TARIFNAME KIRIM-KONGO KANAMALI ATES HASTALIGINA (KKKAH) KARSI REKOMBINANT ASI GELISTIRILMESI Bulusun Ilgili Oldugu Teknik Alan Bulus, evrensel potansiyeli olan bir KlElEli Kongo KanamalDAtesi Hastaltglü/irüsü (KKKAHV) asEEile ilgilidir. Bu asüKKKAHV'ne karsEimmun yanllîlolusturan KKKAHV'nin Biyoinformatik olarak Olusturulan Korunmus Antijenlerini (Bioinformatically Generated Conserved Antigen- BGCA) kodlayan adenovirus 5 vektörü içermektedir. Bulusla Ilgili Teknigin Bilinen Durumu (Önceki Teknik) Rekombinant aslîgelistirilmesinde kullanllân birçok sistem bulunmaktadlE Bununla beraber son yllüarda viral vektör tabanlElasEl/ektörleri öne çEIZl'riaktadIB Teknigin bilinen durumunda viral vektör tabanlElasElvektörleri içerisinde en yaygI olarak çalSlEnElAdenovirüslerdir. Adenovirüsler, farklEDNA moleküllerini hedef hücre içerisine taslakta ve intrinsik olarak konakçlîl immun yan-I stimülasyonunu saglamaktadlEllar. Bu özellikleri dolayElsîla adenovirüslerin moleküler biyolojisi ve viral genomlarla ilgili metodolojisi yogun bir sekilde çallgllIhStE AyriEla, son yillarda adenovirüslerin aslZlvektörü olarak etkin bir sekilde kullanilBiaslerekombinant asllârI gelistirilmesinde adenovirüs tabanlElvektörleri çok cazip kllüiaktadlB En yaygI olarak bulunan Ad5'e karsEkIinik öncesi çallginalarEtamamlanmlg ve basarllüîlfaz çallgmalarlîlbulunan örnekler bulunmaktadlB Bununla beraber HIV'e karslîl gelistirilen Adenovirüs tabanlElasEI basarlîlîl olmasi. nedeni tam olarak bilinmemekle beraber HIV'nin CD4 ve dentritik hücreleri enfekte ettigi ve Adenovirüs tabanlüsllârlia CD4 ve dentritik hücrelerin vücutta sergilenmesi arttElârak virüsün enfekte edecegi popülasyon için daha uygun bir ortam hazlElladlgllîtlüsünülmektedir. Bununla beraber bu durumun HIV'e spesifik oldugu düsünülmektedir. Ebola virüsü dentritik hücreleri, monosit, makrofaj ve damar endotelial hücrelerini enfekte ettigi halde primatlarda Adenovirüs vektör tabanllZEbola as.. %100 koruyucu oldugu saptanmlgtlîl Teknigin bilinen durumunda Adenovirüs tabanlEl vektör olarak enfeksiyöz hastalllîlara karsürekombinant asElgelistirilen ve faz çallgirialarEl devam eden birçok örnek bulunmaktadlE Bunlardan en önemlileri; HIV (Faz I, IIb), Influenza (Faz I), Kuduz (fare, tilki, köpek ve koyun denemeleri), Ebola (Faz I), Hepatitis C (Faz I), Hepatitis B (rodent ve primatlarda), Herpes Simplex virüs 2 (fare), Sitomegolavirüs (fare ve primatlarda), Tüberküloz (Faz I ve II) ve Sllilna (Faz Ia, Ib) örnekleri verilebilir. Teknigin bilinen durumunda son yll]hrda Adenovirüs tabanlüvektör kullanilarak rekombinant asIZI çallgi'nalarII birçogu klinik öncesi çallginalarlîlbasarlîlile geçerek gönüllü insanlarda faz çaligtnalarülasamaslüb geçmistir. Viral vektör tabanIEasÜ/ektörlerinden olan poxvirüs vektörü kullanilarak tam büyüklükteki M genini (Prekürsör glikoprotein=GPC) poxvirüs vektör tabanlEl expression sistemine adapte ederek KKKAH virüsüne karsErekombinant asElgelistirilmistir. gelistirilen asiöliöl koruyucu oldugu saptanmlîstlE Teknigin bilinen durumunda IFNAR farelerinde KKKAHV Türkiye Kelkit 06 susuna karslîönemli düzeyde koruma saglayan hücre kültürü tabanlElinaktif aslîigelistirilmistir. Bulgaristan'da KKKAH'ye karsEgelistirilmis, yavru fare beyinlerden izole edildikten sonra inaktive edilmis virüs aslîlîbulunmaktadiîl Ancak, bu asEiIe asllânmigl bireylerden elde edilen serumlarda düsük seviyede nötralizan antikor titresi belirlenmis, ek olarak asII koruyucu etkinligi degerlendirilmemistir. KKKAHV nükleoproteinini (IbAr 10200 susu) eksprese eden adenovirüs tabanllîalsIlEl, IFNAR farelerine karslZl/o78'e kadar koruyucu etkinlik gösterdigini kanlflbmlStE ancak çaliSinada herhangi bir standart hücresel immün yanltâ ait sonuç olmadan, sadece asII etkinligine ait sonucu gösterilmistir. Rekombinant DNA teknolojisinin günümüzde uygulama alanübuldugu bir diger gelisme özellikle fazla saylîlh genotipi olan ve dünyada yaygI olarak bulunan viral patojenlere karsEl rekombinant aslîgelistirme stratejisidir. DNA düzeyinde karsliâstIEIân ve daha sonra amino asit dizilim karsilâstlBlIl'iasElsonucunda en çok korunmus ortak bölgelerin belirlenerek kompütürize olarak optimize edilmis genis spektrumlu reaktif antijen (COBRA: Patent numarasE U59212207) kodlayan rekombinant antijenlerin asElantijeni olarak kullanllüiaslîl esas. dayanmaktadlEI Bulusta , COBRA sisteminden farkIEbIarak KKKAHV izolatlarIlEl ilk olarak amino asit dizilim karsilâstEilÜialarII yapiiüiasEisonucunda en çok korunmus ortak bölgelerin belirlenerek daha sonra kodon optimize DNA bölgeleri in Stil/co olarak belirlenmis ve Biyoinformatik olarak Olusturulan Korunmus Antijen (BGCA) ismi verilmistir. Bulusun, COBRA sisteminden bir diger temel farkEDNA asEEblarak degil Adenovirus vektörü kullanilârak asEl adaylarEiiiazEIbnmlStlEl Teknigin bilinen durumunda KKKAH'ye karsügelistirilmis FDA veya EMA onaylübir asü bulunmamaktadlE IFNAR farelerinde KKKAHV Türkiye Kelkit 06 susuna karsiîönemli düzeyde koruma saglayan hücre kültürü tabanlElinaktif asEl gelistirilmistir (Patent numarasE dokümanda viral vektör tabanlEasEivektörlerinden olan poxvirüs vektörü kullanilârak tam büyüklükteki M geni (Prekürsör glikoprotein=GPC) poxvirüs vektör tabanlEiexpression sistemine adapte edilmistir. Sonuç olarak, KKKAHV karsßsgelistirilmesinde BGCA dizilimleri rekombinant DNA teknolojisi kullanilârak Adenovirüs vektörüne klonlanüârak asadaylarßlusturulmustur. KKKAHV'ye karsEl gelistirilen teknigin bilinen durumundaki tüm asilâr, dünyadaki belirli bir bölgeye ait spesifik bir susa karslîilmmün yanlElEtetiklemektedir. Bu nedenle, bilinen tüm KKKAHV suslarlEla karsEl genis bir antikor yanEIlolusturan evrensel bir KKKAHV as-I gelistirilmesine ihtiyaç duyulmaktadEl Bulusun KlEla AçEIillamasElre Amaçlarlîl Bulusun öncelikli amaclîtadece belli bir bölgeye ait spesifik bir susa karsüjegil, bilinen tüm KKKAHV suslar- karsElimmün yan. tetikleme potansiyeline sahip rekombinant asEl gelistirilmesidir. Bulusun amacEIKKKAH virüsünün dünyada sirküle olan bütün genotiplere ait Nukleoproteinin (NP) amino asit düzeyinde korunmus bölgelerini ve KKKAH'a karslîülkemizde dominant olarak görülen genotip 5'e ait tam büyüklükteki prekürsör glikoprotein (GPC) içermesi nedeniyle evrensel potansiyeli olan bir asgelistirmektir. Bulus ile gelistirilen rekombinant asEüretiminde canlEl/irüs kullanllßiadlgilîiçin biyogüvenlik seviye 3 yerine biyogüvenlik seviye 2 kosullarIa üretilmektedir. Biyogüvenlik seviye 2'de üretilecek olan rekombinant asII maliyetinin azalmasII yanIda, daha güvenli bir asEl olarak degerlendirilmektedir. Bulus ile gelistirilen rekombinant aslîzlla adjuvant kullanUIhasEa gerek kalmamakta ve adjuvant kullanIiIan kaynaklanan yan etkiler ortadan kaldlîllü'iaktadlEl Bulus ile gelistirilen rekombinant asElE gerek maliyetinin az olmaslîgerekse de biyogüvenlik seviye 2'de üretilebilmesi faz asamalar_ geçildigi taktirde özel sektör taraflEldan tercih edilmesini ve yatlîlm yapßasIERolaylastßcaktIE Bulus ile KKKAHV izolatlarII ilk olarak amino asit dizilim karsllâstlElB'ialarII yapllüiaslîl sonucunda en çok korunmus ortak bölgelerin belirlenerek daha sonra kodon optimize DNA bölgeleri in 5/7/'60 olarak belirlenmekte ve Biyoinformatik olarak Olusturulan Korunmus Antijen (BGCA) ismi verilmektedir. Bulus ile KKKAHV karslîlaslîgelistirilmesinde BGCA dizilimleri rekombinant DNA teknolojisi kullan llârak Adenovirüs vektörüne klonlanllârak aslîidaylarßlusturulmaktadEl Bulus yöntemi ile , BGCA V GPC olarak adlandEllân, KKKAH virusu Grup V içinde yer alan tam büyüklükteki konsensüs GPC sekansEl/e BGCA V NP olarak adlandlEllân, Grup V içinde yer alan KKKAHV'Ierde bulunan tam büyüklükteki konsensüs NP antijenini olusturan en korunmus amino asitler belirlenmistir. Benzer sekilde BGCA I-VI NP olarak adlandlElilEn ve dünyada sirküle olan KKKAHV gruplarEEilçeren tam büyüklükteki konsensüs NP amino asitler belirlenmistir. Bulusu Aç[lillayan Sekillerin TanlE'ilarEl KKKAHV nükleoproteinini baz alan 107 KKKAHV izolatlarII filogenetik analizi KKKAHV nükleoproteinini (NP) baz alan Grup V KKKAHV izolatlarII filogenetik KKKAHV glikoproteinini (GPC) baz alan Grup V KKKAHV suslarßlßl/izolatlarlrîlül filogenetik analizi A) KKKAHV BGCA V GPC içeren adenoviral vektörden, KKKAHV BGCA V GPC protein ekspresyonunun immünoblotlama yöntemi ile gösterilmesi. KKKAHV BGCA V GPC içeren adenoviral vektörün (1), KKKAHV Türkiye/KelkitOö GPC içeren adenoviral vektörün (2) ve KKKAHV Türkiye/Kelkit06 susu PEG presipite KKKAHV antijeninin (3) western blot görüntüleri. KKKAHV karSEblusmus poliklonal tavsan serumu primer antikor olarak; keçi anti-tavsan HRP sekonder antikor olarak kullanilBllStlB B) KKKAHV BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektörden KKKAHV BGCA I-VI NP protein ekspresyonunun immünoblotlama yöntemi ile gösterilmesi. KKKAHV Türkiye/Kelkit06 susu PEG presipite