TW201323615A - 核酸變異的偵測方法、電腦系統及電腦程式產品 - Google Patents
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Abstract
一種核酸變異的偵測方法、電腦系統及電腦程式產品是關於基於至少二鑑別性標示探針的校正後信號強度的比率針測至少一核酸變異。鑑別性標示探針具有偵測核酸變異的能力。一種核酸變異的偵測方法、電腦系統及電腦程式產品亦關於實行此方法的設備。
Description
本發明是關於偵測核酸變異,例如基因體鑑定(genotyping),特別是關於一種樣本中的基因座的核酸變異的偵測方法。尤其是,可偵測等位基因變異(allelic variation)或單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism;SNP)。
在一族群中,個體的基因型(genotype)和基因組成(genetic makeup)變化。基因體鑑定一般是關於辨識個體生物的基因組成。基因體鑑定可偵測一個體中的核酸變異,例如:等位基因變異或單核苷酸多態性。近年來的發展已致使健全基因體鑑定平台。基因體鑑定平台的例子包括侵染分析(invader assay)(如Olivier等學者2005年發表之文章)、陣列基方法(array-based method)(如Perkel學者2008年發表之文章)及陣列引子延伸(arrayed primer extension;APEX)(如Kurg等學者2000年發表之文章)。以此些健全基因體鑑定平台產生的大量資料需要被分析,典型地是利用電腦化的方法。利用多變的演算法的資料分析方法的例子已描述在美國公開號第2009/0062138號申請案、Ritchie等學者2009年發表之文章及Takitoh等學者2005年發表之文章。發展具有高準確性基因體鑑定的方法是令人期望的。
本發明是關於偵測核酸變異。根據第一方面,本發明提供一種樣本中的基因座的核酸變異的偵測方法,其包括下列步驟。
(i)將至少二鑑別性標示探針與一樣本接觸。其中,此些鑑別性標示探針包括一第一標示探針和一第二標示探針。第一標示探針用以偵測一第一核酸變異A,並且第二標示探針用以偵測一第二核酸變異B。
(ii)在一底座上偵測第一標示探針的第一信號強度X及第二標示探針的第二信號強度Y。其中,第一信號強度X關聯於第一核酸變異A的存在,而第二信號強度Y關聯於第二核酸變異B的存在。
(iii)執行第一信號強度和第二信號強度的背景校正,以得到背景校正後的第一信號強度XA和背景校正後的第二信號強度YB。
(iv)表達XA:YB為一比率(Sr)。其中,若XA:YB≧C:1、XA>0且YB>0,或者若XA>0且YB≧0,核酸變異為A:A。若XA:YB≦1:C、XA>0且YB>0,或者若YB>0且XA≧0,核酸變異為B:B。若XA:YB位在C:1和1:C之間,核酸變異為A:B。若XA≦0和YB≦0,A和B均不存在或是核酸變異未能測定。於此,C為一實數。
舉例來說,方法可用以偵測不同等位基因。尤其是,方法可用以偵測單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism;SNP)。
陣列是涉及包括載片、晶片、膜、珠或微量滴定板(microtiter plate)的一底座,且此底座具有鍵結或固定在確定位置上的多個成分。此些成分可包括分子,例如:核酸分子。尤其是,微陣列涉及一高密度陣列。舉例來說,微陣列可具有每平方公分120個
以上的成分的密度。
當兩單核苷酸多態性是定位在彼此旁邊、以其他核苷酸間隔、在相同核酸分子的不同股上、或在不同核酸分子上時,雙聚核苷酸多態性(double polynucleotide polymorphism;DNP)涉及兩單聚核苷酸多態性且包括情況(circumstance)。
鑑別性標示探針亦包括一探針被標示且其它探針無的情況。
