方法相比，利用“可逆性末端终结反应”技术，四种dNTP碱基末端被保护基团封闭，并分别以不同颜色荧光标记。
根据以上方法，采用不同探针进行测试结果如下：
一、不同探针长度检测数据对比
探针长度对检测的特异性和中靶率影响较大，因此，我们设计了4种不同长度的探针，探针长度分别是80bp、100bp、120bp和140bp，使用上述探针分别进行NGS捕获测序，并对测序数据进行质控，通过中靶率、目标区域覆盖率及经济性来确定不同探针长度对测序结果的影响。具体质控结果见下表：
根据上述测序结果可以看出，120bp的探针中靶率和目标区域覆盖率显著高于80bp和100bp的探针。继续增加探针长度至140bp时，中靶率和目标区域覆盖率未见明显提高，然而探针长度的增加势必会引起探针合成成本的提高，综合考虑选用了120bp长度探针。
二、不同探针overlap长度对比
相邻探针间的相连方式可能与探针覆盖均一性相关，因此我们设计了三种相连形式，分别为10bp gap、5bp overlap和20bp overlap，捕获后进行NGS测序，质控结果如下：
相邻探针间存在5bp overlap相比于10bp gap时50％覆盖率显著升高，与20bpoverlap无显著差异，综合考虑选用了5bp overlap。
三、内含子区域常规覆盖与优化覆盖方式对比
由于大部分基因断裂位点位于基因的内含子区域，因此我们对NTRK基因内含子高频断裂区间也进行了全覆盖。与传统覆盖形式(仅临近外显子的区域上设计探针)相比，覆盖热点内含子区域探针覆盖情况见图3，上图为采用本专利优化技术设计的探针覆盖情况，下图为采用传统探针捕获后的探针覆盖情况，优化后的探针设计对内含子的覆盖显著优于传统探针设计。如图3所标记的内含子区域探针数较对照组增加2条，SEQ ID NO.40-41(对照组在该区域未设置这2条探针)。若NTRK基因融合的断裂位点位于热点内含子区域，采用优化后的探针覆盖该断裂位点测序深度为1000X，突变丰度为10％，而采用传统探针不覆盖该断裂位点的话，会直接导致融合漏检。
四、外显子临近内含子传统覆盖和优化覆盖方式对比
内含子区域的覆盖情况对融合基因检测极其重要，因此我们针对外显子临近内含子区域也进行了特定探针设计，与传统探针设计(不在外显子临近内含子的区域内设计探针)相比，内含子区域探针覆盖情况见图4，上图为优化后覆盖外显子临近内含子后内含子区域的探针情况，下图是传统探针内含子区域覆盖情况。如图4所标记的外显子临近内含子区域探针数较对照组增加1条，SEQ ID NO.42(对照组在该区域未设置这条探针)。优化后的探针内含子区域捕获效果显著优于传统探针。
五、检测灵敏度的验证
现有技术中，对于融合基因检测存在着检测灵敏度不高的问题，通常灵敏度为约为10％以上，因此如何提高检测灵敏度是一个亟需解决的问题。
针对LMNA:exon7-NTRK1:exon11融合突变构建了突变型和野生型的质粒，按照突变型在野生型中拷贝数比例混合而不同丰度的样品，采用上述的探针库进行捕获、测序考察灵敏性，将SEQ ID NO.164-165的探针作为SEQ ID NO.164探针的对照，考察检测灵敏度，每个样本重复测试3次，结果如下：
从表中可以看出，本发明提供的检测探针库和检测方法能够对低丰度的样本也具有较好的检测灵敏度，能够达到0.5％左右的检测灵敏度水平。
六、检测准确性的验证
采用优化后的探针库分别对10例经过FISH和IHC检测NTRK融合均阳性与5例检测均阴性的患者肿瘤组织样本进行NTRK基因融合检测，并通过本发明优选的探针和方法进行测序，结果中显示，通过本发明提供的检测探针库和检测方法能够较好地对NTRK基因融合进行检测，并且检测结果与FISH和IHC检测结果相同，证明了本方法的可靠性，同时通过NGS检测能够明确融合伴侣基因及具体融合形式。
综上可以看出，本发明的检测试剂盒可以有效地对NTRK融合基因进行检测。
序列表
<110> 南京世和基因生物技术有限公司
南京世和医疗器械有限公司
<120> 一种NTRK融合基因的检测方法、试剂盒以及探针库
<130> 无
<160> 165
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgctcccagc tgcagctgcc aggcctcccc cgacatgtgc gctgggcggt gttaaagacc 60
cagccgccag gaaagggcgg agccagcggc ccccgcccgg ccccgccttg cccctcttct 120
<210> 2
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgtgctcgt cctgcctgac cagcaaacaa gcagcgagtc cgcgccctcg gggcactgca 60
atgcctgcct gtccccgcgc ccccccaccg cccgccggac actcacagct cagtcaggtt 120
<210> 3
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagatgctgc agatgctgct ggttctcgat gtagctgtgg ggagagcgga tgggagtcac 60
agggctcagg cccacacttg agttcccatg cccacccact tactccctca caatacacat 120
<210> 4
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgcttgagc cctccctgac cttctggtct cccccaggcc catgctgagc tccacaccca 60
cagtccccgt ttccctcaca ggtttctcag ctcccccagg cccctcagat cacggagctc 120
<210> 5
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctacccctcc tcaggcccct cattgtttcc tcaactactc tagacccctc aaagccctga 60
gcttcctgac ttctcccagt ccctcagtgc tcagcctctc aggtcctccc aggccctcgg 120
<210> 6
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctgcccatc ccagcctccc agtcccctgt gctgaacccc tacccctcct caggcccctc 60
attgtttcct caactactct agacccctca aagccctgag cttcctgact tctcccagtc 120
<210> 7
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaggagtgaa atggaaggca tctggcgcca cgaaacggag accactcttc acgatggtgc 60
tggggagggg tgcaggagga tcagtcccca ggtctcagct actctgggcc cctggccctc 120
<210> 8
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggcttgggcc ctcctcgcaa tcattccccg gggacagcca agcccattag cagcccaagt 60
ctgggtgtcc tccccaactc ccactgccca gcactggcca cactcacagg cgactgagcc 120
<210> 9
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agattcctgc gggcgtggag acacagcaag acagacccct tgagtgaccc gacctcactc 60
tgaccagaat gagggagggg aggagccaag aaagaagttg acatctggct cccccgcccc 120
<210> 10
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtgcacacag gcacacacac acttggtgct cttgcccctg gaagcgcccc cactcacagt 60
tcctgtaagg agaggccctg cacagttttc caggagagag actccagagc gttgaaggag 120
<210> 11
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acgggtagtc ctgcagcccc tgctttgatg ggggtttcac tggcatgcac atagtcccca 60
aagagacccc ccagcagtgt cacacagaca cagtgaccca atgtcatcca acagacccaa 120
<210> 12
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cctcccagcg ctgtagccag cgcagggcac aagaacagtg cagagggttc cccgacagga 60
ccctgggggg catgggggac accaacagag tcaaggaaag ggcctgaggg atcacagggg 120
<210> 13
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agccccctta caccacctcc ctcacccggc acctaccaca gctggcattg ggcatgtggg 60
ccaggggccc ttgcccatga cactgcagct tctgttcagg cactccgccc agtccctcct 120
<210> 14
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cctggagccc aggcgatgtc accccaggca gtttccccca gcctttgcca gtgcccattc 60
cccaggcctt ttcagtgctt gctcagtgcc ctctccctca ggcaggtagg tctcttcccc 120
<210> 15