KKKAHV antijeninin (1), KKKAHV BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektörün (2) western blot görüntüleri. KKKAHV NP'ye karsßlusan monoklonal antikor primer antikor olarak; keçi anti-fare HRP sekonder antikor olarak kullanilI'hlStBC) KKKAHV Türkiye/Kelkit06 NP içeren pET28 vektöründen KKKAHV Türkiye/Kelkit06 NP protein ekspresyonunun immunblotlama yöntemi ile gösterilmesi. KKKAHV Türkiye/Kelkit06 NP içeren pET28'in (1) ve KKKAHV Türkiye/Kelkit06 susu PEG presipite KKKAHV antijeninin (2) western blot görüntüleri. KKKAHV karsEblusmus poliklonal tavsan serumu primer antikor olarak; keçi anti- tavsan HRP sekonder antikor olarak kullanilIhISIlB D) KKKAHV BGCA V NP içeren adenoviral vektörden KKKAHV BGCA V NP protein ekspresyonunun immünoblotlama yöntemi ile gösterilmesi. KKKAHV BGCA V NP içeren adenoviral vektörün (1) ve KKKAHV Türkiye/Kelkit06 susu PEG presipite KKKAHV antijeninin (2) western blot görüntüleri. KKKAHV NP'ye karsEl monoklonal antikor primer antikor olarak; keçi anti-fare HRP sekonder antikor olarak kullanilßilgtlü A) BGCA V GPC ad ve BGCA I-VI NP acl vektörleriyle prime ve prime boost immunizasyonu ve KKKAHV eprüvasyonundan sonra farelerin sagkalIi yüzdeleri B) BGCA V GPC ad ve BGCA I-VI NP ad vektörleriyle prime immunizasyonu ve KKKAHV hücre kültür tabanllîlaslîlve pET28 Turkey/Kelkit06 NP ile yapilân prime boost immunizasyonlarElyapilân farelerde KKKAHV eprüvasyonundan sonra farelerin sagkaln yüzdeleri A) BGCA V GPC ad ve BGCA I-VI NP acl vektörleriyle prime ve prime boost immunizasyonu ve klinik bulgular ve hastaligb iliskin semptomlar. siddeti. Klinik bulgular. siddetinin degerlendirilmesi normal = 0; hayvan. sIEil k[l]]aria diklesme görülmesi : 1, k[l]]arda diklesme ve hafif Ietarji : 3, sadece Ietarji : 3, nefes darliglEl ve Ietarji = 4 olarak yapilBiEtlBB) BGCA V GPC ad ve BGCA I-VI NP ad vektörleriyle prime immunizasyonu ve KKKAHV hücre kültür tabanlüisülre pET28 Turkey/Kelkit06 NP ile yapüân prime boost immunizasyonlarEi/apüân farelerde klinik bulgular ve hastal[gb iliskin semptomlarllîl siddeti. Klinik bulgularI siddetinin degerlendirilmesi normal = 0; hayvan. sI kUJIarEizla diklesme görülmesi = 1, k[l]}irda diklesme ve hafif letarji = 3, sadece Ietarji = 3, nefes darllglüle letarji = 4 olarak yaptlIhlStlîl A) BGCA V GPC ad ve BGCA I-VI NP ad vektörleriyle prime immunizasyonu ve BGCA V GPC ad ve BGCA V NP ile prime boost immunizasyonlarElyapllân farelerde eprüvasyon sonrasEtüm gruplardaki vücut süklilîlarüjegisimi. B) BGCA V GPC ad ve BGCA I-VI NP acl vektörleriyle prime immunizasyonu ve KKKAHV hücre kültür tabanlüisEi/e pET28 Turkey/Kelkit06 NP ile yapilân prime boost immunizasyonlarEl yapüân farelerde eprüvasyon sonrasEliüm gruplardaki vücut lelakliElarlJlegisimi. A) BGCA V GPC ad ve BGCA I-VI NP ad vektörleriyle prime ve prime boost immunizasyonlarEl/apilân farelerde eprüvasyon sonraslîfarelerin aglîlltlg degisimiß) BGCA V GPC ad ve BGCA I-VI NP ad vektörleriyle prime immunizasyonu ve KKKAHV hücre kültür tabanllZlaSElve pET28 Turkey/Kelkitûö NP ile yaptlân prime boost immunizasyonlarlîýapilân farelerde eprüvasyon sonrasEllarelerin ag lEIlilZl degisimi. A) BGCA V GPC ad ve BGCA I-VI NP ad vektörleriyle prime immunizasyonu ve BGCA V GPC ad ve BGCA V NP ad vektörleriyle prime boost immunizasyonu yapliân farelerde eprüvasyon sonrasEfarelerin vücut leiaklElZlariaki degisim (°C) B) BGCA V GPC ad ve BGCA I-VI NP ad vektörleriyle prime immunizasyonu ve KKKAHV hücre kültür tabanIEl aSEl ve pET28 Turkey/Kelkit06 NP ile yapilan prime boost immunizasyonlarEl yapilân farelerde eprüvasyon sonrasEi farelerin vücut slîiaklllîlarütlaki degisim (°C) A) Eprüvasyon sonraslîprime ve prime boost immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile yapllân gruptaki farelerin bireysel vücut lelaklHZlarIaki degisim (°C). B) Eprüvasyon sonraslîibrime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA V NP içeren adenoviral vektör ile yapllân gruptaki farelerin bireysel vücut lelakliElarIaki degisim (°C). C) Eprüvasyonundan sonraslîbrime ve prime boost immünizasyonu bos adenoviral vektör ile yapüân gruptaki farelerin bireysel vücut slükllKlarIaki degisim (°C). D) Eprüvasyon sonrasüirime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu hücre kültürü tabanIElnaktif asEiIe yapilan gruptaki farelerin bireysel vücut sükliElarlEldaki degisim (°C). E) Eprüvasyon sonraslîprime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu pET28 Turkey/Kelkit06 NP ile yapilan gruptaki eprüvasyon sonrasiîlfarelerin bireysel vücut lethilZlarIaki degisim (°C) A) BGCA V GPC ad ve BGCA I-VI NP ad vektörleriyle prime ve prime boost immunizasyonlarlîlyapiiân farelerde eprüvasyon sonrasiîfarelerde bireysel aglEliilZl degisimi. B) BGCA V GPC ad ve BGCA I-VI NP ad vektörleriyle prime immunizasyonu ve KKKAHV hücre kültür tabanllîiasüie pET28 Turkey/Kelkit06 NP ile yapilan prime boost immunizasyonlarlîlyapilân farelerde eprüvasyon sonrasEl fa relerde bireysel ag EiilEJ degisimi. A) Eprüvasyon sonrasEbrime ve prime boost immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile yapliân gruptaki farelerin bireysel agIEliHZlarII yüzde olarak degisimi B) Eprüvasyon sonrasünrime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA V NP içeren adenoviral vektör ile yapllân gruptaki farelerin bireysel agiîllUZIarII yüzde olarak degisimi C) Eprüvasyon sonrasiZbrime ve prime boost immünizasyonu bos adenoviral vektör ile yapilân gruptaki farelerin bireysel agliiilElarII yüzde olarak degisimi D) Eprüvasyon sonrasEbrime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu hücre kültürü tabanlElnaktif asElle yapEIân gruptaki farelerin bireysel aglilllKlarElI yüzde olarak degisimi E) Eprüvasyonundan sonrasEl prime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu Türkiye/Kekit06 NP içeren pET28 ile yapüân gruptaki farelerin bireysel aglEHElZlarIlBl yüzde olarak degisimi A)KKKAHV antijenlerine karsEqusan serum IgG yanltlhrIEtest etmek için enzim baglEitnmünosorbent tahlil (ELISA) testi kullanllÜiEtlE Bu deneyde, prime ve prime boost immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile yapllân gruptaki farelerden aI-n serumlar test edilmistir. 27. günde (prime boost immünizasyondan önce) ve 55. günde (KKKAHV eprüvasyonundan önce) farelerden alin kandan elde edilen serumlar 1/400 oranIa dilüe edilerek kullanilIhlgtlB Prime ve prime boost immünizasyonu bos adenoviral vektör ile yapüân gruptaki farelerden allEbn kanlardan elde edilen serumlar negatif kontrol olarak kullanilBîlStE Örneklerin optik yogunluklarHOD) 450 nm'de ELISA okuyucuda ölçülmüstür. Negatif kontrollerin ortalamasIZlve standart sapma (SD) kullanilârak hesaplanan cut off degeri, negatif kontrollerin ortalamasEl- ZSD olarak aIlErnSIIEB) KKKAHV antijenlerine karslîilusan serum IgG yanltlhrlElEltest etmek için enzim bagIElimmünosorbent tahlil (ELISA) testi kullanüBiEtE Bu deneyde, prime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA V NP içeren adenoviral vektör ile yapilan gruptaki farelerden aI-n serumlar test edilmistir. 27. günde (prime boost immünizasyondan önce) ve 55. günde (KKKAHV eprüvasyonundan önce) farelerden alman kandan elde edilen serumlar 1/400 oranlîiba dilüe edilerek kullanHII'iStE Prime ve prime boost immünizasyonu bos adenoviral vektör ile yapilan gruptaki farelerden aI-n kanlardan elde edilen serumlar negatif kontrol olarak kullanUIhlIstE Örneklerin optik yogunluklarEI(OD) 450 nm'de ELISA okuyucuda ölçülmüstür. Negatif kontrollerin ortalamasElve standart sapma (SD) kullanüârak hesaplanan cut off degeri, negatif kontrollerin ortalamasE-li- ZSD olarak allEinlStlEl C) KKKAHV antijenlerine karslîblusan serum IgG yanlfllarIEtest etmek için enzim baglümmünosorbent tahlil (ELISA) testi kullanHBrlgtE Bu deneyde, prime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu hücre kültürü tabanlEl inaktif asElle yapliân gruptaki farelerden alin serumlar test edilmistir. 27. günde (prime boost immünizasyondan önce) ve 55. günde (KKKAHV eprüvasyonundan önce) farelerden aI-n kandan elde edilen serumlar 1/400 oranlEda dilüe edilerek kullanllfnlgtlü Prime ve prime boost immünizasyonu bos adenoviral vektör ile yapliân gruptaki farelerden alin kanlardan elde edilen serumlar negatif kontrol olarak kullanllfnlgtlB Örneklerin optik yogunluklarEl(OD) 450 nm'de ELISA okuyucuda ölçülmüstür. Negatif kontrollerin ortalamaslIlve standart sapma (SD) kullanUârak hesaplanan cut off degeri, negatif kontrollerin ortalamasE-li- ZSD olarak allömlgtlü D) KKKAHV antijenlerine karslZblusan serum IgG yan[tliarIEtest etmek için enzim bagllîimmünosorbent tahlil (ELISA) testi kullanllöilgE Bu deneyde, prime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu Türkiye/Kelkit06 NP içeren pET28 ile yapilan gruptaki farelerden alin serumlar test edilmistir. 