引子是涉及由DNA聚合酶將脫氧核糖核苷酸(deoxyribonucleotide)加入其中的寡核苷酸。單引子能用以放大DNA或RNA部位,例如:序列(sequencing)。
引子對通常包括互補於DNA或RNA分子的一股的一第一引子及互補於DNA或RNA分子的第二股的一第二引子,並以兩引子位在目標DNA或RNA部位的兩側,以由DNA聚合酶放大。
探針是涉及用以設置和/或辨識目標DNA或RNA序列的任一分子。探針通常能以標準方法標示,例如:放射性地或以螢光標識。舉例來說,包括單核苷酸多態性的探針能用以偵測DNA或RNA序列的差異。鑑別性標示探針亦包括至少二鑑別性標示核苷酸,其中一核苷酸是以聚合酶併入至延伸的聚核苷酸,藉以取決於單核苷酸多態性存在。
核酸變異包括等位基因、雙聚核苷酸多態性、雙聚核苷酸多態性、刪除、插入、替換、核酸放大、核酸序列、基因和/或其對應之轉錄和/或轉譯產物的重新排列、和/或轉錄和/或轉譯產物的選擇性剪接,但不限於此。
單核苷酸多態性是涉及在生物的基因材料中的單核苷酸發生
時的DNA和/或RNA序列變異,並且在多個種的膜之間(或在生物中成對染色體之間)不同的基因材料。單核苷酸多態性包括單核苷酸的插入、刪除、或替換。
本發明是涉及用以偵測核酸變異的偵測方法。此偵測方法的步驟如下所述。
(i)將至少二鑑別性標示探針與一樣本接觸。其中,此些鑑別性標示探針包括一第一標示探針和一第二標示探針。第一標示探針用以偵測一第一核酸變異A,並且第二標示探針用以偵測一第二核酸變異B。
(ii)在一底座上偵測第一標示探針的第一信號強度X及第二標示探針的第二信號強度Y。其中,第一信號強度X關聯於第一核酸變異A的存在,而第二信號強度Y關聯於第二核酸變異B的存在。
(iii)執行第一信號強度和第二信號強度的背景校正,以得到背景校正後的第一信號強度XA和背景校正後的第二信號強度YB。
(iv)表達XA:YB為一比率(Sr)。其中,若XA:YB≧C:1、XA>0且YB>0,或者若XA>0且YB≧0,核酸變異為A:A。若XA:YB≦1:C、XA>0且YB>0,或者若YB>0且XA≧0,核酸變異為B:B。若XA:YB位在C:1和1:C之間,核酸變異為A:B。若XA≦0和YB≦0,A和B均不存在或是核酸變異未能測定。於此,C為一實數。
尤其是,樣本包括一分離樣本。
如同本領域所熟知之任意標示手段能使用在本發明的實踐
上。核酸變異的刪除是以至少二鑑別性標示探針的背景校正後的信號強度的比率為基礎。背景校正能偵測第一核酸變異A的第一探針的信號強度X,以得到XA。背景校正能偵測第二核酸變異B的第二探針的信號強度Y,以得到YB。
能由適當的方法執行背景校正。舉例來說,背景校正是將信號強度X和信號強度Y減去背景強度(BI),以分別得到XA和YB。能以量測在缺少任何探針(負控制)上的信號強度測定背景強度。
若XA和YB皆大於0,則基於校正後信號比率(Sr)(即,XA:YB)測定核酸變異存在。若XA:YB≧C:1,核酸變異則測定為A:A。相反地,若XA:YB≦1:C,核酸變異則測定為B:B。若XA:YB位在C:1和1:C之間,核酸變異則測定為A:B。尤其是,C(cut-off;截止)為一實數。舉例來說,C可為大於或等於2的任意值。尤其是,C可為2或3。更特別地是,C等於3。
舉個例子,考慮C為3的情況。若XA:YB≧3:1,核酸變異則測定為A:A。若XA:YB≦1:3,核酸變異則測定為B:B。
若XA:YB位在3:1和1:3之間,核酸變異則測定為A:B。
分別以背景為標準的核酸變異A和核酸變異B的修正信號強度應比0大。若XA或YB小於或等於0,信號取得為可以忽略的或不存在的。相應地,若XA:YB≧3:1且得到的XA和YB皆大於0,或若XA大於0且YB大於或等於0,核酸變異則測定為A:A。若XA:YB≦1:3且得到的XA和YB皆大於0,或若XA大於或等於0且YB大於0,核酸變異則測定為B:B。若XA和YB皆
小於或等於0,將視為核酸變異A和核酸變異B均不存在或是信號錯誤(即,核酸變異未能測定)。
信號強度X、Y是在一底座上偵測。此底座可包括一陣列,更特別地是一微陣列。
