ES2951683T3 - Evaluación de la calidad de ADN acelular circulante usando PCR digital en nanogotas multiplexada - Google Patents

Evaluación de la calidad de ADN acelular circulante usando PCR digital en nanogotas multiplexada Download PDF

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Abstract

La presente invención proporciona un método para determinar la integridad y/o cantidad de ADN libre de células (ADNcf) en una muestra biológica que comprende amplificar secuencias diana con al menos un primer conjunto de cebador/sonda y al menos un segundo conjunto/sonda de cebador, amplificar la diana. secuencias de diferentes longitudes, y monitorización de la detección de los marcadores de las sondas de oligonucleótidos, y determinación de la integridad y/o cantidad del ADNcf en función del nivel de detección del marcador de la sonda de oligonucleótidos del primer conjunto de cebadores/sonda en comparación con la detección del nivel del marcador de la sonda oligonucleotídica del segundo conjunto de cebador/sonda. La presente invención también proporciona métodos para generar una biblioteca con el cfDNA para secuenciación y análisis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Evaluación de la calidad de ADN acelular circulante usando PCR digital en nanogotas multiplexada REFERENCIA CON RESPECTO A SOLICITUDES RELACIONADAS
La presente solicitud reivindica prioridad de la solicitud provisional estadounidense 62/149.386, presentada el 17 de abril de 2015.
REFERENCIA A LISTADO DE SECUENCIAS PRESENTADO ELECTRÓNICAMENTE
La copia oficial del listado de secuencias se presenta electrónicamente a través de EFS-Web como un listado de secuencias con formato ASCII con un archivo denominado "91482_179_Seq_Listing_ST25.txt" creado el 14 de abril de 2016 y con un tamaño de 6 kilobytes, y se presenta junto con la memoria descriptiva. El listado de secuencias contenido en el presente documento con formato ASCII forma parte de la memoria descriptiva.
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere a métodos de generación de bibliotecas de secuenciación con ADN acelular de menos de 300 pb.
ANTECEDENTES
El análisis de ADN acelular circulante (ADNac) en plasma tiene varias aplicaciones diagnósticas establecidas y futuras en la medicina prenatal, oncológica y de trasplantes (1-7). La secuenciación hologenómica de ADNac está clínicamente disponible para el equilibrado prenatal no invasivo de aneuploidies fetales (1, 5). La secuenciación de próxima generación del ADNac en pacientes con cáncer puede permitir la identificación no invasiva de mutaciones de cáncer, el seguimiento de la carga del cáncer y la evolución de tumores (4, 8-10). Sin embargo, se sabe poco sobre el efecto de los factores preanalíticos en la calidad del DNA y en el rendimiento de los ensayos moleculares. La fracción informativa del ADNac está generalmente fragmentada con un tamaño modal de 160-180 pb. Los factores preanalíticos, tales como el fraccionamiento tardío del plasma o la eliminación incompleta de las células de sangre periférica antes de la congelación, pueden provocar un aumento de la fracción de ADN de mayor peso molecular (HMW, del inglés higher molecular weight) debido a la lisis celular. Para las estrategias de secuenciación basadas en PCR, esto puede reducir artificialmente la fracción de alelos diana, tales como las mutaciones específicas de tumor en el ADN tumoral circulante, lo que dificulta su detección y provoca errores en los análisis de a Dn . Dado que el ADNac se fragmenta in vivo, la preparación de bibliotecas de secuenciación mediadas por ligamiento a partir de ADNac no implica cizallamiento y, por lo tanto, el ADN HMW no se incorpora a las bibliotecas de secuenciación. Si la medición inicial del ADNac total es erróneamente alta debido a una gran fracción de ADN HMW, la secuenciación posterior puede verse comprometida.
La cuantificación del ADNac puede realizarse utilizando métodos fluorimétricos o espectrofotométricos, tales como QUBIT® (Life Technologies) o NANODROP™ (Thermo Scientific). Estos métodos no miden el tamaño del ADN y no pueden tener en cuenta la fracción de HMW en ADN plasmático. Los métodos electroforéticos pueden realizar una cuantificación basada en el tamaño, pero requieren cantidades de entrada para obtener resultados fiables que no son factibles para el análisis de ADNac. Además, ninguno de estos métodos proporciona una evaluación de las copias de ADN amplificables disponibles para el análisis molecular posterior. La PCR cuantitativa multiplexada puede proporcionar una evaluación del tamaño y del ADN amplificable, pero requiere la comprobación con una curva patrón. Esta se basa en 1-2 locus genómicos para inferir el contenido total de ADNac, suponiendo que los locus diana son genes de una sola copia. Esta suposición puede afectar a la medición del ADNac de pacientes con cáncer con cambios somáticos en el número de copias reflejados en el plasma. Además, recientemente se ha demostrado que las lecturas relativas de múltiples ensayos de un solo locus pueden variar sistemáticamente debido posiblemente al rendimiento de ensayo y a la estabilidad variable del ADN genómico (11).
Se necesita un método eficaz para la cuantificación exacta del ADNac y la evaluación su integridad. Dado que las cantidades de ADNac disponible en una muestra son generalmente muy limitadas, un método de este tipo requiere un intervalo dinámico relativamente amplio y la capacidad de detectar y evaluar cantidades mínimas de ADNac. Pamela Pinzani et al. desvela cuestiones cualitativas y cuantitativas del ADN acelular circulante en plasma de pacientes con melanoma, CLINICA CHIMICA ACTA, ELSEVIER BV, AMSTERDAM, NL, vol. 412, n.° 23, páginas 2141 - 2145, 20110803 (DOI: 10.1016/j.cca.2011.07.027). Yoruker et al. desvelan una evaluación de la integridad del ADN en suero circulante en pacientes con cáncer colorrectal, ANTICANCER RESEARCH, vol. 35, n.° 4, 20150401, páginas 2435 - 2440 (DOI: abril 2015; 35(4):2435-40).
SUMARIO
La presente invención se expone en el juego de reivindicaciones adjunto. En un aspecto, el método de generación de una biblioteca de secuenciación con ADN acelular (ADNac) de menos de 300 pb se define en la reivindicación 1 adjunta.
En algunos aspectos, los cebadores oligonucleotídicos tienen una longitud de secuencia de nucleótidos de aproximadamente 10 a aproximadamente 150. En otros aspectos, las sondas oligonucleotídicas tienen una longitud de secuencia de nucleótidos de aproximadamente 10 a aproximadamente 50.
En ciertas realizaciones, la primera secuencia diana y la segunda secuencia diana son de al menos un gen constitutivo. En una realización, el al menos un gen constitutivo se selecciona del grupo que consiste en ACTB (Beta-actina), GAPDH (Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa), RPLPO (proteína ribosómica ácida 60 S PO), GUSB (beta-glucuronidasa) y TFRC (receptor de transferencia 1).
En algunos aspectos, el primer conjunto de cebador/sonda comprende al menos una sonda oligonucleotídica y al menos dos cebadores oligonucleotídicos que comprenden, cada uno de ellos, una secuencia oligonucleotídica seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 13-27.
En otros aspectos, el segundo conjunto de cebador/sonda comprende al menos una sonda oligonucleotídica de al menos dos cebadores oligonucleotídicos que comprenden, cada uno de ellos, una secuencia oligonucleotídica seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-12.
En una realización, el primer conjunto de cebador/sonda comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco sondas oligonucleotídicas que están marcadas de manera detectable y al menos cuatro, al menos seis, al menos ocho o al menos 10 cebadores oligonucleotídicos, cada uno de ellos hibridándose a una secuencia diana de menos de 300 pb, y en donde la detección de los marcadores de las sondas oligonucleotídicas del primer conjunto de cebador/sonda se promedian para determinar la detección de los marcadores.
