JP6291467B2 - 組換えウイルス発現のためのプロモーター - Google Patents

Description

本発明は、ポックスウイルス、特に改変ワクシニアウイルスアンカラ（Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）などのワクシニアウイルスにおける遺伝子のタンパク質発現の新規なプロモーターに関する。本発明はさらに、前記プロモーターを含むポリヌクレオチド、特に、前記プロモーターおよび発現させようとする核酸を含むポリヌクレオチド、それを含むベクター、前述のコンストラクトを含む宿主細胞、ならびに前述のもののいずれかを含む組成物にも関する。本発明はさらに、核酸、好ましくは遺伝子を発現させるための前述のコンストラクトのいずれかの使用、様々な疾患を治療および／または予防するための医薬を調製するための前述のコンストラクトの使用、様々な疾患を治療および／または予防する方法、前述のコンストラクトを使用する（ｉｍｐｌｅｍｅｎｔ）、ポリペプチドを調製する方法、ならびに前述のコンストラクトの内のいくつかを使用する、核酸を発現させる方法にも関する。

組換えポックスウイルスは、感染細胞において外来抗原を発現させるために広く使用されている。さらに、組換えポックスウイルスは、ポックスウイルスベクターから発現させた外来抗原に対する免疫応答を誘導するための非常に有望なワクチンである。最も普及しているのは、一方ではアビポックスウイルスであり、他方では、ワクシニアウイルス、特に改変ワクシニアウイルスアンカラ（「ＭＶＡ」）である。ＭＶＡは、ワクシニアウイルスに関連しており、ポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）科のオルソポックスウイルス（Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）属のメンバーである。

ＭＶＡは、ワクシニアウイルスのアンカラ株（ＣＶＡ）をニワトリ胚線維芽細胞において５１６回連続的に継代培養することによって作製された（概要については、Ｍａｙｒら（１９７５）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ３、６〜１４を参照されたい）。これらの長期に渡る継代培養の結果として、得られたＭＶＡウイルスは、そのゲノム配列の約３１キロベースを欠失しており、したがって、トリ細胞に著しく宿主細胞が限定されていると説明された（Ｍｅｙｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．７２、１０３１〜１０３８）。様々な動物モデルにおいて、得られたＭＶＡは、かなり無毒性であることが示された（ＭａｙｒおよびＤａｎｎｅｒ（１９７８）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．４１、２２５〜３４）。さらに、このＭＶＡ株は、ヒト天然痘疾患に対して免疫性を与えるためのワクチンとして臨床試験で試験されている。

ポックスウイルスにおける異種遺伝子の発現のためには、ごく少数のプロモーターしか公知ではなく、例えば、３０Ｋプロモーターおよび４０Ｋプロモーター（例えば、ＵＳ５，７４７，３２４を参照されたい）、強力な合成の初期／後期プロモーター（例えば、Ｓｕｔｔｅｒら（１９９４）Ｖａｃｃｉｎｅ １２、１０３２〜１０４０を参照されたい）、Ｐｒ７．５プロモーター（７．５Ｋプロモーター、例えば、Ｅｎｄｏら（１９９１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ ７２、６９９〜７０３を参照されたい）、ならびに牛痘ウイルスＡ型封入体（ＡＴＩ）遺伝子に由来するプロモーター（ＰｒＡＴＩ、Ｌｉら（１９９８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７９、６１３）である。これらのプロモーターはすべて、異種遺伝子を発現させるために組換えワクシニアウイルスにおいて使用されており、前記遺伝子を発現させて、異種遺伝子にコードされるタンパク質の産生をもたらすことが示された。しかし、ワクシニアウイルスにおける代替のプロモーター、具体的には強力なプロモーターが依然として一般に必要とされている。

したがって、ＭＶＡは、ワクチン、ならびに多量の組換えタンパク質を作製するための
発現系として広く使用されている。特にワクチンとしての用途において、誘発される所望の免疫応答は、ＭＶＡを含有するワクチンの投与後に産生されるタンパク質の量に部分的に依存するため、高レベルの抗原を産生することが望ましい。これまで、タンパク質の所望の免疫原性の強化は、いくつかの方法で達成されている。第１に、裸の（ｎａｋｅｄ）抗原タンパク質をワクチンとして投与する場合、より多量の関連するタンパク質が、ワクチン接種しようとする対象に導入され得る。組換え発現系に基づいたワクチン、すなわち、例えば、ＭＶＡなどのポックスウイルスベクターにおいてコード核酸が投与され、この核酸から発現されたタンパク質によって実際の免疫応答が誘発されるワクチンにおいて、抗原の転写を促進することによって免疫原性を強化することもまた、可能である（Ｗｙａｔｔら（２００８）Ｖａｃｃｉｎｅ ２６、４８６〜４９３）。また、既に転写されたＲＮＡの翻訳を促進することも可能である。最後に、免疫原性は、免疫系への抗原提示を促進することによって強化することができる。

特にワクチンとして使用するためのウイルス組換え発現系を設計する際に頻繁に遭遇する１つの問題は、これらのコンストラクトがしばしば、核酸レベルで安定性を欠くことである。さらに、核酸は、ウイルスベクター内で望ましくない組換えを受けることが頻繁にあり、これにより、ワクチン接種された宿主において所望の免疫原性ペプチドをウイルスベクターが産生する能力がしばしば低下し、場合によっては抑止さえされてしまう。

したがって、十分な免疫原性応答を誘発するために必要な、程度の高いタンパク質発現を保持しつつ、これらの問題を克服することが目的である。

本発明の１つの態様は、
（ａ）配列番号１に記載するヌクレオチド配列を有する核酸（それぞれ「ＰｒＳＳＬ」）、
（ｂ）（ａ）に記載した核酸に由来するヌクレオチド配列を有する核酸であって、（ａ）のヌクレオチド配列と比べて少なくとも１つのヌクレオチド付加、欠失、置換、および／または逆位（ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）を含み、かつ（ａ）の核酸と本質的に同じ発現特性を有する核酸、
（ｃ）（ａ）の核酸と少なくとも７０％の同一性を有し、かつ（ａ）の核酸と本質的に同じ発現特性を有する核酸配列、ならびに
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の核酸配列にハイブリダイズすることができ、かつ（ａ）の核酸と本質的に同じ発現特性を有する核酸
からなる核酸の群から選択されるプロモーターを提供する。

好ましくは、プロモーターは、２７以下のヌクレオチド長を有する。

好ましくは、プロモーターは、配列番号３３または配列番号３４に記載するヌクレオチド配列を有する。

本発明の別の態様は、上記のプロモーターを含むポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、ポリヌクレオチドは、プロモーターのほかに、＋１位以降に（ｆｒｏｍ）付加される別のヌクレオチドも含んでよい。

好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号２、３、４、または５に記載するヌクレオチド配列を有する。

本発明の別の態様は、前述のプロモーターまたは前述のポリヌクレオチドおよび発現させようとする核酸を含むポリヌクレオチドを提供する。

本発明の別の態様は、前述のプロモーターまたはポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

別の態様において、本発明は、前述のプロモーター、前述のポリヌクレオチド、および／または前述のベクターを含む宿主細胞を提供する。

本発明の別の態様は、前述のプロモーター、前述のポリヌクレオチド、前述のベクター、および／または前述の宿主細胞を含む組成物を提供する。

別の態様において、本発明は、ワクチンにおいて使用するための、前述のプロモーター、前述のポリヌクレオチド、前述のベクター、前述の宿主細胞、および／または前述の組成物を提供する。

本発明の別の態様は、核酸、好ましくは遺伝子を発現させるための、前述のプロモーター、前述のポリヌクレオチド、前述のベクター、前述の宿主細胞、および／または前述の組成物の使用を提供する。

本発明の別の態様は、薬剤としての、前述のプロモーター、前述のポリヌクレオチド、前述のベクター、前述の宿主細胞、および／または前述の組成物を提供する。

本発明の別の態様は、免疫応答を誘導するため、または癌および／もしくは感染症を治療もしくは予防するための医薬の調製における、前述のプロモーター、前述のポリヌクレオチド、前述のベクター、前述の宿主細胞、および／または前述の組成物の使用を提供する。

本発明の別の態様は、免疫応答を誘導するため、または癌および／もしくは感染症を治療もしくは予防するための、前述のプロモーター、前述のポリヌクレオチド、前述のベクター、前述の宿主細胞、および／または前述の組成物を提供する。

別の態様において、本発明は、
（ａ）前述のポリヌクレオチドを提供するステップであって、発現させようとする核酸配列がオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）または部分的ＯＲＦを含むステップと、
（ｂ）発現させようとする核酸の転写および翻訳の助けとなる条件に（ａ）のポリヌクレオチドを供するステップと、
（ｃ）ポリペプチドを回収するステップと、
（ｄ）場合によってはポリペプチドを精製するステップと
を含む、ポリペプチドを調製する方法を提供する。

本発明の別の態様は、発現させようとする核酸を含むポリヌクレオチドを提供するステップと、発現させようとする核酸に作動可能に連結された前述のプロモーターまたはこのプロモーターを含むポリヌクレオチドを提供するステップと、核酸の発現の助けとなる条件に、このようにして提供されたヌクレオチドを供するステップとを含む、核酸を発現させる方法を提供する。

本発明の別の態様は、前述のプロモーター、前述のポリヌクレオチド、前述のベクター、前述の宿主細胞、および／または前述の組成物を提供するステップと、ヒトを含む対象
動物に組成物を投与するステップとを含む、免疫応答を誘導するための方法、または癌および／もしくは感染症を治療もしくは予防するための方法に関する。