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gagggccaag gggtgttaga gctgggagtg gccccagaac tctactgcgg ggctgctcct 60
tcccccaccc tcctcaatga cctggagccc aggcgatgtc accccaggca gtttccccca 120
<210> 16
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggcaccgcag cagcacgtcg tcccccacat ccaccgaggc attgggcacc tggaccttca 60
gcgtgggcac acctggccac ccaggacgcc cgagggccaa ggggtgttag agctgggagt 120
<210> 17
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctgtgctctg cctggacctc ttgggggctg ccagcgaagg tcttctcacc atcaccgtgg 60
ctgactgctc cagctctgtg aggatccagc cggcctgctc caggccccgc ccctccacct 120
<210> 18
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gtgtgtctct ctttccccat ctttgtcccc tgtgctctgc ctggacctct tgggggctgc 60
cagcgaaggt cttctcacca tcaccgtggc tgactgctcc agctctgtga ggatccagcc 120
<210> 19
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tcctgttgag gtcactggtg acattggcca gggtcagccc cagggatggc agacccccag 60
atttctagat caggaaagag aggggggaat aagaaggagc tttagccagc ttggggctgg 120
<210> 20
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggaagaagag atgagtaggg ggtgggtgcc ggagctgcca ctgagactca caggagacgt 60
tgacctgaac agagacctct gcccggccca catcgttctc tgcccagcac gtcacgttct 120
<210> 21
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
caggacttcc cccaaaggat caggttttca tgggaatctg gaaacagctg ggagggagca 60
gctgtggaga cacacatccc accctttctt ccagcccccc accctacatc ctcttttgag 120
<210> 22
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atctccaccg ccgtgtgcag ctgcacactg gccgggactg tgggccagaa agagcaacag 60
caggaggtca gggcgcagct ggagggagcc tggcacacac ccgacaagtc cacgggcaaa 120
<210> 23
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gccggctcca ggaactcagt gaagatgaag ctggtctcat tgagcacgga gccattgaag 60
agccagcgca gagacggtgc cggctgccca tccacagaga aggggatgca ccagtggtgc 120
<210> 24
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gccatgatgg aggcggaggc ctggccgaag gggttggcag ccagcagcgt gtagttgccg 60
ttgttgacgt gggtgggctg gttgaggcgc agacacccgt gccgcacggt ctcattggct 120
<210> 25
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atagcaggaa gttggctgta acccaggagg agcccaggag tgggggcagg gttcaggatg 60
gccctcgcac cagggatggg gtcctcgggg ttgaactcga aagggttgtc catgaaggca 120
<210> 26
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gctcaggagt tcaggagtcc tggcttgggg agagggtaag gaggccagaa cagcgggaca 60
ccaggactcc agactccttt ctgtcccgaa ccaggcactc caatttctgg ggtcagggct 120
<210> 27
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aggggggatg gaggtgggct gctgggcctc aaggaagaag atgcatgtga cccttttcca 60
gctgggccag gatgccctgc tgcatggctg tctcctcagc cagccgacaa ggacggaata 120
<210> 28
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aaggagactg cagcaggagg gaggagagaa agcagtcaga gggaggagag aaagcagtca 60
gagggaggag gaaagcagtg agtcccctgc ctactctggg actcattcct tcatgggacg 120
<210> 29
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ccaaccctgg ccccagctgg tctctcaggg atcagttcag ctgtaccctc tgccccagcc 60
tcagctccag agaccaggca gaacctgccc tccaccttgg gctactcacc caccggcgag 120
<210> 30
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
caccccaaaa ggtgtttcgt ccttcttctc caccgggtct ccagatgtgc tgttagtgtc 60
tgtagggaca cagggcagga ggggtgagcc ttgacacaca ctgtagcctc cagtaacccc 120
<210> 31
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ggccgtcaga gctcaggcca gatggtagtg atctccctgc tctgaccaga aatgacatgc 60
agatgagcct ctacccagcc tcccggtccc aaagtctgca caagcttcta cttcctatct 120
<210> 32
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ctcctgtact ctcagagcct cctgtagtaa gccatttttt catcctgcat gggagcccgg 60
agccaggtct ccagacctgc ctcatcctcc cctggggacc cctgcagtgg ctgtgcgggt 120
<210> 33
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tctccgtcca catttgttga gcacaaggag cagcgtagaa aggaagaggc aggcaaagac 60
ggccaggccc acagccaccg agacctggtg ggggacaggg gtagttagat ccaggggctc 120
<210> 34
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tcccatgtgc acagcccccc agagacagag tcaggaagag ccagtaggaa acaaagccag 60
gagaacagac agacagacag ccctctgcag ccccgactca cggttgatcc caaacttgtt 120
<210> 35
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ctgccgcctc tgaaactacc ccagcaccag cccgacacac gctcccacac acactcacac 60
tcacaagcct cacagccagg ccttcattta taccccaaac acactcacac gccctggaac 120
<210> 36
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gctggctcct gtcccacccc tggccccatg ggcaccaaag aactccccct ccacccccac 60
agagcccaga cctcccagac ccacttaatg cttgactaca atccagccac caattagcag 120
<210> 37
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gcccaccctt gcctgcagga tgcctggtca cccccacctt gtaacttgca ggggagagac 60