En otra realización, el segundo conjunto de cebador/sonda comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco sondas oligonucleotídicas que están marcadas de manera detectable y al menos cuatro, al menos seis, al menos ocho o al menos 10 cebadores oligonucleotídicos, cada uno de los cuales, se hibrida con una secuencia diana de 300 pb o de mayor longitud, y en donde la detección de los marcadores de las sondas oligonucleotídicas del segundo conjunto de cebador/sonda se promedia para determinar la detección de los marcadores.
En otros aspectos más, en donde la PCR digital en nanogotas (ddPCR, del inglés droplet digital PCR) es una ddPCR multiplexada, y opcionalmente en donde las copias amplificables (CA) de ADNac en la muestra biológica se calcula de la siguiente manera:
(i) dividiendo el número de nanogotas positivas que indican hibridación con la primera secuencia diana entre el número de sondas oligonucleotídicas en el primer conjunto de cebador/sonda; (ii) dividiendo el número de nanogotas positivas que indican hibridación con la segunda secuencia diana entre el número de sondas oligonucleotídicas en el segundo conjunto de cebador/sonda; y (iii) restando (ii) de (i) para estimar las CA de ADNac en la muestra biológica. En determinados aspectos, las sondas oligonucleotídicas se marcan de manera detectable con un marcador fluorescente seleccionado del grupo que consiste en FAM (5- o 6- carboxifluoresceína), VIC, NED, Fluoresceína, FITC, IRD-700/800, CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, HEX, TET (5-tetracloro-fluoresceína), TAMRA, JOE, ROX, BODIPY TMR, Oregon Green, Rhodamine Green, Rhodamine Red, Texas Red, Yakima Yellow, Alexa Fluor PET, Biosearch Blue™, Marina Blue®, Bothell Blue®, Alexa Fluor®, 350 FAM™, SYBR® Green 1, Fluoresceína, EvaGreen™, Alexa Fluor® 488 JOE™, 25 VIC™, HEX™, TET™, CAL Fluor®Gold 540, Yakima Yellow®, ROX™, CAL Fluor® Red 610 Cy3.5™, Texas Red®, Alexa Fluor® 568 Cry5™, Quasar™ 670, LightCycler Red640®, Alexa Fluor 633 Quasar™ 705, LightCycler Red705®, Alexa Fluor® 680, SYT0®9, LC Green®, LC Green® Plus+ y EvaGreen™.
En una realización, los marcadores fluorescentes son FAM™ (5- o 6-carboxifluoresceína) y TFT™ (5-tetraclorofluoresceína).
En otra realización más, el primer conjunto de cebador/sonda detecta al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco secuencias diana de aproximadamente 50 pb a aproximadamente 100 pb de longitud. En un aspecto, el segundo conjunto de cebador/sonda detecta al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco secuencias diana de aproximadamente 300 pb a aproximadamente 1000 pb de longitud.
En algunos aspectos, el método comprende además generar una biblioteca con el ADNac para la secuenciación y el análisis. En una realización, la biblioteca es una biblioteca de exoma.
En otros aspectos, la muestra biológica se divide en partes alícuotas, y cada parte alícuota se somete a un proceso anterior diferente para evaluar cómo afecta el procesamiento anterior a la integridad y/o cantidad de ADNac en la muestra biológica.
En otro aspecto más, el método comprende adicionalmente realizar una amplificación con el primer conjunto de cebador/sonda y/o el segundo conjunto de cebador/sonda sin la muestra biológica como control negativo.
La invención se define mediante las reivindicaciones y cualquier otro aspecto, configuración o realización expuestos en el presente documento que no se incluya dentro del alcance de las reivindicaciones es con propósitos ilustrativos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 muestra secuencias de cebador y sonda que pueden utilizarse para cuantificar y evaluar la integridad del ADNac. Las longitudes de los cebadores y las sondas, sus temperaturas de fusión ("Tf') y el contenido de GC ("porcentaje de GC") también se indican junto con la longitud de los amplicones resultantes ("Amplicón pb").
La Figura 2 representa las etapas implicadas en una forma de PCR digital en nanogotas (ddPCR). En esta figura, la muestra contiene una mezcla de ADN genómico con un gen mutante y un ADN genómico con el gen de tipo silvestre correspondiente. La ddPCR se diseña para amplificar y detectar cantidades relativas de cada forma del gen con sondas fluorescentes específicas.
La Figura 3 presenta una realización del diseño del ensayo con ddPCR que produce cinco amplicones cortos (una longitud de ~71 pb) y cuatro amplicones largos (de una longitud de ~471 pb). Las nueve regiones genómicas representan regiones constitutivas. Las sondas fluorescentes mostradas en la figura comprenden desactivadores indicados con una "D" y los fluoróforos fluoresceína amidita (FAM) y 5-tetracloro-fluoresceína (TET), aunque en el ensayo puede utilizarse cualquier fluoróforo conocido en la técnica que puede conjugarse con las sondas utilizadas.
La Figura 4 representa un cálculo de muestra del número de copias amplificables de ADNac de bajo peso molecular (LMW, del inglés low molecular weight) en una hipotética muestra biológica que contiene 50 copias haploides de ADNac con un tamaño promedio de fragmento de aproximadamente 180 pb y 20 copias haploides de ADN de células de sangre periférica intacta. El cálculo se basa en el diseño del ensayo con ddPCR mostrado en la Figura 3.
La Figura 5 muestra mediciones de fluorescencia de amplicones grandes y amplicones cortos con el ensayo de ddPCR desvelado en el presente documento.
La Figura 6 representa mediciones en bruto de intensidad de fluorescencia de amplicones generados con ADN fragmentado.
La Figura 7 representa equivalentes genómicos por microlitro de muestra de ADN genómico intacto y ADN genómico fragmentado que tiene tamaños de fragmento específicos de 1000 pb, 500 pb, 300 pb y 150 pb calculado a partir de mediciones de intensidad de fluorescencia.
La Figura 8 muestra curvas reales (líneas en negrita) generadas con datos experimentales y curvas simuladas (líneas discontinuas) basados en distribuciones exponenciales con tasas que corresponden a tamaños promedio de fragmentos. En cada curva se indican las copias amplificables por ddPCR a tamaños de fragmento de entrada de 150 pb, 300 pb, 500 pb, 1.000 pb y 10.000 pb.
La Figura 9 representa la biblioteca de secuenciación obtenida de ADN cortado frente a intacto, comprendiendo el ADN intacto o el ADN cortado fragmentos de ADN del 25 %, 50 % o 75 % de aproximadamente 300 pb.
La Figura 10A muestra la fluorescencia generada a partir de dos muestras biológicas con diferentes cantidades de ADN HMW y LMW utilizando el ensayo de ddPCR multiplexada.
La Figura 10B representa un gráfico de barras que indica las cantidades relativas de amplicones grandes y amplicones pequeños producidos a partir de cada muestra con el ensayo de ddPCR multiplexada.
La Figura 11 representa la diversidad en la biblioteca de secuenciación y el tamaño en cuanto a la relación con la entrada de ADNac optimizado por ddPCR.
La Figura 12 presenta el efecto de diversos protocolos de recogida de muestras sobre el número de copias amplificables de ADNac por ml de plasma.
Las Figuras 13A y 13B muestran el impacto de diversos kits de extracción de ADN sobre la cantidad de copias amplificables de ADNac obtenidas a partir de muestras de plasma. Los kits de extracción identificados como A, B y C utilizan columnas de centrifugación, mientras que los kits de extracción identificados como D, E, F, G y H utilizan perlas magnéticas.
La Figura 14 representa un análisis de la calidad de las muestras biológicas de diferentes cohortes de estudio utilizando el ensayo de ddPCR multiplexada.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Como se usa en el presente documento, el verbo "comprender" como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones y sus conjugaciones se utiliza en un sentido no limitante para indicar que los elementos que siguen a la palabra están incluidos, pero que elementos no específicamente mencionados no están excluidos. Además, la referencia a un elemento mediante el artículo "un" o "una" no excluye la posibilidad de que haya uno o más de los elementos, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos. Por tanto, el artículo indefinido "un" o "una" normalmente significa "al menos uno(a)".