ａｒａＣ（アラビノシルシトシン、ＤＮＡ合成の阻害剤）を伴う場合および伴わない場合のＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）対照と比較した、初期／後期プロモーターＰｒＳ、ＰｒＳＳＬ（配列番号１）、および後期プロモーター阻害物質ａｒａＣの様々な組合せの存在下でのタンパク質オボアルブミン（「ＯＶＡ」）の発現を示す図である。市販の定量用オボアルブミン特異的ＥＬＩＳＡ（ＳＥＲＡＭＵＮ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ）を用いて発現を測定し、市販のＢＣＡアッセイ（ＵＰＴＩＭＡ）を用いて全タンパク質を測定する。発現の値は、全タンパク質１ｍｇ当たりのオボアルブミン発現量（μｇ）として算出する。棒１：ＰｒＳ−ＯＶＡ＋ａｒａＣ。棒２：ＰｒＳ−ＯＶＡ。棒３：ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ＋ａｒａＣ。棒４：ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ。棒５：ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）（対照の空ベクター）＋ａｒａＣ。棒６：ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）（対照の空ベクター）、ａｒａＣ無し。Ｙ軸は、全細胞タンパク質１ｍｇ当たりのオボアルブミン発現量（μｇ）を表し、数が大きいほど、より多くのタンパク質産生、すなわち、より高い発現を表す。ＭＶＡにおけるオボアルブミンタンパク質の発現にはプロモーターが必要であり、ＰｒＳＳＬのほかには他のプロモーターが存在しなかったため、棒４（ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ）は、プロモーターとしての配列番号１の活性を示す。ａｒａＣはＭＶＡ生活環の後期にプロモーター活性を阻害するが初期には阻害しないことが公知であるため、棒３（ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ＋ａｒａＣ）は、後期プロモーターとしての配列番号１の活性を示す。 ａｒａＣ（アラビノシルシトシン、ＤＮＡ合成の阻害剤）を伴う場合および伴わない場合のＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）対照と比較した、ＰｒＳＳＬまたはフィラー配列のいずれかを伴うＰｒ７．５プロモーターおよびＰｒ７．５ｅプロモーター、ならびに後期プロモーター阻害物質ａｒａＣの様々な組合せの存在下でのタンパク質オボアルブミン（「ＯＶＡ」）の発現を示す図である。市販の定量用オボアルブミン特異的ＥＬＩＳＡ（ＳＥＲＡＭＵＮ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ）を用いて発現を測定し、市販のＢＣＡアッセイ（ＵＰＴＩＭＡ）を用いて全タンパク質を測定する。発現の値は、全タンパク質１ｍｇ当たりのオボアルブミン発現量（μｇ）として算出する。ＰｒＳＳＬは、配列番号１のプロモーターを示す。棒１：Ｐｒ７．５−フィラー−ＯＶＡ＋ａｒａＣ。棒２：Ｐｒ７．５−フィラー−ＯＶＡ。棒３：Ｐｒ７．５−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ＋ａｒａＣ。棒４：Ｐｒ７．５−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ。棒５：Ｐｒ７．５ｅ−ＯＶＡ＋ａｒａＣ。棒６：Ｐｒ７．５ｅ−ＯＶＡ。棒７：Ｐｒ７．５ｅ−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ＋ａｒａＣ。棒８：Ｐｒ７．５ｅ−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ。棒９：ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）（対照の空ベクター）＋ａｒａＣ。棒１０：ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）（対照の空ベクター）、ａｒａＣ無し。Ｙ軸は、全細胞タンパク質１ｍｇ当たりのオボアルブミン発現量（μｇ）を表し、数が大きいほど、より多くのタンパク質産生、すなわち、より高い発現を表す。棒２（Ｐｒ７．５−フィラー−ＯＶＡ）と比較した棒４（Ｐｒ７．５−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ）、ならびに棒６（Ｐｒ７．５ｅ−フィラー−ＯＶＡ）と比較した棒８（Ｐｒ７．５ｅ−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ）から、他のプロモーターと組み合わせたＰｒＳＳＬが、レポーター遺伝子ＯＶＡの発現を促進することが示される。実施例３のように、ａｒａＣの実験的添加により、融合されたプロモーターに対するＰｒＳＳＬの相加作用が消失するため、ＰｒＳＳＬの発現特性は後期である。「フィラー」とは、ランダムなＧＣリッチ配列ＴＴＣＡＧＴＣＣＴＡＴＧＧ（配列番号６）を示し、これは、プロモーターとしてのＰｒＳＳＬの活性を与えずに試験した他のコンストラクトにおいてＰｒＳＳＬとほぼ同じ空間を占める対照としてＰｒＳＳＬを置き換えることが意図される。 ＰｒＳＳＬと比較した、牛痘ウイルス（Ｃｏｗｐｏｘｖｉｒｕｓ）に由来する周知の強力な後期プロモーターであるＰｒＡＴＩの存在下での組換えＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）からのタンパク質オボアルブミン（「ＯＶＡ」）の発現を示す図である。市販の定量用オボアルブミン特異的ＥＬＩＳＡ（ＳＥＲＡＭＵＮ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ）を用いて発現を測定し、市販のＢＣＡアッセイ（ＵＰＴＩＭＡ）を用いて全タンパク質を測定する。発現の値は、ＰｒＡＴＩ−フィラー−ＯＶＡ（棒１）の発現に対する倍率ｘとして算出する。棒１：ＰｒＡＴＩ−フィラー−ＯＶＡ。棒２：ＰｒＡＴＩ−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ（ＰｒＳＳＬは、配列番号１のプロモーターに対応する）。Ｙ軸は、オボアルブミン発現の倍率ｘを表し、数が大きいほど、より多くのタンパク質産生、すなわち、より高い発現を表す。ＰｒＡＴＩプロモーターにＰｒＳＳＬ配列を融合することにより、ＰｒＡＴＩのみを使用した場合に観察された発現と比較して１４倍高いオボアルブミン発現がもたらされたことから、ＰｒＳＳＬがＭＶＡにおいて強力なプロモーターであることが示される。

（表１）配列番号１に示されるプロモーターの決定。２４種のＭＶＡ遺伝子に由来する開始コドンの周囲の領域のアライメントにより、高レベルの発現タンパク質が生じると想定された。表の下の最初の２つの行は、配列中の各位置において最も多く出現するヌクレオチド、およびこのヌクレオチドの出現率を示す。表の下の最後の２つの行は、配列中の各位置において２番目に多く出現するヌクレオチド、およびこのヌクレオチドの出現率を示す。列の下の空白箇所は、２５％未満の出現率を意味する。所与の位置における２つのヌクレオチドは、その所与の位置におけるこれらのヌクレオチドの出現率が同一であることを示す。表１は、実施例の最後に含まれる。

前述したように、１態様において、本発明は、
（ａ）配列番号１に記載するヌクレオチド配列を有する核酸（それぞれ「ＰｒＳＳＬ」）、
（ｂ）（ａ）に記載した核酸に由来するヌクレオチド配列を有する核酸であって、（ａ）のヌクレオチド配列と比べて少なくとも１つのヌクレオチド付加、欠失、置換、および／または逆位を含み、かつ（ａ）の核酸と本質的に同じ発現特性を有する核酸、
（ｃ）（ａ）の核酸と少なくとも７０％の同一性を有し、かつ（ａ）の核酸と本質的に同じ発現特性を有する核酸配列、ならびに
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の核酸配列にハイブリダイズすることができ、かつ（ａ）の核酸と本質的に同じ発現特性を有する核酸
からなる核酸の群から選択されるプロモーターを提供する。

好ましくは、プロモーターは、２７以下のヌクレオチド長を有する。

本発明は、配列番号１に記載する配列および関連する配列が、ポックスウイルス系、特にワクシニアウイルス系、特にＭＶＡにおける遺伝子発現の後期プロモーターとして効率的に機能するという驚くべき発見に基づいている。「後期プロモーター」という用語は、ウイルスＤＮＡ複製が起こった後に活性である任意のプロモーターを意味する。本発明のプロモーターは、長さが非常に短いために、プロモーターとして独特である。例えば、配列番号１（ＰｒＳＳＬ）、配列番号３３、または配列番号３４は、わずか１６個のヌクレオチドを含み、したがって、他の公知のワクシニアプロモーターよりも、長さがはるかに短い。この極端な短さは、他の公知のワクシニアウイルスプロモーターよりも優れたいくつかの明瞭な利点を意味する。

第１に、核酸配列の安定性は、一般にその長さに反比例する。したがって、長い核酸配列ほど、ｉｎ ｖｉｖｏでの安定性が低いことが一般に予想され、短い核酸配列ほど、ｉｎ ｖｉｖｏで高い安定性を示すことが一般に予想される。プロモーターは一般に、ワクシニアにおける組換え発現系の必須エレメントであるため、遺伝子コンストラクトの所望の発現を失うことなくプロモーターを除外することはできない。したがって、本発明者らは、ＰｒＳＳＬおよび関連するプロモーター配列中のこの必須プロモーターエレメントの
サイズを大きく減らすことによって、結果として生じる遺伝子コンストラクトの安定性を大きく改善し、それによって、時間とともに減弱しないｉｎ ｖｉｖｏでの継続的な高い発現レベルを確保した。

第２に、ＰｒＳＳＬおよび配列番号１と本質的に同じ発現特性を有する関連する配列の方が、それぞれ、他の公知のプロモーターよりも、ワクシニア中の伸長された発現カセットの一部として合成するのが容易である。

さらに、２つの遺伝子間の相同組換えの頻度は、２つの連鎖遺伝子間の距離に比例することが一般に公知である。さらに、所与の配列内の各ヌクレオチドは、ある一定の統計学的組換え確率を伴っているため、より長い相同配列ほど、より多くのヌクレオチドを含むために、不安定ウイルスまたは非機能的ウイルスを潜在的にもたらし得る組換えを起こしやすいと一般に考えられる。逆に、より短い配列は、より低い組換え確率を意味し、これが、それらをより安定にする。ＰｒＳＳＬによって与えられるプロモーターおよび本質的に同じ発現特性を有する関連するプロモーターの長さは極めて短いため、これらのプロモーターは、ワクシニアゲノム内で組換えをはるかに起こしにくくなっており、したがって、より長い他の公知のプロモーターよりも、継続的な高いタンパク質発現レベルをもたらす可能性が高い。ワクシニアウイルスがワクチンとして使用される場合、この発現量の増大は、産生される抗原性タンパク質の免疫原性の増大として顕在化する。これは、より大きな効果的タンパク質力価が生じるためである。