tgagaagcta gggagcgaga cagcaggcag ggggaagggg gcaccaccgc ctctccctgt 120
<210> 38
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gagctgccac ccaatgtcat gaaatgcagg gacatggcca gcccatcctc tggagccagc 60
acagccgggc ctagagagga gacacagccg catggagggg tttgcccaca ccttggccct 120
<210> 39
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
cacacacact cgtccctgcc cttgacccag catagcccct cacaggcatc actgaagtat 60
tgtgggttct cgatgatgtg gccttggagc ccagagcctt tgccctcggt gggggacagg 120
<210> 40
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tcagcctgag aagaatatga cagggcctat ggctggaata gggctgggga ggggtgggag 60
aaagggaggg atcgttcagg cctaggggct tctacacaca cacacacaca cacacacaca 120
<210> 41
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
caacctgcac cccttcagca agccccatgt catagtgtgg ggctgcacct gccccgagag 60
gacatggttt gggctagctg tgactctggg caggggatgc agctaagagc caggctggac 120
<210> 42
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ttgcagggtc agacggtagc cccagtcttg ggagggctgg ggttgtagcg gggactgtct 60
tggcagggct gtgtgctgca caaggctgcc cagacgaggg actgcatggg ggctaaaatt 120
<210> 43
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gtcctgctca ggcaggaggt tgtggcactc agcaaggaag accttcccaa aggcgccctc 60
ccccagctcc cacttgagca cgatgtcccg gcgcttgatg tggtgaacac ctgagggggc 120
<210> 44
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
catgtcagcc ctctgcatct ccccccactc tgtcctgatg tgatggagct cctgggggtg 60
ggacccaggc cagcagtacc ccccggggca gggtctcacc ttgacagcca ccagcatctt 120
<210> 45
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ccgagcactc tcggacgcct ccttcagtgc ctggatggaa gcggcaggga caggactgag 60
ttgggggccg agccctcact gctgttcacc cagggcagcc cgcccacccc ggtatccagc 120
<210> 46
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gtgccgcata tactcaaaga ccatgagcag ggggcggccc tcggtgcaga cgccgaagaa 60
gcgcacgatg tgctggtgct gcagcatggt gagcagctca gcctcacgct ggaagtcctg 120
<210> 47
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
cccttggttt gaaagacaag cagggatgtc tatagggaag ggaagacggg gcccagagcc 60
aggggccggg gccagcgctg aggccaggtg ctggtaccgg aggaagcggt tgaggtcccc 120
<210> 48
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
atgtgccttc ctgatctttc ttggtgtctc cccttggttt gaaagacaag cagggatgtc 60
tatagggaag ggaagacggg gcccagagcc aggggccggg gccagcgctg aggccaggtg 120
<210> 49
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ccacatcctc cccaccagcc agcagcttgg catcaggtcc atgggatctg tgaacaagaa 60
aaggagaggg gataggctgg gaggatagaa ctcccaggag cctgaggaag gcgatcccca 120
<210> 50
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ctagacagtt gcgtgtggcc aggtcccggt gcacaaaatg cagacccgcc aggtacacca 60
tccccgcagc gacctggcta gccacggcca gcagctgccc cagacccagg gggcctggag 120
<210> 51
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
tacagtttgg atgcagggga aggcgttggg gacaaaggac ccttacacgg taatagtcgg 60
tgctgtagat atccctgctc atgccaaaat caccaatctt gaccaccagt ccctggccca 120
<210> 52
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
acagagcccc ctccaccagg agccgaggag gtaggttgaa aaccagagcc agtgaatctc 60
agacccatgc agccatccta gcaagggcag gctctcagtg gtcttgggat ccagggtgtc 120
<210> 53
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
cctgccacgg gcggacactg catcaattcc aggggcgcct gggacagccc gtcaaggcac 60
agcctacccc agccccatca ttaaaaataa atacacaagc tcggtggttc acgcctgtaa 120
<210> 54
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
aggtgaagat ctcccagagc accacgccga agctccacac gtcgctctcg gtggtgaact 60
tacggtacag gatgctctcg ggcggcatcc agcgaatggg cagcatggtg cggcctccca 120
<210> 55
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
ggaaccgagt tccctgaaaa aggaacctga aggggcatgg gacggggagg ccagcaaggg 60
gtgaccatgg gccggggctg acctccgtgt tggagagctg gtaccagggc tgcttgccgt 120
<210> 56
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gggcaggcac gtggccgctc caactcacgt ccctgcgtga tgcagtcgat tgcctggggc 60
caccggagag acagaggaga aagcccacta ggctgggggc aagagagtga ggccagtccc 120
<210> 57
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
tccaggtaga caggaggtgc ctgggccagg gcttgcagcc gggcgtgcac atccttgatg 60
ctgtggcgtt gctggggctc ccgctgccag cagccccgca tgatggcgta gacctctggt 120
<210> 58
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
tgaattagat actttgagat caccctgggg ctgctgggag ctatggggga tgctgagggc 60
aggccccagt attccggcta accactccca gcccctgggc cggcccccta gcccaggaca 120
<210> 59
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
aactggcaag agacacagcc aagggataat aaatataatt gctatgacgg gaccttgcct 60
agagaagcag gaacatcctc tactcccagc ccccacctgt cccttcccac atgctgaggg 120
<210> 60
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