27. günde (prime boost immünizasyondan önce) ve 55. günde (KKKAHV eprüvasyonundan önce) farelerden allElan kandan elde edilen serumlar 1/4000 oranlElda dilüe edilerek kullanHB'ilStE Prime ve prime boost immünizasyonu bos adenoviral vektör ile yapuân gruptaki farelerden aI-n kanlardan elde edilen serumlar negatif kontrol olarak kullanUÜilgtE Örneklerin optik yogunluklarüOD) 450 nm'de ELISA okuyucuda ölçülmüstür. Negatif kontrollerin ortalamasüve standart sapma (SD) kullanliârak hesaplanan cut off degeri, negatif kontrollerin ortalamasl]L ZSD olarak allEtnlStlB KKKAHV antijenlerine karslZlasllânan tüm gruplardaki fare serumlarlEtlan en son elde edilen IgG titreleri. A) Prime ve prime boost immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile yapllân gruptaki farelerden alin serumlardaki nötralizan antikor titreleri. Bu deneyde, 27. günde (prime boost immünizasyondan önce) ve 55. günde (KKKAHV eprüvasyonundan önce) dilüe edilerek kullanüîhlgtE Prime ve prime boost immünizasyonu bos adenoviral vektör ile yapllân gruptaki farelerden 27. günde (prime boost immünizasyondan önce) ve 55. günde (KKKAHV eprüvasyonundan önce) allElan kanlardan elde edilen serumlar aynlîiranda dilüe edilmis ve asüânmglfarelerde nötralizasyon aktivitesinin belirlenmesi için elde edilen sonuçlari& karsüâstEllIhasIa kullanllînlgtü B) Prime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA V NP içeren adenoviral vektör ile yapilan gruptaki farelerden alin serumlardaki nötralizan antikor titreleri. Bu deneyde, 27. günde (prime boost immünizasyondan önce) ve 55. günde (KKKAHV eprüvasyonundan önce) dilüe edilerek kullanllîhlgtE Prime ve prime boost immünizasyonu bos adenoviral vektör ile yapüân gruptaki farelerden 27. günde (prime boost immünizasyondan önce) ve 55. günde (KKKAHV eprüvasyonundan önce) aI-n kanlardan elde edilen serumlar aynüiranda dilüe edilmis ve asllânmlglfarelerde nötralizasyon aktivitesinin belirlenmesi için elde edilen sonuçlar& karsilâstEllBiasHa kullaniIB'iIStECWrime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu hücre kültürü tabanlEilnaktif asEl ile yapilan gruptaki farelerden alin serumlardaki nötralizan antikor titreleri. Bu deneyde, 27. günde (prime boost immünizasyondan önce) ve 55. günde (KKKAHV eprüvasyonundan önce) farelerden aI-n kandan elde edilen serumlar 1/16, 1/32, 1/64 ve 1/128 oranliîha dilüe edilerek kullanilEnStE Prime ve prime boost immünizasyonu bos adenoviral vektör ile yapliân gruptaki farelerden 27. günde (prime boost immünizasyondan önce) ve 55. günde (KKKAHV eprüvasyonundan önce) alIn kanlardan elde edilen serumlar aynüiranda dilüe edilmis ve asüânmlgl farelerde nötralizasyon aktivitesinin belirlenmesi için elde edilen sonuçlar. karsllâstülîhaslda kullanilBilgtlB D) Prime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu Türkiye/Kelkit06 NP içeren pET28 ile yapüân gruptaki farelerden aI-n serumlardaki nötralizan antikor titreleri. Bu deneyde, 27. günde (prime boost immünizasyondan önce) ve 55. günde (KKKAHV eprüvasyonundan önce) dilüe edilerek kullanUBilStE Prime ve prime boost immünizasyonu bos adenoviral vektör ile yapllân gruptaki farelerden 27. günde (prime boost immünizasyondan önce) ve 55. günde (KKKAHV eprüvasyonundan önce) aI-n kanlardan elde edilen serumlar aynüiranda dilüe edilmis ve asllânmEfarelerde nötralizasyon aktivitesinin belirlenmesi için elde edilen sonuçlar. karsilâstlîllßwsia kullanilBiiStlEI A) BGCA V GPC ad ve BGCA I-VI NP ad vektörleriyle prime ve prime boost immunizasyonlarElyapUân farelerden aIlElan serumlarda proinflamatuar sitokin yanEIbrüThl/Thz panelinde analiz etmek için, Luminex bio-plex magpix okuyucu kullanllfnlStE Bu grafik, asllâma yapllân her bir farklEgruptaki interferon gama (IFN-y) yan-D ve gruplar arasIaki sonuçlarEl karsliâstünalü olarak göstermektedir.B) BGCA V GPC ad ve BGCA I-VI NP ad vektörleriyle prime immunizasyonu ve KKKAHV hücre kültür tabanlllsüre pET28 Turkey/Kelkit06 NP ile yapüân prime boost immunizasyonlarlîlyapllân farelerden allEbn serumlarda proinflamatuar sitokin yan[fl]arüTh1/Th2 panelinde analiz etmek için, Luminex bio- plex magpix okuyucu kullanllIhlgtlEl Bu grafik, asüâma yapüân her bir farkllîgiruptaki interferon gama (IFN-y) yan-Elve gruplar arasIaki sonuçlarElkarsHâstlElnalEl olarak göstermektedir. A) Asüânan farelerden alin serumlarda proinflamatuar sitokin yanlHlarlZIThl/Thz panelinde analiz etmek için, Luminex bio-plex magpix okuyucu kullanllîhlStB Bu grafik, aslßma yapüân her bir farklElgruptaki tümör nekrozis faktör o (TNF-ci) yan-Elle gruplar aras-aki sonuçlarEkarsliâstlElnalEblarak göstermektedir. B) Asliânan farelerden alin serumlarda proinflamatuar sitokin yanllîllarlZlThl/ThZ panelinde analiz etmek için, Luminex bio-plex magpix okuyucu kullanliîhlgtlîl Bu grafik, aslßma yapHBn her bir farklElgruptaki tümör nekrozis faktör ci (TNF-ci) yan-üre gruplar araleldaki sonuçlarEllarsllâstlElnallîblarak göstermektedir. A) BGCA V GPC ad ve BGCA I-VI NP ad vektörleriyle prime ve prime boost immunizasyonlarüyapüân farelerden alin serumlarda proinflamatuar sitokin yanElbrElAsHâma yaplßn her bir farklEgruptaki interlökin-12 pro70 (IL-12pro70) yan-Elve gruplar arasIaki sonuçlarElkarsliâstlünallîlolarak göstermektedir. Asüânan farelerden allEbn serumlarda proinflamatuar sitokin yanElbrEDThl/ThZ panelinde analiz etmek için, Luminex bio-plex magpix okuyucu kullanllüilStEB) BGCA V GPC ad ve BGCA I-VI NP ad vektörleriyle prime immunizasyonu ve KKKAHV hücre kültür tabanlEbsEl/e pET28 Turkey/Kelkit06 NP ile yapüân prime boost immunizasyonlarüiapuân farelerden al-n serumlarda proinflamatuar sitokin yanlfliarüAsllâma yapllân her bir farklEgruptaki interlökin-12 pro70 (IL-12pr070) yan-Elve gruplar arasIaki sonuçlarElkarsüâstlîiinallîlolarak göstermektedir. Asliânan farelerden allEbn serumlarda proinflamatuar sitokin yanElhrEJElThllThZ panelinde analiz etmek için, Luminex bio-plex magpix okuyucu kullanllîhlgtEl A) BGCA V GPC ad ve BGCA I-VI NP acl vektörleriyle prime ve prime boost immunizasyonlarlîlyapllân farelerden allElan serumlarda proinflamatuar sitokin yanlflhrlZl Asllâma yapllân her bir farkIElgruptaki interlökin-2 (IL-2) yan-Elve gruplar arasIdaki sonuçlarEl karsllâstülnalü olarak göstermektedir. Asüânan farelerden alülan serumlarda proinflamatuar sitokin yanlflbrlElDThl/Thz panelinde analiz etmek için, Luminex bio-plex magpix okuyucu kullanmIStEB) BGCA V GPC ad ve BGCA I-VI NP ad vektörleriyle prime immunizasyonu ve KKKAHV hücre kültür tabanlEasü/e pET28 Turkey/Kelkit06 NP ile yaptlân prime boost immunizasyonlarEl yapllân farelerden allEtan serumlarda proinflamatuar sitokin yanlfllarlîl Asllâma yapilan her bir farklElgruptaki interlökin-Z (IL-2) yan-Eve gruplar arasIdaki sonuçlarlîl karsllâstlünallîl olarak göstermektedir. Asüânan farelerden alin serumlarda proinflamatuar sitokin yanlflhrIEThl/ThZ panelinde analiz etmek için, Luminex bio-plex magpix okuyucu kullanUE1lgtlE A) BGCA V GPC ad ve BGCA I-VI NP ad vektörleriyle prime ve prime boost immunizasyonlarlîlyapüân farelerden allElan serumlarda proinflamatuar sitokin yanElbrü Asllâma yaplßn her bir farklElgruptaki interlökin-4 (IL-4) yan-Elve gruplar arasliîdaki sonuçlarEl karsilâstünalü olarak göstermektedir. Asllânan farelerden alin serumlarda proinflamatuar sitokin yanlHiarIDi'hl/Thz panelinde analiz etmek için, Luminex bio-plex magpix okuyucu kullanllßîlgtEB) BGCA V GPC ad ve BGCA I-VI NP ad vektörleriyle prime immunizasyonu ve KKKAHV hücre kültür tabanlEasüie pET28 Turkey/Kelkit06 NP ile yapüân prime boost immunizasyonlarEl yapllân farelerden aI-n serumlarda proinflamatuar sitokin yanlfliarlîl Asüâma yapllân her bir farklügruptaki interlökin-4 (IL-4) yan-üye gruplar arasIaki sonuçlarlîl karsllâstlEnaIEl olarak göstermektedir. Asüânan farelerden alin serumlarda proinflamatuar sitokin yanltlbrIllThl/ThZ panelinde analiz etmek için, Luminex bio-plex magpix okuyucu kullanüIhlStlB A) BGCA V GPC ad ve BGCA I-VI NP acl vektörleriyle prime ve prime boost immunizasyonlarlîlyapüân farelerden alln serumlarda proinflamatuar sitokin yanltlbrlZlAsHâma yapüân her bir farklEgruptaki interlökin-lO (IL-10) yan-Elle gruplar arasIaki sonuçlarEl karsllâstülnalü olarak göstermektedir. Asllânan farelerden alülan serumlarda proinflamatuar sitokin yanlfliarIDI'hI/Thz panelinde analiz etmek için, Luminex bio-plex magpix okuyucu kullanllBilStlEl B) BGCA V GPC ad ve BGCA I-VI NP ad vektörleriyle prime immunizasyonu ve KKKAHV hücre kültür tabanlEbsEl/e pET28 Turkey/Kelkit06 NP ile yapüân prime boost immunizasyonlarÜ/apllân farelerden alin serumlarda proinflamatuar sitokin yanlfliarljAsilâma yapllân her bir farkIEgruptaki interlökin-lO (IL-10) yan-Elle gruplar arasliîtlaki sonuçlarEl karsllâstünalü olarak göstermektedir. Asllânan farelerden aI-n serumlarda proinflamatuar sitokin yanlfbrIDI'hI/Thz panelinde analiz etmek için, Luminex bio-plex magpix okuyucu kullanilIhlStlEl Sekil 22:A) BGCA V GPC ad ve BGCA I-VI NP ad