步驟(i)可更包括一放大步驟。尤其是,此放大是以聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction;PCR)進行。尤其是,此聚合酶鏈反應是以第一標示探針、第二標示探針和一基因座特異寡核苷酸為引子以得到多個聚合酶鏈反應產物。然後,此聚合酶鏈反應產物是雜交至固定在該底座上的基因座特異核酸。舉例來說,Illumina GoldenGate技術包括一放大步驟(如下述範例)。
典型地,雙通道偵測(two-channel detection)可用以偵測信號強度X、Y。然而,若只有一探針被標示,可使用一通道偵測。再者,根據本發明任一方面的方法可適用在偵測多於二個核酸變異。舉例來說,若有三個核酸變異A、B、C,可以A與B、B與C、以及B與C執行此分析。若有三個核酸變異A、B、C、D,可以A與B、A與C、A與D、B與C、B與D、以及C與D執行此分析。本方法可相應適用於偵測任意數量的核酸變異。
本方法可適用在本領所熟知之任意適合的用以偵測核酸變異和/或基因體鑑定之矩陣平台,其包括Illumina GoldenGate、Illumina Infinium、Affymetrix平台或侵染分析,但不限於此。舉例來說,本發明亦可用於Illumina Infinium平台(如Steemers等學者2006年發表之文章),於此於放大期間併入對應單核苷酸多態性的鑑別性標示探針。
本發明亦包括用以執行本發明的裝置。此裝置包括底座系統和/或相關電腦系統。此底座系統包括陣列系統。
電腦系統可用以處理和/或分析來自陣列的信號強度。根據進一步的方面,本發明是關於電腦系統,而此電腦系統執行上述方法的步驟(iii)和步驟(iv)。雖然在實踐上電腦系統更可能通常是工作站或大型電腦,但電腦系統原則上亦可為任意一般電腦,例如:個人電腦。
本發明亦關於電腦系統可執行的軟體。此軟體由電腦系統執行,以致使電腦系統執行上述方法的步驟(iii)和步驟(iv)。本發明亦包括一電腦程式產品,且此電腦程式產品包括此軟體。尤其是,電腦程式產品是有實體的。舉例來說,電腦程式產品包括有實體的記錄媒體、有實體的儲存媒體和/或有實體的電腦可讀取媒體。上述媒體的例子包括電腦硬碟、碟片(compact disc;CD)、快閃記憶體(例如:記憶卡、USB隨身碟、固態硬碟等)、和軟碟(floppy disk)。本領域所熟知的其他合適的媒體亦可使用。
於是,根據本發明的方法包括電腦實施方法。再者,此方法具有自動化的能力。
本發明現已一般描述如上,通過參考下述以實例所提出的範例亦可更容易地理解,但並不意圖限制本發明。
本領域所熟知及未具體描述的標準分子生物技術一般是遵循如Sambrook和Russel(2001)所述之。
根據製造商的指示利用Illumina GoldenGate分析執行單核苷
酸多態性分析。在根本上,基因體鑑定平台使用用以偵測單核苷酸多態性(第1圖)的基因座特異寡核苷酸(或探針)以及鑑別性標示等位基因特異探針。等位基因特異探針是以不同螢光染料標示。各個基因座特異寡核苷酸包括特異IllumiCode區域,而此特異IllumiCode區域是基因座所特有的。依靠單核苷酸多態性變異存在,對應的等位基因特異探針將明顯的鍵結至樣本的DNA模版(template)並經由聚合酶鏈反應而延伸至基因座特異寡核苷酸。在延伸之後,由等位基因特異探針和基因座特異寡核苷酸未側接的聚合酶鏈反應產品是經由IllumiCode區域雜交至一組珠子。各特異IllumiCode區域將表現特異基因座,並且追蹤和使用在陣列上具有對應互補IllumiCode區域的珠子的位置,以助於相關於基因座的預期單核苷酸多態性的辨識。為了各鑑別性標示探針的存在/不在,掃描與局部化至在陣列上的特異位置的珠子鍵結之聚合酶鏈反應產品。鑑別性標示探針將指示單核苷酸多態性存在,即同型結合性(homozygous)或異型結合性(heterozygous)(第2圖)。
