TW202212567A - 重組牛痘病毒 - Google Patents

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伊藤靖
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Abstract

提供作為臨床可使用的COVID-19預防疫苗(SARS-CoV-2用疫苗)之重組牛痘病毒等。 本發明之重組牛痘病毒，其特徵為包含編碼源自SARS-CoV-2之非結構蛋白質或結構蛋白質的cDNA之全部或一部分，與表現啟動子。

Description

重組牛痘病毒
本發明係關於作為SARS-CoV-2用疫苗之重組牛痘病毒等。
2019年於中國武漢首次被確認到的高病原性之新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)所致之感染症(COVID-19)，之後直到2020年，於世界各國猖獗。感染者數於2020年7月時間點時確認到的，全世界有超過1600萬人，日本亦有超過3萬人之狀況，其中死者數在全世界超過65萬人，日本亦約達到1000人。 而COVID-19之康復者的約30%即使於病毒排除後，免疫誘導亦不充分(非專利文獻1)，因此SARS-CoV-2之再感染風險受到顧慮。另一方面，以感冒冠狀病毒感染所誘導的免疫，於感染後1、2年之比較短期間即降低、消失，週期性地重複感染。因而，考慮到現狀係人類大多對SARS-CoV-2不具免疫力、即使於經一次罹患的患者於短期間內免疫亦會降低、今後亦可能於世界中繼續蔓延時，強力誘導免疫，且可長期間維持免疫的COVID-19預防疫苗(SARS-CoV-2用疫苗)之開發是必須的。
又，因持續蔓延，可能於SARS-CoV-2引起基因變異，因此係要求具備對伴隨變異之抗原性變化亦可對應之廣泛的交叉反應性之疫苗。進一步地，2002年之SARS冠狀病毒(CoV)出現以後，MERS-CoV或本次的SARS-CoV-2等感染人類的新型CoV於短期間出現，今後亦有未知的CoV出現的可能性。因而，對複數種CoV顯示防禦效果之泛CoV感染症預防疫苗之開發亦為重要的課題。
[先前技術文獻] [非專利文獻1]：MedRxiv, 2020(Fan Wu et al., Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in a COVID-19 recovered patient cohort and their implications., medRxiv preprint doi：https：//doi.org/10.1101/2020.03.30.20047365.)
於如此之狀況下，可於臨床使用之COVID-19預防疫苗(SARS-CoV-2用疫苗)等之開發係受到期望。
本發明係考慮上述狀況而為者，其係提供以下所示之重組牛痘病毒或醫藥組成物等。 (1)一種重組牛痘病毒，其包含編碼源自SARS-CoV-2之非結構蛋白質或結構蛋白質的cDNA之全部或一部分，與表現啟動子。 (2)如上述(1)之重組牛痘病毒，其中牛痘病毒為DIs株。 (3)如上述(1)或(2)之重組牛痘病毒，其中前述編碼非結構蛋白質之cDNA，為包含編碼源自SARS-CoV-2之非結構蛋白質中的ORF1b區域(編碼病毒複製所必須的蛋白質之非結構蛋白質基因區域)之cDNA者。
(4)如上述(1)~(3)中任一項之重組牛痘病毒，其中前述編碼非結構蛋白質之cDNA，為以下之(a)~(d)之任一者的DNA， (a) 由序列編號1所示之鹼基序列所構成的DNA； (b) 與由與序列編號1所示之鹼基序列互補的鹼基序列所構成的DNA具有80%以上之同一性，且編碼源自SARS-CoV-2之非結構蛋白質之DNA； (c) 由序列編號3所示之鹼基序列所構成的DNA； (d) 與由與序列編號3所示之鹼基序列互補的鹼基序列所構成的DNA具有80%以上之同一性，且編碼源自SARS-CoV-2之非結構蛋白質之DNA。 (5)如上述(1)或(2)之重組牛痘病毒，其中前述編碼結構蛋白質之cDNA，為包含編碼源自SARS-CoV-2之結構蛋白質中的棘蛋白質之cDNA者。
(6)如上述(1)、(2)或(5)之重組牛痘病毒，其中前述編碼結構蛋白質之cDNA，為以下之(a)~(d)之任一者的DNA， (a) 由序列編號5所示之鹼基序列所構成的DNA； (b) 與由與序列編號5所示之鹼基序列互補的鹼基序列所構成的DNA具有80%以上之同一性，且編碼源自SARS-CoV-2之結構蛋白質之DNA； (c) 由序列編號7所示之鹼基序列所構成之DNA； (d) 與由與序列編號7所示之鹼基序列互補的鹼基序列所構成的DNA具有80%以上之同一性，且編碼源自SARS-CoV-2之結構蛋白質之DNA。 (7)如上述(1)~(6)中任一項之重組牛痘病毒，其係即使於室溫下亦可保持安定性者。 (8)一種醫藥組成物，其含有如上述(1)~(7)中任一項之重組牛痘病毒。
(9)如上述(8)之醫藥組成物，其係SARS-CoV-2感染症之預防藥。 (10)如上述(8)之醫藥組成物，其係SARS-CoV-2感染症之治療藥。 (11)一種SARS-CoV-2用疫苗，其含有如上述(1)~(7)中任一項之重組牛痘病毒。 [發明之效果]