tgcctcctct ctccctgcct cacatctccc ttccacctca caactccttc catccttgac 60
tgaagcgaac atcttcatat aaactcaagt gcctgctaca catacaacac tgaaaaaagg 120
<210> 61
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
acagcagcgg ttgaacatca aggagatcta caaaatcctc catgctttgg ggaaggccac 60
cccaatctac ctggacattc ttggctagtg gtggctggtg gtcatgaatt catactctgt 120
<210> 62
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
cttgttcttc tcactctttc aggtcattga gtgcattacc caaggtcgtg ttttggagcg 60
gccccgagtc tgccccaaag aggtgtacga tgtcatgctg gggtgctggc agagggaacc 120
<210> 63
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
gcctagcctt tagcttgtgc ttgtgagagc ctcggctctg catagaaact aatccgggaa 60
gttgttgctt tttgccgagt ctgagccaca ggaccaaggc tgagctttgg gtgtaacttc 120
<210> 64
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
acggaggtaa aaagggggtg cgtaggaatc ttgattgggg gagggctcat aagagctatc 60
tcagcccaga acttggacct actgaacaag acattaggtg ggatttagag ccagcagagt 120
<210> 65
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
atgcctcctg aaagcatcat gtaccggaag ttcactacag agagtgatgt atggagcttc 60
ggggtgatcc tctgggagat cttcacctat ggaaagcagc catggttcca actctcaaac 120
<210> 66
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
gtgcatctat gtgtgaagag tgcagacaga taacactcat tctggccatc tggtcactct 60
gtgtgcctct atctcaaccc cttttaggtg ggaggacaca ccatgctccc cattcgctgg 120
<210> 67
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gccttgctta catgtctttt tcattgtcca ttaaccctgt cactctggca cacacatata 60
cacacccatg cccagacatg cactcaacag ttatcttttg gcctctcttg catcttgaca 120
<210> 68
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
ggttggagcg aatctgctag tgaagattgg ggacttcggc atgtccagag atgtctacag 60
cacggattat tacagggtaa agtgactttc ccagctgcag gactcagcca cagagctagc 120
<210> 69
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
ggccaagggt gagctggggc tctcccaaat gctccacatt gccagtcaga tcgcctcggg 60
tatggtgtac ctggcctccc agcactttgt gcaccgagac ctggccacca ggaactgcct 120
<210> 70
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
gacccaggaa ggcctttctc cttgatctcc tgatttctct ctgccccctc tcttctcccc 60
atgctcttgc agggcccatg ggccagatgc aatgatcctt gtggatggac agccacgcca 120
<210> 71
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
accccctcat catggtcttt gaatacatga agcatggaga cctgaataag ttcctcaggt 60
aagcaaggat tgtcttcccc tgcacctgac cccagtccca ccgaaccctt ggggttttcc 120
<210> 72
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
cctaggccct gaaggatccc accctggctg cccggaagga tttccagagg gaggccgagc 60
tgctcaccaa cctgcagcat gagcacattg tcaagttcta tggagtgtgc ggcgatgggg 120
<210> 73
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
aattccattt agattcatat ttattggtaa cccagtggtg tgtggggcca gtttctttcc 60
aggagtagaa aagacagccc cctgccctgt agttgttaaa cacctgtgtc ctgcattgtt 120
<210> 74
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
gtgaaggtaa accccagagg catgccggca ccaggaggag ggctggctga gggcccaggg 60
agggaaggaa gaggctccct ccatttgaga agatagtgct caattggctt tctcagatgc 120
<210> 75
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
cagcacatta agaggagaga catcgtgctg aagcgagaac tgggtgaggg agcctttgga 60
aaggtcttcc tggccgagtg ctacaacctc agcccgacca aggacaagat gcttgtggct 120
<210> 76
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
gcctgctgta ggctcagaac caagttctcc acgctagacc tctgtactct tctgtctccc 60
tgtgtcacca aacgaggact gatttgctgc cctcctcttt gtccccatcc tacagatgtg 120
<210> 77
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
cttctagggt gacctgctac ctgccaacct cccactttct aagagaccct ccctgtttgt 60
ttcaaaactt gaagaatagc ctgagccagg agtccccggg accagagtcc tctgcgaagg 120
<210> 78
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
acttccgtca gggacacaac tgccacaagc cggacacgtg taagtactgg gatggaatgc 60
tctccctcct ggggagggga gggtggttgg tgatagacca tgtacctggg gttctggaac 120
<210> 79
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
actcagccag cccactgcac cacatcaacc acggcatcac cacgccctcg tcactggatg 60
ccgggcccga cactgtggtc attggcatga ctcgcatccc tgtcattgag aacccccagt 120
<210> 80
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
ggaacagtag ttgggggttg tctgtggaca gggctggaaa ctggccggat gtgacgtcac 60
caggtcctgc gtctctcttg gtgtgtgcag gtcccgtggc tgtcatcagt ggtgaggagg 120
<210> 81
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
ccaaatttgg aatgaagggt aaggtgggag tttcattttc aagggcgtca tggggggaaa 60
cattactgct tttgatcaaa agatactgtt ttaatctccc attgctctct gagagggcct 120
<210> 82
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
attgttgctg actctctgtt tctggttcct cacaggtatc catagcagtt ggacttgctg 60
cttttgcctg tgtcctgttg gtggttctct tcgtcatgat caacaaatat ggtcgacggt 120