在陣列基單核苷酸多態性基因體鑑定平台上,各單核苷酸多態性基因座一般是由兩染料表現。各染料表現單核苷酸多態性等位中之一,且此兩染料在組合上表現此些等位基因(異型結合性)的存在。以儀器挑選各染料的信號強度,並且利用由製造商提供的軟體分析各染料的信號強度。對於各單核苷酸多態性基因座,具有相關資訊,例如:表現各等位基因的染料、單核苷酸多態性等位基因和單核苷酸多態性的一致性。
舉例來說,由Illumina公司提供的軟體(Genome studio)是具有在圖解型式上處理和顯示信號強度及相關資訊(第3及4圖)的能力。Genome studio亦包括一所有聚集演算法(proprietary clustering algorithm),且此所有聚集演算法分析信號強度以測定(或判定(call))單核苷酸多態性基因型(genotype)。然而,發現Genome studio提供之演算法是不符合要求的,且當信號是可用的且可判定的時,其常判定為錯誤對比於單核苷酸多態性基因型的毛細管序列(capillary sequencing)的單核苷酸多態性基因型或根本不判定(未判定)。錯誤判定的單核苷酸多態性會分散,且未判定的單核苷酸多態性是排除在分析之外。
本方法可適用於本領域所熟知之任意適合的用以偵測核酸變異和/或基因體鑑定的陣列平台。
本方法是測定在Illumina GoldenGate平台。首先,來自Illumina Genome studio的下列相關資訊是以一連串的預處理腳本(preprocessing script)所萃取的。
1)、“Full data table.txt”,此檔案帶著原始強度(raw intensity)、單核苷酸多態性的位置和基因座、以及基因體鑑定的主體/樣本的名稱的資訊。
2)、“Sample Table.txt”,此檔案帶著樣本的資訊以及樣本的強度的分布。
3)、“Paired sample table.txt”,此檔案帶著單核苷酸多態性以及在信號強度X、Y上的單核苷酸多態性和珠子類型的資訊,其
包括負控制的背景強度。
4)、“SNPtable.txt”,此檔案帶著使用Illumina GoldenGate陣列的TOP/BOT協定的單核苷酸多態性的方向以及引子序列的資訊。
舉例來說,考慮等位基因核酸變異A、B的情況,於此信號強度X、Y表現各自的對位基因原始信號強度。對於各個陣列,將有負控制,且此負控制包括未與任何聚合酶鏈反應產品鍵結的點或珠子,於此此些點的強度可作為背景強度(BI)。在Illumina GoldenGate分析的例子中,背景強度是來自於少數空白珠子,而此少數空白珠子是在Illumina GoldenGate分析中負控制的一部分。此可以來自任何單核苷酸多態性基因體鑑定分析的控制實驗的任何信號強度所替換。
等位基因核酸變異A、B的校正後信號強度XA、YB分別如下:
XA=X-BI
YB=Y-BI
分別以背景為標準的等位基因核酸變異A、B的校正後信號強度XA、YB應比0大。若發現校正後信號強度XA或校正後信號強度YB為少於0,其將被指定為0。當等位基因校正後信號強度中之一為0時,得知等位基因是可忽略的或不存在的,並且被發現的其他等位基因將判定為基因型。換言之,若發現信號強度中之一為太低,即,在背景扣除後只有一染料顯著的強度,表現的等位基因是作為表示單核苷酸多態性。
若發現校正後信號強度XA和校正後信號強度YB皆為0,基
因型判定為No Call(NC)。換言之,若二染料的信號強度落到背景強度之下,是認可為信號缺乏或測定的單核苷酸多態性等位基因是不存在。
舉例來說,若使用比率1:3(即,C為3),當等位基因核酸變異A、B的校正後信號強度的信號比率(Sr)(即,XA對YB或XA:YB)≧3:1在樣本中的等位基因會為A:A;若XA:YB的信號比率≦1:3,單核苷酸多態性會為B:B;而XA:YB的信號比率在3:1和1:3之間,其會為A:B。
計算和基因型判定(genotype calling)式表現如下。
XA=X-BI,X≧0
XA=核酸變異A的校正後信號強度,XA≧0
X=等位基因核酸變異A的原始信號強度