依照本發明，可提供作為於臨床可使用之COVID-19預防疫苗(SARS-CoV-2用疫苗)的重組牛痘病毒，及使用其之醫藥組成物等。本發明之重組牛痘病毒，作為強力地誘導免疫，且可維持長期間免疫的SARS-CoV-2用疫苗，於COVID-19感染症之預防或治療上極為有用。又，本發明之重組牛痘病毒，即使於室溫下，亦可保持作為SARS-CoV-2用疫苗的安定性，其保存及輸送時之溫度可為冷藏亦可為室溫，為實用性優良者。
以下詳細說明本發明。本發明之範圍不受限於此等說明，於以下之例示以外，亦可在不損及本發明之要旨的範圍內適當變更來實施。再者，本說明書包含本案優先權主張基礎的日本特願2020-130717號說明書(令和2年(2020年)7月31日申請)、日本特願2020-215454號說明書(令和2年(2020年)12月24日申請)，及日本特願2021-078781號說明書(令和3年(2021年)5月6日申請)之全體。本說明書中引用的全部刊物，例如先前技術文獻及公開公報、專利公報或其他專利文獻，係作為參照而併入本說明書中。
1.本發明之概要 作為對新型冠狀病毒感染症(COVID-19)之預防疫苗，係以對天花疫苗之將牛痘病毒馴化而經高度弱毒化之DIs株，導入源自SARS-CoV-2之基因而得的基因重組活疫苗之開發與早期實用化為目的。藉由使用牛痘病毒作為母體，疫苗接種後，可於短期間強力地誘導對SARS-CoV-2之免疫，所賦予的免疫力長期持續，且可期待具備對於抗原變異亦可對應之廣泛的交叉反應性之免疫的誘導。
本發明者，作為COVID-19預防疫苗(SARS-CoV-2用疫苗)之候選，建立了1)根據於SARS疫苗之實績(圖1、圖3)，而表現露出於病毒粒子表面，對吸著/感染細胞為重要之棘蛋白質(S蛋白質)的基因重組疫苗(抗體誘導及T細胞誘導型)，與2)表現於冠狀病毒基因體上基因序列相似性最高的區域(Zhou et al., Nature. 2020 Mar；579(7798)：270-273))(圖2)，且係編碼病毒複製所必須之蛋白質的非結構蛋白質基因區域(ORF1b)的基因重組疫苗(T細胞誘導型)。
至今為止經確立並評估的表現SARS-CoV之S蛋白質之重組疫苗，於接種後1週可誘導中和抗體，防禦SARS-CoV對小鼠之攻擊感染(Fumihiko Yasui et al., J Immunol, 181：6337-6348 (2008))(圖1)。又，對經接種天花疫苗之兔子，亦與對未致敏兔子之接種可同等地誘導SARS-CoV特異性免疫(Masahiro Kitabatake et al., Vaccine, 25：630-637 (2007))(圖3)。因而，對於COVID-19之重症化高風險族群，接種過天花疫苗之高齡者層，亦認為重組牛痘病毒係有效的。進一步地，本發明者等人，以確保更高安全性為目的，也開發了使用日本國立預防衛生研究所多賀谷勇博士等人以雞纖維母細胞(CEF)經馴化所開發的在多數正常哺乳動物細胞中為非增殖性之高度弱毒化牛痘病毒DIs株(Isamu Tagaya et al., Nature, 192：381-382, 1961)作為母體的重組疫苗。使用DIs株之SARS-S疫苗亦可防禦SARS-CoV感染(Koji Ishii et al., Virology, 351(2)：368-380, 2006)。又，本發明者等人，亦進行DIs母體之H5亞型及H7型血球凝集素(HA)蛋白質基因表現重組禽流感疫苗(rDIs-H5 HA及rDIs-H7 HA)之開發，實證了於疫苗接種後1週的短期間即發揮發病防禦效果、一次所賦予的免疫力在小鼠模式顯示出可說是終生免疫的長期免疫持續效果。基於此等見解，進行製作可表現SARS-CoV-2病毒結構蛋白質基因及非結構蛋白質基因之重組牛痘病毒(牛痘疫苗)(圖4、5)。
2.重組牛痘病毒之製作 作為編碼SARS-CoV-2之蛋白質的全部基因、編碼外殻蛋白質區域之基因，及編碼與複製相關之非結構蛋白質區域之基因的資訊，具體而言，SARS-CoV-2病毒株：hCoV-19/Japan/AI/I-004/2020之基因序列資訊(序列編號9)，係於NCBI網站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中以GenBank存取編號：LC521925而被登錄。
因此，本發明之重組牛痘病毒中所含有的基因，亦即包含SARS-CoV-2之非結構蛋白質區域或結構蛋白質區域的基因，可藉由通常之基因工程方法得到。例如，可使用利用了作為基因工程方法一般而言所使用的DNA合成裝置之核酸合成法。又，可使用將作為模板之基因序列予以單離或合成後，對於各自之基因設計特異性引子，並使用PCR裝置放大該基因序列之PCR法，或利用了選殖載體之基因放大法。上述方法為所屬技術領域中具有通常知識者可遵照「Molecular cloning 4th Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)」等來進行。所得之PCR產物之純化可使用公知的方法。