Como se usa en el presente documento, "conjunto de cebador/sonda" se refiere a una agrupación de un par de cebadores oligonucleotídicos y una sonda oligonucleotídica que hibridan con una secuencia de nucleótidos específica. Dicho conjunto de oligonucleótidos consiste en: (a) un cebador directo discriminatorio que hibrida con una primera ubicación de una secuencia de ácido nucleico; (b) un cebador inverso discriminatorio que hibrida en una segunda ubicación de las secuencias de ácido nucleico hacia abajo de la primera ubicación y (c) una sonda fluorescente marcada con un fluoróforo y un desactivador, que hibrida en una ubicación de la secuencia de ácido nucleico entre los cebadores. En otras palabras, un conjunto de cebador/sonda consiste en un conjunto de cebadores específicos de PCR capaces de iniciar la síntesis de un amplicón específico en una secuencia de ácido nucleico, y una sonda fluorescente que hibrida con el amplicón.
Un "amplicón" se refiere a un fragmento de ácido nucleico formado como un producto de acontecimientos o técnicas de amplificación naturales o artificiales. Por ejemplo, un amplicón puede producirse mediante reacción en cadena de PCR ligasa o duplicación de genes.
Las expresiones "amplicón corto" y "amplicón pequeño" como se usan en el presente documento son expresiones sinónimas y se refieren a amplicones que tienen una longitud inferior a 300 pb.
Las expresiones "amplicón largo" y "amplicón grande" utilizadas en el presente documento son expresiones sinónimas y se refieren a amplicones que tienen una longitud mayor que o igual a 300 pb.
Una "sonda" o "sonda fluorógena" comprende una secuencia de oligonucleótidos marcada con un "colorante indicador fluorescente" o "fluoróforo" y un "colorante desactivador" o "desactivador". Un "colorante indicador fluorescente" o "fluoróforo" se refiere a una molécula que emite luz de una determinada longitud de onda después de haber absorbido primero luz de una longitud de onda más corta, específica, en donde la longitud de onda de emisión es siempre mayor que la longitud de onda de absorción. Un "colorante desactivador" o "desactivador" se refiere a una molécula que acepta energía de un fluoróforo en forma de luz a una longitud de onda particular y disipa esta energía bien en el formato de calor (por ejemplo, desactivación proximal) o luz de una longitud de onda mayor que se emite a partir del fluoróforo (por ejemplo, desactivación FRET). Generalmente, los desactivadores tienen una capacidad de desactivación en todo su espectro de absorción, pero rinden mejor cerca de su máximo de absorción. Por ejemplo, el Desactivador II Deep Dark absorbe en un amplio intervalo del espectro visible y, por consiguiente, inactiva de manera eficaz la mayoría de los fluoróforos comúnmente utilizados, especialmente aquellos que emiten a longitudes de onda más altas (como los colorantes Cy®). De manera similar, la familia de Desactivadores Black Hole cubre un intervalo grande de longitudes de onda (en todo el espectro visible y en el IR cercano). En cambio, el Desactivador I Deep Dark y el Desactivador Eclipse® Dark desactivan de manera eficaz los colorantes de menores longitudes de onda, tales como FAM, pero no desactivan de manera muy eficaz aquellos colorantes que tienen a longitudes de onda elevadas.
La expresión "genes constitutivos" como se utiliza en el presente documento indica que se refiere a genes que codifican productos proteicos que no están conectados, implicados en o son necesarios para procesos específicos en una patología (por ejemplo, cáncer) en células y, por tanto, muestran un nivel de expresión fijo en células enfermas y sanas. Como ejemplos de genes constitutivos se incluye, pero sin limitación, genes que codifican ACTB (Beta-actina), GAPDH (Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa), Rp LPO (proteína P0 ribosomal ácida 60 S), GUSB (beta-glucuronidasa) y TFRC (receptor 1 de transferencia).
Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" o "paciente" se refiere a cualquier vertebrado, incluyendo pero sin limitación seres humanos y otros primates (por ejemplo, chimpancés y otras especies de simios y monos), animales de granja (por ejemplo, ganado, ovejas, cerdos, cabras y caballos), animales domésticos (por ejemplo, perros y gatos), animales de laboratorio (por ejemplo, roedores tales como ratones, ratas y cobayas) y aves (por ejemplo, aves domésticas, silvestres y de caza, tales como pollos, pavos y otras aves gallináceas, patos, gansos y similares). En algunas implementaciones, el sujeto puede ser un mamífero, preferentemente y ser humano.
Como se usa en el presente documento, "PCR digital" se refiere a un ensayo que proporciona una medición de criterio de valoración que proporciona la capacidad de cuantificar ácidos nucleicos sin el uso de curvas patrón, como se usa en la PCR en tiempo real. En un experimento de PCR digital habitual, la muestra se distribuye al azar distintas divisiones, de tal manera que algunas no contienen moldes de ácido nucleico y otras contienen una o más copias de molde. Las divisiones se amplifican hasta la fase estable terminal de la PCR (o punto final) y después se leen para determinar la fracción de divisiones positivas. Si las divisiones tienen un volumen uniforme, puede calcularse el número de moléculas de ADN diana presentes de la fracción de regiones finales positivas utilizando estadísticas de Poisson de acuerdo con la siguiente ecuación:
en donde A es el número promedio de moléculas de ADN diana por copia de reacción y p es la fracción de reacciones finales positivas. A partir de A, junto con el volumen de cada PCR copiada y el número total de copias analizado, se calcula una estimación de la concentración de ADN diana absoluta. La PCR digital incluye una variedad de formatos, incluyendo PCR digital en nanogotas BEAMing (perlas, emulsión, amplificación y magnetismo) y microplacas de microfluido.
"PCR digital en nanogotas" (ddPCR) se refiere a un ensayo de PCR digital que mide las cantidades absolutas contando las moléculas de ácido nucleico encapsuladas en divisiones de nanogotas de agua en aceite distintas, definidas volumétricamente, dan soporte a la amplificación por PCR (Hinson et al., 2011, Anal. Chem. 83:8604-8610; Pinheiro et al., 2012, Anal. Chem. 84:1003-1011). Una sola reacción ddPCR puede estar comprendida por al menos 20.000 nanogotas divididas por pocillo.
Una "nanogota" o "nanogota de aceite en agua" se refiere a una división individual del ensayo de PCR digital en nanogotas. Una nanogota da soporte a la amplificación por PCR de una o más moléculas molde utilizando químicas de ensayo homogéneas y flujos de trabajo similares a los ampliamente utilizados para aplicaciones de PCR en tiempo real (Hinson et al., 2011, Anal. Chem. 83:8604-8610; Pinheiro et al., 2012, Anal. Chem. 84:1003-1011). La PCR digital en nanogotas puede realizarse utilizando cualquier plataforma que realice un ensayo de PCR digital que mida cantidades absolutas contando las moléculas de ácido nucleico encapsuladas en distribuciones de nanogotas de aceite en agua distintas, volumétricamente definidas, que dan soporte a la amplificación por PCR. La estrategia de la PCR digital en nanogotas puede resumirse de la siguiente manera: una muestra se diluye y divide en cientos a millones de cámaras de reacción separadas (nanogotas de aceite en agua) de manera que cada una de ellas contiene o no copias de la molécula de ácido nucleico de interés. El número de nanogotas "positivas" detectado, que contiene amplicón diana (es decir, la molécula de ácido nucleico de interés), frente al número de nanogotas "negativas" que no contienen el amplicón diana (es decir, la molécula de ácido nucleico de interés), puede utilizarse para determinar el número de copias de la molécula de ácido nucleico de interés que estaba en la muestra original. Como ejemplos de sistemas de PCR digital en nanogotas se incluyen el sistema de PCR digital en nanogotas QX100™ de Bio-Rad, que dividen muestras que contienen molde de ácido nucleico en nanogotas de un tamaño de 20.000 nanolitros; y el sistema PCR digital RainDrop™ de RainDance, que divide muestras que contienen molde de ácido nucleico en 1.000.000 a 10.000.000 de un tamaño de picolitro.