<210> 83
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
tttcttcttc taaagacctt actcagtatt gcagttctga gaaggctaca attactatgg 60
cagtaggact gttcttatct gggcacacac attattttca aggaaattgg gttttctgtg 120
<210> 84
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
agacactttt ggggtgagtc acttcttggt caagaggagt gtgttgactg gcatagtcat 60
tttcagactt catttgtgtt gctaactttt ccaaatatta tcttacttga aactttgaaa 120
<210> 85
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
gggactgtgg ctgagcctcc ccagccggga agctaactgt cctcctcctt tttgtgtttg 60
gttttcagtt gacgaagtga gtcccacacc tcctatcact gtgacccaca aaccagaaga 120
<210> 86
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
aggaacctgg tctgtggggg tggggggtcc tgcaaagcct ggggaaggca gactgcaaga 60
gcctggcttt cagaggatgt tctgcagggg gaagtctcaa gggagcttgg gagttgggca 120
<210> 87
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
gcacggataa ctttatcttg tgtaagtctg ctttacctgt tgctttgaaa ctgatttatt 60
ctgatactat cggtaactat tgaattcaaa tagccctctc tcctattcca catcatccct 120
<210> 88
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
gccatgagaa cagggaatca tggtgaatgg gagagatcat agctattagg accaagtagt 60
gtgtctgttc tggtttttat taaatttgtt aattatctct ttgtcctttt tttgcagaga 120
<210> 89
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
tgccaaaaac ccactgggca cagccaacca gaccatcaat ggccacttcc tcaaggagcc 60
ctttccaggt gagggcagcg tagctggatc ggaggtgtat ggattctttc tacaagcttg 120
<210> 90
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
gcagcctctg cgggagtcca agatcatcca tgtggaatac taccaagagg gagagatttc 60
cgagggctgc ctgctcttca acaagcccac ccactacaac aatggcaact ataccctcat 120
<210> 91
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
tcccttgaca gatcccccac gtgtggtgag cctggaggag cctgagctgc gcctggagca 60
ctgcatcgag tttgtggtgc gtggcaaccc cccaccaacg ctgcactggc tgcacaatgg 120
<210> 92
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
gacttctgct tccctcagcc ttttcagagt gggtggggaa gaaccgggat tcccatttta 60
gttgctggaa ggctactgca ggaggtggta gactctgtgt cctggatttc agcaggcttc 120
<210> 93
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
gacgtgcatt gcagagaacg tggtgggcat gagcaatgcc agtgttgccc tcactgtcta 60
ctgtaagtgc atgttattgt gggggatggc tgtgtgtgag gggcaactgg cataggaggc 120
<210> 94
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
agaagctatc tgattgttat ctttttattg gggttttcag accaatctga actggaccaa 60
tgttcatgcc atcaacttga cgctggtgaa tgtgacgagt gaggacaatg gcttcaccct 120
<210> 95
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
caccccttcc tgatgtggac tggatagtca ctgggctgca gtccatcaac actcaccagg 60
taggcatcct gggcttcagc cccatcagga ggctagggag tgatcacact gtagtcttga 120
<210> 96
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
ttgcctgtct tttcacccac tttgtctggc tcccagacct tcctgagatc agcgtgagcc 60
acgtcaacct gaccgtacga gagggtgaca acgctgttat cacttgcaat ggctctggat 120
<210> 97
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
gcgtcttgga tttgcgggtc ttccaagaac tcaagcaggt ggtgttagag tcattactgg 60
gcaaggcaag aagtgccacc atcagcccca tggacagagc ttcctttggg tagtaagtgt 120
<210> 98
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
ggccgcctgg cccagctggc tccagggagg catccctcag acaccagaga tggtgctgga 60
cgttaccttg ggatgccaga gccttccttt cgaaacgccc tcccagcctt gaactctgca 120
<210> 99
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
gcagctctgg caggagcagg gggaggccaa gctcaacagc cagaacctct actgcatcaa 60
cgctgatggc tcccagcttc ctctcttccg catgaacatc agtcagtgtg gtgagtgagt 120
<210> 100
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
cctcatagcc ctgggagggt cctgggccat cttcggttca gaggttccct tcccctctct 60
ctttgccgac aggcagttgg agcagaactt tttcaactgc agctgtgaca tccgctggat 120
<210> 101
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
aaccacctga aggctgagca tacatctact cgaagagcct acttgggttg gttgacacag 60
agtgtaccat gttcagtgag agcaattaac ccttttgctt gacttcggat gctctttctg 120
<210> 102
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
acactctcgt ggcagctctt ccagacgctg agtcttcggg aattgtaagt ttggttttga 60
agactgtcca ggtactgaag tgctggtaat gggtggatgg ggaggagtgt caagcagtgg 120
<210> 103
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
aagccaggct ccagtgaaat gattaagctt actacctaga gcattatttg tgccagactt 60
gttttaaaat ttccctttat ttgtcaatct tgcagaaacc tgtcaagtaa ccggctcacc 120
<210> 104
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
tcggagcatt cagcccagag cctttgccaa gaacccccat ttgcgttata tgtgagtaga 60
gctgggctgc agggattggg ggcacatggc aggtactctt ggggcagtga aaccggagac 120
<210> 105
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