本發明中，係將SARS-CoV-2之全基因區域中編碼非結構蛋白質區域或結構蛋白質區域之基因DNA，使用於重組牛痘病毒的製作。該非結構蛋白質區域，為由ORF1a、ORF1b、ORF3a、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8，及ORF10區域所構成的區域，本發明中，例如以選擇ORF1b區域來使用為佳。又，該結構蛋白質區域，為由spike(S)、envelope (E)、integral membrane (M)，及nucleoprotein (N)區域所構成的區域，本發明中，例如以選擇棘(S)蛋白質區域來使用為佳。
本發明中，將編碼源自SARS-CoV-2之非結構蛋白質區域中之ORF1b區域的鹼基序列DNA，示於序列編號1，將編碼源自SARS-CoV-2之結構蛋白質區域中之S蛋白質區域的鹼基序列DNA，示於序列編號5。進一步地，將編碼上述ORF1b區域之鹼基序列DNA的變異型DNA(為了提高於重組牛痘病毒內之基因表現效率，將編碼ORF1b區域之鹼基序列DNA中6處的鹼基取代為其他鹼基者)，示於序列編號3，將編碼上述S蛋白質區域之鹼基序列DNA的變異型DNA(為了提高於重組牛痘病毒內之基因表現效率，將編碼S蛋白質區域之鹼基序列DNA中8處的鹼基取代為其他鹼基者)，示於序列編號7。惟，於由序列編號1、3、5及7所示之鹼基序列所構成的DNA以外，以下之DNA，亦可於本發明中使用。
與由與序列編號1所示之鹼基序列互補的鹼基序列所構成的DNA具有80%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上之同一性(相似性)，且編碼源自SARS-CoV-2之非結構蛋白質之DNA(ORF1b區域之變異型DNA)。 與由與序列編號3所示之鹼基序列互補的鹼基序列所構成的DNA具有80%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上之同一性(相似性)，且編碼源自SARS-CoV-2之非結構蛋白質之DNA(於ORF1b區域中施加前述鹼基取代變異之區域的變異型DNA)。
與由與序列編號5所示之鹼基序列互補的鹼基序列所構成的DNA具有80%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上之同一性(相似性)，且編碼源自SARS-CoV-2之結構蛋白質之DNA(S蛋白質區域之變異型DNA)。 與由與序列編號7所示之鹼基序列互補的鹼基序列所構成的DNA具有80%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上之同一性(相似性)，且編碼源自SARS-CoV-2之結構蛋白質之DNA(於S蛋白質區域中施加前述鹼基取代變異之區域的變異型DNA)。
與由與序列編號1所示之鹼基序列互補的鹼基序列所構成的DNA在嚴苛條件下雜交，且編碼源自SARS-CoV-2之非結構蛋白質之DNA(ORF1b區域之變異型DNA)。 與由與序列編號3所示之鹼基序列互補的鹼基序列所構成的DNA在嚴苛條件下雜交，且編碼源自SARS-CoV-2之非結構蛋白質之DNA(於ORF1b區域中施加前述鹼基取代變異之區域的變異型DNA)。
與由與序列編號5所示之鹼基序列互補的鹼基序列所構成的DNA在嚴苛條件下雜交，且編碼源自SARS-CoV-2之結構蛋白質之DNA(S蛋白質區域之變異型DNA)。 與由與序列編號7所示之鹼基序列互補的鹼基序列所構成的DNA在嚴苛條件下雜交，且編碼源自SARS-CoV-2之結構蛋白質之DNA(於S蛋白質區域中施加前述鹼基取代變異之區域的變異型DNA)。
此處，「編碼源自SARS-CoV-2之非結構蛋白質」，意指編碼病毒增殖時於細胞中所產生的蛋白質。又，編碼上述非結構蛋白質之基因中，除全長序列外，亦包含其一部分之序列。 又，「編碼源自SARS-CoV-2之結構蛋白質」，意指編碼構成病毒之外殻的蛋白質。又，編碼上述結構蛋白質之基因中，除全長序列外，亦包含其一部分之序列。
上述變異型DNA，可藉由化學合成得到，或者，能夠以由序列編號1、3、5或7表示之鹼基序列所構成的DNA或其片段為探針，藉由群落雜交、溶斑雜交、南方墨點等之公知雜交法，由cDNA基因庫及基因體庫而得到。又，上述雜交中，嚴苛之條件，例如，可列舉0.1×SSC~ 10×SSC、0.1%~1.0%SDS及20℃~80℃之條件，更詳細而言，可列舉於37℃~56℃進行30分鐘以上預雜交後，於0.1×SSC、0.1%SDS中，於室溫下進行1~3次的10~20分鐘洗淨之條件。雜交法之詳細流程，可參照「Molecular cloning 4th Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)」等。
本發明之重組牛痘病毒之製作中，並不特別限定，可採用公知之任意方法，例如，首先將編碼SARS-CoV-2之非結構蛋白質區域(ORF1b區域等)或結構蛋白質區域(S蛋白質區域等)之鹼基序列DNA，插入所期望之表現載體(質體)(例如DIs株同源重組載體(質體)(Koji Ishii et al. Virology 2006))。然後，可藉由將該質體載體轉染至所期望之牛痘病毒株(例如弱毒牛痘病毒DIs株)感染細胞，於牛痘病毒之基因體內引起同源重組，來製作表現SARS-CoV-2之非結構蛋白質或結構蛋白質的所期望之區域的重組牛痘病毒。該表現載體不特別限定，例如可使用具備DIs株同源基因序列區域之pSMART(註冊商標)載體等，本發明之重組牛痘病毒中所含有的表現啟動子，可使用自以往即使用於牛痘病毒基因表現的各種表現啟動子(例如mH5啟動子等)。