最後に、ＰｒＳＳＬおよび本質的に同じ発現特性を有する関連するプロモーターのプロモーター活性は、非常に強い。例えば、ＰｒＳＳＬのプロモーター活性はＰｒＳのプロモーター活性の約２／３であることが観察されている（実施例および対応する図面を参照されたい）。ＰｒＳは、最強ではないとしても、公知の最強プロモーターの内の１つである。

本明細書において使用される場合、「プロモーター」という用語は、発現させようとする核酸の配列の上流に位置する、核酸、通常ＤＮＡの調節領域を意味し、これは、例えば、タンパク質転写因子および促進される遺伝子のコード領域からＲＮＡを合成するのに関与するポリメラーゼによって認識され結合される特殊なＤＮＡ配列エレメントを含む。したがって、プロモーター配列は、−１位までのヌクレオチドを含んでよい。しかし、＋１位以降のヌクレオチドは、プロモーターの一部分ではない。すなわち、この点に関して、翻訳開始コドン（ＡＴＧまたはＡＵＧ）はプロモーターの一部分ではないことに留意しなければならない。したがって、配列番号２および配列番号３は、本発明のプロモーター、およびさらに、任意選択の別のヌクレオチドと共に翻訳開始コドンＡＴＧを含むポリヌクレオチドである。ヌクレオチドのこの番号付与を表１に示す。プロモーターおよびポリヌクレオチドに関して本明細書において与える位置は、ｍＲＮＡ位置に関連している位置を必ずしも反映しないことに、さらに留意しなければならない。

本明細書において使用される場合、配列番号１に記載するヌクレオチド配列と「本質的に同じ発現特性」を有するヌクレオチド配列は、産生される組換えタンパク質の量に基づいて測定した場合、配列番号１のプロモーター活性の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％を示すと考えられる。問題のプロモーター配列が、配列番号１のいずれかと「本質的に同じ発現特性」を有するか否かは、本出願の実施例１に記載する方法を用いて、当業者は容易に判定することができる。本発明によるプロモーターは、好ましくは、ポックスウイルスプロモーターとして、好ましくはワクシニアウイルスプロモーターとして活性であるか、またはポックスウイルス感染細胞、好ましくはワクシニアウイルス感染細胞におけるプロモーターとして活性である。ワクシニアウイルスは、好ましくはＭＶＡ、特に、下記に特定するＭＶＡ株の内の１つであ
る。「ポックスウイルスプロモーターとして活性」とは、そのプロモーターが、ポックスウイルス中でそれが作動可能に連結されている遺伝子の発現を、前記ウイルスによる細胞感染後に指示できることを意味する。これらの細胞は、好ましくは、ポックスウイルスの後期および／もしくは初期ならびに／または初期／後期発現を可能にする細胞である。また、「ポックスウイルス感染細胞中で活性なプロモーター」には、そのプロモーターがポックスウイルスゲノムの一部分ではない、例えば、プラスミドもしくは直線状ポリヌクレオチドまたは非ポックスウイルスのウイルスゲノムの一部分である状況も含まれ、このような状況において、本発明によるプロモーターは、そのプロモーターを含む細胞が、ポックスウイルスゲノムも含む場合、例えば、その細胞がポックスウイルスに感染した場合、活性である。これらの環境下で、ウイルスＲＮＡポリメラーゼは、本発明によるプロモーターを認識し、このプロモーターに連結している遺伝子／コード配列の発現が活性化される。

本明細書において使用される場合、「配列番号１に記載する核酸に由来する」という用語は、配列番号１のヌクレオチド配列が、指定されるヌクレオチド改変、例えば、少なくとも１つのヌクレオチド付加、欠失、置換、および／または逆位を生じさせるための基盤として使われることを意味する。「由来する」という用語は、例えば、配列番号１に対応する物理的配列を公知の方法、例えば、誤りがちなＰＣＲによって実際に改変する可能性を含む。「由来する」という用語は、コンピューター上（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で配列番号１の配列に対する改変を実施し、次いで、そのようにして決定された配列を物理的核酸として合成する可能性をさらに含む。例えば、「由来する」という用語は、例えば、ハイブリダイゼーション安定性に関する核酸配列の解析のために任意の公知のコンピュータープログラムを使用する可能性、および配列番号１の開始配列を改変する際の任意の核酸二次構造の可能性を包含する。好ましくは、配列番号１の核酸から、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、または１個以下のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および／または逆位が起こされる。さらに、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、挿入、または欠失は、発現させようとする核酸の開始コドンに起こる（ｒｅｓｕｌｔ ｔｏ）べきではない。配列番号１に記載する核酸に由来するこのようなプロモーターの例は、例えば、配列番号３３（ａａｔｔｔｔｔａａｔｃｔａｔａａ）または配列番号３４（ａｔｔｔｔｔｔａｔｔｃｔａｔａａ）である。

本明細書において使用される場合、「発現される」、「発現する」、および「発現」などの用語は、関心対象の配列の転写のみ、ならびに転写と翻訳の両方を意味する。したがって、ＤＮＡの形態で存在する核酸の発現に言及する際、この発現の結果として生じる産生物は、（発現させようとする配列の転写のみの結果として生じる）ＲＮＡまたは（発現させようとする配列の転写と翻訳の両方の結果として生じる）ポリペプチド配列のいずれかでよい。したがって、「発現」という用語はまた、ＲＮＡおよびポリペプチド産物の両方が前記発現の結果として生じ、かつ同じ共通環境において一緒に残る可能性も含む。例えば、これは、ｍＲＮＡが、ポリペプチド産物へのその翻訳後に存在し続ける場合である。

本発明の１つの態様は、配列番号１と少なくとも７０％、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、かつ配列番号１と本質的に同じ発現特性を有する核酸を有するプロモーターを含む。例えば、公知の任意のポックスウイルスゲノムの一部分ではない配列番号１（「ＰｒＳＳＬ」）のプロモーター活性が認識されたことにより、ＭＶＡ（１２８Ｌ遺伝子）ならびにワクシニアウイルス（Ａ１８Ｌ遺伝子）、漿尿膜ウイルスアンカラＣＶＡ（ＣＶＡ１４４遺伝子）、ショープ線維腫ウイルスＳＦＶ（ｓ１０７Ｌ遺伝子）、およびヒト病原性痘瘡ウイルス（Ａ１８Ｌ遺伝子）など他のポックスウイルスにおいて同様の対応するプロモーターをさらに認識することが可能になった。各場合において、ＰｒＳＳＬに類似しているが同一ではない配列は、オープンリーディン
グフレームの上流に位置し、−１５位および−１６位（表１を参照されたい）が、配列番号１と比べて最も変化している位置である。

配列番号１および開始コドンを含む別のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドをクエリ配列として用いてＮＣＢＩデータベースのＢＬＡＳＴ検索を行い、続いて、最初の１０００個のデータベースヒットを解析したところ、ヌクレオチド第−１５位が配列番号１と比べて変化しているいくつかの配列が指摘された。このような変化が見出されたウイルス株としては、様々な株のワクシニアウイルス、漿尿膜ウイルスアンカラ、改変ワクシニアウイルスアンカラ、粘液腫ウイルス、タナ痘ウイルス、エクトロメリアウイルス、ラクダ痘ウイルス、馬痘ウイルス、牛痘ウイルス、タテラポックス（ｔａｔｅｒａｐｏｘ）ウイルス、ヤギ痘ウイルス、羊痘ウイルス、シカポックスウイルス、サル痘ウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス、ランピースキン病ウイルス、豚痘ウイルス、大痘瘡ウイルス、小痘瘡ウイルス、およびヤバ様疾患（ｙａｂａ−ｌｉｋｅ ｄｉｓｅａｓｅ）ウイルスが挙げられる。−１５位および−１６位における変異性に加えて、＋４位もまた、配列番号１および開始コドンを含む別のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと比べて変異性を示すことが判明した。これらの位置の番号付けは、表１に示すとおりである。

本発明の別の態様は、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の核酸配列にハイブリダイズすることができ、かつ（ａ）の核酸と本質的に同じ発現特性を有する核酸に関する。「ハイブリダイズすることができる」という用語は、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の核酸の任意の部分が別のＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができて、（ａ）の核酸と本質的に同じ発現特性を有する任意のＤＮＡ配列の検出および単離が可能になる条件でのハイブリダイゼーションを意味する。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件で実施される。条件がストリンジェントであるほど、部分的に相補的な配列は離れることを余儀なくされる可能性が高い。すなわち、高ストリンジェンシーの方が、ハイブリダイゼーションの確率は低くなる。実際には、「ストリンジェントな条件」という用語は、高温（例えば、６５℃）および／または低塩濃度（例えば、０．１×ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーション条件を意味する。温度を上昇させること、および／または塩濃度を低下させることにより、ストリンジェンシーは高まる。ストリンジェントな条件下では、配列間に少なくとも７０％、または好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こると考えられる。ハイブリダイゼーションは、Ａｕｓｕｂｅｌら（２００２）Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、第５版、カナダに記載されているようにして実施することができる。

好ましくは、本発明のプロモーターは、２７以下のヌクレオチド長、すなわち、２８個未満のヌクレオチドを有する。さらにより好ましくは、本発明のプロモーターは、２６以下のヌクレオチド長、すなわち、２７個未満のヌクレオチドを有するか、または２５以下のヌクレオチド長、すなわち、２６個未満のヌクレオチドを有する。１つの実施形態において、前述の（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）の核酸は、約５〜２５個のヌクレオチド、約６〜２４個のヌクレオチド、約７〜２３個のヌクレオチド、約８〜２２個のヌクレオチド、約９〜２１個のヌクレオチド、約１０〜２０個のヌクレオチド、約１１〜１９個のヌクレオチド、約１２〜１８個のヌクレオチド、または約１３個、１４個、１５個、１６個、もしくは１７個のヌクレオチドを含む。さらに、好ましい実施形態は、１０〜２７ヌクレオチド長、１０〜２６ヌクレオチド長、１０〜２５ヌクレオチド長、１４〜２３ヌクレオチド長、または１５〜２０ヌクレオチド長のプロモーターである。これらの存在し得るプロモーター長の最長のものでさえ、先行技術において一般的に公知であり容認されているプロモーター長よりもかなり短い。例えば、本発明者らが知る最短のポックスウイルスプロモーターであるＩ１Ｒは、２７ヌクレオチド長であるが、ＰｒＳと比べて同じ程度の高いプロモーター活性を示さない。しかし、この短い長さでさえ例外であり、大半の公知の
プロモーターはもっと長く、およそ３０〜１００個程度のヌクレオチドである。特に好ましい実施形態において、プロモーターは、１６〜２５個のヌクレオチドからなる。