En algunos aspectos, la presente invención proporciona un método para realizar una cuantificación de ADN en una etapa y valorar la integridad del ADN (medición de fracciones de h Mw y ADNac) utilizando una estrategia múltiple de 9-plex utilizando ddPCR. En lugar de medir locus individuales, el ensayo se basa en la lectura promedio de todos los locus analizados, midiendo la concentración de ADNac y el ADN de HMW con la alta precisión y exactitud. La cuantificación de ADNac utilizando esta estrategia predice el rendimiento posterior de la secuenciación del exoma mediada por ligamiento.
En otros aspectos, la presente divulgación proporciona una estrategia para evaluar de manera precisa la cantidad de ADN en una etapa y la integridad a partir de diminutas cantidades de ADN acelular utilizando una PCR digital en nanogotas (ddPCR) de picolitro.
En algunas realizaciones, se proporciona un ensayo de ddPCR multiplexada que incluye cebadores y sondas oligonucleotídicas específica de secuencia que se dirige a 5 amplicones cortos (67-71 pb) y 4 amplicones largos (439-522 pb) de regiones inactivas independientes del genoma humano. En una realización, todas las sondas de amplicón cortas y largas se marcan con colorantes fluorescentes FAM y TET, respectivamente. Los fragmentos de ADN amplificables que amplifican amplicones cortos y largos se calculan como el promedio a lo largo de cada conjunto, para aumentar la precisión y exactitud cuando se evalúan pequeñas cantidades de entrada de ADN. El rendimiento del ensayo puede evaluarse utilizando ADN genómico de control cortado mediante ultrasonido en fragmentos de un tamaño promedio de 150-1000 pb. Para validar el ensayo se prepararon 15 bibliotecas de secuenciación del exoma basadas en ligamiento a partir de muestras de ADN plasmático de control, guiadas por la evaluación de la integridad de ADN por ddPCR sin realizar cortes adicionales.
En algunos aspectos, cantidades relativas de fragmentos de amplificables utilizando PCR corta y larga reflejan la integridad del ADN genómico cortado, aproximadamente siguiendo las expectativas de la distribución exponencial de la fragmentación del ADN. La cuantificación y evaluación precisa de la integridad puede conseguirse utilizando cantidades de picogramo de ADN acelular (de tan solo 200 μg). Las evaluaciones de la integridad y la cantidad de ADN predicen la diversidad de la biblioteca y la profundidad de cobertura obtenible en las bibliotecas de secuenciación de próxima generación preparadas a partir de muestras ADN acelular.
A medida que se evalúa la relevancia clínica de las nuevas aplicaciones diagnósticas del ADN acelular circulante, se necesitan ensayos fiables para evaluar la calidad del ADN y tener en cuenta objetivamente la variación preanalítica. La presente divulgación proporciona una estrategia de PCR digital en nanogotas concisa y precisa para implementar de forma práctica la garantía de la calidad en los estudios clínicos de ADN acelular.
En determinados aspectos, la presente divulgación se refiere a un método de determinación de la integridad de una muestra de ácido nucleico, comprendiendo el método las etapas de: obtener una muestra que comprende ácidos nucleicos; amplificar de la muestra una pluralidad de primeros marcadores para proporcionar una pluralidad de primeros amplicones utilizando al menos un primer oligonucleótido, en donde el primer oligonucleótido comprende un primer colorante; amplificar de la muestra una pluralidad de segundos marcadores para proporcionar una pluralidad de segundos amplicones utilizando al menos un segundo oligonucleótido, en donde el segundo oligonucleótido comprende un segundo colorante en donde, el primer colorante y el segundo colorante son colorantes diferentes; y comparar un nivel de intensidad de colorante de la amplificación de la pluralidad de primeros marcadores con un nivel de intensidad de colorante de la amplificación de la pluralidad de segundos marcadores. En determinados aspectos, los ácidos nucleicos son ADN. En otros aspectos, los ácidos nucleicos son ADN acelular. En una realización, el primer colorante es FAM. En otra realización, el segundo colorante es TET.
En determinados aspectos, la pluralidad de primeros amplicones está entre aproximadamente 1 y 180 pares de bases de longitud. En otros aspectos, la pluralidad de primeros amplicones está entre aproximadamente 50 y aproximadamente 70 pares de bases de longitud. En otros aspectos más, la pluralidad de segundos amplicones está entre aproximadamente 250 y 1.000 pares de bases de longitud. En una realización, la pluralidad de segundos amplicones está entre aproximadamente 400 y 500 pares de bases de longitud.
En algunas realizaciones, la pluralidad de los primeros marcadores consiste en entre 4 y 10 marcadores. En otras realizaciones, la pluralidad de los primeros marcadores consiste en entre 5 y 7 marcadores. En otras realizaciones más, la pluralidad de los segundos marcadores consiste en entre 4 y 10 marcadores. En un aspecto, la pluralidad de los segundos marcadores consiste en entre 4 y 7 marcadores.
En algunos aspectos, el método comprende adicionalmente secuenciar al menos una parte de los ácidos nucleicos en la muestra. En un aspecto, una cantidad de la muestra secuenciada se determina al menos parcialmente basándose en la comparación de los niveles de intensidad del colorante. En algunas realizaciones, la secuenciación comprende secuenciación holoexómica.
En otros aspectos, el método comprende además realizar una amplificación utilizando al menos un primer oligonucleótido sin la muestra como control negativo. En un aspecto, el método comprende además realizar una amplificación utilizando al menos un segundo oligonucleótido sin la muestra como control negativo.
En algunas realizaciones, las etapas de amplificación se producen durante una o más reacciones PCR. En un aspecto, la PCR es PCR digital. En otro aspecto, la PCR digital es PCR digital en nanogotas.
La presente divulgación también se refiere a un método de selección de una pluralidad de primeros marcadores y una pluralidad de segundos marcadores para determinar la integridad de una muestra de ácido nucleico, comprendiendo el método las etapas de: obtener información sobre la expresión a escala genómica de posibles marcadores; seleccionar la pluralidad de primeros marcadores basándose en la información de la expresión, en donde la pluralidad de los primeros marcadores se selecciona basándose en condiciones en las que los primeros marcadores se expresan; y seleccionar la pluralidad de segundos marcadores basándose en la información de la expresión, en donde la pluralidad de los segundos marcadores se selecciona basándose en condiciones en las que los segundos marcadores se expresan, en donde la pluralidad de los primeros marcadores y la pluralidad de los segundos marcadores no se solapan.
En una realización, la información de la expresión se obtiene a partir de al menos una de una o más bases de datos, análisis de secuenciación de ARN, micromatrices y experimentos de PCR con transcriptasa inversa.
En otros aspectos más, la presente divulgación se refiere a un método de determinación de la integridad de una muestra de ácido nucleico, comprendiendo el método las etapas de: obtener una muestra que comprende ácidos nucleicos; amplificar a partir de la muestra una pluralidad de primeros marcadores para proporcionar una pluralidad de primeros amplicones utilizando al menos un primer oligonucleótido, en donde la pluralidad de primeros amplicones está entre aproximadamente 1 y 180 pares de base de longitud; amplificar a partir de la muestra una pluralidad de segundos marcadores para proporcionar una pluralidad de segundos amplicones utilizando al menos un segundo oligonucleótido, en donde la pluralidad de segundos amplicones están entre aproximadamente 250 y 1.000 pares de bases de longitud; y comparar una masa de la pluralidad de los primeros amplicones con una masa de la pluralidad de los segundos amplicones.