再者，上述之弱毒牛痘病毒DIs株，為自作為天花疫苗之大連株(DIE)藉由1日卵繼代法所建構之宿主範圍基因缺損體中高度弱毒化者，僅於Chick Embryo Fibroblast (CEF) cells中可增殖，係為國立預防衛生研究所(現國立感染症研究所)之多賀谷勇博士所開發(Tagaya et al. Nature, 192：381-382, 1961)。因大規模之基因缺失，於小鼠、天竺鼠、兔子、人類等幾乎所有的哺乳動物細胞中均無法增殖。因此即使萬一對免疫不全/免疫抑制患者接種，亦確保安全性。
所製作之重組牛痘病毒，能夠以病毒基因體為模板，藉由對SARS-CoV-2之非結構蛋白質區域基因或結構蛋白質區域基因特異性的引子進行PCR，來確認所期望之非結構蛋白質區域或結構蛋白質區域之基因導入。 又，所期望之非結構蛋白質或結構蛋白質之表現，能夠以感染所製作之重組牛痘病毒後的動物細胞為樣品，藉由西方墨點法來確認。再者，西方墨點法中之抗體，例如可使用特異性辨識所期望之非結構蛋白質區域或結構蛋白質區域的市售抗體，或由以SARS-CoV-2多肽誘發免疫而製作的抗血清中藉由Protein G純化IgG而得者。 本發明之重組牛痘病毒，為溫度安定性高者，例如其係即使於室溫下(雖不限定，但包含10~40℃之範圍，通常較佳為10~20℃)亦可保持作為SARS-CoV-2用疫苗之安定性者。因此，該牛痘病毒或後述之醫藥組成物等，其保存及輸送時之溫度可為冷藏之溫度亦可為室溫，為實用性、便利性優良者。
3.新型冠狀病毒感染症(COVID-19)之預防或治療用之醫藥組成物 本發明提供含有上述重組牛痘病毒之醫藥組成物，更具體而言，提供作為新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染症(COVID-19)之預防藥及治療藥之醫藥組成物。 本發明之醫藥組成物，可藉由任意公知之方法例如肌肉、腹腔內、皮內或皮下等之注射，或由鼻腔、口腔或肺的吸入，經口投予而導入於生物體中。進一步地，亦可合併使用本發明之醫藥組成物中所含有的重組牛痘病毒與既存的抗病毒藥(例如干擾素)。合併使用之態樣不特別限定，可將本發明之重組牛痘病毒與既存的抗病毒藥同時投予，亦可藉由將一方投予後，經過一定時間後投予另一方的方法而導入於生物體中。
又，本發明之醫藥組成物，可與賦形劑、增量劑、結合劑、潤滑劑等公知之藥學上容許之藥物載體、緩衝劑、等張化劑、螯合劑、著色劑、保存劑、香料、風味劑、甘味劑等混合。 本發明之醫藥組成物，可依錠劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、丸劑、液劑、糖漿劑等之經口投予劑；注射劑、外用劑、栓劑、點眼劑、點鼻劑等之非經口投予劑等之形態，而進行經口投予或非經口投予。較佳例示有對皮內、肌肉、腹腔等之局部注射等。
投予量係依有效成分之種類、投予路徑、投予對象、患者之年齡、體重、性別、症狀或其他條件而適當選擇，就重組牛痘病毒之一日投予量而言，經口的情況為1000~1000000000PFU(plaque forming units)左右、較佳為100000~100000000PFU左右，非經口的情況為100~ 1000000000PFU(plaque forming units)左右、較佳為1000~ 100000000PFU左右。病毒可1日投予1次，亦可分為數次進行投予。
本發明之重組牛痘病毒，可作為COVID-19之預防用或治療用疫苗使用，較佳為預先測定作為疫苗之抗體價或細胞性免疫活性。 例如，對本發明之重組牛痘病毒或親株之DIs株的抗體價，可藉由將此等病毒株對小鼠、兔子等接種後，經時地回收血清，並測定血清對SARS-CoV-2蛋白質的ELISA價或LIPS(luciferase immunoprecipitation system)價等而得到。藉此可確認於接種個體有無SARS-CoV-2之基因表現及免疫反應。接種過本發明之重組牛痘病毒的小鼠血清，為可自接種1週後起觀察到對SARS-CoV-2蛋白質之抗體價的上昇者。
又，細胞性免疫活性，例如可將本發明之重組牛痘病毒或親株之DIs株對小鼠接種後，由誘發免疫之小鼠分離脾臟細胞，並藉由FACS或ELISPOT assay來測定對SARS-CoV-2之非結構蛋白質或結構蛋白質特異性的CD4陽性及CD8陽性細胞是否被誘導/活化。例如，可藉由將經本發明之重組牛痘病毒誘發免疫的BALB/c小鼠由來的脾臟細胞，與表現非結構蛋白質或結構蛋白質之標的細胞共同培養，來檢測抗原特異性地活化之CD4及CD8陽性T細胞。