１つの実施形態において、本発明は、前述のプロモーターを含むポリヌクレオチドに関する。この実施形態の好ましい態様において、少なくとも１つの別のヌクレオチドが、＋１位以降に付加される。すなわち、プロモーターの下流に付加される。この態様の１つの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、発現させようとする核酸の開始コドンＡＴＧまたはＡＵＧ（＋１位〜＋３位）と共に前述のプロモーターを含む。開始コドンを有するこのようなポリヌクレオチドの例は、配列番号２および配列番号３である。この場合、発現させようとする核酸の＋４位はＧまたはＡであることが好ましい。このようなポリヌクレオチドの例は配列番号２である。さらに好ましい実施形態において、このポリヌクレオチドは、−３位〜＋２位にＴＡＡＡＴモチーフを含み、このようなポリヌクレオチドの例は、配列番号２、３、４、および５である。

別の実施形態において、前述の（ｂ）のプロモーターは、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％のＡＴ含有量またはＡＵ含有量を含む。ＰｒＳＳＬの配列は、高い発現レベルで組換えタンパク質を生じることが想定される２４種の異なるＭＶＡ遺伝子を解析することによって決定された。

本明細書において使用される場合、「ＡＴ含有量」または「ＡＵ含有量」という用語は、ヌクレオチドＡ、Ｔ、およびＵを含む各配列（例えば、ＰｒＳＳＬまたは本質的に同じ発現特性を有する関連するプロモーター）の全長を基準とした、所与の配列中のすべてのアデニンヌクレオチドおよびチミンヌクレオチドまたはアデニンヌクレオチドおよびウラシルヌクレオチドの累加含有量を意味する。例えば、問題の配列のＡＴ含有率（％）またはＡＵ含有率（％）は、問題の配列中のヌクレオチドＡおよびＴ（ＤＮＡの場合）またはヌクレオチドＡおよびＵ（ＲＮＡの場合）を合わせた数を、問題の配列中のヌクレオチドの総数（上記で既に数えた物を含む）で割り、その結果に１００を掛けることによって算出することができる。

別の態様において、本発明は、発現させようとする核酸および前述のプロモーターを含むポリヌクレオチドを提供する。例えば、本発明によるポリヌクレオチドに含まれるプロモーターは、配列番号１、３３、もしくは３４のいずれかに記載のヌクレオチド配列を有する核酸でもよく、または実施例１で記載する方法によって決定されるように、配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有し、かつ配列番号１と本質的に同じ発現特性を有する核酸配列でもよい。また、ポリヌクレオチドに含まれるプロモーターは、例えば、配列番号１に由来するヌクレオチド配列を有し、配列番号１の配列と比べて、少なくとも１つのヌクレオチド付加、欠失、置換、および／または逆位を含み、かつ実施例１で記載する方法によって決定されるように、配列番号１と本質的に同じ発現特性を有する核酸でもよい。この実施形態の１つの態様において、ポリヌクレオチドコンストラクトは、＋１位以降に付加される別のヌクレオチドと共に本発明のプロモーターを含むポリヌクレオチド、好ましくは、配列番号２〜５のいずれか、および発現させようとする核酸を含んでよい。

１つの実施形態において、発現させようとする核酸と前述のプロモーターの両方を含むポリヌクレオチドは、発現させようとする核酸の開始コドンＡＴＧまたはＡＵＧに直接的に結合された形態で、プロモーターを含む。他のワクシニア／ＭＶＡ配列と同様に、このポリヌクレオチドは一般に、ＤＮＡの形態で存在し、したがって、開始コドンはＡＴＧであると考えられる。しかし、いくつかのより珍しい場合において、開始コドンのすぐ上流に位置するプロモーターの一部分がＲＮＡに転写されること、およびこの転写が、発現させようとするタンパク質をコードする核酸領域へと続くことが観察されている。このよう
な場合、前述のプロモーターの少なくとも一部分は、開始コドンに直接的に結合されている場合、ＲＮＡの形態で存在してよく、この場合、このＲＮＡは「ＡＵＧ」開始コドンに結合されているはずである。定義上、開始コドンＡＴＧまたはＡＵＧは、プロモーター配列の一部分ではないことに留意しなければならない。

本明細書において使用される場合、「上流」という用語は核酸の５’側の方向を意味し、「下流」という用語は核酸の３’側の方向を意味する。例えば、同じ核酸において配列Ｘが配列Ｙの「上流」に位置する場合、これは、配列Ｘが配列Ｙの５’側に位置すること、または逆に言えば、配列Ｙが配列Ｘの３’側に位置することを意味する。

別の実施形態において、このポリヌクレオチドに含まれるプロモーターは、開始コドンＡＴＧもしくはＡＵＧを含まない約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、約１０〜２０個、約２０〜３０個、約３０〜４０個、約４０〜５０個、約５０〜１００個、または約１００〜２００個のヌクレオチドの非転写領域によって、開始コドンＡＴＧまたはＡＵＧから離されている。本発明のＰｒＳＳＬ系列のプロモーターおよび関連する配列に関して、転写に関与する配列は、開始コドンに直接隣接して位置する必要はなく（ただし、これは可能ではある）、発現させようとする実際の配列から離れた上流に位置してもよいことが周知であり、観察されている。

この実施形態において、プロモーターが、発現させようとする核酸に、ある長さの介在核酸を介して結合されている場合、そのプロモーターを含むポリヌクレオチドが、（例えば、配列番号４のように）−３位〜＋２位に配列ＴＡＡＡＴを有することが有利であり、またはそのプロモーターを含むポリヌクレオチドが、（例えば、配列番号５のように）−３位〜＋３位に配列ＴＡＡＡＴＡを有することが、さらにより好ましい。

この実施形態において、本発明のプロモーターは、開始コドンＡＴＧまたはＡＵＧから離れているが、発現させようとするポリヌクレオチドのＡＴＧ開始コドンのすぐ後にＧが続き、したがって、高発現が可能であることが好ましい。

本明細書において使用される場合、「約」という用語は、所与の値の近似値を意味し、指定された値より１０％程度大きいか、または小さい変動を意味すると解釈してよい。適切な場合には、例えば、端数のヌクレオチドが不可能であるヌクレオチド長を算出する場合、当業者は、「約」という用語が、最も近い完全なヌクレオチドへの切り上げまたは切り下げを伴うことを理解する。例えば、「約１６個のヌクレオチド」とは、例えば、この値より１０％大きいおよび小さい、数学的には１４．４ヌクレオチド長または１７．６ヌクレオチド長（いずれも不可能である）をもたらす変動を意味する。したがって、当業者は、この例において、１４．４個のヌクレオチドは１４個のヌクレオチドに切り下げられ、１７．６個のヌクレオチドは１８個のヌクレオチドに切り上げられることを理解する。

１つの実施形態において、発現させようとする核酸は、翻訳されるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を含む。

本明細書において使用される場合、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」という用語は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を意味し、ＯＲＦ中の開始コドンＡＴＧまたはＡＵＧの「Ａ」は、翻訳のために使用されるリーディングフレームの始まりを画定する。発現させようとする、すなわち本発明に従って転写ならびに／または転写および翻訳されるタンパク質は、一般に、組換えタンパク質である。したがって、その配列は、一般に、コードされるアミノ酸配列の従来の（ｆｏｒｍｅｒ）知識を用いて決定される。したがって、ＤＮＡの形態のポリヌクレオチドは、ＯＲＦにおいて関心対象の（組換え）タンパク質をコードするｃＤＮＡを一般に含む。また、「ＯＲＦ」という用語
は、既知のポリペプチドの一部分のみをコードするヌクレオチド配列である「部分的ＯＲＦ」を含む。これは、例えば、ワクチンにおいて宿主免疫系に提示されるエピトープが、既知のポリペプチドの一部分にのみ存在する場合に、適用され得る。この場合、既知のポリペプチドの対応する部分のみを部分的ＯＲＦとしてポリヌクレオチドに含めることで十分な場合がある。

別の実施形態において、プロモーターが、発現させようとする核酸のＡＴＧまたはＡＵＧ開始コドンに直接的に結合されている場合、このＡＴＧまたはＡＵＧ開始コドンは、定義上（表１を参照されたい）、発現させようとする核酸の＋１位〜＋３位に位置する。この場合、発現させようとする核酸の＋４位はＧまたはＡであることが好ましい。これは、発現させようとするポリペプチドの２番目のアミノ酸をコードするヌクレオチドトリプレットの１番目のヌクレオチドに相当する。したがって、＋４位に「Ｇ」を組み入れることは、この組入れにより、翻訳された際に、発現させようとするポリペプチドの２位に望ましいまたは必要なものとは異なるアミノ酸をもたらすと考えられる場合には、常に可能であるとは限らない場合がある。しかし、当業者は、遺伝コードの縮重により、翻訳されるアミノ酸の同一性を変えることなく、所与のトリプレットコドン内において１つのヌクレオチドで別のものを置換することがしばしば可能になることを理解している。また、当業者は、ヌクレオチド置換によって、所与の位置で結果として生じるアミノ酸の同一性が変わる場合でさえ、これは、所与のポリペプチドにおける全体的なフォールディング、したがってエピトープ分布に影響を及ぼすとは限らないことも理解している。したがって、コード鎖の＋４位を「Ｇ」または「Ａ」で置換する際に得られる上記の利点が、発現されるポリペプチドの２位のアミノ酸の同一性をおそらく改変する際にこうむる任意の不利益を相殺するかどうかは、そのポリペプチドの既知の配列および所望の免疫応答を引き出す際のアミノ酸２の重要性を考慮して、ケースバイケースで評価しなければならない問題である。配列番号２は、発現させようとする核酸のＡＴＧ開始コドンに直接隣接して位置し、かつ＋４位がＧである本発明のポリヌクレオチドの例である。