gcagggccag ccttagcctc accccctgcc agcctcagcc cagagcagat atccctctgc 60
cacttgagct ctgctgatcc tctttttctc tctgtctagg accatcaaga actcaggact 120
<210> 106
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
tgacctccca gcctcacggg gccctggggc gtgtgagccc aggtgcctcc actgagcaac 60
cccagcaggc cacctgtgat aactggcaat gaagaggtgt agataatcca cagggcggct 120
<210> 107
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
ttctggggtg gcgtgagggg cacagcaaga ctgccatccg tgctttctcc cccaggtctt 60
cttttggtag agttggcaat atgcacttag gggacaccag aggcttcaaa ggccatctct 120
<210> 108
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
agtcttcaca cgctcaacgc cgtggacatg gagctctaca ccggacttca aaagctgtga 60
gtacacccgg ccacagagag gcctttccct gtggaagggg tggatgccac ctggtctgcc 120
<210> 109
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
cttctggctg accgttacct ttcctcctcc cctgcagaca catagagaac tggcgcagtc 60
ttcacacgct caacgccgtg gacatggagc tctacaccgg acttcaaaag ctgtgagtac 120
<210> 110
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
caatgggaac gccagtatca acatcacgga catctcaagg aatatcactt ccatgtaagt 60
caggcggccg ctccccagcc tgcctccccc gcgctctgcg tctccctcct gcccacccgc 120
<210> 111
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
tgtgggctcc gtgctggctt gccctgcaaa ttgtgtctgc agcaagactg agatcaattg 60
ccggcggccg gacgatggga acctcttccc cctcctggaa gggcaggatt cagggaacag 120
<210> 112
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
ccccctctcc tctcctcctc ctctttttta gaagcagcga tcggagatgg atgtctctct 60
ttgcccagcc aagtgtagtt tctggcggat tttcttgctg ggaagcgtct ggctggacta 120
<210> 113
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
tgcaccggcc gctttccccc acccgtgcgg ggaggccttc cctgcgcttg cggctctctt 60
aactcctcgg tgcttgttgc gggcgtgccg agtccagctt atcagaggct gagctggtcc 120
<210> 114
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
ctccagaagc ccacaaccag ccagcagaag ccccagagcc gcgccatggc gggtccatgc 60
caccttatcc aggacgacat ccctagcagc cagtgccagc ccgagtgcct gtccccgcgc 120
<210> 115
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
ttctcaggat ctacactgtt aggctccaat ctcggaaatg ccacgatgcc aggagaaggg 60
tcgctgcacc agatccgaga ggcactgcat ttgcaggacg tgggacaggc gaaagcggcc 120
<210> 116
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
tgacttctcc ccactcttgg gacagcattc acttccagga cctacccacc tggccagctc 60
gggccctagg ggcaaggaga aaaaggagga aaagctccag gaactcacat ttcggtgatg 120
<210> 117
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
gtccaaggtg ctccctccac accactctga gccttgccat ttttttaaat acagcagtag 60
agcaaaactg agcatgactg agcagaaacc atgactgacc aggtttcatg gtcaataacc 120
<210> 118
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
ttgatgattt ctaacctttt ctggtttgcg atgaaactgt aacaaagcag agagtgaatc 60
gcagtgactc agaatgtagg cagcagcacc atgaagaact cccatccacc tcacccaggt 120
<210> 119
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
cgaaccagtg aatgcctgcc tgaccagagc agacaacagg aaaattctct gagataatgt 60
gccctggtcc tgagtactca cagatttctc agtcccacat aagcttcaac atcatcttcg 120
<210> 120
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
cttacatgtg ctgcaggttg ctgtttttca gaaatgcttt atgagccaca aattttaatc 60
cagaatccac aattgtcctg tgaaaacaca taatttcatg cacattagaa cgaaccagtg 120
<210> 121
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
gaggtttcaa gttggaaaag aaggaaaata aacagagggg ggaaatattg aataaaatgg 60
gtcctgggaa gcaaaagaat caatctctac ttacatgtgc tgcaggttgc tgtttttcag 120
<210> 122
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
ttgctctgtc caagatggaa ctggcccaga aattcatgaa agggaataaa cagcctgttc 60
taagtacccc tctgaagcta ttcaaaaaat caaacaaaat cagagctaat gtttctaagc 120
<210> 123
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
acatttcccc aaatgccaca caaaatcatt acttacagtt cagacaagtc aaggtgacgg 60
aaatgtttcc tagacaaact cgtcagtttg tttcgggtaa aattgctgaa aggaatcaaa 120
<210> 124
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
taattacccc ttcctttgaa aacatttccc caaatgccac acaaaatcat tacttacagt 60
tcagacaagt caaggtgacg gaaatgtttc ctagacaaac tcgtcagttt gtttcgggta 120
<210> 125
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
cttgatccac ataatgtcac aggagcatgt aaatggattg cccaccagga tcctacaggg 60
aacaaaaatg acaacagatc aagttccttt ttccatttta gctacattag tgcttgtaaa 120
<210> 126
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
atttaaaaat aaattaccac aattgggtat ctgcaggttt gccaggggaa tattcttgct 60
gctttcattc aggcagtaca aatcctgagt gtctggactg gatttagcct cttggagagt 120
<210> 127
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
aatgttgtct gagtcactgg agacatcaac agaatactat atacaatcca ggtagtggta 60
attttcccag actaccgcac caaggcaatg agaataatta atagcaacta gaacacattg 120