本發明之重組牛痘病毒，為可誘導對SARS-CoV-2之細胞性免疫者，特別是於可表現源自SARS-CoV-2之非結構蛋白質(較佳為ORF1b)的重組牛痘病毒中，其效果為顯著。又，本發明之重組牛痘病毒，為可誘導對SARS-CoV-2之中和抗體者，特別是於可表現源自SARS-CoV-2之結構蛋白質(較佳為S蛋白質)的重組牛痘病毒中，其效果為顯著。 進一步地，本發明之重組牛痘病毒(SARS-CoV-2用疫苗)，可成為具備不僅當然對於該牛痘病毒本來直接作為對象的SARS-CoV-2，且對伴隨SARS-CoV-2之變異的抗原性變化亦可對應之廣泛的交叉反應性之疫苗。亦即，本發明之SARS-CoV-2感染症之治療藥及預防藥的醫藥組成物，及SARS-CoV-2用疫苗中，作為SARS-CoV-2，亦包含於其鹼基序列或胺基酸序列具有取代、缺失、附加等之任意變異的所謂的變異株。作為SARS-CoV-2變異株，例如可列舉SUMS2(滋賀醫科大學分離株)、QHN001(UK型變異株)、TY7-501(巴西型變異株)、TY8-612(南非型變異株)等。 又，本發明之重組牛痘病毒，亦可作為對今後有出現的可能性之未知的新型冠狀病毒(CoV)亦顯示防禦效果的泛CoV感染症預防疫苗而被利用。
以下列舉實施例而更具體說明本發明，但本發明不限定於此等。 [實施例1]
1.方法 (1)SARS-CoV-2病毒結構蛋白質基因及非結構蛋白質基因重組牛痘疫苗之製作 (i)基因重組所用之SARS-CoV-2病毒株之選擇 SARS-CoV-2病毒株：基於hCoV-19/Japan/AI/I-004/ 2020之基因序列資訊(GenBank存取編號：LC521925)(序列編號9)，合成下述4種之基因。
・非結構蛋白質1b(ORF1b)基因區域 nCoV-Japan-1b (8198 bp) (序列編號1) ・非結構蛋白質1b(ORF1b)基因區域 mnCoV-Japan-1b GND (8198 bp) (序列編號3) ・棘蛋白質基因區域 nCoV-Japan-S (3926 bp) (序列編號5) ・棘蛋白質基因區域 mnCoV-Japan-S (3926 bp) (序列編號7)
上述4種之基因當中，序列編號1表示之基因為野生型之ORF1b基因，序列編號5表示之基因，為野生型之棘蛋白質基因。 另一方面，序列編號3及7表示之基因，分別為基於序列編號1及5表示之基因，以於牛痘病毒之基因表現效率提高的方式經最佳化的變異型之基因。 具體而言，序列編號3表示之變異型基因，為序列編號1表示之鹼基序列之第2445號、第2448號、第4998號、第5001號，及第6000號之T(胸腺嘧啶)，被取代為C(胞嘧啶)取代，且第2539號之G(鳥嘌呤)，被取代為A(丙胺酸)者(計6處之鹼基被取代者)。
又，序列編號7表示之變異型基因，為序列編號5表示之鹼基序列之第99號、第102號、第2364號、第2367號、第3213號、第3216號、第3417號，及第3420號之T(胸腺嘧啶)，被取代為C(胞嘧啶)者(計8處之鹼基被取代者)。 本實施例中，上述4種之基因當中，係將序列編號3及7表示之基因，用於建構重組牛痘病毒。
(ii)將2種之合成基因選殖於pSMART-DIs-L3載體內 將2種之合成基因(序列編號3及7表示之基因)，插入於DIs重組疫苗製作用之重組載體：pSMART-DIs-L3(序列編號10)(圖6、7)。使用此等之重組載體進行重組牛痘病毒(rDIs-1b-GND、rDIs-S)之建構(圖4)。「rDIs-1b-GND」，為使用插入有序列編號3表示之基因的載體(pSMART-DIs-L3-mnCoV-Japan-1b GND-GPTF)而得到的重組牛痘病毒，亦稱為「rDIs-mnCoV-1b-GND」。「rDIs-S」，為使用插入有序列編號7表示之基因的載體(pSMART-DIs-L3-mnCoV-Japan-S-GPTF)而得到的重組牛痘病毒，亦稱為「rDIs-mnCoV-S」。
(2)SARS-CoV-2病毒非結構蛋白質基因或結構蛋白質基因重組牛痘疫苗之評估 (i)確認插入於ORF1b非結構蛋白質基因重組DIs(rDIs-1b-GND)之基因序列後，以Real-Time Detection polymerase chain reaction (RTD-PCR)法確認mRNA表現(圖8)，以西方墨點法確認ORF1b構成蛋白質表現(圖11B)。 上述RTD-PCR所用之引子/探針、反應液組成、反應條件，係如以下所述。
＜引子・探針＞ 正向引子(HKU-ORF1b-nsp14F)： 5’-TGGGGYTTTACRGGTAACCT-3’(序列編號11) 反向引子(HKU-ORF1b-nsp14R)： 5’-AACRCGCTTAACAAAGCACTC-3’(序列編號12) 探針(HKU-ORF1b-nsp141P)： 5’-FAM-TAGTTGTGATGCWATCATGACTAG-TAMRA-3’ (序列編號13)
＜反應液組成＞
水(RNase free) 8.5μL
4x 反應混合液 5μL
正向引子   (10μM) 1μL
反向引子   (10μM) 1μL
探針(10μM) 0.5μL
RNA樣品 4μL
最終反應體積 20μL
＜反應條件＞
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(ii)確認插入於棘蛋白質基因區域重組DIs(rDIs-S)之基因序列後，以西方墨點法確認棘蛋白質表現(圖9、圖11A)。