En determinados aspectos, el marcador y en la sonda oligonucleotídica es un marcador fluorescente y el marcador se selecciona del grupo de FAM (5- o 6-carboxifluoresceína), VIC, NED, Fluoresceína, FITC, IRD-700/800, CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, HEX, TET, TAMRA, JOE, ROX, BODIPY TMR, Oregon Green, Rhodamine Green, Rhodamine Red, Texas Red, Yakima Yellow, Alexa Fluor PET, Biosearch Blue™, Marina Blue®, Bothell Blue®, Alexa Fluor®, 350 FAM™, SYBR® Green 1, Fluoresceína, EvaGreen™, Alexa Fluor® 488 JOE™, VIC™, HEX™, TET™, CAL Fluor® Gold 540, Yakima Yellow®, ROX™, CAL Fluor® Red 610, Cy3.5™, Texas Red®, Alexa Fluor®.568 Cy5™, Quasar™ 670, LightCycler Red640®, Alexa Fluor 633 Quasar™ 705, LightCycler Red705®, Alexa Fluor® 680, SYTO®9, LC Green®, LC Green® Plus+, EvaGreen™. En la Tabla 1 se proporcionan marcadores fluorescentes (es decir, colorantes) junto con su canal de detección y las longitudes de onda de excitación y detección.
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En la actualidad existen pruebas contundentes de que el nivel de ADNac fetal (y/o ADNac total) presente en el sistema circulatorio (por ejemplo, en plasma) de una gestante es un marcador de una o más formas de preeclampsia, tal como preeclampsia de inicio precoz, preeclampsia leve y/o grave. Los métodos de la divulgación muestran utilidad particular en la detección/cuantificación eficiente, eficaz, sensible y/o de baja variabilidad del ADNac fetal presente en plasma de gestantes, y tiene particular utilidad en el presente documento. Por consiguiente, en realizaciones particulares de la presente divulgación, el sujeto es una gestante y es susceptible a padecer o desarrollar una afección médica relacionada con la gestación; particularmente cuando dicha afección médica asociada con la gestación es preeclampsia. Como se usa en el presente documento, un sujeto "susceptible a" una afección médica puede describirse alternativamente como que "se sospecha que" o que "se considera que está en riesgo de ser susceptible a" padecer o desarrollar una afección médica; y en determinadas realizaciones, los métodos de la presente divulgación se utilizan para explorar y/o diagnosticar la susceptibilidad del individuo a, un riesgo de padecer o desarrollar, o de padecer o desarrollar una afección médica.
En realizaciones alternativas, el individuo es una gestante y es susceptible a (o se considera que está en riesgo de ser susceptible a) padecer o desarrollar una afección médica asociada con la gestación seleccionada del grupo que consiste en: parto prematuro, retraso del crecimiento intrauterino y reabsorción fetal. Los métodos de la presente divulgación también pueden utilizarse en la determinación del género de embarazos gemelares, teniendo en cuenta los valores relativos de ADNac fetal en comparación con recuentos de secuencias del cromosoma Y determinado a partir del ADNac (por ejemplo, utilizando estrategias de secuenciación en paralelo). En estos aspectos, debe observarse que las estrategias que utilizan secuenciación masiva en paralelo de ADNac al azar en sangre materna normalmente siempre cuenta una frecuencia muy baja de secuencias "de cromosoma Y" (tal como entre aproximadamente 0,003 % y 0,004 % de todas las secuencias, o entre aproximadamente 0,0015 % y 0,01 % o 0,002 % y 0,005 % de todas las secuencias) en todas las gestantes debido a la homología de determinadas secuencias cortas de cromosoma Y con otros cromosomas. Por lo tanto, para muestras femeninas puede emplearse un corte de "cromosoma Y" de aproximadamente 0,005 %, o entre aproximadamente 0,003 %, 0,004 %, 0,006 % o 0,007 %.
Como se describe en cualquier parte del presente documento, también hay muchas pruebas de que la presencia y cantidad de determinadas formas de ADNac es indicativa o pronóstico de determinadas afecciones médicas que no están asociadas con la gestación. Por consiguiente, en otra realización particular de la presente divulgación, dichas especies de ADN se originan a partir de un tipo celular asociado a dicha afección médica, particularmente en aquellas realizaciones en las que dichas especies ADN es ADN acelular circulante y dicha muestra es una fracción de sangre tal como plasma o suero. Por ejemplo, la afección médica puede ser un trastorno proliferativo celular, tal como un tumor o un cáncer. En realizaciones particulares, la afección médica es un tumor o un cáncer de un órgano seleccionado de la lista que consiste en: hígado, pulmón, mama, colon, esófago, próstata, ovario, cuello uterino, útero, testículo, cerebro, médula ósea y sangre; y/o dichas especies de ADN pueden originarse a partir de células de un tumor; particularmente cuando dicho tumor es un carcinoma o un cáncer de un órgano de un órgano seleccionado del grupo que consiste en: hígado, pulmón, mama, colon, esófago, próstata, ovario, cuello uterino, útero, testículo, cerebro, médula ósea y sangre.
En otra realización particular más de la presente divulgación, dichas especies de ADN se originan de un tipo celular asociado a una afección médica seleccionada del grupo que consiste en: una infección/enfermedad infecciosa, un trastorno consuntivo, un trastorno degenerativo; un trastorno (auto)inmunitario, nefropatía, hepatopatía, enfermedad inflamatoria, toxicidad aguda, toxicidad crónica, infarto de miocardio y una combinación de cualquiera de lo anterior (tal como septicemia) y/o a un trastorno proliferativo celular, particularmente en aquellas realizaciones en donde dicha especie de ADN es ADN acelular circulante y dicha muestra es una fracción de sangre tal como plasma o suero. Por ejemplo, la afección médica puede ser una infección/enfermedad infecciosa, tal como una causada por un patógeno bacteriano, vírico o protozoo, incluyendo un patógeno seleccionado del grupo que consiste en: un retrovirus (tal como el VIH), un herpes virus (tal como HSV, EBV, CMV, HHV o VSV), virus del dengue, micobacteria (por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis) y hantavirus. En determinadas realizaciones, la afección médica es septicemia y/o excluye la nefropatía.
En algunos aspectos de la presente divulgación, existen realizaciones en donde la muestra biológica es una muestra tisular o una muestra de líquido biológico. En particular, la muestra es sangre entera o una fracción de sangre (por ejemplo, tal como plasma o suero). En realizaciones alternativas, la muestra es un líquido biológico seleccionado del grupo que consiste en: orina, saliva, sudor, semen, lágrimas, esputo, secreción vaginal, lavado vaginal y lavado colónico. En realizaciones más particulares, la muestra es una muestra de plasma o suero del individuo o, en otras realizaciones, es orina del individuo, la muestra carece mayoritariamente (o esencialmente) de células, y/o no es una muestra de sangre entera y/o semen.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben considerarse como limitantes.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Materiales y Métodos
ADN genómico de control
Se obtuvieron muestras de ADN genómico humano intacto a partir de un vendedor comercial (Sigma Aldrich). El ADN de control de un individuo se diluyó para proporcionar 4 partes alícuotas de 50 μl cada una a una concentración de ADN de 0,5 ng/μl. La concentración de ADN se midió utilizando el ensayo fluorométrico QUBIT® dsDNA BR (Life Technologies). Cada alícuota se sometió a cizalla utilizando ultrasonido con el ultrasonido E220™ Focused (Covaris) siguiendo las instrucciones del fabricante para obtener fragmentos de un tamaño específico de 150 pb, 300 pb, 500 pb y 1000 pb. La distribución del tamaño de los fragmentos de ADN se evaluó utilizando el ensayo BioAnalyzer High Sensitivity (Agilent Technologies, Inc.).
ADN plasmático de control
Se obtuvieron muestras de plasma de control de donantes sanos de un vendedor comercial (BioreclamationlVT). El ADN plasmático acelular se extrajo de alícuotas de plasma de 1 ml de 5 muestras independientemente adquiridas utilizando el kit de ácido nucleico circulante QIAAMP® (Qiagen). El protocolo recomendado se modificó para eluir en un volumen de 100 μl y el eluyente se pasó a través de la columna dos veces. El ADN plasmático se extrajo con ARN transportador, excepto cuando específicamente se indique lo contrario. Las concentraciones de ADN total se midieron utilizando el ensayo fluorométrico QUBIT® dsDNA BR (Life Technologies). La distribución del tamaño de los fragmentos de ADN se evaluó utilizando el ensayo de alta sensibilidad BioAnalyzer (Agilent).