vektörleriyle prime ve prime boost immunizasyonlarEIyaptlân farelerden aI-n serumlarda proinflamatuar sitokin yanlflhrDAsllâma yapllân her bir farkllîgruptaki tümör granülosit-makrofaj koloni- uyarElZlfaktör (GM-CSF) yan-Elve gruplar arasIdaki sonuçlarElkarsllâstlîlnalIZl olarak göstermektedir. Asilânan farelerden alln serumlarda proinflamatuar sitokin yanEIhrIDl'hl/ThZ panelinde analiz etmek için, Luminex bio-plex magpix okuyucu kullanllüîlStE B) BGCA V GPC ad ve BGCA I-VI NP acl vektörleriyle prime immunizasyonu ve KKKAHV hücre kültür tabanllîlaslîl/e pET28 Turkey/Kelkit06 NP ile yapllân prime boost immunizasyonlarülapllân farelerden allElan serumlarda proinflamatuar sitokin yanltltarElAsllâma yapllân her bir farkllîgruptaki gruptaki tümör granülosit-makrofaj koloni-uyarlEEl faktör (GM-CSF) yan-El ve gruplar arasIaki sonuçlarIZl karsllâstEnalEl olarak göstermektedir. Asllânan farelerden aI-n serumlarda proinflamatuar sitokin yanlfllarIlZll'hl/ThZ panelinde analiz etmek için, Luminex bio-plex magpix okuyucu kullanllBiStlEl Bulusun AyrIIttlllîAçlamasEl Tam büyüklükteki KKKAH Virüsü Prekürsör glikoprotein (GPC) ve Nukleoprotein (NP) proteinlerini sifreleyen BGCA V NP, BGCA V GPC ve BGCA I-VI NP KKKAHV izolatlarII amino asit dizilim karsllâstEllüîalarElsonucunda en çok korunmus ortak bölgelerin belirlenerek rekombinant antijenlerin profilleri yapilân in sißca çallglnalar sonucunda belirlenmistir. BGCA V NP, BGCA V GPC olarak isimlendirilen konstraklar ülkemizde ve ayn üamanda Rusya, Gürcistan, Bulgaristan ve Kosova gibi bölgelerdeki yaygI genotip olup bu genotipe ait GenBankaletla kayEllEtam büyüklükteki 29 adet NP izolatI ve adet M izolatI amino asit düzeyinde ve daha sonra gen düzeyinde en çok korunmus ortak bölgelerinin allEmasEile elde edilmistir. BGCA V GPC olarak adlandlEIlân, 25 farklEKKKAHV susu tarafIan kodlanan GPC, 1688 amino asitten olusmaktadE BGCA V GPC, tüm Türkiye korunmus halde bulunmaktadlü Bu oran NP proteininde daha yüksek olarak tespit edilmistir. AnlatIlgBekilde belirlenen BGCA V NP, BGCA V GPC ve BGCA I-VI NP dizilimleri hizmet alIiEl yoluyla sentez ettirilmis (GenScript) ve puc57 ve pShuttIe plazmidleri içerisine yerlestirilmistir. Sentez edilen BGCA konstraklarI pShuttle mekik vektörlerine klonlanmasüve memeli hücrelerinde açilillatili'naslîl puc57 plazmidi içerisinde yerlestirilmis BGCA V NP, BGCA V GPC ve BGCA I-VI NP DNA dizilimleri Adenovirüs sistemine transferinde Adeno-X Adenoviral System 3 (Clontech) kullanilüilgtlü Bu metotda linearize pAdenoX Vector DNA'si klonlanacak olan bölgenin 5' ve 3' uçlarIaki vector DNA'sEiIe 15 baz çifti homoloji gösteren ve BCGA DNA'IarEPZR ile çogaltacak sekilde primerler dizayn edilerek PZR yöntemiyle çogaltilBiEtlI.] Böylece hem BCGA DNA'larHa hem de Adenovirüs vektöründe 15 baz çifti uzunlugunda homolog knlar elde edilmistir. Daha sonra In-Fusion rekombinasyon kitiyle vektör ve insert bulunan 15 baz çiftlik homolog bölgelerin fuzyonu ile BCGA DNA'larI pAdenoX Vektör DNA'lela transferi saglanmlgtlEl Bu sekilde Adenovirus DNA's- transfer edilen rekombinant BCGA konstraklarEl PacI kesim enzimi ile linearize edilerek kalsiyum metodu ya da lipofektamin ile HEK-293 hücrelerine transfekte edilmistir. Istenilen rekombinant KKKAH antijenlerin üretildiginin teyit edilmesi amaclsîla IFA ve immunoblotlama yapilö1l$tü BCGA ve BULUS TANIMLARI: Söz konusu bulusta viral vektör olarak genom büyüklügü 36000 bp olan, rekombinant DNA teknolojisinde avantajlarHan dolayüsilîl [Ela kullanilan insan adenovirüs tip5 vektörü (Clontech) kullanilInIStEI Adenoviral vektörü kullanman. avantajlarüvektörün çesitli memeli hücre tiplerinde çogalabilmesi ve stabil kalmasüproliferasyon süsia genomun yeniden düzenlenmesinin çok yüksek seviyede olmamaslsîlvirüsün çogalmas. uygun olan hücrelerde viral genom replikasyonunun yüksek oranda olmasßlarak slßlanabilir. Replikasyonda görev alan erken viral proteinleri kodlayan E1 bölgesinin adenoviral vektör genomundan silinmesi, adenovirüs replikasyonunu yetersiz kilöîasüllöl yanßüi ilgili yabancEl genin viral genoma eklenmesini mümkün kilEiaktadlü AynlISekiIde, E3 bölgesinin genomdan El bölgesiyle birlikte silinmesi, 8 kb'ye kadar olan istenilen genin vektöre klonlanmasIIZI saglamaktadlEI Bu nedenle, adenoviral vektörün, memeli hücrelerinde replike olabilmesi için El tamamlaylEIZIfaktöre ihtiyacüduyulmaktadlî.! Vektör ayrlEla sitomegalovirüs (CMV) için promotör bölge içermektedir. Böylece, vektör transfekte edilen hücrede inaktif olarak kalsa da ilgili gen baglisEolarak eksprese edilmektedir. Mevcut bulus, KKKAHV'ne karslîimmun yaniEl olusturan KKKAHV'nin Biyoinformatik olarak Olusturulan Korunmus Antijenlerini (Bioinformatically Generated Conserved Antigen-BGCA) kodlayan adenovirus 5 vektörü içermektedir. Antijenik fragment, KKKAHV enfeksiyonuna karsEimmün yanifllarEilndükleme yetenegine sahip olan, KKKAHV BGCA glikoproteinini (GPC) veya BGCA nükleoproteinini (NP) ifade eden amino asit sekanslîlilarak tanIiIanmaktadEI Bulus, KKKAHV'nin Biyoinformatik olarak Olusturulan Korunmus Antijeni (BGCA) olarak adlandEllEn konsensüs KKKAHV sekansIEllJir adenoviral vektör araciIJgEIe üretme yöntemine dayanmaktadlü Bu yöntem, BGCA V GPC olarak adlandlîllân, Grup V (Sekil 3) içinde yer alan KKKAHV'Ierde bulunan tam uzunluktaki konsensüs GPC sekansüle BGCA V NP sekanslîlolarak adlandEllân, Grup V (Sekil 2) içinde yer alan KKKAHV'Ierde bulunan tam uzunluktaki konsensüs NP sekansIEiçeren KKKAHV'nin farklügenotip gruplar-a bulunan en korunmus amino asitleri belirlemeye dayalIIE Benzer sekilde BGCA I-VI NP olarak adlandlEilân ve tüm KKKAHV gruplarIa (Sekil 1) yer alan tam uzunluktaki konsensüs NP sekansEitermektedir. Mevcut bulusta, tüm KKKAHV genotiplerine ait nükleoprotein (NP) aminoasit sekanslarEl/e KKKAHV genotip 5'e ait oldugu bilinen tüm glikoprotein (GPC) amino asit sekanslarECEenBank veritabanIdan allüinlgtlü Biyoinformatik program (MEGA) kullanilarak virüsün cografik daglDEliI göre, suslar 7 farklüilogenetik gruba ayriIB'ilgtE Bütün gruplara ait GPC ve NP proteinlerini olusturan amino asitler sßlanmlgve her bir gruptaki amino asit sekanslarIa korunmus bölgeler tespit edilmis ve GPC ve NP için primer bir konsensüs dizisi belirlenmistir. Daha sonra, her bir gruba ait amino asit sekans- karsilâstlîlârak tüm gruplarda bulunan en çok korunmus amino asit dizisi belirlenmistir. Bulusta her bir gruba ait bu amino ait sekanslarEIBGCA I, II, III, IV, V, VI ve VII KKKAHV antijeni olarak adlandlEllBßIlE Mevcut bulus, Grup V (Sekil 3) için BGCA GPC amino asit dizisi, biyoinformatik program kullanilârak, daha önce açilZlanan yöntem ile belirlenmistir. Grup V'de yer alan 25 farklE'kusa ait amino asit sekanslarEhizalanmg ve en çok korunan amino asit dizisini içeren bölge belirlemistir (Sekans ID No. 2). Daha sonra, belirlenen amino asit dizisi tersine transle edilerek nükleik asit sekanslarlîblde edilmis ve memeli hücrelerinde ekspresyonu için kodon optimizasyonu yapllîhlstlîlßekans ID No.1). Elde edilen bu BGCA fragmenti bulusta BGCA V GPC olarak isimlendirilmistir. BGCA V GPC, yapay olarak sentezlenmis ve pShuttIe 2 vektörüne klonlanmlgtlE Daha sonra rekombinant DNA teknolojisiyle Adenovirüs tip 5 vektörüne yerlestirilmistir. Mevcut bulus, BGCA V GPC olarak adlandlEllân ve 25 farklEKKKAHV susa ait korunmus 1688 amino asitteri olusmaktadEI(Sekil 3). BGCA V GPC, tüm Türkiye KKKAHV suslarIa %96-97; bulunmaktadlEl(Sekil 3). Mevcut bulus, BGCA V GPC, BGCA V'de (Avrupa/Türkiye) %100; BGCA IV'de (Asya/Orta korunmus halde bulunmaktadlîl(Sekil 3). Mevcut bulus, tüm gruplar için BGCA I-VI NP amino asit dizileri, biyoinformatik program kullanllârak, daha önce açllZIanan yöntem ile belirlenmistir. Ilk olarak, 6 farklügrupta yer alan için BGCA fragmentleri belirlenmistir. Daha sonra, tüm gruplar için olusturulan BGCA I-VI NP aminoasit sekanslarIZl incelenmis ve korunmus amino asitleri dizileri belirlenerek tüm gruplar için en çok korunmus amino asitleri içeren ve BGCA I-VI NP olarak adlandlEllân fragmenti olusturulmustur (Sekans edilmis ve memeli hücrelerinde ekspresyonu için kodon optimizasyonu yapiliilgtlüßekans ID N0.4). BGCA I-VI NP, yapay olarak sentezlenmis ve pShuttle 2 vektörüne klonlanmStE Daha sonra rekombinant DNA teknolojisiyle Adenovirüs tip 5 vektörüne yerlestirilmistir. Mevcut bulus, BGCA I-VI NP tüm gruplardaki KKKAHV suslarütarafian kodlanan ve korunmus 482 amino asitten olusmaktadlEI(Sekans ID No. 5). BGCA I-VI NP, BGCA V'de (Avrupa/Asya) % % 98.96; BGCA III'de (Güney Afrika/BatEAfrika) % % oranIda korunmus halde bulunmaktadlE Mevcut bulus, Grup V (Sekil 2) için BGCA V NP amino asit dizisi, biyoinformatik program kullanüârak, daha önce açllZlanan yöntem ile belirlenmistir. Grup V'de yer alan 29 farklEtusa ait amino asit sekanslarü hizalanmlgl ve en çok korunan amino asit dizisini içeren bölge belirlemistir (Sekans ID No. 8). Daha