2.結果 (1)確認插入於ORF1b非結構蛋白質基因重組DIs(rDIs-1b-GND)之基因序列後，以Real-Time Detection polymerase chain reaction (RTD-PCR)法確認mRNA表現(圖8)。12殖株中於10殖株確認到良好的mRNA表現。又，於rDIs-1b-GND中，以西方墨點法確認ORF1b構成蛋白質表現(圖11B)。
(2)確認插入於棘蛋白質基因區域重組DIs(rDIs-S)之基因序列後，以西方墨點法確認棘蛋白質表現(圖9、圖11A)。9殖株中於9殖株確認到良好的棘蛋白質表現。
3.考察 對源自SARS-CoV-2之ORF1b非結構蛋白質的疫苗(rDIs-1b-GND)，可成為誘導細胞性免疫之有效的預防疫苗。又，對源自SARS-CoV-2之棘蛋白質的疫苗(rDIs-S)，可成為誘導中和抗體之有效的預防疫苗(圖10)。 [實施例2]
將rDIs-1b-GND，接種於表現人類ACE2之基因轉殖小鼠(表現hACE2之Tg小鼠)，進行該小鼠中之SARS-CoV-2特異性T細胞反應之解析。具體而言，如圖12所示，以3週間隔接種rDIs-1b-GND或DIs(控制組)2次，於其1週後以SARS-CoV-2進行攻擊感染，以干擾素γ ELISpot分析來解析感染6日後之抗原特異性T細胞對SARS-CoV-2之活化。 其結果，於rDIs-1b-GND接種群觀察到SARS-CoV-2特異性之T細胞(ORF1b抗原(RdRp)特異性T細胞)之活化(干擾素γ之產生)(圖12)。 [實施例3]
使用食蟹猴評估rDIs-S之有效性及安全性。具體而言，如圖13所示，對食蟹猴以3週間隔皮內接種rDIs-S或DIs(控制組)2次，於其1週後以SARS-CoV-2進行攻擊感染，感染7日後進行剖檢。於以下(1)~(5)，說明各評估內容及其結果。
(1)測定SARS-CoV-2感染後之體溫變化。於控制組(DIs)群(虛線)，自SARS-CoV-2感染起2日後觀察到1度以上之體溫上昇，但於rDIs-S接種群(實線)，未觀察到體溫上昇(圖14)。
(2)測定鼻腔/氣管拭子中之感染性病毒量之經時變化。 鼻腔拭子中之病毒量：於DIs接種群，至感染7日後為止，係檢測到感染性病毒。於rDIs-S接種群，僅於感染1日後檢測到，其後迅速被排除。rDIs-S接種群之4隻中之1隻，即使感染1日後亦為檢測極限以下(圖15A)。 氣管拭子中之病毒量：於DIs接種群，4隻中之1隻，至感染7日後為止，檢測到感染性病毒。於rDIs-S接種群，4隻中之2隻，即使感染1日後亦為檢測極限以下，被檢測到的2隻亦為顯著之低值(圖15B)。
(3)測定SARS-CoV-2感染7日後之肺中病毒RNA量。於DIs接種群，4隻之幾乎所有的肺葉中檢測到高的病毒RNA量，於rDIs-S接種群，於肺葉之病毒RNA量幾乎為檢測極限以下，顯示出良好的排除效果(圖16)。
(4)確認SARS-CoV-2感染7日後之肺的病理觀察與病理分數。於DIs接種群，觀察到伴隨間質部之肥厚化的肺炎影像。另一方面，於rDIs-S接種群，幾乎觀察不到病變部分，顯示出可減輕肺炎(圖17)。
(5)確認於rDIs-S接種群之中和抗體誘導效果(NT 50titer)。於rDIs-S接種群，於全部4隻檢測到中和抗體(0 dpi)，藉由SARS-CoV-2攻擊感染(7 dpi)，觀察到抗體價之迅速增大(圖18)。 [實施例4]
使用表現人類ACE2之基因轉殖小鼠(表現hACE2之Tg小鼠)及C57BL/6來評估rDIs-S的有效性。於以下(1)及(2)，說明各評估內容及其結果。
(1)於接種rDIs-S之表現hACE2之Tg小鼠中的SARS-CoV-2感染防禦試驗 如圖19所示，對表現hACE2之Tg小鼠以3週間隔接種rDIs-S或DIs(控制組)2次，於其1週後，以SARS-CoV-2進行攻擊感染實驗。於DIs接種個體，伴隨急劇的體重變化而死亡，但於rDIs-S接種個體，幾乎未觀察到體重減少，顯示100%之生存率(圖19)。
(2)於接種rDIs-S之C57BL/6小鼠的抗原特異性細胞毒性T細胞之in vivo活性評估 如圖20所示，對C57BL/6小鼠以3週間隔接種rDIs-S或DIs(控制組)2次，於其1週後，將經SARS-CoV-2之S蛋白質刺激的脾細胞及未刺激脾細胞之1：1混合液對該小鼠進行靜脈內移入。翌日，採取脾臟，使用流式細胞儀分析法解析於細胞移入個體內的抗原刺激細胞之排除效果。於DIs接種個體，無法排除S蛋白質胜肽刺激細胞，但於rDIs-S接種個體，可迅速地排除源自S蛋白質之胜肽刺激細胞(圖20)。由此，確認到rDIs-S所致之SARS-CoV-2之S蛋白質特異性細胞毒性T細胞的誘導。 [實施例5]
使用C57BL/6J小鼠評估rDIs-S之抗體誘導能力。於以下(1)及(2)，說明各評估內容及其結果。
(1)如圖21所示，對C57BL/6J小鼠以3週間隔接種rDIs-S或DIs(控制組)2次，自接種前起至4週後為止毎週進行採血。將血清檢體以稀釋溶液(含有1%BSA、0.5% Tween 20、2.5 mM EDTA之PBS(-)稀釋100倍後，藉由ELISA測定對SARS-CoV-2之S蛋白質特異性的結合抗體(免疫球蛋白G；IgG)之產生。於rDIs-S接種個體(n=3)，自rDIs-S接種1週後起檢測到S蛋白質特異性抗體。進一步地，自初次接種起3週後，由於追加接種rDIs-S，其1週後之血清中所含有的S蛋白質特異性IgG量增加。