Diseño del ensayo
Se diseñó un ensayo múltiple dirigido a 9 locus genómicos de copias sencillas que se esperaba que fuesen estables y con menos probabilidades de verse afectados por acontecimientos de números de copias en pacientes con cáncer. Se diseñaron cinco amplicones de PRC cortos con un tamaño medio del producto de ~71 pb (intervalo de 67-75 pb) y todas las sondas correspondientes se marcaron con amidita de fluoresceína (FAM). Se diseñaron cuatro amplicones de PCR largos con un tamaño medio de ~471 pb (intervalo de 439-522 pb) y todas las sondas correspondientes se marcaron con 5-tetracloro-fluoresceína (TET). Los cebadores y las sondas se diseñaron utilizando la herramienta PRIMERQUEST® (IDT). Los cebadores/sondas se evaluaron manualmente para garantizar que no se solapaban con sitios polimórficos conocidos. Se utilizó PCR informática para confirmar que cada cebador producía un solo producto y ningún producto cruzado cuando utilizaba en multiplexación. En la Figura 1 se indican las secuencias de cebador y sonda.
PCR digital en nanogotas
En la Figura 2 se muestra una presentación esquemática de las etapas implicadas en una aplicación de PCR digital en nanogotas para detectar genes de tipo mutante y de tipo silvestre en ADN genómico. De manera similar, puede utilizarse un ensayo de ddPCR multiplexada para detectar ADN de alto peso molecular (HMW) y ADNac de bajo peso molecular (LMW) en una muestra biológica que contiene tanto ADNac como ADN derivado de células (por ejemplo, ADN de células de sangre periférica).
Todas las reacciones de PCR digital en nanogotas se prepararon a un volumen de 25 μl utilizando 12,50 μl de 2x Kapa Probe Fast Master Mix (Kapa Biosystems, USA), 1 μl de dNTP Mix 5 mM (Kapa), 1 μl de estabilizador en gotas (RainDance Technologies, Lexington, MA), 1,25 μl de cada cebador (IDT) 20 uM y 0,38 μl de 20 μM de cada sonda (IDT DNA, USA) y 2 μl de ADN de entrada y agua de calidad de biología molecular. Las nanogotas se generaron siguiendo las instrucciones del fabricante utilizando un sistema de fuente PCR digital RAINDROP™ (RainDance). El ciclado de temperaturas se realizó utilizando DNA ENGINE TETRAD® 2 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) con los siguientes parámetros: 1 ciclo de 3 min a 95 °C, 50 ciclos de 15 seg a 95 °C y 1 min a 60 °C con una rampa de 0,5 °C/seg de 95 °C a 60 °C, 1 ciclo de 98 °C durante 10 min y un mantenimiento a 4 °C siempre. La fluorescencia de las nanogotas se midió utilizando el sistema RAINDROP™ Digital PCR Sense (RainDance).
Cuantificación de ADN plasmático
El análisis de fluorescencia se realizó utilizando el programa informático del fabricante que acompaña RAINDROP™. La identificación de nanogotas positivas requiere establecer umbrales de fluorescencia (selecciones) para cada ensayo de ddPCR. Se compararon resultados en todo el ADN genómico intacto y sin controles de molde para evaluar los umbrales de este ensayo. Estos umbrales se utilizaron para todas las muestras futuras.
Basándose en el diseño del ensayo, que se representa en la Figura 3, se esperaban dos poblaciones de nanogotas en ddPCR, cada una de ellas representando la suma de productos de los dos conjuntos de amplicones. Por lo tanto, el número de nanogotas positivas a FAM (con el amplicón de PCR corto) representa 5 veces el número de copias haploides amplificables del genoma (CA) con tamaños de fragmento > 71 pb (el tamaño de amplicón PCR promedio en el conjunto corto). Esto se utilizó para calcular la concentración de ADN plasmático amplificable total. De manera similar, el número de nanogotas positivas a TET (con los productos de PCR largos) representa 4 veces las CA con tamaños de fragmento > 471 pb (el tamaño de amplicón de PCR promedio en el conjunto largo). Esto se utilizó para calcular la concentración de ADN plasmático de HMW. La diferencia entre los dos conjuntos se tomó como la concentración de ADNac de bajo peso molecular. Un ejemplo de este cálculo se muestra en la Figura 4. La cuantificación de la fluorescencia a partir de amplicones cortes y largos generados por el ensayo desvelado se representa en la Figura 5.
Simulación de la fragmentación de ADN y rendimiento del ensayo esperado
Las simulaciones de la fragmentación de ADN se realizaron utilizando R (código disponible previa petición). Se supuso una molécula de ADN que abarcaba 2500 pb en cada lado del tamaño de amplicón promedio para cada conjunto. La longitud de esta molécula era de 5071 pb para el conjunto de amplicón corto y de 5471 pb para el conjunto de amplicón largo. Esta molécula se fragmentó matemáticamente muestreando a partir de una distribución exponencial con un índice que representaba el tamaño de fragmento diana (150, 300, 500 o 1000 pb). Se determinó que molécula será "omitida" por un amplicón si una rotura de ADN se encuentra dentro de la región del amplicón (delimitada por los extremos 5' de cualquiera de los cebadores). Se muestrearon 50.000 moléculas para determinar la frecuencia global de las moléculas omitidas para cada combinación de tamaño de amplicón y tamaño de fragmento. La distribución exponencial se ha utilizar para modelar el cizallamiento del ADN por ultrasonido previamente.
Secuenciación de exoma
Se prepararon bibliotecas de secuenciación hologenómica de ADN plasmático y genómico utilizando el kit THRUPLEX® DNA-Seq (Rubicon Genomics), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNac de entrada o ADN cortado se cuantificó utilizando el ensayo ddPCR descrito en el presente documento y diluido a un volumen de 10 μl. Se asignaron códigos de barras específicos de muestra a cada biblioteca. Cada biblioteca se cuantificó utilizando los kits de cuantificación de biblioteca de PCRc (PCR cuantitativa) (Kapa). Se agruparon hasta 8 bibliotecas en 4 grupos a concentraciones equimolares en preparación para el enriquecimiento de exomas. El enriquecimiento de exomas se realizó utilizando el kit NimbleGen SeqCap EZ Human Exome v3, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se modificó el protocolo para utilizar oligos bloqueantes universales XGEN® - TS HT-i5 y TS HT-H (Integrated DNA Technologies).
Todas las bibliotecas de exomas enriquecidas se cuantificaron utilizando PCRc y se agruparon a concentraciones equimolares para la secuenciación. La secuenciación se realizó en el MiSeq® utilizando el kit de 150 ciclos TruSeq® v3 (Illumina) para generar lecturas emparejadas de 75 pb y lecturas de código de barras de 6 pb.
Análisis de datos de secuenciación
Los datos sin procesar del secuenciador se desmultiplexaron y convirtieron en archivos fastq utilizando las herramientas Picard. La desmultiplexación en códigos de barras específicos de la muestra se realizó permitiendo cero discordancias y requiriendo una puntuación Phred de calidad de base mínima de 30. Las lecturas de secuenciación se alinearon con el genoma humano hg19 utilizando Bwa v1.1. Los archivos alineados se clasificaron e indexaron utilizando Samtools v1.0. Se calcularon lecturas de secuenciación por duplicado identificadas, se calculó la complejidad de la biblioteca y se calcularon métricas de calidad (tal como lecturas específicas) utilizando Picard.