sonra, belirlenen amino asit dizisi tersine transle edilerek nükleik asit sekanslarEéIde edilmis ve memeli hücrelerinde ekspresyonu için kodon optimizasyonu yapiliilgtüßekans ID No 7). Elde edilen bu BGCA fragmentine bulusta BGCA V NP adElverilmistir. BGCA V NP, yapay olarak sentezlenmis ve pShuttle 2 vektörüne klonlanmlgtE Daha sonra rekombinant DNA teknolojisiyle Adenovirüs tip 5 vektörüne yerlestirilmistir. Mevcut bulus, Grup V'deki bütün KKKAHV suslarEtarafIEUan kodlanan korunmus 482 amino asitten olusmaktadlîl(Sekans ID No. 8). BGCA V NP, Türkiye KKKAHV suslarlEUa % 98.99; Mevcut bulus, BGCA V NP, BGCA V'de (Avrupa/Asya) % % BGCA VI'de (Yunanistan) % % 96.26 oranIa korunmus halde bulunmaktadE BGCA V GPC ve BGCA V NP ya da BGCA I-VI NP içeren, replikasyonu sIIEllanmELladenoviral vektör 5 ile çesitli kombinasyonlarda yapüân immüzasyondan sonra, gelistirilen bu yeni bulusun KKKAHV'ye karslîkoruyucu etki saglad @müsterilmistih Bulus ile, KKKAHV enfeksiyonuna karslZlimmün yanlElEirEluyaran, biyoinformatik olarak olusturulan korunmus GPC veya NP antijenlerini kodlayan nükleik asitleri içeren adenoviral vektör olusturma yöntemleri tan Iilanm @E Bulus ile BGCA segmentlerini (BGCA V GPC veya BGCA V NP veya BGCA I-VI NP) içeren adenoviral yapII HEK 293 hücrelerine transfeksiyon yöntemleri tanIilanmIStlEI Mevcut bulus, HEK293 hücreleri, adenoviral vektörün hücrelerde replikasyonunu saglayan E1 tamamlaylElZflaktöre sahiptir. Bulus ile BGCA V GPC, BGCA V NP ya da BGCA I-VI NP içeren rekombinant adenovirüsün transfeksiyondan sonra HEK 293 hücrelerinden elde edilme yöntemleri tanIilanmlgtlB Bulus, E. call' temelli ekspresyon sistemi için kodon optimize KKKAHV Türkiye/Kelkit06 susu NP sekansIEiianilamlStlElßekans ID No. 11). Bulus ile ayrlEia, kodon optimize Türkiye-Kelkit06 NP içeren bakteriyel vektörü olusturma yöntemi tannlanmstlîl Bulus, pET28 bakteriyel vektörü (Novagen), pET28 Türkiye/Kelkit06 NP'yi olusturmak için kullanilEiStlE Olusan pET28 Türkiye/Kelkit06 NP antijenik fragment olarak rol oynamakta ve KKKAHV enfeksiyonuna karslZimmun yan [Elolusmasßaglam lgtlB Bu bulusta, BGCA V GPC nükleik asit dizisi ile Sekans ID No. 1 olarak ifade edilen dizi en az Bulusta, BGCA V GPC'yi kodlayan amino asit dizilimleri ile Sekans ID No. 2 olarak ifade edilen (Sekans ID No. 2). Bulusta, BGCA V GPC'yi kodlayan amino asit dizilimlerinin olusturdugu peptit ile Sekans ID benzerlik göstermektedir (Sekans ID No. 3). Bulusta, BGCA I-VI NP nükleik asit dizisi ile Sekans ID No. 4 olarak Ifade edilen dizi en az % Bulusta, BGCA I-VI NP'yi kodlayan amino asit dizilimleri ile Sekans ID No. 5 olarak ifade göstermektedir (Sekans ID No. 5). Bulusta, BGCA I-VI NP'yi kodlayan amino asit dizilimlerinin olusturdugu peptit ile Sekans ID benzerlik göstermektedir (Sekans ID No.6). Bulusta, BGCA V NP nükleik asit dizisi ile Sekans ID No. 7 olarak ifade edilen dizi en az % 70 Bulusta, BGCA V NP'yi kodlayan amino asit dizilimleri ile Sekans ID No. 8 olarak Ifade edilen (Sekans ID No. 8). Bulusta, BGCA V NP'yi kodlayan amino asit dizilimlerinin olusturdugu peptit ile Sekans ID No. benzerlik göstermektedir (Sekans ID No. 9). Bulusta, KKKAHV Türkiye/KelkitOö NP nükleik asit dizisi ile Sekans ID No. 10 olarak ifade göstermektedir (Sekans ID No. 10). Bulusta, KKKAHV Türkiye/Kelkit06 NP'yi kodlayan amino asit dizisi ile Sekans ID No. 11 göstermektedir (Sekans ID No. 11). Bir aslîidayII ilk kez denege verilmesi "prime", ayn Ellenege aslîidayII ikinci kez verilmesi deneklerin asilânmasßüsia homolog veya heterolog kombinasyonlar seklinde yapilâbilir. Burada kullan-[giElsekiIde, bir asi. uygulandlgllîlhayvan ya da insana "denek" adEl verilmektedir. Mevcut bulusta ayrlîb, nükleik asit dizisi için Sekans ID No.1 kullanllân BGCA V GPC içeren adenoviral vektör, prime ve prime boost asliâma için birlikte uygulanmlgtlîl Bu uygulama KKKAHV enfeksiyonuna karsüienekte yeterli immun yan. olusmaslßaglamßtlü Mevcut bulusta ayrlîia, nükleik asit dizisi için Sekans ID No.1 kullanilan BGCA V GPC içeren adenoviral vektör, prime asilâma için birlikte uygulanmlgtlîl Buna bagllîblarak prime boost asllâma için nükleik asit sekanslîliçin Sekans ID No.1 kullanüân BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ile nükleik asit sekansEiçin Sekans ID No.? kullanliân BGCA V NP içeren adenoviral vektör birlikte uygulanmlSIlE Bu uygulama KKKAHV enfeksiyonuna karsillenekte yeterli immun yan. olusmaslßaglamlgtlü Mevcut bulusta ayrlaa nükleik asit sekansElçin Sekans ID No.4 kullanilan BGCA I-VI NP kullanüân Türkiye/Kelkit06 NP içeren pET28'in prime boost asüâma için kullanHEKKKAHV enfeksiyonuna karsiJlienekte immun yan. olusmasIlEaglamlgtlE SekansID No.10 kullanilân Türkiye/Kelkit06 NP içeren pET28 ise prime boost olarak kullanilîhlgtlü BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör birlikte prime olarak, hücre kültürü tabanlEilnaktif asEI prime boost olarak kullanüBilgtlB Bu kombine uygulama KKKAHV enfeksiyonuna karsEl denekte yeterli immun yari- olusmaslßaglamlgtlü Bulus, BGCA V GPC, BGCA V NP veya BGCA I-VI NP'nin antijenik fragment olarak bir adenoviral vektör aracHJgiEile taslEtnasIIEaglar. Bu adenoviral vektör stabildir ve asilâmadan sonra bagsiZ olarak eksprese edilen BGCA V GPC, BGCA V NP veya BGCA I-VI NP antijenik fragmentlerin, denekte immun yanEIbrljittIEnasIßaglamlStlEI Bulus, Türkiye/Kelkit06 NP'nin antijenik fragment olarak bir bakteriyel vektör olan pET28 aracHJgEile eksprese edilen Türkiye/Kelkit06 NP'nin denekte immun yanElhrEbrttlÜnasIlIl saglamlsîtlîl Bulusta, BGCA V GPC fragmentlerinin 5' ucuna, XbaI (TCTAGA) ve BamHI (GGATCC) restriksiyon kesim bölgeleri yapay olarak eklenmistir. BGCA V GPC fragmentlerinin 3' ucuna XhoI (CTCGAG) ve KpnI (GGTACC) restriksiyon kesim bölgeleri yapay olarak eklenmistir (Sekans ID No. 1). Bulusta, BGCA V GPC fragmentlerinin 5' ucuna, KOZAC (GCCACC) DNA dizisi yapay olarak Bulusta, BGCA I-VI NP fragmentlerinin 5' ucuna, XbaI (TCTAGA) ve BamHI (GGATCC) restriksiyon kesim bölgeleri yapay olarak eklenmistir. BGCA I-VI NP fragmentlerinin 5' ucuna, XhoI (CTCGAG) ve KpnI (GGTACC) restriksiyon kesim bölgeleri yapay olarak eklenmistir (Sekans ID No. 4). Bulusta, BGCA I-VI NP fragmentlerinin 5' ucuna, KOZAC (GCCACC) DNA dizisi yapay olarak Bulusta, BGCA V NP fragmentlerinin 5' ucuna, XbaI (TCTAGA) ve BamHI (GGATCC) restriksiyon kesim bölgeleri yapay olarak eklenmistir. BGCA V NP fragmentlerinin 3' ucuna, XhoI (CTCGAG) ve KpnI (GGTACC) restriksiyon kesim bölgeleri yapay olarak eklenmistir (Sekans ID No. 7). Bulusta, BGCA V NP fragmentlerinin 5' ucuna, KOZAC (GCCACC) DNA dizisi yapay olarak Bulusta, Türkiye/Kelkit06 NP fragmentlerinin 5'ucuna BamHI (GGATCC) restriksiyon kesim bölgesi ve 3'ucuna XhoI (CT CGAG) restriksiyon kesim bölgesi yapay olarak eklenmistir. Bulus, BGCA V GPC, BGCA V NP veya BGCA I-VI NP'yi içeren adenoviral vektör bilesiminden olusan asmapsamaktadß Asilâma esnaletla, asüidaylarII dilüsyonunu yapmak için steril fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS; pH 7.2-7.4) kullanllüilgtü Bu asEadayIarII bilesiminde herhangi bir kimyasal adjuvan kullanmamlstlü Bulusta, hücre kültürü tabanlEihaktif aslEI imject alum (Alüminyum Hidroksit ve Magnezyum Hidroksit) ile karlStEIIârak hazlEllanmlgtE Bulusta, Türkiye/Kelkit06 NP içeren pET28 asEiadayElmject alum (Alüminyum Hidroksit ve Magnezyum Hidroksit) ile karlgtliîllârak hazlElanmlStlEl Bulus, KKKAHV enfeksiyonlari ve hastal[ElarI karsElmmün yanilîlolusturmak için insan veya hayvana uygulanabilen, BGCA V GPC, BGCA V NP veya BGCA I-VI NP ile formülize edilmis bir adenoviral vektörü kapsamaktadlE Olusan immün yan[ü T hücre aracDJJIi/eya B Bulusta, KKKAHV enfeksiyonlari ve hastaliEIarI karsEimmün yanllîlolusturmak için insan veya hayvana uygulanabilen, bakteriyel bir vektör olan pET28'de üretilen Türkiye/Kelkit06 NP antijeni kullanHIhIStlEl Olusan immün yanit'l T hücre araclIlElreya B hücre araclIlEJIabilir. Bulusta, KKKAHV enfeksiyonlari ve hastalilZlar- karsEimmün yanlüolusturmak için insan veya hayvana uygulanabilen, hücre kültürü tabanlEinaktif aslîkullanllüilgtlü Olusan immün yanlt] T hücre aracHJJSleya B hücre aracIDJIbIabilmektedir. Bulusta, immun yan[ElB hücre ve T hücre aracDJIilnmun yanüEllapsamaktadE Bulus, adenoviral vektör ile asllâma stratejisi saglar. BGCA V GPC içeren adenoviral vektör, bir denege asliâma yapüûiadan hemen önce BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile karlgtßlßßtß BGCA V GPC içeren adenoviral vektör, bir denege asilama yapilihadan hemen Önce BGCA V NP içeren adenoviral vektör ile karSIIEIJEI Bu çesitlilikte, esit hacimde mililitre baslEb esit infeksiyöz ünite (ifu/ml) bulunmaslîprensibi esas alünlgtlü Mevcut bulus, BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ile BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör karlgliîiiw prime ve prime boost olarak uygulama