別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも２つのプロモーターを含み、その内の少なくとも１つは、配列番号１に記載するプロモーターまたは本明細書において説明する本質的に同じ発現特性を有する関連するプロモーターである。例えば、ＰｒＳＳＬは、ＰｒＳＳＬの１つもしくは複数の構成単位と同種直列（ｈｏｍｏ−ｔａｎｄｅｍ）に、または本質的に同じ発現特性を有する関連するプロモーターのいずれかの１つもしくは複数の構成単位と異種直列（ｈｅｔｅｒｏ−ｔａｎｄｅｍ）に結合されてよい。同じことが、ＰｒＳＳＬまたは本質的に同じ発現特性を有する関連するプロモーターのいずれかの起こり得る同種直列および異種直列に当てはまる。好ましくは、少なくとも２つのプロモーターが、互いに作動可能に連結される。

さらに好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも２つのプロモーターを含み、その内の少なくとも１つは、配列番号１に記載するプロモーターまたは本明細書において説明する本質的に同じ発現特性を有する関連するプロモーターであり、これらのプロモーターの内の少なくとも１つは初期プロモーターである。「初期プロモーター」という用語は、ウイルスＤＮＡ複製が起こる前に、ポックスウイルスまたはポックスウイルス感染細胞において活性であるプロモーターを意味する。ワクシニアウイルスの初期プロモーターの好ましい例は、７．５ｋＤａ初期プロモーター（Ｐｒ７．５Ｋプロモーターの断片）およびＴＫプロモーター（チミジンキナーゼ）である。

本発明はさらに、前述のプロモーターおよび／または前述のポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。

１つの態様において、ベクターは、ポリヌクレオチドベクターである。「ポリヌクレオ
チドベクター」という用語は、当業者に公知である任意のベクターを意味する。ポリヌクレオチドベクターは、例えば、直線状ＤＮＡ、環状ＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡ、例えば、ｐＢＲ３２２もしくはｐＵＣ系列の任意のベクターなど）または人工ＤＮＡでよい。

例えば、本発明によるプラスミドベクターは、例えば、ウイルスベクター、特にＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）のゲノムに由来するかまたは相同であるＤＮＡ配列を含んでよく、その際、前記ＤＮＡ配列は、ウイルスゲノムの２つの隣接した配列の間に位置するか、またはそれらによって挟まれた、発現させようとする配列の完全な断片または部分的断片を含む。好ましくは、ウイルスゲノムは、発現させようとする配列を挿入するため、好ましくは、発現させようとする核酸に作動的に連結された本明細書において前述したプロモーターのいずれかなどのポックスウイルス転写制御エレメントを挿入するための、少なくとも１つのクローニング部位を含む。

別の実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。本明細書において使用される場合、「ウイルスベクター（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）」または「ウイルスベクター（ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は、ウイルスゲノムを含む感染性ウイルスおよび／または弱毒化ウイルスを意味する。この場合、本発明の核酸は、代表的なウイルスベクターのウイルスゲノムの一部分であり、かつ／またはウイルスゲノムを構成する。組換えベクターは、細胞および細胞株の感染のため、特に、ヒトを含む生きている動物の感染のために使用され得る。本発明による典型的なウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ２）に基づくベクターである。最も好ましいのは、ポックスウイルスベクターである。ポックスウイルスは、好ましくは、カナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルス、またはワクシニアウイルスでよい。

好ましい実施形態において、ウイルスベクターは、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）（Ｓｕｔｔｅｒら（１９９４）、Ｖａｃｃｉｎｅ １２、１０３２〜１０４０）である。典型的なＭＶＡ株は、寄託番号ＥＣＡＣＣＶ００１２０７０７で欧州動物細胞培養物コレクション（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に寄託されているＭＶＡ ５７５である。最も好ましいのは、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）においてｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖的複製（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）する能力を有するが、ヒトケラチノサイト細
胞株ＨａＣａＴ、ヒト胎児由来腎臓細胞株２９３、ヒト骨肉腫細胞株１４３Ｂ、およびヒト子宮頸部腺癌細胞株ＨｅＬａにおいて増殖的複製する能力は有さないＭＶＡ株である。別の好ましい実施形態において、ＭＶＡ株は、成熟したＢ細胞およびＴ細胞を産生することができず、したがって、極度に免疫力が低下しており、複製するウイルスの影響を極めて受けやすいマウスモデルにおいて複製することができない。さらに好ましいのは、ＤＮＡプライム／ワクシニアウイルスブーストレジメンと比べた場合、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブーストレジメンにおいて少なくとも同じレベルの特異的免疫応答を誘導するＭＶＡ株である。最も好ましいのは、前述の特性の３つすべてを含むＭＶＡ株である。以下で一般に「ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）」と呼ぶ、このような最も好ましいＭＶＡ株はすべて、２００１年１１月２２日に欧州特許庁に出願された「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋａｒａ Ｖｉｒｕｓ Ｖａｒｉａｎｔ」という表題のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ０１／１３６２８において説明されている。ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）の試料は、寄託番号ＥＣＡＣＣＶ ０００８３００８で欧州動物細胞培養物コレクションに寄託されている。ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）を使用することにより、改変ワクシニアアンカラウイルスに由来し、かつヒト細胞において増殖的に複製する能力を喪失していることを特徴とする、極端に弱毒化し、したがって安全なウイルスにおいて、発現させようとするタンパク質を発現させることができる。ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）は、ヒトに
おいて複製しないため、他の公知のワクシニアウイルス株より安全である。別の最も好ましい実施形態において、前述のプロモーターまたは前述のポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、寄託番号ＥＣＡＣＣＶ ０００８３００８で欧州動物細胞培養物コレクションに寄託されているＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）である。ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）の特徴、ＭＶＡがＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）であるかを評価することを可能にする生物学的検定法の説明、およびＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）を得ることを可能にする方法は、参照より本明細書に組み入れられる、上記に参照したＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ０１／１３６２８において開示されている。

別の態様において、本発明は、前述のプロモーター、前述のポリヌクレオチド、および／または前述のベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。好ましくは、宿主細胞は、ＣＥＦ細胞などウイルスがその中で複製できる細胞、またはＭＶＡに感染し得るが、ウイルスがその中で複製しない細胞（ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）に関して前述したタイプのヒト細胞株など）である。

本発明の別の態様において、前述のプロモーター、ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞はまた、組成物、好ましくは薬学的組成物の一部となってもよい。読みやすくするために、以下の組成物は、配列番号１のプロモーターまたは本質的に同じ発現特性を有する関連するプロモーターを含むＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）を含むと想定されるが、当業者は、この組成物が、本明細書において前述したプロモーターのいずれか、本明細書において前述したポリヌクレオチドのいずれか、または本明細書において前述したＭＶＡでもＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）でもないベクターのいずれかを代わりにまたはさらに含んでもよいことを理解するであろう。

１つの実施形態において、組成物はワクチン組成物である。このワクチン組成物は、有利には、１つもしくは複数の同種配列または１つもしくは複数の異種配列を細胞中に導入するために使用され得、また、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの治療法の一環として適用され得る。例えば、この組成物は、例えば、本発明による配列番号１のプロモーターまたは本質的に同じ発現特性を有する関連するプロモーターを含む組換えＭＶＡに以前に（ｅｘ ｖｉｖｏで）感染した単離細胞を含んでよい。このような細胞を含有する組成物は、好ましくは、免疫応答に影響を及ぼす、好ましくは免疫応答を誘導するために、生きた動物の身体に投与するのに適している。

あるいはまたはさらに、この組成物は、本明細書において前述したプロモーター、ポリヌクレオチド、またはベクターを含む、組換えＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）などの組換えポックスウイルスを含んでもよく、好ましくは、免疫応答に影響を及ぼす、好ましくは免疫応答を誘導するために、生きた動物の身体に投与するのに適している。この場合、接種部位の周囲の細胞だけでなく、例えば血流を通してそのウイルスが輸送される先の細胞が、本発明による組換えＭＶＡにｉｎ ｖｉｖｏで直接感染する。感染後、これらの細胞は、外因性コード配列にコードされる治療用遺伝子のタンパク質、ペプチド、または抗原性エピトープ（例えば、部分ペプチド）を合成し、続いて、細胞表面にそれらまたはその一部分を提示する。免疫系の特殊化された細胞は、このような異種のタンパク質、ペプチド、エピトープの提示を認識し、特異的免疫応答を開始する。

したがって、本発明はまた、ヒトを含む生きた動物の身体において免疫応答を誘導するのに適した薬学的組成物およびワクチンも提供する。薬学的組成物は、一般に、薬学的に許容されるか、かつ／または承認されている１種または複数種の担体、添加剤、抗生物質、保存剤、アジュバント、希釈剤、および／または安定化剤を含んでよい。このような補助物質は、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝化物質などでよい。典型的には、適切な担体は、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸
、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、または脂質凝集体など大型でゆっくりと代謝される分子である。

ワクチンを調製するために、１つの実施形態において、（薬学的）組成物は、生理学的に許容される形態に変換される。例えば、（薬学的）組成物が、ポックスウイルス、好ましくは、配列番号１の本発明のプロモーターまたは本質的に同じ発現特性を有する関連するプロモーターを有するＭＶＡを含む状況において、生理学的に活性な形態への変換は、天然痘に対するワクチン接種のために使用されるポックスウイルスワクチンの調製における経験に基づいて実施することができる（Ｓｔｉｃｋｌら（１９７４） Ｄｅｕｔｓｃｈｅ ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒｉｆｔ ９９、２３８６〜２３９２によって説明されているようにする）。例えば、精製したウイルスは、約１０ｍＭのＴｒｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４〜ｐＨ７．８、例えばｐＨ７．４またはｐＨ７．７中で調剤され、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ（１ミリリットル当たりの組織培養物感染量）の力価を有し、−８０℃で保存される。ワクチンショットを調製するために、例えば、１０２〜１０８個のウイルス粒子を、アンプル、好ましくはガラスアンプルに入れた２％ペプトンおよび１％ヒトアルブミンの存在下のリン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）１００ｍｌ中に含める。あるいは、ワクチンショットは、製剤中のウイルスを段階的に凍結乾燥することによって作製することもできる。この製剤は、メタノール、デキストリン、糖、グリシン、ラクトース、もしくはポリビニルピロリドンなどの付加的な添加剤、または抗酸化剤もしくは不活性ガス、安定化剤、もしくはｉｎ ｖｉｖｏ投与に適した組換えタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）など他の助剤を含有してよい。次いで、ガラスアンプルを密封し、４℃〜室温で数ヶ月間保存することができる。しかし、必要がない限り、アンプルは好ましくは、−２０℃より低い温度で保存される。