BI=背景強度
YB=Y-BI
YB=核酸變異B的校正後信號強度,YB≧0
Y=等位基因核酸變異B的原始信號強度
BI=背景強度
或
二擇一地,1:2的比率亦可應用之。
於是,本發明使用一原理,其染料的差異和校正後信號比率中的偏壓反映被判定如預期的校正後基因型(第5圖)。
藉由毛細管序列以27個植物樣本上40個單核苷酸多態性進行判定(call)的確認。40個單核苷酸多態性為執行在油棕樣本上的一組單核苷酸多態性,而油棕樣本皆具有在可用以分析的序列資料上的GoldenGate分析信號。
在相較於毛細管序列的結果之不正確的正判定的觀察後,發現誤差幅度(error margin)為15%(第6圖)。換言之,得到的3:1的XA:YB的比率為3.000,並且錯誤在3.000的15%內或3.000±15%為存在不正確的正判定的區域(第6圖)。較小的範圍可應用於比率1:2。並非所有存在於誤差幅度中的結果都是錯誤的。於此,術語「誤差幅度」和「信號邊界(signal border)」是可互換使用的。
用以判定單核苷酸多態性的本校正後信號比率演算法的實施已進行在稱為「GGGTSNPcaller.pl」的Perl腳本(script)。此代碼
亦可帶至其他程式語言來實現。此腳本可輸出如表1所示的必要資料,其指出樣本的概要、單核苷酸多態性、在陣列中單核苷酸多態性位址、預期的第一單核苷酸多態性(SNP1)和第二單核苷酸多態性(SNP2)等位基因、校正後信號強度XA和YB、得到的基因型判定(同型結合性或異型結合性)、判定的單核苷酸多態性、校正信號比率(Sr)、從信號邊界的百分比變化(VARPCT)以及邊界(Borders)-信號是否在15%邊界內。
透過觀察Genome studio軟體(Genome Studio)的幾個不錯且成功的判定,由染料在1:2或1:3的範圍下背景強度扣除後的校正後信號強度被發現暗示有相對高的正確判定的信賴。針對定序基因型做出基準(Benchmark)。
參照表2和第7圖,於此比較來自信號比率演算法(Poh)、Genome studio軟體(GS)和序列(Seq)的判定,其可看到校正後信號比率演算法具有累計56.2%(15.09%+41.11%)之匹配於序列(Seq)的判定,而Genome studio軟體(GS)具有累計48.6%(41.11%+7.5%)之匹配於序列的判定。此顯示根據本發明之校正後信號演算法顯示出較Genome studio軟體(GS)高的百分比之在變異上以序列正確辨識單核苷酸多態性。
(i)Kurg等學者的文章(Arrayed primer extension: Solid phase four color DNA resequencing and mutation detection technology; Genet. Test; 2000, 4: 1-7)。
(ii)學者Olivier的文章(The Invader assay for SNP genotyping; Mutat. Res.; 2005, 573(1-2): 103-110)。
(iii)學者Perkel的文章(SNP genotyping: six technologies that keyed a revolution; Nat. Methods; 2008, 5: 447-454)。
(iv)Ritchie等學者的文章(Bioinformatics; 2009, 25(19): 2621-2623)。
(v)學者Sambrook和Russel的文章(Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Springs Harbor Laboratory; New York; 2001)。
(vi)Steemers等學者的文章(Whole-genome genotyping with the single-base extension assay; Nat. Methods; 2006, 31(1): 31-33)。