adIiIIarEkapsamaktadlE Prime boost asüâmanl bu homolog kombinasyonu, KKKAHV hastal[lZIarIEb ve enfeksiyonlar. karsü yeterli immun yan olusmas yol açmgtlB Mevcut bulus, BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ile BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör karlSlEiiII prime ve BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ile BGCA V NP içeren adenoviral vektör karlSIEJiIE prime boost olarak uygulama adIiIIarEkapsamaktadE Prime boost asllâmanl bu heterolog kombinasyonu, KKKAHV hastal[EIar. ve enfeksiyonlar. karsüreterli immun yan-olusmasi yol açmlgtE Mevcut bulus, BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ile BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör karlglînill prime ve hücre kültürü tabanlEinaktif asII prime boost olarak uygulama adIilarlEleapsamaktadE Prime boost asHâmanI bu heterolog kombinasyonu, KKKAHV hastalllîlar. ve enfeksiyonlar. karslîyeterli immun yan-olusmasi yol açmlgtlü Mevcut bulus, BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ile BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör karlSImII prime ve bakteriyel bir vektör olan pET28'de üretilen Türkiye/Kelkit06 NP antijenin prime boost olarak uygulama adIiIarIEkapsamaktadlEl Prime boost asliâmanl bu heterolog kombinasyonu, KKKAHV hastaliElar. ve enfeksiyonlar. karsEiyeterli immun Bulus, asüdaylarII deneklere uygulama zamanlarII planIEkapsamaktadlE Asüdaylarü bir denege 2-8 haftalilg araI[IZIarIa çoklu dozlarda tatbik edilmistir. Denekte yeterli immun yanührüilusturmak için dozlar araleiJEikllân arallgil süresi çok önemlidir. Mevcut bulusta, BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ile BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör karlglmüprime ve prime boost asüâmada kullanilüilstlîl Prime ve prime boost asilâma arasEUa 2-8 hafta aralEblEkilmlStE Mevcut bulusta, BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ile BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör karlgIEiEbrime aslßmada ve BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ile BGCA V NP içeren adenoviral vektör karlSlElilIprime boost asilâmada kullanilî'nlgtlü Prime ve prime boost asllâma araleda 2-8 hafta araliEIblükilBwlgtEl Mevcut bulusta, BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ile BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör karlglEiEprime asiiâmada, hücre kültürü tabanlEinaktif aslîprime boost asilâmada kullanilüîßtlü Prime ve prime boost asilâma arasIa 2-8 hafta araliElbIÜkilBüStEl Mevcut bulusta, BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ile BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör karlglüiü prime asilâmada ve bakteriyel bir vektör olan pET28'de üretilen Türkiye/Kelkit06 NP antijenin prime boost asiiâmada kullanilBiStlEl Prime ve prime boost asllâma arasIa 2-8 hafta araliEIbIîakiEnIStEI Mevcut bulus, asßdaylarlillil bir denege verilmesi gereken uygun miktarlarIEkapsamaktadlB Herhangi bir viral enfeksiyona karsEyeterIi immun yanlEEblusturmak için uygulanan miktar çok önemlidir. Mevcut bulusta, yeterli immun yaniEIljqusturmak için adenoviral vektör asüadaylarII uygulanmasügereken tam miktar belirlenmistir. Mevcut bulusta, prime boost olarak uygulandilîtan sonra yeterli immun yan[ü0lusturmak için, uygulanmaslîgereken bakteriyel bir vektör olan pET28'de üretilen Türkiye/Kelkit06 NP antijen miktarEliJelirlenmistir. Mevcut bulusta, prime boost olarak uyguland [Ktan sonra yeterli immun yaniüolusturmak için, uygulanmaslîgiereken hücre kültürü tabanllILhaktif asülniktarElJJelirlenmistir. Mevcut bulus, asII denege verilis yolunu kapsamaktadlîl BGCA V GPC, BGCA V NP, BGCA I- VI NP (prime veya prime boost olarak) içeren adenoviral vektör denege intramusküler (kas içi) olarak verilmistir. Prime boost olarak uygulanan hücre kültürü tabanlEinaktif aslîdenege intraperitonel (karlE içi) olarak verilmistir. Aynlîlsekilde bakteriyel bir vektör olan pET28'de üretilen Türkiye/Kelkit06 NP antijenin denege verilis yolu intraperitonealdir. Burada kullanI[g]|:$ekIi ile, canIEKKKAHV Türkiye/Kelkit06 susunun bir denege enjeksiyonu BGCA V GPC içeren rekombinant adenoviral vektörün olusturulmaslîl Bilinen tüm KKKAHV suslar. ait glikoprotein (GPC) amino asit sekanslarüGenBank veritabaniElclan allElnlgtE Virüs cografik dagm- göre 7 filogenetik gruba ayrilIhlStE Grup V, 25 KKKAHV susunu içermektedir (Sekil 3). 25 farklEIsusa ait amino asit sekanslarü Daha sonra bu amino asit sekansEtersine transle edilerek nükleik asit dizisi elde edilmis ve memeli hücrelerinde ekspresyonu için kodon optimizasyonu yapllfhßtüßekans ID No 1). BGCA V GPC fragmentlerinin 5' ucuna, XbaI (TCTAGA) ve BamHI (GGATCC) restriksiyon kesim bölgeleri yapay olarak eklenmistir. Benzer sekilde, BGCA V GPC fragmentlerinin 3' ucuna XhoI (CTCGAG) ve KpnI (GGTACC) restriksiyon kesim bölgeleri yapay olarak eklenmistir. Ayrlîla, bu fragmentlerin 5' ucuna, KOZAC (GCCACC) DNA dizisi yapay olarak eklenmistir. BGCA V GPC fragmenti yapay olarak sentezlenmis ve pShuttIe 2 ekspresyon vektörüne klonlanmlStE pShuttIe 2 vektörü,kullan[|ârak BGCA V GPC fragmenti amplifiye edilmistir. BGCA V GPC fragmenti In-Fusion klonlama reaksiyonu ile adenoviral vektöre (ticari olarak Clontech'ten temin edilmistir) klonlanmlgtlîl BGCA V GPC Içeren rekombinant adenoviral vektör Iipofectamine arac[l]]]lransfeksiyon reaktifi kullanüârak HEK-293 hücrelerine transfekte edilmistir. Titrasyonun arttlEllIhasülçin (infeksiyöz ünite/ml) HEK-293 hücrelerine BGCA V GPC içeren rekombinant adenoviral vektör ile birkaç kere enfeksiyon yapllIhlStEI BGCA V GPC içeren rekombinant adenoviral vektörün ekspresyonu Immunoblotlama ile dogrulanmlStlEl(Sekil 4A). KKKAHV'ye karslîcblusmus poliklonal tavsan serumu primer antikor olarak kullanllîhlsLtE Sekil 4A hat 3'te KKKAHV'in (Türkiye/Kelkit06) PEG presipite edilerek elde edilen viral antijenler immunoblotma ile belirlenmistir. Ekprese edilen glikoproteinin (GPC'nin) post-translasyonel modifikasyonlar sonucu olusan 75 kDa büyüklügündeki Gc ve 37 kDa büyüklügündeki Gn proteinlerini gösterilmistir (Sekil 4A, hat 3). Sekil 4A hat 2'de Türkiye/Kelkit06 GPC içeren adenoviral vektörün memeli hücrelerde üretilmesini sonraslZ] yapilan immunoblotlamada birden fazla protein ekspresyonu belirlenmistir. Bu proteinlerden bazüârüdenoviral vektör proteini ile çapraz reaksiyona girmis olabilir. KKKAHV GPC spesifik proteinleri olan 75 kDa büyüklügündeki Gc (klElnlîElokla isaretlenmis) ve 37 kDa büyüklügündeki Gn (mavi okla isaretlenmis) gösterilmistir (Sekil 4A, hat 2). Benzer sekilde, KKKAHV BGCA V GPC içeren adenoviral vektörün memeli hücrelerde üretilmesini sonrasIZl yapilan immunoblotlamada 75 kDa büyüklügündeki Gc (künlîßkla isaretlenmis) ve 37 kDa büyüklügündeki Gn (mavi okla isaretlenmis) proteinleri Sekil 4A hat 1'de gösterilmistir. Sonuç olarak, rekombinant BGCA V GPC içeren adenoviral vektör yap-E aynEpost-translasyonel modifikasyonlara ugradlgiüie Gc ve Gn glikoproteinlerini ürettigi belirlenmistir (Sekil 4A, hat BGCA I-VI NP içeren rekombinant adenoviral vektörün olusturulmasü Bilinen tüm KKKAHV suslar- (107 adet) ait nükleoprotein (NP) amino asit sekanslarEl GenBank veritabanIan allEmlgE Virüs cografik dagm- göre 6 filogenetik gruba ayrliîhßtIEI(Sekil 1). Her gruptaki konsensüs amino asit sekanslarEbirbirlerinden bagIislZI olarak belirlenmistir. 6 farklElgrubun, her birinin tüm konsensüs amino asit sekanslarü belirlendikten sonra, bu gruplarda yer alan sekanslarI tekrar homoloji analizleri yapllârak I- VI konsensüs amino asit dizisi tespit edilmistir. Bu konsensüs amino asit fragmenti BGCA I-VI NP olarak adlandEIlIhlgtlEl (Sekans ID No 5). Daha sonra bu amino asit sekansEtersine transle edilerek edilerek nükleik asit sekanslarlZleIde edilmis ve memeli hücrelerinde ekspresyonu için kodon optimizasyonu yapiliigtlüßekans ID No:4). BGCA I-VI NP fragmentlerinin 5' ucuna, XbaI (TCTAGA) ve BamHI (GGATCC) restriksiyon kesim bölgeleri yapay olarak eklenmistir. Benzer sekilde, BGCA I-VI NP fragmentlerinin 3' ucuna XhoI (CTCGAG) ve KpnI (GGTACC) restriksiyon kesim bölgeleri yapay olarak eklenmistir. Ayrlîia, bu fragmentlerin 5' ucuna, KOZAC (GCCACC) DNA dizisi yapay olarak eklenmistir. BGCA I-VI NP fragmenti yapay olarak sentezlenmis ve pShuttIe 2 ekspresyon vektörüne klonlanmlStE pShuttIe 2 vektörü,kullan[lârak BGCA I-VI NP fragmenti amplifiye edilmistir. BGCA I-VI NP fragmenti In-Fusion klonlama reaksiyonu ile adenoviral vektöre klonlanmStlB BGCA I-VI NP içeren rekombinant adenoviral vektör Iipofectamine araciIJIIIe transfeksiyon reaktifi kullanilarak HEK-293 hücrelerine transfekte edilmistir. Titrasyonun arttlEIBiasEiçin (enfeksiyöz birim/ml) HEK-293 hücrelerine BGCA I-VI NP içeren rekombinant adenoviral vektör ile birkaç kere enfeksiyon yapilBilStlEI BGCA I-VI NP içeren rekombinant adenoviral vektörün ekspresyonu, immunoblotlama ile dogrulanmlgtlEl(Sekil 4B). KKKAHV NP'ye karsljlnonoklonal fare antikoru primer antikor olarak kullaniiârak görüntüleme yapiIIhIStlEI Sekil 45 hat 1'de PEG presipite KKKAHV Türkiye/Kelkit06 55 kDa büyüklügündeki NP proteni gösterilmistir. Sekil 48 hat 2'de gösterilen BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör tarafIEUan 55 kDa büyüklügünde Nükleoproteinin eksprese edildigi belirlenmistir. 