(2)使用與上述(1)所使用的相同血清檢體，藉由溶斑減少中和試驗法來評估對SARS-CoV-2(TY/WK-521：流行初期株)之中和抗體價。具體而言，係將血清以培養基稀釋10倍後，進一步進行4倍階段稀釋。分別將10倍、40倍、160倍、640倍、2560倍、10240倍稀釋之血清50μL與50 PFU/50μL之病毒溶液混合，於37度反應一小時。之後，將階段稀釋血清/病毒混合溶液(100μL)接種於對SARS-CoV-2具有感染感受性之VeroE6/TMPRSS2細胞，使其吸附1小時。將溶液去除，以培養基洗淨細胞後，添加含有0.6%瓊脂糖之培養基，培養48小時。48小時後，當於不含血清之檢體所形成溶斑數為100%時，算出藉由血清添加而使溶斑數成為半數的血清稀釋率之倒數，作為「50% 中和力價(50% neutralization titer)」。如圖22所示，於rDIs-S接種個體(n=3)，明顯可知自rDIs-S接種1週後起，中和抗體被誘導。又，藉由初次接種起3週後之追加接種，中和抗體價亦增強。 [實施例6]
實施例3中，係使用經rDIs-S接種(以3週間隔，皮內接種2次)之食蟹猴的血漿檢體，以TCID50法測定對SARS-CoV-2之流行初期株(TY/WK-521)及變異株(SUMS2：滋賀醫科大學分離株、QHN001：UK型變異株、TY7-501：巴西型變異株)的中和抗體價。本實施例中，係使用自初次rDIs-S接種起3週後之追加免疫時(圖23之圖表中 day -7)、SARS-CoV-2攻擊感染時(圖23之圖表中 day 0)，及剖檢時(圖23之圖表中 day 7)所採取的血漿。如圖23所示，可知藉由接種疫苗2次，對流行初期株及所有的變異株中和抗體均被誘導。 [實施例7]
對表現hACE2之Tg小鼠以3週間隔接種rDIs-S或DIs(控制組)2次，自追加免疫起1週後，使100 PFU之SARS-CoV-2南非型變異株(TY8-612)經氣管感染。每日觀測生存率，自感染起7日後剖檢。如圖24所示，於DIs接種(控制組)群，4隻中之2隻死亡，但於rDIs-S接種群，5隻之全部個體生存。對該變異株(TY8-612)，亦確認到rDIs-S接種所致之發病防禦效果。
相關資訊/論文
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[產業上之可利用性]
作為本發明之COVID-19預防疫苗(SARS-CoV-2用疫苗)的重組牛痘病毒，及使用其之醫藥組成物等，作為強力地誘導免疫，且可維持長期間免疫的SARS-CoV-2用疫苗，於COVID-19感染症之預防或治療極為有用。又，本發明之重組牛痘病毒，即使於室溫下亦可保持作為SARS-CoV-2用疫苗之安定性，其保存及輸送時之溫度可為冷藏亦可為室溫，實用性優良。 [序列表非關鍵詞文字]
序列編號3：合成DNA 序列編號4：合成建構體 序列編號7：合成DNA 序列編號8：合成建構體 序列編號10：合成DNA 序列編號11：合成DNA 序列編號12：合成DNA 序列編號13：合成DNA
[圖1]：顯示SARS-CoV-S基因重組疫苗(重組牛痘病毒)之發病防禦效果(於SARS疫苗之實績)的圖。 [圖2]：顯示於冠狀病毒基因體之基因序列相似性的圖。 [圖3]：顯示SARS-CoV-S基因重組疫苗(rVV-S)對兔子(牛痘病毒LC16m8前免疫群與未接種群)的接種試驗之結果的圖。
[圖4]：顯示SARS-CoV-2基因重組牛痘病毒之基因構成的圖。 [圖5]：顯示SARS-CoV-2基因重組疫苗之概略的圖。 [圖6]：顯示pSMART-DIs-L3-mnCoV-Japan-1b GND-GPTF載體之構成的圖。
[圖7]：顯示pSMART-DIs-L3-mnCoV-Japan-S-GPTF載體之構成的圖。 [圖8]：顯示藉由Real-Time Detection polymerase chain reaction，鑑定SARS-CoV-2基因重組牛痘病毒(rDIs-1b-GND)感染細胞中之SARS-CoV-2 mRNA表現之結果的圖。 [圖9]：顯示藉由西方墨點，鑑定SARS-CoV-2基因重組牛痘病毒(rDIs-S)感染細胞中之SARS-CoV-2 棘蛋白質表現之結果的圖。
[圖10]：表示新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)預防疫苗(SARS-CoV-2基因重組牛痘病毒)的防禦之機構的圖。 [圖11]：表示藉由西方墨點法確認所製作之重組疫苗(rDIs-S及rDIs-1b-GND)中的導入抗原之表現之結果的圖。 A(左圖)：使用SARS-CoV-2 棘蛋白質(S蛋白質)之特異性抗體的該S蛋白質之檢測結果。 B(右圖)：使用SARS-CoV-2 ORF1b構成蛋白質(經ORF1b區域所編碼之非結構蛋白質)之特異性抗體的1b蛋白質之檢測結果。 [圖12]：顯示於接種rDIs-1b-GND之人類ACE2表現基因轉殖小鼠(hACE2表現Tg小鼠)中的SARS-CoV-2特異性T細胞反應之解析結果的圖。