ワクチンまたは治療法のために、配列番号１のプロモーターまたは本明細書において前述した関連するプロモーターを含むＭＶＡを、０．１〜０．５ｍｌの水溶液、好ましくは生理食塩水またはＴｒｉｓ緩衝液中に溶解し、全身的または局所的に、すなわち、非経口的に、皮下に、筋肉内に、乱切法もしくは当業者に公知である他の任意の投与経路によって投与することができる。投与様式、投与量、および投与回数は、公知の様式で当業者が最適化することができる。しかし、最も一般的には、１回目のワクチン接種ショット後約１ヶ月〜６週目に、対象に２回目のショットを行ってワクチン接種する。

ワクチンがワクシニアウイルス、特にＭＶＡ、特にＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）である場合、ヒト用の典型的なワクチンショットは、少なくとも１０２、好ましくは少なくとも１０４、好ましくは少なくとも１０６、さらにより好ましくは１０７または１０８のウイルスＴＣＩＤ５０を含む。

ワクチンが組換えＭＶＡ、特に組換えＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）である場合、ウイルスは、プライム−ブースト投与のために使用され得る。したがって、本発明はさらに、ベクターが、配列番号１のプロモーターまたは本明細書において前述した関連するプロモーターを含むＭＶＡ、特にＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）であり、かつ前記ベクターまたは前記ベクターを含む組成物もしくはワクチンが、それを必要とするヒトを含む動物に、第１回接種（「プライミング接種」）、第２回接種（「ブースティング接種」）、および／または追加の第３回もしくはそれ以上の接種において治療有効量で投与される方法にも関する。

本発明の別の態様は、核酸、好ましくは遺伝子を発現させるための、前述のプロモーター、前述のポリヌクレオチド、前述のベクター、前述の宿主細胞、および／または前述の組成物の使用を提供する。

本発明のさらに別の態様は、免疫応答を誘導するため、または癌および／もしくは感染
症を治療もしくは予防するための医薬の調製における、前述のプロモーター、前述のポリヌクレオチド、前述のベクター、前述の宿主細胞、および／または前述の組成物の使用を提供する。

さらに、本発明は、免疫応答を誘導するため、または癌および／もしくは感染症を治療もしくは予防するための、本発明のプロモーター、前述のポリヌクレオチド、前述のベクター、前述の宿主細胞、および／または前述の組成物を提供する。

理想的には、この医薬によって治療または予防される癌は、ＡＩＤＳ関連癌（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫）、乳癌、結腸癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、皮膚癌（例えば、黒色腫）、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、扁平上皮癌、扁平上皮頸部癌、胃（胃の）癌、精巣癌、および甲状腺癌からなる群から選択される。

理想的には、この医薬によって治療または予防される感染症は、ウイルス感染症、細菌感染症、寄生虫感染症、真菌感染症、およびプリオン感染症からなるリストから選択される。

特に好ましい実施形態において、医薬は、ワクチンである。組換えワクチンの特性ならびにその製剤および適切な投薬計画は、本明細書において前述される。

別の態様において、本発明はさらに、（ａ）前述のポリヌクレオチドを提供するステップであって、発現させようとする核酸が、ＯＲＦまたは部分的ＯＲＦを含むステップと、（ｂ）発現させようとする核酸の転写および翻訳の助けとなる条件に（ａ）のポリヌクレオチドを供するステップと、（ｃ）ポリペプチドを回収するステップと、（ｄ）場合によってはポリペプチドを精製するステップとを含む、ポリペプチドを調製する方法を提供する。

本明細書において使用される場合、「転写および翻訳の助けとなる条件」という用語は、例えば、前述のポリヌクレオチドを、例えば、好ましくは感染多重度が１０である組換えウイルス、好ましくはＭＶＡを用いて、例えばＨｅＬａ細胞中に導入し、続いて、例えば、増殖培地、例えば、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で２４〜４８時間、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベーションすることを含み得る。これらの条件および他の適切な条件は、当業者に周知である。

この態様によれば、本発明のプロモーターの有利な特性は、事実上任意の所望のポリペプチドの作製において使用され得る。理想的には、ポリペプチドは、ウイルスベクターに依存した発現系において調製される。例えば、これは、配列番号１のプロモーターまたは本明細書において前述した本質的に同じ発現特性を有する関連するプロモーターを含むウイルスベクターに感染した細胞のタンパク質発現能力を使用する発現系でよい。ウイルスベクターは、有利には、前述のウイルスベクターのいずれか、特にＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）である。このような細胞からタンパク質を作製および単離するための適切な方法は、当技術分野において公知である。

別の態様において、本発明は、発現させようとする核酸を含むポリヌクレオチドを提供するステップと、発現させようとする核酸に作動可能に連結された前述のプロモーターを提供するステップと、核酸の発現の助けとなる条件に、このようにして提供されたポリヌクレオチドを供するステップとを含む、核酸を発現させる方法を提供する。前述したように、「発現させる（ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ）」という用語または「発現させる（ｅｘｐｒｅｓｓ）」および「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」など文法的に関係する用語は、転写（すなわち、ＲＮＡの産生）または翻訳（すなわち、コードされたポリペプチドの転写お
よび合成）を意味し得る。この態様の方法はｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することができる。核酸を発現させる場合、プロモーターは、ウイルスベクター、好ましくはポックスウイルスベクター、特にワクシニアウイルスベクターに含まれてよいことに留意すべきである。しかし、このプロモーターを含むコンストラクトが、ポックスウイルスベクター以外のベクター（例えば、プラスミド）中に存在するか、またはゲノム中に導入される場合には、転写機構の供給源としての宿主細胞中でポックスウイルスが必要とされる。

本発明の別の実施形態は、前述のプロモーター、前述のポリヌクレオチド、このプロモーターを含むベクターを含む免疫原性の組成物またはワクチンを提供するステップと、ヒトを含む対象動物にこの組成物またはワクチンを投与するステップとを含む、免疫応答を誘導するため、または癌および／もしくは感染症を治療もしくは予防するための方法に関する。好ましくは、前述のウイルスベクターを含む組成物は、少なくとも１０２のＴＣＩＤ５０、より好ましくは、１０７〜１０８のＴＣＩＤ５０（組織培養物感染量）の用量で投与される。好ましくは、この実施形態の組成物は、第１回接種（「プライミング接種」）および第２回接種（「ブースティング接種」）において投与され得る。いくつかの態様において、追加の第３回またはそれ以上の接種もまた、好ましい場合がある。

以下の非限定的な実施例によって、本発明を以下に例示する。

配列番号１のプロモーター活性
プロモーター活性を試験するために、オボアルブミン（「ＯＶＡ」）タンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動的に連結された配列番号１のプロモーターを含むＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）株を構築した。配列番号１のプロモーター（ＰｒＳＳＬ）を用いた発現の結果として生じるオボアルブミン産生レベルは、（ａ）ＰｒＳＳＬが所望の遺伝子の発現を促進する能力、および（ｂ）このような発現促進の規模の指標として利用することができた。ＰｒＳ−ＯＶＡコンストラクトを陽性対照として、およびＰｒＳＳＬの発現の相対的強さを推定するために使用した。

ＭＶＡコンストラクトは、次のようにして調製した。本研究の組換えＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）ウイルスは、同じ組込み部位（ＷＯ０３／０９７８４５に記載されているように、ＭＶＡ−ＢＮの遺伝子０７と０８の間の遺伝子間領域）かつ同じ向きにＯＶＡレポーター遺伝子を有するように設計した。さらに、ＯＶＡカセットの下流に、化学的選択マーカーおよび蛍光マーカーを有する選択カセットを含める。この部分は、試験する組換えＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）ウイルスすべてにおいて同一である。これらのコンストラクトは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流の領域のみが異なる。

（５’から３’に向かって）ＰｒＳＳＬ配列が直接その後に続くＢｓｐＥＩ制限部位、次いで、開始コドンおよびＯＶＡ遺伝子の配列のストレッチを含むプライマーを用いたＰＣＲによって、ＯＶＡ ＯＲＦの上流にＰｒＳＳＬ配列を融合した。これにより、ＯＶＡ
ＯＲＦへのＰｒＳＳＬの直接的融合物がもたらされる。下流のプライマーは、ＯＶＡ遺伝子の３’末端のストレッチとそれに続く停止コドンおよびＢｇｌ ＩＩ制限酵素部位からなった（このプライマー配列は、非コード鎖に由来した）。これらのプライマーをＰＣＲで使用し、ＯＶＡ遺伝子は鋳型としての機能を果たした。結果として生じるＰＣＲ産物を組換えプラスミドのＢｓｐＥＩおよびＢｇｌ ＩＩ中にクローニングした。この組換えプラスミドは、選択カセットを含む。一緒になったＯＶＡ遺伝子および選択カセットには、連続したＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）配列のストレッチが隣接しているため、相同組換えによってＯＶＡ遺伝子および選択カセットをＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）ゲノム中に組み込むことが可能になる。結果として生じるウイルスはＰｒＳＳＬ−ＯＶＡと名付けた。