<210> 128
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
caacatccca atacatatta ggaaccggat cacctgccac actacaggat aatgtgatag 60
actttccttc ctccacagtg aggttaggtg cggccagatt tgcagatggc aaacctatgg 120
<210> 129
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
tataaaatat caaatgatca tcactaggtt taatacattc tcgcattctg aaacactctt 60
gtctctctat taagacacag ccaaacacaa gccttaccat atgtttggaa accaggttac 120
<210> 130
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
ggattgatcc caaagtgaca agatttgggg tttcttcccc taactagaga aaatatgtat 60
atatagcatt agaaaagctt ctctgcctga actgggctca ggcgaagaag taaatcagaa 120
<210> 131
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
gccacacaag agatctgctt cccactgtca tcggatgaaa tgttagttat ccttaaggag 60
ccctgtgtgt ggcttgtttc attctacaaa tgaattaaca gacaaaaata accttgatta 120
<210> 132
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
ccccagcaac aaacgtaggt acgtccatga tcatttgcta ttaaaaacac atgccagtct 60
gattacgtac aatgcacagt gaggttgaca gaatcttgat cttctcctac aagattttcc 120
<210> 133
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
aggttggaga ttcgagaaat gtgatagttg gtgcaactaa attgaaaaag agagagttaa 60
tagcatcaga aagctcagaa ttctccccat ctcgagatgt ctgtgtcatt gatagggaat 120
<210> 134
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
taacatgtat tttagtacag atgtatttgg actcattcaa tattgccccg ttatagaacc 60
actgaagcgc tggtttgggg ttgcctttca cagtgaatgg aatgcaccag tggtggtctg 120
<210> 135
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
gagcagaaat ctgtttctca tccttcccat actcattctt ggctattaga gtgtagtccc 60
cattgttcat gtgagtggga ttatccagct ggaggcagcc gtggtactcc gtgtgattgg 120
<210> 136
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
tgggggatgg cttattgtat acatgatttt gtcaacaggt gaatgataga ctttatcttc 60
tccccacata caaaagtgtc agttactcac catcgtcaat tccaggccag cccatgaagt 120
<210> 137
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
aaacattttg aaaaagaaat acaaagtaga aaacacgata gctaccttca taaattacat 60
caggataatt tgggtttgca cctaaaaggc aaaacagagc aaagatttgt aagtatgcat 120
<210> 138
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
cattcgctgc agttccataa tcttaagtgg gcaaaggggg aatgaggaag aacatgaagt 60
tgtcattaag ctgccaacaa acacagggcc acagtaagag ccagaatgaa gcaagacaaa 120
<210> 139
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
atgctcagaa ccaattcaga cacctattta ttccactcac cgagagatgt tcccgaccgg 60
ttttatcagt gacgtctgtg gaagggattt cattacttct gttcgtggtg tccccgatgt 120
<210> 140
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
tcacttttgt taagcctttt attaattctt ccaacctagg tgttaacacc ctatttatat 60
ctgaacaata aaagtgtctt attgaagcag ctacattcct ctaacatgga ggcatccaaa 120
<210> 141
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 141
ttggagtgtc ttgccaactt aagcagaaac agcattacca aaaggcaaaa tcccaccaca 60
gacgcaatca ccaccacagc atagacctag agaaaggaag ggagggtggt tataaccttg 120
<210> 142
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 142
cctaatcatc ataaatctag ccacttcctt ctttagtggt aattagcatt agtcataagc 60
caaaaatgat ccacataaga agctaaataa acacaaccct tcttaccttt catgccaaac 120
<210> 143
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
tccaaaccat gagaaatctg aaaaccacaa caaaacataa aataaacttc gaaagagaag 60
tagaaaccgg aggtggtcaa cactgtcctt ggtcaaataa tgcaacaaac tccccccgac 120
<210> 144
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
gtggaatgta aagagggtct aagcattttc atccgaataa aaacatagac tcattactta 60
tccaaagaag gagtgagtta actacttacc aacaccttgt cttgatttta ctttcccaaa 120
<210> 145
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
gattttcaat gacagggatc ttggtcattc caataatgac agcatctggg ccaccttccg 60
aagaagatgg agtgttactc ccattggaga tgtgatggag tgggctggca gagtcatcat 120
<210> 146
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
aggggctctg ataaacactc tggttgatac agctatgcag caaatgggac aataagtaca 60
aacagctgta cttacatgtg tctggcttga gctgactgtt ggtgatgcca aagtactggg 120
<210> 147
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 147
gcaggagaca cacccggaga attccataag caacaaacta aaggatctat tcctgggcca 60
aaagctgcaa gaatcctcaa acatttcact gcaccctgtt ccccgccagt catccctatc 120
<210> 148
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 148
ttcgcctagc tcccttttca gaacaatgtt atgtcgcttg atgtgctgaa caactgcaaa 60
acaaagacag aatggaaatt ggaattgaag catgtggagg tgaaggcagc gggtgaagag 120
<210> 149
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 149
gtgtgatcat ggttaatgag acattctgga atgttctctt accttcactg ccaccaagat 60
cttgtcctgc tcaggacaga ggttatagca ttcagctagg aacacttttc caaaggctcc 120
<210> 150
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 150