(vii)Takitoh等學者的文章(Genome Analysis; 2007, 23(4): 408-413)。
(viii)美國專利公開號第2009/0062138號申請案。
A1‧‧‧第一等位基因
A2‧‧‧第二等位基因
L1‧‧‧第一基因座
T‧‧‧胸苷
A‧‧‧腺苷
第1圖是描述基因座特異寡核苷酸(探針)和等位基因特異探針的雜交;基因座特異寡核苷酸包括IllumiCode區域(來自Illumina GoldenGate分析的步驟)。
第2圖是描述聚合酶鏈反應產品對在陣列上的珠子的雜交。
第3圖是顯示原始信號強度分布的範例;原始信號強度分布從Genome studio軟體輸出在圖解型式上。
第4圖是顯示原始信號強度分布的進一步範例;原始信號強度分布從Genome studio軟體輸出在圖解型式上,其中橫軸為強度(A),而縱軸為強度(B)。
第5圖是比對預期基因型之背景校正後信號強度的圖解表示。
第6圖是顯示用以偵測核酸變異的本校正後信號比率演算法的誤差幅度。
第7圖是顯示比較來自校正後信號比率演算法(Poh)、Genome studio軟體(GS)和序列的Venn圖表。
第8圖是顯示本發明的方法的一範例之流程圖。
Claims (14)
- 一種樣本中的基因座的核酸變異的偵測方法,包括:將至少二鑑別性標示探針與一樣本接觸,其中該些鑑別性標示探針包括一第一標示探針和一第二標示探針、該第一標示探針用以偵測一第一核酸變異A、以及該第二標示探針用以偵測一第二核酸變異B;在一底座偵測該第一標示探針的一第一信號強度X及該第二標示探針的一第二信號強度Y,其中該第一信號強度X關聯於該第一核酸變異A的存在,以及該第二信號強度Y關聯於該第二核酸變異B的存在;執行該第一信號強度和該第二信號強度的背景校正,以得到背景校正後的第一信號強度XA和背景校正後的第二信號強度YB;表達XA:YB為一比率;當該XA:YB≧C:1、該XA>0且該YB>0時,或者當該XA>0且該YB≧0時,核酸變異為A:A;當該XA:YB≦1:C、該XA>0且該YB>0時,或者當該YB>0且該XA≧0時,該核酸變異為B:B;當該XA:YB位在該C:1和該1:C之間時,該核酸變異為A:B;以及當該XA≦0和該YB≦0時,該A和該B均不存在或是該核酸變異未能測定;其中,該C為一實數。
- 如請求項1所述之樣本中的基因座的核酸變異的偵測方法,其中該C≧2。
- 如請求項1所述之樣本中的基因座的核酸變異的偵測方法,其中該C=2或3。
- 如請求項1所述之樣本中的基因座的核酸變異的偵測方法,其中該C=3。
- 如請求項1所述之樣本中的基因座的核酸變異的偵測方法,其中該執行步驟包括將該X和該Y減去背景強度。
- 如請求項1所述之樣本中的基因座的核酸變異的偵測方法,其中該執行步驟包括執行一放大。
- 如請求項6所述之樣本中的基因座的核酸變異的偵測方法,其中該放大是以一聚合酶鏈反應進行。
- 如請求項7所述之樣本中的基因座的核酸變異的偵測方法,其中該聚合酶鏈反應是以該第一標示探針、該第二標示探針和一基因座特異寡核苷酸為引子以產生複數個聚合酶鏈反應產物。
- 如請求項8所述之樣本中的基因座的核酸變異的偵測方法,其中該些聚合酶鏈反應產物是雜交至固定在該底座上的基因座特異核酸。
- 如請求項1所述之樣本中的基因座的核酸變異的偵測方法,其中該偵測方法是用以偵測不同等位基因。
- 如請求項1所述之樣本中的基因座的核酸變異的偵測方法,其中該偵測方法是用以偵測單核苷酸多態性。
- 如請求項1所述之樣本中的基因座的核酸變異的偵測方法,其 中該偵測方法包括一電腦實施方法。
- 一種電腦系統,其中該電腦系統程式地執行如請求項1所述之樣本中的基因座的核酸變異的偵測方法。
- 一種電腦程式產品,包括:一電腦系統能執行的一軟體,當該電腦系統執行該軟體後以造成該電腦系統執行如請求項1所述之樣本中的基因座的核酸變異的偵測方法。
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