Ejemplo 2. Evaluación del fondo de ensayo
Se evaluó el ensayo ddPCR utilizando 3 controles sin molde, 2 muestras de ADN de maíz y 2 muestras de ADN canino para evaluar el ruido de fondo. El número máximo de nanogotas positivas observadas en los controles sin molde (límite de blanco) fue de 28 y 20 para amplicones cortos y largos, respectivamente, equivalentes a 6 y 5 CA. El número de nanogotas positivas en el ADN de maíz y canino era mayor que en los controles sin molde probablemente debido a la amplificación cruzada entre especies de regiones genómicas conservadas.
Ejemplo 3. Evaluación de la integridad y cuantificación de ADN genómico cortado
Los resultados de la evaluación de ddPCR de ADN genómico intacto y ADN genómico fragmentado se muestran en la Figura 6 y la Figura 7. La Figura 6 presenta un conjunto de datos con las mediciones de intensidad de fluorescencia sin procesar de los amplicones generados con ADN fragmentado. La Figura 7 muestra los equivalentes del genoma por microlitro de muestra de ADN genómico intacto y ADN genómico fragmentado que tiene tamaños de fragmento diana de 1000 pb, 500 pb, 300 pb y 150 pb calculado a partir de las mediciones de intensidad de fluorescencia.
La evaluación de ddPCR de ADN genómico intacto a una concentración cuantificada por QUBIT® de 0,5 ng/μl produjo 175 copias amplificables cortas y 183 largas. El número de CA cortas permaneció generalmente no afectado en todas las muestras de ADN cortado, excepto una disminución significativa con fragmentos de 150 pb. En cambio, el número de CA largos se redujo con cada disminución en un tamaño de fragmento promedio (véase la Figura 7). La tendencia en las CA largas fue similar a la observada en los datos simulados basándose en distribuciones exponenciales con tasas correspondientes a tamaños de fragmento promedio. Sorprendentemente, los datos simulados subestimaron el número de CA cortas para todos los tamaños de fragmento, lo que demuestra que el ensayo de ddPCR dirigido a amplicones cortos fue más eficaz de lo estimado en la producción de CA. En la Figura 8 se muestran las curvas reales y simuladas.
Ejemplo 4. Evaluación de producción de biblioteca de ADN cortado frente a intacto
Se generaron bibliotecas de secuenciación hologenómicas utilizando ADN intacto o ADN cortado que comprendían fragmentos de ADN del 25 %, 50 % o 75 % de aproximadamente 300 pb. Las cantidades de ADN de entrada utilizadas para generar las bibliotecas fueron 2,5 ng o 5 ng. La producción de bibliotecas resultante de las diversas entradas se determinó mediante PCRc.
Como se observa en la Figura 9, el ADN intacto no produjo ninguna cantidad detectable de secuencias de biblioteca. En cambio, el ADN cortado produjo mayores rendimientos de secuencias de biblioteca, ya que el porcentaje relativo de fragmentos de ADN de aproximadamente 300 pb aumentó. La mayor producción de biblioteca resultó de 5 ng de ADN que contenía fragmentos del 75 % de aproximadamente 300 pb.
Estos resultados indican que el ADN intacto presente en las muestras biológicas con ADNca generalmente no contribuye al rendimiento de la biblioteca de secuenciación. Además, dado que la cantidad de ADNac de bajo peso molecular aumenta en una muestra biológica, el rendimiento resultante de la biblioteca producida a partir de este ADNac probablemente aumente.
Ejemplo 5. Preparación de ADNac a partir de muestras biológicas con diferentes cantidades de ADN de HMW y de LMW
La preparación de ADNac para la secuenciación hologenómica presupone un ADN prefragmentado y no se realiza ningún otro corte del ADN. Sin embargo, los resultados varían de una preparación de ADNac a otra. Para investigar las causas de esta variación, se preparó ADNac a partir de dos muestras biológicas y se cuantificó el ADN de HMW (es decir, amplicones grandes) y el ADNac de LMW (es decir, amplicones pequeños) utilizando el método de ddPCR descrito en el Ejemplo 1.
La Muestra 1 generó un mayor número de CA en comparación con la Muestra 2 utilizando cantidades similares y material de partida (compárese la mayor fluorescencia observada con ddPCR de ADN de la Muestra 1 con la observada con ddPCR de ADN de la Muestra 2 en la Figura 10A). Cuando se compararon las cantidades relativas de amplicones grandes y de amplicones pequeños producidas a partir de cada muestra, se observó que la Muestra 1 tenía una mayor proporción de amplicones pequeños en comparación con amplicones grandes en relación con la Muestra 2 (véase la Figura 10B). Estos resultados sugieren que la evaluación de ADN HMW y LMW en muestras biológicas utilizando los métodos desvelados en el presente documento proporcionan un indicador preciso de la calidad y cantidad de ADNac presente en las muestras.
Ejemplo 6. Diversidad de bibliotecas de exoma de plasma optimizado mediante ddPCR
La evaluación de ADNac mediante ddPCR en muestras de plasma de control se utilizó para guiar una preparación de biblioteca. Las bibliotecas de secuenciación se evaluaron con respecto a su diversidad (es decir, "diversidad de biblioteca calculada") y tasa de duplicación (es decir, "número de equivalentes genómicos"). La diversidad y el tamaño de la biblioteca se relacionaron con el ADN de entrada que se cuantificó utilizando el ensayo de ddPCR (véase la Figura 11). A medida que aumentaba la cantidad de ADNac optimizado por ddPCR utilizada para la preparación de la biblioteca, también lo hacía la diversidad y la tasa de duplicación de la biblioteca.
Ejemplo 7. Evaluación de los efectos del procesamiento anterior de muestras biológicas en copias amplificables de ADNac
Antes del análisis de ADNac con secuenciación hologenómica se requieren varios procesos previos para recoger y procesar muestras biológicas. Estos procesos anteriores incluyen, entre otras cosas, la recogida de muestras biológicas (por ejemplo, sangre, orina, saliva) y la extracción de ADN de las muestras biológicas. Los procesos anteriores pueden afectar al análisis posterior y a la secuenciación del ADNac.
El ensayo de ddPCR descrito en el Ejemplo 1 se utilizó para evaluar el efecto de diversos protocolos de recogida de sangre. Los protocolos emplearon tubos de recogida de sangre que contenían EDTA como anticoagulante o tubos de recogida de sangre de ADNac Streck (Streck Laboratories, Omaha, NE) que contenía un conservante patentado (Streck Laboratories). En la Figura 12 se muestra el efecto de los diversos protocolos de recogida de sangre en número de copias amplificables de ADNac por mililitros de plasma.
El ADN se extrajo de muestras biológicas de diversas maneras, y este proceso anterior también afectó al análisis posterior y a la secuenciación del ADNac. Se evaluaron diversos kits de extracción de ADN utilizando columnas giratorias o centrífugas o perlas magnéticas con respecto a su efecto sobre el ADNac en muestras de plasma. El ADN de cada muestra se extrajo siguiendo las instrucciones del fabricante en cada kit. Las copias amplificables de ADNac por mililitro de plasma en cada muestra biológica se determinaron mediante el ensayo de ddPCR descrito en el Ejemplo 1. Los resultados del análisis presentado en la Figura 13A y 13B muestran que el kit de extracción utilizado puede impactar significativamente sobre la cantidad de copias amplificables de ADNac obtenidas de muestras de plasma.
El ensayo de ddPCR descrito en el presente documento también puede utilizarse para analizar la calidad de muestras biológicas de diferentes cohortes de estudio. Se realizó dicho análisis, dando como resultado los datos mostrados en la Figura 14. Esta evaluación de calidad en cohortes de estudio puede ser útil a la hora de interpretar los resultados de los datos y explicar las diferencias observadas en las cohortes. Por ejemplo, si una cohorte tiene un nivel relativamente alto de copias amplificables de ADNac en sus muestras biológicas, la secuenciación halogenómica posterior y análisis puede identificar indicadores genéticos de enfermedad que no son detectables en otras cohortes debido a la mala calidad o a los niveles relativamente bajos de copias amplificables de ADNac en sus muestras biológicas.