tgtcctttcc actgtccatt tagtttaaag gaatttgaat acatccatca tagcaggaac 60
aatttactcc tgcattggcc accaaaatat aataaaatag agttaaattt ccacacgtaa 120
<210> 151
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 151
ttgacgatgt gctcatgctg gaggttggtc aggagctcgg cctcacggtg gaagtccttg 60
cgtgcattgt cactggcatc cttcagggtc tggggatggg tgttaaaaga gaaggattac 120
<210> 152
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 152
ctccctcctg gagcccacct ccccgcctca ctgtacctga ggaacttgtt gaggtcccca 60
tgcttcatgt actcaaagac catgatgagg gggtcgccct ccacgcagac gccatagaac 120
<210> 153
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 153
tttctctcct cctttctctg gcatatgctg gtgtcattat caaataagat gcttcgagaa 60
aggtccaggg gtcccttgtt ccctcccatg aaccctccac tcctgaaccc tgaaggcctg 120
<210> 154
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 154
cctggggaag gacatggaga atgaagctgg gggcctcagc attttcactc caggggccct 60
ttgcccctgc ccctccccgt ccctcttgct aagctcctca cccccaccct gtagctgctg 120
<210> 155
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 155
ctgggacgcc aggtagacca tgcccgcggc gatctgctgg gctatatgca gcatctgcga 60
ctgcgtcagt tccgtgggcg ggttgccctc agccatcagc acggcatcag ggccgtgtgc 120
<210> 156
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 156
actcaccctg tagtagtcag tgctgtacac gtcccgggac atcccaaagt ccccgatttt 60
caccagcaag ttctccccga ccaggcagtt cctggtggcc aaatcgcggt gcacgaagtg 120
<210> 157
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 157
tgtacatgat gctctctgga ggcatccagc gaatgggcag cattgtgtgg ccaccgacct 60
ggggagaaag ggatcaacag ggaggcatca gtcaccccga aaccaggtgt ggaagggagc 120
<210> 158
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 158
ggccagaccc attgcacacc tcattgtttg acagctggta ccagggctgt ttgccatagg 60
tgaaaatctc ccacaacacg acccccaggc tccagacgtc gctttccgtc gtgaatttcc 120
<210> 159
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 159
tacttgggaa gtgctgccac caacaaagcc cataagatcg tgtcctgaca tggtcttcca 60
acccaaaaca aggccccagc caatggatgc ctctgggatc tcagccctct ggagggtctt 120
<210> 160
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 160
gaggaaaagc aatgcacatc gaagaaatgt cagtgcaaaa aaacagcaga agagagggct 60
tttacaaaag aagcccactc ttggttttgt tttctcagaa ggaagagagc aattattata 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 161
tgccagcacc ccagcatcag ctcatacacc tcctgggggc acgtgcgggg tcgctgcagg 60
actcggccct gagtgataca ctctatcacc tggatggaga tcaaagatag gatgagacag 120
<210> 162
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 162
ggatcggtct ggggaaaagg gccctagcct agaatgtcca ggtagaccgg agatgccttg 60
gccaagttct gaaggagggt atggatgccc ttgatgttct tcctcatgtg gggctctcgc 120
<210> 163
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 163
gagagcttct cggagtcttt gatgttaata ctgtcagagt gaaggagagc agcttggtgg 60
cctccagcgg cagttaaaag atgttcatcc tctcagcccg tctgaggagt acgttgggaa 120
<210> 164
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 164
ggccgtcaga gctcaggcca gatggtagtg atctccctgc tctgaccaga aatgacatgc 60
agatgagcct ctacccagcc tcccggtccc aaagtctgca caagcttcta cttcctatct 120
<210> 165
<211> 116
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 165
cgtcagagct caggccagat ggtagtgatc tcgctgctct gaccagacat gacatgcaga 60
tgagcctcta ccagcctccc ggtcccaaag tctgcacaag cttctacttc ctatct 116
Claims (5)
1.探针库在用于制备检测NTRK融合基因的试剂盒中的应用，其特征在于，所述的探针库中包括有核苷酸序列如SEQ ID NO. 1～163所示的全部探针。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用中还包括以下步骤：
1）获得受试者的DNA样本库；
2）获得所述的探针库；
3）使所述探针库与所述DNA样本库进行杂交；
4）分离步骤3）的杂交产物，然后释放经杂交富集的NTRK融合基因DNA片段；
5）通过高通量测序的方法对NTRK融合基因DNA片段进行检测。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤1）中的DNA样本库由双链DNA片段组成，并且，所述步骤1）包括：1-1）提取全基因组DNA，然后将其片段化；或者1-2）提取mRNA，将其片段化，然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA；其中，所述受试者为人，且从受试者的细胞、组织或体液样本中提取全基因组DNA或mRNA。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述DNA片段的长度为150～600bp。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述DNA片段的长度为150～200bp。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 210032 No. 3-1 Xinjinhu Road, Nanjing High-tech Development Zone, Jiangsu Province Applicant after: Nanjing Shihe gene Biotechnology Co., Ltd Applicant after: NANJING SHIHE MEDICAL DEVICES Co.,Ltd. Address before: 210032 No. 3-1 Xinjinhu Road, Nanjing High-tech Development Zone, Jiangsu Province Applicant before: GENESEEQ TECHNOLOGY Inc. Applicant before: NANJING SHIHE MEDICAL DEVICES Co.,Ltd. |
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| CB02 | Change of applicant information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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