ＯＶＡ ＯＲＦの開始点に最適に融合された周知のＰｒＳプロモーターを用いて、別のＭＶＡを作製した。ＰＣＲによってこれを実施し、結果として生じるウイルスをＰｒＳ−ＯＶＡと名付けた。
ＰｒＳ−ＯＶＡ：ＭｌｕＩ−ＰｒＳ−ＯＶＡのＡＴＧ開始点
ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ：ＭｌｕＩ−ＢｓｐＥＩ−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡのＡＴＧ開始点

タンパク質発現の試験は以下のようにして実施した：
細胞播種：６ウェルプレート（ＦＡＬＣＯＮ）に入れた体積２ｍｌの培地中に、ウェル１個当たり細胞１．５×１０６個のＨｅＬａ細胞を播種した。使用した培地は、１０％ウシ胎児血清（ＰＡＡ）および１％ゲンタマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を補充した、グルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）および高グルコース（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を含むＤＭＥＭであった。これらの細胞は、感染より２４時間前に播種し、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。この結果、感染時に８０〜９０％コンフルエンシーになる。

感染：これらの細胞を、各組換えウイルスに感染多重度（ｍｏｉ）１０で感染させた。感染のために、補充された増殖培地を細胞から除去し、各ウイルス接種物を含有する補充されていないＤＭＥＭ ５００μｌで置き換えた。室温で１時間穏やかに揺り動かした後、細胞から感染培地を除去し、ウェル１個当たり１．５ｍｌの補充されたＤＭＥＭ培地で置き換えた。

細胞スクリーニング：感染または感染／トランスフェクション後２４時間目に、細胞変性効果および感染効率の対照としての機能を果たす緑色蛍光タンパク質の発現に関して、６ウェルプレートを倒立型蛍光顕微鏡下で検査した。緑色蛍光タンパク質の遺伝子を有する選択カセットが、使用した各組換えウイルス中に存在した。感染レベルは、１つの実験において検査した全試料において同様でなければならなかった。さもなければ、その材料は廃棄した。

細胞の回収：細胞回収のために、増殖培地を細胞から除去し、氷冷した溶解緩衝液２５０μｌ（＝ＰＢＳ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）＋０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＳＩＧＭＡ）＋１ｍＭプロテアーゼインヒビター（ＲＯＣＨＥ））で置き換えた。室温で５分間インキュベーションした後、これらの細胞をウェルの底からかき落として溶解緩衝液中に入れ、この細胞−ウイルス懸濁液を２ｍｌ容反応試験管に移した。これらの試料を、予冷したカップホーン超音波破砕機（ＢＲＡＮＳＯＮ）により、４℃、最大強度で１分間超音波処理し、氷上で保存した。全タンパク質を測定するために、試料を溶解緩衝液で１：１０に希釈した。

全タンパク質の測定：タンパク質定量キット（試薬Ａ、試薬Ｂ、およびＢＳＡ標準原液（２ｍｇ／ｍｌ）を含むＢＣＡアッセイキット、カタログ番号ＵＰ４０８４０、陽性対照
ＴＢＳ中２００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、カタログ番号ＵＰ３６８５９Ａ；ＵＰＴＩＭＡ）を用いて、全タンパク質を測定した。

全タンパク質に対する試料の標準化：出発濃度が０．５μｇ／μｌまたは１μｇ／μｌとなるように、全試料のタンパク質濃度を溶解緩衝液で調整した。

ＯＶＡに関するＥＬＩＳＡ：試料中のＯＶＡの発現を、オボアルブミン定量ＥＬＩＳＡキット（ＳＥＲＡＭＵＮ、カタログ番号Ｅ−０４１ｃ）を用いて定量した。ＥＬＩＳＡは、キットのプロトコルに従って実施した。ＥＬＩＳＡキット（ＳＥＲＡＭＵＮ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ）の希釈剤を用いて、標準化した試料からいくつかの希釈物（試料によっ
て、１：１０〜１：５０００）を作製した。４５０ｎｍでＥＬＩＳＡ Ｒｅａｄｅｒ（ＴＥＣＡＮ Ｓｕｎｒｉｓｅ）を用いて、９６ウェルプレートの光学濃度（ＯＤ）の値を測定した。ＥＬＩＳＡキットに含まれるオボアルブミン標準試料から作成した検量線を用いて、ＯＤ値から試料中のＯＶＡ濃度を決定した。ＯＶＡ濃度を算出した。これは、全タンパク質１ｍｇ当たりのＯＶＡ（μｇ）の単位で図１に示す。

これらの結果は、図１の棒４（ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ）および棒６（ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標））に示す。図１は、Ｙ軸に沿ってタンパク質産生レベルを示し、数が大きいほど、産生されるタンパク質、したがって、各配列のプロモーターとしての強さのレベルが高いことを示す。棒４の結果を得るために使用された組換えＭＶＡ中のＯＶＡ遺伝子が、ＰｒＳＳＬのプロモーターによって排他的に調節されたことは、注目に値する。空ベクターＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）に感染した細胞によるタンパク質発現は、予想されない。ＭＶＡに関してオボアルブミンＥＬＩＳＡにおいて測定されたレベルは、ゼロ発現（棒５および棒６）として算出した。

全体として、この実験の結果から、プロモーターとしてのＰｒＳＳＬの活性が実証される。図１の棒４におけるＯＶＡは、ＰｒＳＳＬを用いて得られたため、この棒において示すＯＶＡ発現のレベルは、ＰｒＳＳＬのみに帰すことができるプロモーター活性の好適な指標である。タンパク質発現のこのレベルは、公知の合成初期／後期プロモーターＰｒＳのみをプロモーターとして使用した場合に観察されたレベル（棒２を参照されたい）よりわずかに低かったが、ＰｒＳは、公知の最強プロモーターの内の１つであること、およびＰｒＳＳＬはＰｒＳよりはるかに短いこと（４４塩基対、ＡＴＧ開始コドン無し）を忘れるべきではない。したがって、プロモーターとしてのＰｒＳＳＬの活性は、ＰｒＳよりわずかに低い活性であるが、コンストラクト中でより安定である可能性があり、合成が容易であり、かつ野生型ＭＶＡゲノムまたは組換えＭＶＡゲノム中の他の配列との有害な組換えを起こす傾向が低い。

ＰｒＳＳＬの後期プロモーター活性の測定
上記の実験に続いて、ＭＶＡ生活環のおよそどの時期にＰｒＳＳＬが活性であるかを決定することが次に望まれた。プロモーターは、典型的には、それらが作動的に連結されている遺伝子の転写を支配的に推進するＭＶＡ生活環の範囲内の時点に応じて、初期、後期、中期、または初期／後期に分類される（初期／後期促進とは、ウイルス生活環の初期段階と後期段階の両方における促進を意味する）。

このために、上記に実施した実験を、今回はアラビノースＣ（ａｒａＣ）を添加して繰り返した。ａｒａＣは、ＤＮＡ複製（後期発現の必要条件）の公知の阻害物質であるが、初期プロモーター活性に対する効果は皆無に等しい。したがって、ａｒａＣの使用によって実施例１で観察されたタンパク質発現レベルが低下する場合は、ＰｒＳＳＬが後期プロモーターであることが示唆されるのに対し、ａｒａＣを用いた場合のタンパク質発現が、ａｒａＣを欠く実施例１の実験と比べて未変化である場合は、ＰｒＳＳＬが初期プロモーターであることが示唆される。

オボアルブミンコード配列およびプロモーターとしてのＰｒＳＳＬを有するＭＶＡの構築を、実施例１において前述したように実施した。ａｒａＣを用いた実験は、次のようにして実施した。いかなる添加物も無しで、６ウェル当たり総体積５００μｌの補充されていないＤＭＥＭ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中で、感染を実施した。感染は、ａｒａＣ処理について三つ組、かつ未処理の感染細胞について三つ組で実施した。室温で１時間穏やかに揺り動かした後、細胞から感染培地上清を除去し、ウェル１個当たり１．５ｍｌのＶＰ−ＳＦＭ培地で置き換えた。指示されているとおり最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように
、感染細胞の培地にａｒａＣ（シトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド；ＳＩＧＭＡ）を補充した。実施例１で説明したように、感染後２４時間目に細胞の解析および回収を実施した。図１に示す結果は、３回の独立した実験から算出する。

この実験の結果は図１の棒３に示す。ここで、棒４（ａｒａＣ無し）で以前に観察したタンパク質発現が、ａｒａＣを添加すると完全に消滅したことが明らかであり、ＰｒＳＳＬが後期プロモーターであることが示唆される。一方、ａｒａＣの添加無し（棒２）の場合に観察されるＰｒＳプロモーターの活性は、ａｒａＣによって完全に妨害することはできない（棒１）。ａｒａＣと共にＰｒＳを用いた場合（棒１）に観察された残りのタンパク質発現は、初期／後期プロモーターＰｒＳの初期部分に起因する残存発現を反映している。この決定は、例えばＴａｄｄｉｅおよびＴｒａｋｔｍａｎ（１９９１）．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ６５、８６９〜８７９において説明されているような当技術分野において公知のプロモーターエレメントの機能的分類に依拠している。ａｒａＣ処理を伴う空ベクター対照およびａｒａＣ処理を伴わない空ベクター対照（棒５および棒６）は、バックグラウンドのＯＶＡレベルの基準として使用し、ゼロ（発現無し）に設定した。

ＰｒＳＳＬプロモーターとＰｒ７．５プロモーターまたはＰｒ７．５ｅプロモーターのいずれかとの組合せ
多くのプロモーターが、互いに協力して働いて、いずれかのプロモーターのみを単独で用いて得ることができると思われる程度を上回ってタンパク質発現を増強することが公知であるため、ＰｒＳＳＬが他の公知のプロモーターと組合せ可能であるかを判定することが望まれた。そこで、ＰｒＳＳＬを、Ｐｒ７．５プロモーターおよびＰｒ７．５ｅプロモーター（Ｐｒ７．５ｅはＰｒ７．５の初期プロモーター部分である）のそれぞれと、別々に異種直列で組み合わせた。ＰｒＳＳＬならびにＰｒ７．５プロモーターおよびＰｒ７．５ｅプロモーターのそれぞれを別々に組み合わせ、Ｐｒ７．５またはＰｒ７．５ｅのいずれかをＰｒＳＳＬの上流に配置した。対照コンストラクトは、ＰｒＳＳＬの代わりに配列番号６のフィラー配列を含み、Ｐｒ７．５またはＰｒ７．５ｅのいずれかがフィラー配列の上流に配置された。