[圖13]：顯示使用食蟹猴之重組疫苗(rDIs-S)的有效性/安全性之評估方法的圖。 [圖14]：顯示接種rDIs-S之食蟹猴中，SARS-CoV-2感染後的體溫變化之測定結果的圖。 [圖15]：顯示接種rDIs-S之食蟹猴中，鼻腔拭子及氣管拭子中之感染性病毒量的經時變化之結果的圖。 A(左圖)：鼻腔拭子中之病毒量；B(右圖)：氣管拭子中之病毒量
[圖16]：顯示接種rDIs-S之食蟹猴中，SARS-CoV-2感染7日後的肺中病毒RNA量之測定結果的圖。 [圖17]：顯示接種rDIs-S之食蟹猴中，SARS-CoV-2感染7日後的肺病理觀察(圖17之左圖)與病理分數(圖17之右圖)的圖。 [圖18]：顯示接種rDIs-S之食蟹猴中，中和抗體誘導效果的圖。 [圖19]：顯示接種rDIs-S之hACE2表現Tg小鼠中，SARS-CoV-2感染防禦試驗之結果的圖。 [圖20]：顯示接種rDIs-S之C57BL/6小鼠中，抗原特異性細胞毒性T細胞之in vivo活性評估結果的圖。 [圖21]：顯示接種rDIs-S之C57BL/6J小鼠中，S蛋白質特異性結合抗體誘導之效果的圖。 [圖22]：顯示接種rDIs-S之C57BL/6J小鼠中，中和抗體誘導效果的圖。 [圖23]：顯示使用接種rDIs-S之食蟹猴血漿的對SARS-CoV-2之流行初期株(TY/WK-521)及變異株(SUMS2：滋賀醫科大學分離株、QHN001：UK型變異株、TY7-501：巴西型變異株)之中和抗體價測定結果的圖。圖中、#1~#4表示接種rDIs-S之食蟹猴之各個體由來的4種血漿檢體。 SUMS2(滋賀醫科大學分離株)，為SARS-CoV-2之棘蛋白質(S蛋白質)的胺基酸序列(序列編號6)中，帶有「D614G、Q675H」之胺基酸取代變異者， QHN001(UK型變異株)，為SARS-CoV-2之S蛋白質的胺基酸序列(序列編號6)中，帶有「N501Y、D614G」之胺基酸取代變異者， TY7-501(巴西型變異株)，為SARS-CoV-2之S蛋白質的胺基酸序列(序列編號6)中，帶有「K414T、E484K、N501Y、D614G」之胺基酸取代變異者。 [圖24]：顯示使用接種rDIs-S之hACE2 Tg小鼠的對SARS-CoV-2之變異株(TY8-612：南非型變異株)的防禦效果之結果的圖。 TY8-612(南非型變異株)，為SARS-CoV-2之S蛋白質的胺基酸序列(序列編號6)中，帶有「RBD區域：K417N、E484K、N501Y；N端區域：D80A、D215G；Subdomain 1區域：D614G；S2區域：A701V」之胺基酸取代變異，且第242~244號胺基酸(Leu-Ala-Leu)缺失者。
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Claims (11)

  1. 一種重組牛痘病毒，其包含編碼源自SARS-CoV-2之非結構蛋白質或結構蛋白質的cDNA之全部或一部分，與表現啟動子。
  2. 如請求項1之重組牛痘病毒，其中牛痘病毒為DIs株。
  3. 如請求項1或2之重組牛痘病毒，其中前述編碼非結構蛋白質之cDNA，為包含編碼源自SARS-CoV-2之非結構蛋白質中的ORF1b區域之cDNA者。
  4. 如請求項1~3中任一項之重組牛痘病毒，其中前述編碼非結構蛋白質之cDNA，為以下之(a)~(d)之任一者的DNA； (a) 由序列編號1所示之鹼基序列所構成的DNA， (b) 與由與序列編號1所示之鹼基序列互補的鹼基序列所構成的DNA具有80%以上之同一性，且編碼源自SARS-CoV-2之非結構蛋白質之DNA， (c) 由序列編號3所示之鹼基序列所構成的DNA， (d) 與由與序列編號3所示之鹼基序列互補的鹼基序列所構成的DNA具有80%以上之同一性，且編碼源自SARS-CoV-2之非結構蛋白質之DNA。
  5. 如請求項1或2之重組牛痘病毒，其中前述編碼結構蛋白質之cDNA，為包含編碼源自SARS-CoV-2之結構蛋白質中的棘蛋白質之cDNA者。
  6. 如請求項1、2或5之重組牛痘病毒，其中前述編碼結構蛋白質之cDNA，為以下之(a)~(d)之任一者的DNA； (a) 由序列編號5所示之鹼基序列所構成的DNA， (b) 與由與序列編號5所示之鹼基序列互補的鹼基序列所構成的DNA具有80%以上之同一性，且編碼源自SARS-CoV-2之結構蛋白質之DNA， (c) 由序列編號7所示之鹼基序列所構成之DNA， (d) 與由與序列編號7所示之鹼基序列互補的鹼基序列所構成的DNA具有80%以上之同一性，且編碼源自SARS-CoV-2之結構蛋白質之DNA。
  7. 如請求項1~6中任一項之重組牛痘病毒，其係即使於室溫下亦可保持安定性者。
  8. 一種醫藥組成物，其含有如請求項1~7中任一項之重組牛痘病毒。
  9. 如請求項8之醫藥組成物，其係SARS-CoV-2感染症之預防藥。
  10. 如請求項8之醫藥組成物，其係SARS-CoV-2感染症之治療藥。
  11. 一種SARS-CoV-2用疫苗，其含有如請求項1~7中任一項之重組牛痘病毒。
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