55 kDa büyüklügündeki bu proteinin varl[g]EBGCA I-VI NP'nin ekspresyonunu teyit etmektedir (Sekil 48, hat 2). BGCA V NP içeren rekombinant adenoviral vektörün olusturulmasiîi Bilinen tüm KKKAHV suslar- ait nükleoprotein (NP) amino asit sekanslarDGenBank veritabanIdan allütnlgtlü Virüs cografik dagülîii. göre 6 filogenetik alt gruba ayrilHiIStlEi (Sekil 1). Grup V, 29 farkIEKKKAHV susunu içermektedir (Sekil 2). 29 farklEtusa ait amino asit sekanslarlîlhizalanmlgve konsensüs amino asit dizisini içeren bölge belirlemistir (Sekans No 8). Daha sonra bu amino asit sekansütersine transle edilerek edilerek nükleik asit sekanslarüelde edilmis ve memeli hücrelerinde ekspresyonu için kodon optimizasyonu yapiIIhIStEIßekans ID No 7). BGCA V NP fragmentlerinin 5' ucuna, XbaI (TCTAGA) ve BamHI (GGATCC) restriksiyon kesim bölgeleri yapay olarak eklenmistir. Benzer sekilde, BGCA V NP fragmentlerinin 3' ucuna XhoI (CT CGAG) ve KpnI (GGTACC) restriksiyon kesim bölgeleri yapay olarak eklenmistir. Ayrlîla, bu fragmentlerin 5' ucuna, KOZAC (GCCACC) DNA dizisi yapay olarak eklenmistir. BGCA V NP fragmenti yapay olarak sentezlenmis ve pShuttIe 2 ekspresyon vektörüne klonlanmlStE pShuttIe 2 vektörü kullanilârak BGCA V NP fragmenti çogalttlîzhlStE BGCA V NP fragmenti In-Fusion klonlama reaksiyonu ile adenoviral vektöre klonlanmlStIE BGCA V NP içeren rekombinant adenoviral vektör Iipofectamine aracHJJItransfeksiyon reaktifi kullanilârak HEK-293 hücrelerine transfekte edilmistir. Titrasyonun arttiEllBiasEiçin (enfeksiyöz birim/ml) HEK-293 hücrelerine BGCA V NP içeren rekombinant adenoviral vektör ile birkaç kere enfeksiyon yapüüîßtlü BGCA V NP içeren rekombinant adenoviral vektörün ekspresyonu, Immunoblotlama ile dogrulanmlStlEl(Sekil 4D). KKKAHV NP'ye karslîrhonoklonal fare antikoru primer antikor olarak kullanilIhigtIE KKKAHV NP'ye karsülnonoklonal fare antikoru primer antikor olarak kullanüârak görüntüleme yapilIhlgtEl Sekil 4D hat 2'de PEG presipite KKKAHV Türkiye/Kelkit06 55 kDa büyüklügündeki NP proteni gösterilmistir. Sekil 4D hat 1'de gösterilen BGCA V NP Içeren adenoviral vektör tarafIan 55 kDa büyüklügünde Nükleoproteinin eksprese edildigi belirlenmistir. 55 kDa büyüklügündeki bu proteinin varliglElBGCA V NP'nin ekspresyonunu teyit etmektedir. Türkiye/KelkitOG NP içeren pET28 plazmidinin olusturulmasü Türkiye/Kelkitûö NP susuna ait nükleik asit sekansElGenbank veritabaniEtlan alErnStlü Türkiye/Kelkit06 NP fragmentinin E. call' temelli ekspresyon sistemi için kodon optimizasyonu yapilüilgtEl Daha sonra fragment yapay olarak sentezlenmis ve pUC57 vektörüne klonlanmlStE Fragmentin pET28 ekspresyon vektörüne klonlanmaslÃlapilüilgtlE Türkiye/Kelkit06 NP fragmentlerinin 5'ucuna BamHI (GGATCC) restriksiyon kesim bölgesi ve 3'ucuna XhoI (CT CGAG) restriksiyon kesim bölgesi yapay olarak eklenmistir. Bakteriyel bir vektör olan pET28'de üretilen Türkiye/Kelkit06 NP antijenin varllgEl immunoblotlama ile dogrulanmlStE (Sekil 4C hat 1). KKKAHV'ye karsEblusmus poliklonal tavsan serumu primer antikor olarak kullanllEüStlE Sekil 4C hat 2'de PEG presipite KKKAHV Türkiye/Kelkit06 55 kDa büyüklügündeki NP proteni gösterilmistir. 55 kDa büyüklügündeki bu proteinin varllgiIIpET28'de üretilen Türkiye/Kelkit06 NP antijenin varllgllliiieyit etmektedir. Hücre kültürü tabanlEinaktif KKKAHV asEII hazlîlanmasü patentte belirtildigi gibi aynlîprotokol izlenerek hazlEllanmlStlE Bos adenoviral vektörün hazlIlanmasEi Adenoviral bos vektör (Clontech), üretici talimat. (Clontech) göre dogrudan HEK-293 hücrelerine transfekte edilmistir. BasarIDIbir transfeksiyondan sonra, bos adenoviral vektör titrasyonunu arttlErlnak için birkaç kere enfeksiyon yaplE'ilSIIE AsEGruplarII Olusturulmasüie Immunizasyon Takvimi: Aslîietkinlik çalgnasütla, Tip-1 interferon ci ve [3 reseptör knockout (IFNAR ci/ß R-/- ) fare kullanDII'iStlEl Bu fare modeli, KKKAHV enfeksiyonuna duyarlIIEl Bir asEladayII ilk kez denege verilmesi "prime"; ayniItlenege asüdayll ikinci kez verilmesi "prime boos " olarak adlandEllIhaktadlElve burada aynESekilde kullanilIhlStE Prime boost, deneklerin asliânmaslîl sßsEUa homolog veya heterolog kombinasyonlar seklinde yapilâbilir. Bu deneyde homolog ve heterolog prime boost stratejisi kullanilBiEtEl Ilk immünizasyon (prime) her zaman BGCA V GPC ve BGCA I-VI içeren adenoviral vektör ile yapilüîlgtlü Homolog prime boost immünizasyon için BGCA V GPC ve BGCA I-VI içeren adenoviral vektör kullanllüilgtlEIUablo 1A). Heterolog prime boost immünizasyon için, 3 farklügirup kullanllIhlStB 1. Prime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA V NP içeren adenoviral vektör ile yapilân grup 2. Prime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu hücre kültürü tabanlülnaktif asEilIe yapilan 3. Prime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu Türkiye/Kelkit06 NP içeren pET28 ile yapüân grup Bütün gruplarda immünizasyon için 10'ar adet IFNAR ci/ß R-/- fare kullanilîhlgtü Kontrol grubunda bos adenoviral vektör ile immünizasyon için aynßekilde 7 adet IFNAR ci/ß R-/- fare kullanlliîßtlü Farelerin immünizasyonu, tüm rekombinant adenoviral aslIladaylarEIiçin mililitrede 3x107 infeksiyöz ünite (ifu/ml) kullanüârak intramusküler yapHB'iIStlE 7.5 ug hücre kültürü tabanlElnaktif asEkullanllârak prime boost immünizasyon, intraperitonel yapilEiIStlEl Benzer sekilde, pET28'de üretilen Türkiye/Kelkit06 NP antijeninden 12.5 ug kullanilarak prime boost immünizasyon, intraperitonel yapilBilstlE 3x107 ifu/ml miktarda BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ile esit miktarda BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör immünizasyondan hemen önce karlîstlEllöilStlEl 50 ul BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ile 50 pl BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör, karglînl için kullanllüîßtlü Her fare için immünizasyon dozu toplam 100 ul'dir ve iki farklEbölgeye, her bölgede 50 ul olacak sekilde intramusküler olarak uygulanmEtlEI Bu grupta prime boost immünizasyon benzer sekilde yapiIIhIStlB 3x107 ifu/ml miktarda BGCA V GPC Içeren adenoviral vektör ile esit miktarda BGCA V NP Içeren adenoviral vektör prime boost immünizasyondan hemen önce karlgtlElEnlStlB Karlgîni için her iki vektörden 50 pl kullanilB^ilStE Her fare için immünizasyon toplam miktarlILOOuI'dir ve iki farklEIiiölgeye, her bölgede 50 ul olacak sekilde intramusküler olarak uygulanmStE Prime boost immünizasyon için, 7.5 ug hücre kültürü tabanlEinaktif asEkullanilÜilStlEl Ayrlîla, prime boost immünizasyon için pET28'de üretilen Türkiye/Kelkit06 NP antijeninden 12.5 ug kullanilEiStlE Her fare 4 hafta aralllZIarIa adenoviral rekombinant asilârla iki kere immünize edilmistir. Ilk immünizasyon (prime) 0. günde ve ikinci immünizasyon (prime boost) 28. günde yapiIIhlSIB Ikinci immünizasyondan 4 hafta sonra (56. günde) (400 Ilk immünizasyondan iki hafta sonra farelere, hücre kültürü tabanlElnaktif asIZi/e pET28'de Üretilen Türkiye/Kelkit06 NP antijeni ile prime boost asilâma yapÜIhlstlü Prime boost immünizasyondan iki hafta sonra (42. günde) KKKAHV ile eprüvasyon yapilBilgtlE Ilk immünizasyondan önce, ikinci immünizasyonda (27. günde) ve KKKAHV eprüvasyonundan önce (55. günde) serolojik testlerin yapilIhasEi/e serumda sitokin profilinin belirlenmesi için farelerden kan örnekleri toplanmlgtlE Hücre kültürü tabanIEinaktif asüie pET28'de üretilen Türkiye/Kelkit06 NP antijeni ile immünize edilen farelerden 41. günde (KKKAHV eprüvasyonundan önce) farelerden örnekleri toplanmStIE KKKAHV eprüvasyonunun yapIigEl günden 14. güne kadar, farelerin vücut lelakIilZIarljie vücut aglEIliIZlarEölçülmüstür. KKKAHV eprüvasyonundan 14 gün sonra, viral genom analizinin yapllâbilmesi için farelerin karacigerleri alütnlgtlü Deneysel protokol Tablo 1A ve IB'de gösterilmistir. Hayvan sag-kaIIEi oranlarlB Kaplan-Meier grafigi KKKAHV eprüvasyonundan sonra hayvan sag kaIIi oranlarIEl göstermektedir. Asilânmlgl gruplardaki fareler Ietal KKKAHV eprüvasyonundan %100 korunmustur (Sekil 5A, B). KKKAHV eprüvasyonundan 5 gün sonra kontrol grubundaki fareler ölmüstür (Sekil 5A, B). KKKAHV eprüvasyonundan 4 gün sonra kontrol grubundaki farelerin Asllânmlsîl gruplardaki fareler hastallgiüiliskin herhangi bir klinik bulgu veya semptom göstermemistir (Sekil 6A, B). Bunun aksine, kontrol gruplarüKKKAHV eprüvasyonunun ikinci gününde virüs spesifik bulgular ve semptomlar göstermeye baslamlgtEl(SekiI 6A, B). Kontrol grubu KKKAHV eprüvasyonundan 5 gün sonra deneysel sonlanIi