実施例２で使用した組換えプラスミドは、ＢｓｐＥＩ部位の上流に別の配列を組み込むために使用され得る。ＯＶＡ ＯＲＦの上流では、ＭｌｕＩ制限部位およびＢｓｐＥＩ制限部位により、様々な配列の挿入が容易に可能となる。これらの配列は、起源の異なるものでよく、例えば、ＭｌｕＩおよびＢｓｐＥＩに制限されたプラスミド中に融合され得る各オーバーハングを有する二本鎖を形成する合成オリゴヌクレオチドでよい。Ｐｒ７．５およびＰｒ７．５ｅの場合、これにより、共に同じ向きであり、かつＢｓｐＥＩ制限部位のための配列によって分離されただけでもある、これらの配列のいずれかとＰｒＳＳＬとの直列がもたらされた。これにより、周知のプロモーターＰｒ７．５（７．５ｋＤタンパク質をコードする遺伝子のもの）およびその初期促進部分（Ｐｒ７．５ｅ）プロモーターを有するコンストラクトが得られた。プロモーター末端に各制限配列を付加するＰＣＲによってＰｒ７．５プロモーターを増幅し、オリゴアニーリングによってＰｒ７．５ｅを作製した。牛痘ＰｒＡＴＩプロモーターはオリゴアニーリングによって作製され、Ｐｒ７．５ｅプロモーターに関しては同じ戦略を適用した。以下のコンストラクトを作製した。
Ｐｒ７．５−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ：ＭｌｕＩ−Ｐｒ７．５−ＢｓｐＥＩ−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡのＡＴＧ開始点
Ｐｒ７．５−フィラー−ＯＶＡ：ＭｌｕＩ−Ｐｒ７．５−ＢｓｐＥＩ−フィラー配列−ＯＶＡのＡＴＧ開始点
Ｐｒ７．５ｅ−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ：ＭｌｕＩ−Ｐｒ７．５ｅ−ＢｓｐＥＩ−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡのＡＴＧ開始点
Ｐｒ７．５ｅ−フィラー−ＯＶＡ：ＭｌｕＩ−Ｐｒ７．５ｅ−ＢｓｐＥＩ−フィラー配列
−ＯＶＡのＡＴＧ開始点
ＰｒＡＴＩ−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ：ＭｌｕＩ−ＰｒＡＴＩ−ＢｓｐＥＩ−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡのＡＴＧ開始点
ＰｒＡＴＩ−フィラー−ＯＶＡ：ＭｌｕＩ−ＰｒＡＴＩ−ＢｓｐＥＩ−フィラー配列−ＯＶＡのＡＴＧ開始点

上記のプロモーターコンストラクトを含むＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）コンストラクトを次のようにして作製した：ＢｓｐＥＩ−Ｂｇｌ ＩＩ断片を用いた制限切断により、ＰｒＳ−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡのために使用した組換えプラスミドからＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ融合物を除去することによって、配列Ｐｒ７．５−フィラー−ＯＶＡを含む対照ウイルスを作製した。この配列を、同様にＢｓｐＥＩ−Ｂｇｌ ＩＩで切断できるように調製されたＯＶＡをコードするＯＲＦのすぐ上流に無作為に定められたフィラー配列を有するＰＣＲ産物で置き換えた。結果として生じるウイルスは、Ｐｒ７．５プロモーターおよびフィラー配列とそれに続くＯＶＡ ＯＲＦを含む（ＰｒＳ−フィラー−ＯＶＡ）。コンストラクトＰｒ７．５−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ、Ｐｒ７．５−フィラー−ＯＶＡ、Ｐｒ７．５ｅ−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ、Ｐｒ７．５ｅ−フィラー−ＯＶＡ、ＰｒＡＴＩ−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ、およびＰｒＡＴＩ−フィラー−ＯＶＡは、ＭｌｕＩおよびＢｓｐＥＩを用いた制限酵素消化によって、ＰｒＳ−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡまたはＰｒＳ−フィラー−ＯＶＡのＰｒＳプロモーターを置き換えることによって作製した。

ａｒａＣを用いた実験およびａｒａＣを用いない実験は、実施例１および２において上記に示したようにして実施した。これらの結果を図２に示す。

図２において、プロモーターＰｒ７．５のみを用いたＯＶＡタンパク質発現（Ｐｒ７．５−フィラー−ＯＶＡ）の比較を棒１（ａｒａＣ有り）および棒２（ａｒａＣ無し）に示す。棒２と比べて棒１で明らかである有意に低いＯＶＡ発現は、Ｐｒ７．５による後期促進がａｒａＣによって阻害されたことに起因する。棒４（Ｐｒ７．５−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ、ａｒａＣ無し）の方が、棒２（Ｐｒ７．５−フィラー−ＯＶＡ、同じくａｒａＣ無し）よりもＯＶＡ発現が高いことから、プロモーターＰｒＳＳＬは他のプロモーターと協力して働いて、Ｐｒ７．５単独の場合に達成できるよりも高いレベルに促進を強化できることが示唆される。さらに、棒４（Ｐｒ７．５−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ、ａｒａＣ無し）と比べて棒３（Ｐｒ７．５−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ、ａｒａＣ有り）で明らかである有意に低いＯＶＡ発現は、Ｐｒ７．５およびＰｒＳＳＬによる後期促進がａｒａＣによって阻害されたことに起因する。棒５および棒６（それぞれ、Ｐｒ７．５ｅ−ＯＶＡ、ａｒａＣ有りおよびＰｒ７．５ｅ−ＯＶＡ、ａｒａＣ無し）は、ａｒａＣの添加により最小限のＯＶＡ発現低下しか示さないことから、Ｐｒ７．５ｅによる初期の促進性質が確認される。棒７および棒８（それぞれ、Ｐｒ７．５ｅ−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ、ａｒａＣ有りおよびＰｒ７．５ｅ−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ、ａｒａＣ無し）から、ａ）ＰｒＳＳＬはＰｒ７．５ｅ中で欠けている後期プロモーターエレメントを置き換えて、十分なＯＶＡ発現をもたらし得ること（棒６および棒８の比較）、ならびにｂ）ａｒａＣの添加により、Ｐｒ７．５ｅ単独の場合（ａｒａＣを用いる場合と用いない場合の両方）に得られるのとほぼ同じレベルまでＯＶＡ発現が抑制されること（棒５および棒６と比べた棒７）が示される。ａｒａＣ処理を伴う空ベクター対照およびａｒａＣ処理を伴わない空ベクター対照（棒９および棒１０）は、バックグラウンドのＯＶＡレベルの基準として使用し、ゼロ（発現無し）に設定した。

牛痘ウイルスのＡＴＩ遺伝子の周知のＰｒＡＴＩ後期プロモーターを使用する別の実験では、ＰｒＳＳＬが強力な後期クラスプロモーターと直列して働く能力が示される。この実験の結果は図３に示す。図３は、牛痘ウイルスに由来する周知の強力な後期プロモーターであるＰｒＡＴＩの存在下での組換えＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）からのＯＶＡ発現（コ
ンストラクトＰｒＡＴＩ−フィラー−ＯＶＡ）を、直列型のＰｒＡＴＩ−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡの場合と比較して示す。市販の定量用オボアルブミン特異的ＥＬＩＳＡ（ＳＥＲＡＭＵＮ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ）を用いて発現を測定し、市販のＢＣＡアッセイ（ＵＰＴＩＭＡ）を用いて全タンパク質を測定する。発現の値は、ＰｒＡＴＩ−フィラー−ＯＶＡ（棒１）の発現に対する倍率ｘとして算出する。図３の棒１および棒２の相対的タンパク質レベルを比較することによって確認できるように、ＰｒＡＴＩプロモーターへのＰｒＳＳＬ配列の融合（棒２、ＰｒＡＴＩ−ＰｒＳＳＬ−ＯＶＡ）の結果、１４倍多いオボアルブミン発現が得られる。これにより、ＰｒＳＳＬがＭＶＡにおいて強力なプロモーターであること、およびそれがＰｒＡＴＩプロモーターと直列して協同的に働けることが実証される。

したがって、まとめると、図２および図３に示す結果から、ＰｒＳＳＬが他のプロモーターエレメントと協力して働く能力が確認される。初期のみのプロモーターと併用すると、ＰｒＳＳＬは、その独自の後期プロモーター活性で初期プロモーター活性を補完して、全体的なタンパク質発現を有意に増大させる。別の初期／後期プロモーターと併用すると、ＰｒＳＳＬは、既に高いタンパク質発現レベルをさらに高いレベルまで向上させる。ポックスウイルス後期プロモーターと併用すると、これは、発現レベルを著しく向上させる。

Claims (8)

1. 発現させようとする核酸に作動可能に連結された配列番号１に示される核酸配列からなるプロモーターを含むポックスウイルスベクター。
2. 前記プロモーターが、核酸がＤＮＡの場合には開始コドンＡＴＧに直接的に結合されており、前記開始コドンは＋１位〜＋３位に位置する、請求項１に記載のベクター。
3. ＋４位がＧである、請求項２に記載のベクター。
4. 前記ポックスウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターである、請求項１〜３のいずれかに記載のベクター。
5. 前記ワクシニアウイルスベクターが、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターである、請求項４に記載のベクター。
6. 前記ワクシニアウイルスベクターが、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）においてｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖的複製（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）する能力を有するが、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａＴ、ヒト胎児由来腎臓細胞株２９３、ヒト骨肉腫細胞株１４３Ｂ、およびヒト子宮頸部腺癌細胞株ＨｅＬａにおいて増殖的複製する能力は有さないＭＶＡベクターである、請求項５に記載のベクター。
7. 請求項１から６のいずれかに記載のベクターを含む、宿主細胞。
8. 請求項１から６のいずれかに記載のベクター、および／または請求項７に記載の宿主細胞を含む組成物。

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