Los datos experimentales indicados anteriormente demuestran que el ensayo de ddPCR multiplexada permite la evaluación exacta y precisa de copias amplificables y la integridad de ADNac de pequeñas cantidades de entrada (por ejemplo, picogramos de ADN). La evaluación inicial de la calidad con el ensayo de ddPCR multiplexada puede optimizar el análisis y la secuenciación posteriores. Además, el ensayo de ddPCR multiplexada proporciona métricas fiables para la optimización de factores preanalíticos, tales como procesamiento y extracción de plasma.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos contenidos en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la materia a la que pertenece esta invención. Aunque todos los métodos y materiales, similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, pueden utilizarse en la práctica o ensayo de la presente invención, en el presente documento se describen los materiales y métodos preferidos.
Las publicaciones mencionadas en el presente documento se facilitan únicamente para su divulgación antes de fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de lo aquí expuesto debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tenga derecho a una publicación anterior en virtud de una invención anterior.
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método de generación de una biblioteca de secuenciación con ADN acelular (ADNac) de menos de 300 pb, comprendiendo el método las etapas de:
a) proporcionar una muestra biológica que se haya obtenido de un sujeto, en donde la muestra comprende ADNac;
b) poner en contacto la muestra biológica con al menos un primer conjunto de cebador/sonda y al menos un segundo conjunto de cebador/sonda, cada uno de los cuales comprende al menos una sonda oligonucleotídica que se marca detectablemente y al menos dos cebadores oligonucleotídicos y los marcadores son diferentes para cada conjunto de cebador/sonda, en condiciones tales que el primer conjunto de cebador/sonda es capaz de iniciar la síntesis de un primer amplicón de menos de 300 pb de longitud y el segundo conjunto de cebador/sonda es capaz de iniciar la síntesis de un segundo amplicón de 300 pb o más de longitud;
c) amplificar, si hubiera, la primera secuencia diana y la segunda secuencia diana utilizando PCR digital en nanogotas (ddPCR);
d) monitorizar la detección del marcador de la sonda oligonucleotídica del primer conjunto de cebador/sonda como indicación de hibridación con la primera secuencia diana y la detección del marcador de la sonda oligonucleotídica del segundo conjunto de cebador/sonda como indicación de hibridación con la segunda secuencia diana;
e) determinar la cantidad de ADNac en la muestra biológica, en donde la cantidad de copias amplificables de ADNac se indica comparando el número del marcador detectado de la sonda oligonucleotídica del primer conjunto de cebador/sonda con el número del marcador detectado de la sonda oligonucleotídica del segundo conjunto de cebador/sonda,
en donde el número del marcador detectable de la sonda oligonucleotídica se determina con ddPCR contando moléculas de ácido nucleico encapsuladas en divisiones de nanogotas de agua y aceite distintas, volumétricamente definidas, que dan soporte a la amplificación por PCR, y
en donde un mayor número del marcador detectado de la sonda oligonucleotídica a partir del primer conjunto de cebador/sonda en comparación con el número de marcador detectado de la sonda oligonucleotídica a partir del segundo conjunto de cebador/sonda indica un aumento de la cantidad de ADNac en la muestra biológica; y
f) generar una biblioteca de secuenciación con el ADNac basándose en la cantidad de ADNac en la muestra.
2. El método de la reivindicación 1, en donde los cebadores oligonucleotídicos tienen una longitud de secuencia de nucleótidos de aproximadamente 10 a aproximadamente 150.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde las sondas oligonucleotídicas tienen una longitud de secuencia de nucleótidos de aproximadamente 10 a aproximadamente 50.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la primera secuencia diana y la segunda secuencia diana son de al menos un gen constitutivo, en donde el al menos un gen constitutivo se selecciona del grupo que consiste en ACTB (Beta-actina), GAPDH (Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa), RPLPO (proteína P0 ribosomal ácida 60 S), GUSB (beta-glucuronidasa) y TFRC (receptor 1 de transferencia).
5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primer conjunto de cebador/sonda comprende al menos una sonda oligonucleotídica y al menos dos cebadores oligonucleotídicos, comprendiendo cada uno de ellos una secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 13-27.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el segundo conjunto de cebador/sonda comprende al menos una sonda oligonucleotídica y al menos dos cebadores oligonucleotídicos, cada uno de ellos comprendiendo una secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-12.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primer conjunto de cebador/sonda comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco sondas oligonucleotídicas que se marcan de manera detectable y al menos cuatro, al menos seis, al menos ocho o al menos 10 cebadores oligonucleotídicos, cada uno de los cuales se hibrida con una secuencia diana de menos de 300 pb, y en donde la detección de los marcadores de las sondas oligonucleotídicas del primer conjunto de cebador/sonda se promedia para determinar la detección de los marcadores.
8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el segundo conjunto de cebador/sonda comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco sondas oligonucleotídicas que se marcan de manera detectable y al menos cuatro, al menos seis, al menos ocho o al menos 10 cebadores oligonucleotídicos, cada uno de los cuales hibrida con una secuencia diana de 300 pb o más de longitud, y en donde la detección de los marcadores de las sondas oligonucleotídicas del segundo conjunto de cebador/sonda se promedia para determinar la detección de los marcadores.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la ddPCR es ddPCR multiplexada, y opcionalmente en donde las copias amplificables (CA) de ADNac en la muestra biológica se calculan de la siguiente manera:
(i) dividiendo el número de nanogotas positivas que indican hibridación con la primera secuencia diana entre el número de sondas oligonucleotídicas en el primer conjunto de cebador/sonda;
(ii) dividiendo el número de nanogotas positivas que indica hibridación con la segunda secuencia diana entre el número de sondas oligonucleotídicas en el segundo conjunto de cebador/sonda; y
(iii) restando (ii) de (i) para calcular las CA de ADNac en la muestra biológica.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las sondas oligonucleotídicas se marcan de manera detectable con un marcador fluorescente seleccionado del grupo que consiste en FAM (5- o 6-carboxifluoresceína), VIC, NED, Fluoresceína, FITC, IRD-700/800, CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, HEX, TET (5-tetracloro-fluoresceína), TAMRA, JOE, ROX, BODIPY TMR, Oregon Green, Rhodamine Green, Rhodamine Red, Texas Red, Yakima Yellow, Alexa Fluor PET, Biosearch Blue™, Marina Blue®, Bothell Blue®, Alexa Fluor®, 350 FAM™, SYBR® Green 1, Fluoresceína, EvaGreen™, Alexa Fluor® 488 JOE™, 25 VIC™, HEX™, TET™, CAL Fluor®Gold 540, Yakima Yellow®, ROX™, CAL Fluor® Red 610 Cy3.5™, Texas Red®, Alexa Fluor® 568 Cry5™, Quasar™ 670, LightCycler Red640®, Alexa Fluor 633 Quasar™ 705, LightCycler Red705®, Alexa Fluor® 680, SYT0®9, LC Green®, LC Green® Plus+ y EvaGreen™, y opcionalmente en donde los marcadores fluorescentes son FAM™ (5-o 6- carboxifluoresceína) y TET™ (5-tetracloro-fluoresceína).
11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primer conjunto de cebador/sonda detecta al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco secuencias diana de aproximadamente 50 pb a aproximadamente 100 pb de longitud.
12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el segundo conjunto de cebador/sonda detecta al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco secuencias diana de aproximadamente 300 pb a aproximadamente 1000 pb de longitud.
13. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la biblioteca de secuenciación es una biblioteca de exoma.
14. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde la muestra biológica se divide en partes alícuotas y cada parte alícuota se somete a un proceso anterior diferente para evaluar cómo el procesamiento anterior afecta a la integridad del ADNac en la muestra biológica y en donde la muestra biológica es un líquido corporal seleccionado del grupo que consiste en sangre, plasma, suero, saliva, orina, lágrimas y líquido cefalorraquídeo.
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