noktas- ulasmlStlB SlBakIEIi ve vücut aglIlüi ölçümleri: AsilânmEtüm gruplar için KKKAHV eprüvasyonundan sonra vücut lethiElölçüm grafigi sabit kalmStE(Sekil 7A, B). Buna karsilIEl KKKAHV eprüvasyonundan 3 gün sonra, kontrol grubu farelerinin vücut lelakIiIZlarEl hEIa düsmeye baslamlStE (Sekil 7A, B). KKKAHV eprüvasyonundan sonra, asilânmlg gruplardaki farelerin vücut agIEllllZIarlüda azalma görülmemistir (Sekil 8A, B). Diger taraftan, KKKAHV eprüvasyonundan 2 gün sonra, farelerinin vücut aglîllilîlarüazalmaya baslamigtlEl(Sekil 8A, B). Eprüvasyon sonrasEfareIerin vücut sEaklilZlarIaki kaç ÜC`Iik degisim oldugu Sekil 9A ve 98`de gösterilmistir. AyrlEla, bütün gruplarda kullanllân farelerin bireysel lelakllEI ve vücut aglEIIIEJ ölçümleri Sekil 10A- 12E'de verilmistir. Asühnmlîslve kontrol grubu fare karacigerlerinde viral genomun saptanmasEl Bu deney için 4 asllânmlglgrup ve 1 kontrol grubu fare karacigeri kullaniIIhlgIE 1. Prime ve prime boost immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile yapilân grup - Grup 1 2. Prime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA V NP içeren adenoviral vektör ile yapilân grup - Grup 2 3. Prime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu hücre kültürü tabanllîilnaktif asEille_yapllân 4. Prime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost_immünizasyonu pET28'de üretilen Türkiye/Kelkit06 NP antijeni ile yapilân grup - Grup 4 . Prime ve prime boost immünizasyonu bos adenoviral vektör ile yapliân grup Asllânan gruplardaki farelerin karacigerleri, KKKAHV eprüvasyonundan sonra 14. günde, kontrol grubundaki farelerin karacigerleri ise eprüvasyondan sonra 3. günde toplanmlgtlE KKKAHV eprüvasyonundan 5 gün sonra tüm fareler ölmüstür. RNeasy midi kiti (Qiagen) kullanllârak RNA ekstraksiyonu ve viral genomu tespit etmek için KKKAHV RT-PCR kiti (Altona) kullanilârak Tersine Transkripsiyon-Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) yapilIhStB Asüânan fareler gruplarIaki (grup 1, 2, 3, 4) farelerin karacigerinde KKKAHV genomu saptanamamEtE Bunun aksine, kontrol grubu fare karacigerinde KKKAHV genomu tespit edilmistir. 1. Prime ve prime boost immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile yapilan grup 2. Prime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA V NP içeren adenoviral vektör ile yapliân grup Bu grupta KKKAHV antijenlerine karsüilusan serum IgG yanlflhrIEllest etmek için enzim baglEl immünosorbent (ELISA) testi kullanllîzhlgtlü Ilk immünizasyondan önce, 27. günde (2. prime boost immünizasyondan önce) ve 55. günde (KKKAHV eprüvasyonundan önce) serumlar toplanmlgtlîl Ilk immünizasyondan (prime) sonra, farelerde, bir miktar KKKAHV'ye özgü IgG antikor olusmustur (Sekil 13A, B). Prime boost asllâmadan sonra serum IgG düzeyinde önemli ölçüde artlglgözlenmistir (Sekil 13A, B). Gruplar arasiaki istatistiksel karsüâstlîilna, Mann-Whitney U testi ile yapilüilgtlüve P degeri kabul edilmistir. 3. Prime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu hücre kültürü tabanlEilnaktif asEiIe yapllân 4. Prime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu pET28'de üretilen Türkiye/Kelkit06 NP antijeni ile yapllân grup Ilk immünizasyondan önce, 27. günde (2. prime boost immünizasyondan önce) ve 41. günde (KKKAHV eprüvasyonundan önce) serumlar toplanmlgtlîl Ilk immünizasyondan (prime) sonra, farelerde KKKAHV'ye özgü IgG antikor olusmustur (Sekil 13C, D). Hücre kültürü tabanlIZl inaktif asüile prime boost asllâmadan sonra, serum IgG düzeyinde önemli ölçüde artlgl gözlenmistir (Sekil 13 C). Buna ragmen, diger gruplara göre pET28'de üretilen Türkiye/Kelkit06 NP antijeni ile asllâma yapüân grupta KKKAHV antijenlerine karsl3erum IgG düzeyinde artElgörüImemistir (Sekil 13D). Bu nedenle, grup 1, 2 ve 3'te KKKAHV'ye karslîslon elde edilen IgG titreleri, grup 4` den daha yüksektir (Sekil 14). Nötralizasyon Testi Asllânan her gruptan serumlar toplanmlStE Asllânan 4 gruptan her birinde 10 adet fare bulunmaktadlE -Prime ve prime boost immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile yapHân grup - Grup 1 -Prime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA V NP içeren adenoviral vektör ile yapliân grup - Grup 2 -Prime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu hücre kültürü tabanlEilnaktif asEille yapllân -Prime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu pET28'de üretilen Türkiye/Kelkit06 NP antijeni ile yapilân grup - Grup 4 Bos adenoviral vektör ile astlânan farelerin serumlarElkontrol grubu olarak kullanilIhIStlEl Grup 1 ve Z'den, 27. günde (2. immünizasyondan önce) ve 55. günde (KKKAHV eprüvasyonundan önce) serumlar toplanmlgtß AyrlG, Grup 3 ve 4'den, 27. günde (2. immünizasyondan önce) ve 41. günde (KKKAHV eprüvasyonundan önce) serumlar toplanmlStE Kontrol grubundan 27. ve 55. günde serumlar toplanmlStlEl Grup 1 ve 2'de ilk immünizasyondan sonra nötralizan antikorlar olusmustur (Sekil 15A, B). 27. günde toplanan serumlarda nötralizan antikor titresinin kontrol grubuna klýlasla daha yüksek oldugu belirlenmistir (Sekil15A, B). Nitekim 2. immünizasyondan sonra fare serumlardaki nötralizan antikor titresi, 27. günde toplanan serumlardan daha yüksek bulunmustur. Grup 3'teki immünize farelerde kontrol grubundakilere göre daha yüksek nötralizan antikor olusmustur (Sekil 15C). Hücre kültürü tabanlEinaktif asEile prime boost asllâmadan sonraki 41. günde nötralizan antikor titresi 27. güne klsîlasla daha yüksek düzeyde bulunmustur (Sekil 15C). Grup 4'teki farelerde, prime immünizasyon BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I- VI NP içeren adenoviral vektör ile yapIlthan sonra, diger gruplarda oldugu gibi bir miktar nötralizan antikor olusmustur (Sekil 15D). Buna ragmen, pET28'de üretilen Türkiye/Kelkit06 NP antijeni ile prime boost immünizasyon yap-[Etan sonra, nötralizan antikor olusumu gözlenmemistir (Sekil 15D). Asühnmlgl farelerden alIan serumlarda proinflamatuar sitokin yanIIIarII Th1/Th2 paneli kullanEBirak analiz edilmesi Sitokin profil analizi için asagi belirtilen gruplardan serumlar toplanmlgtlE 1. Prime ve prime boost immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile yapllân grup - Grup 1 2. Prime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA V NP içeren adenoviral vektör ile yapüân grup - Grup 2 3. Prime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu hücre kültürü tabanlEiinaktif aslîile yapllân 4. Prime immünizasyonu BGCA V GPC içeren adenoviral vektör ve BGCA I-VI NP içeren adenoviral vektör ile; prime boost immünizasyonu pET28'de üretilen Türkiye/Kelkit06 NP antijeni ile yapllân grup - Grup 4 Bos adenoviral vektör ile asllânan fare serumlarlZl(55. günde toplanan) ve farelerden immünizasyon öncesi alin serumlar kontrol grubu olarak kullanilBilStlEl Grup 1 ve 2 için, 55. günde (KKKAHV eprüvasyonundan önce) toplanan serumlar sitokin profil analizinde kullaniIIhStIEl Grup 3 ve 4 için, 41. günde (KKKAHV eprüvasyonundan önce) toplanan serumlar sitokin profil analizinde kullanHBilgtlE Gruplar araleUaki istatistiksel klýaslama, Mann-Whitney U testi ile yapllîhlgtlîlve P degeri <0.01 olanlar istatistiksel olarak anlamlEl kabul edilmistir. Interferon y (IFN-y)- IFN-y düzeyi, Grup 1, 2, 3 ve 4'te kontrol gruplarlEla göre önemli ölçüde yüksek seviyede bulunmustur (Sekil 16A, B). Tümör Nekrozis Faktör ci (TNF-u)- TNF-o düzeyi, asüânmlglgruplarda kontrol gruplar. göre, önemli ölçüde yüksek seviyede bulunmustur (Sekil 17A, B). kontrol gruplarIEla göre önemli ölçüde yüksek seviyede bulunmustur (Sekil 18A). Prime boost immünizasyonu hücre kültürü tabanlüinaktif asEIiIe yapllân gruptaki ve prime boost immünizasyonu pET28'de üretilen Türkiye/Kelkit06 NP antijeni ile yaplßn gruptaki fare serumlarIa, bos adenoviral vektör ile immünize edimis fare serumlarlEla göre, IL-12p70 düzeyi yüksek bulunmamgtlEI(Sekil 18B). Interlökin 2 (IL-2)- IL-2 düzeyi, Grup 1 ve Z'den toplanan serumlarda kontrol grubuna göre önemli ölçüde yüksek seviyede bulunmustur (Sekil 19A). Prime boost immünizasyonu pET28'de üretilen Türkiye/Kelkit06 NP antijeni ile yapüân gruptaki (grup 4) fare serumlaria, Grup 3'teki ve kontrol gruplarlEUaki serumlara göre IL-2 düzeyi önemli ölçüde yüksek seviyede bulunmustur (Sekil 19B). AynElsekiIde Grup 3'ten toplanan serumlarda kontrol gruplar. göre IL-2 düzeyi, anlamlülerecede yüksek bulunmustur. Interlökin 4 (IL-4)- IL-4 düzeyi, Grup 1, 2, 3'te kontrol gruplarIEla göre önemli ölçüde yüksek seviyede bulunmustur (Sekil 20A). Prime boost pET28'de üretilen Türkiye/Kelkit06 NP antijeni ile yapüân gruptaki (grup 4) fare serumlarIda kontrol gruplar. göre, IL-4 düzeyi yüksek bulunmamlStEl(Sekil ZOB). Interlökin 10 (IL-10)- IL-10 düzeyi, Grup 1, 2, 3'te kontrol gruplarlEla göre önemli ölçüde yüksek seviyede bulunmustur (Sekil 21A, B). Buna ragmen, Grup 4'te kontrol gruplarlEla göre, IL-10 düzeyi yüksek bulunmamlgtEI(Sekil 21A, B). TR