JP2019511722A - 対象の細胞媒介性免疫能を測定するための方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、対象の細胞媒介性免疫能を測定するための方法に関する。この方法は、対象からの免疫細胞を含む試料に対して細胞媒介性イムノアッセイ法(CMI)を実施することを含む。この方法は、少なくとも3種のウイルス抗原に由来するペプチドのプールに対する免疫応答をインビトロで検出することをさらに含む。

Description

発明の分野
本発明は、対象の細胞媒介性免疫能を測定するための方法に関する。特に、この方法は、免疫細胞、例えば対象から得られた末梢血単核細胞(PBMC)を含む試料に対して細胞媒介性イムノアッセイ法を実施すること、および少なくとも3種のウイルス抗原に対する免疫応答を検出することを含む。
背景
免疫能は、適応(T細胞およびB細胞)免疫応答および先天(補体およびToll様受容体)免疫応答を含む正常に機能している免疫応答が個体に存在することに関する。免疫能、特に細胞媒介性免疫能を測るように設計されたアッセイ法を用いて、抗原に対するドナーのT細胞応答をモニターすることができる。個体の免疫能、特に、細胞媒介性免疫応答を開始する一般能力を測るまたはモニターすることが望ましい。例えば、免疫能の評価は、移植、癌、自己免疫疾患、HIVを含むいくつかの疾患状態およびワクチン試験に関して、臨床医にとって有用である。
免疫機能性の指標を提供するアッセイ法には、市販品のCylex ImmunknowおよびQFT Monitor(登録商標)が含まれる。また、混合リンパ球反応(MLR)を用いて、個体における免疫応答を評価することもできる。
Cylex Immunknowは、PHAによる刺激後の全血からのATP産生を測る。これは、血液試料中に含まれる細胞の非特異的刺激に依拠している。免疫機能性を測るためのこのアッセイ法の有効性については、様々な結果が得られている(Lipschultz et al. (2014))。
Quantiferon Monitor(登録商標)は、免疫機能の定性的指標および定量的指標の両方を与える(Quantiferon Monitor(登録商標)Pack Insert 2014)。特に、QFMは、先天性(TLR媒介性)抗原+適応性(TCR媒介性)抗原の組合せを用いて全血を刺激することを含む。抗原に応答して細胞から分泌されるIFNγは、ELISAによって検出される。QFM読み取り値に基づいて、ドナーは次の3つのカテゴリーに分けられる:低(<15IU/mL IFNγ)、中(15〜1000IU/mL IFNγ)、および高(IU/mL IFNγ)。
混合リンパ球反応(MLR)アッセイ法は、T細胞機能性の予測因子として研究団体において使用されている(Manji et al. (1975))。特に、MLRアッセイ法は、PBMC試料を(増殖を防ぐように処置された)対照に由来するPBMCと混合すること、放射性色素を添加すること、および放射性色素の崩壊に基づいて試料PBMCの増殖を測ることを含む。
本発明者らは、ウイルス抗原の選択物を用いることによって個体の細胞媒介性免疫能を測定できることを確認した。ウイルス抗原の適切なプールを選択することによって、幅広い個体の免疫能を測定して、幅広い個体の免疫能を試験するための単一のアッセイ法システムを開発可能にすることができる。
本発明によれば、対象の細胞媒介性免疫能を測定するための方法が提供され、この方法は、免疫細胞、例えば対象からの末梢血単核細胞(PBMC)を含む試料に対して細胞媒介性イムノアッセイ法(CMI)を実施することを含み、この方法は、少なくとも3種のウイルス抗原に由来するペプチドのプールに対する免疫応答をインビトロで検出することを含む。
プールまたはペプチドが、少なくとも4種、5種、または6種のウイルス抗原に由来する、請求項1に記載の方法。
好ましい態様において、ペプチドのプールは、3種、4種、または5種のウイルス抗原に由来する。
1つの局面において、ウイルス抗原は、ヒトアデノウイルス3のヘキソンタンパク質、インフルエンザウイルスの基質タンパク質1(H3N2)、エプスタイン・バーウイルスのBZLF-1タンパク質、インフルエンザウイルスのヌクレオカプシドタンパク質、呼吸器合胞体ウイルスの融合糖タンパク質G0より選択される。
本発明の1つの局面において、ウイルス抗原は、ヒトアデノウイルス3のヘキソンタンパク質、呼吸器合胞体ウイルスの融合糖タンパク質G0、およびインフルエンザウイルスのヌクレオカプシドタンパク質からなる。
本発明の別の局面において、ウイルス抗原は、ヒトアデノウイルス3のヘキソンタンパク質、インフルエンザウイルスの基質タンパク質1、インフルエンザウイルスのヌクレオカプシドタンパク質、および呼吸器合胞体ウイルスの融合糖タンパク質G0からなる。
本発明のさらなる局面において、ウイルス抗原は、ヒトアデノウイルス3のヘキソンタンパク質、エプスタイン・バーウイルスのトランスアクチベータータンパク質BZLF1、および呼吸器合胞体ウイルスの融合糖タンパク質G0からなる。
本発明のさらなる局面において、ウイルス抗原は、ヒトアデノウイルス3のヘキソンタンパク質、エプスタイン・バーウイルスのBALF-4、BMLF-1、BRLF-1、BZLF-1 EBNA-1、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-4、LMP-1、およびLMP-2タンパク質、インフルエンザウイルスの基質タンパク質1、インフルエンザウイルスのヌクレオカプシドタンパク質、ならびに呼吸器合胞体ウイルスの融合糖タンパク質G0からなる。
ELISPOTアッセイ法におけるヘキソン、EBV、MP1、NP、FGF0、およびBZLF1の加速安定性試験のグラフ例。 ELISPOTアッセイ法における混合ペプチドプール(ICAミックス)および個々のペプチドプールの合計(加算)のグラフ例。 ELISPOTアッセイ法における、様々な民族性のドナーの試験。 ELISPOTアッセイ法においてICAミックスを用いた、免疫適格性ドナーの応答の変動の試験を示すグラフ例。
発明の詳細な説明
開示される方法の様々な用途は、当技術分野における個々の必要に合わせられることを理解すべきである。また、本明細書において使用される専門用語は、本発明の特定の態様を説明することだけを目的とし、限定することを意図しないことも理解すべきである。
さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈において特に規定がない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「断片(a fragment)」への言及は、「断片(fragments)」を含み、「細胞(a cell)」への言及は、2つまたはそれより多いそのような細胞を含み、「対象(a subject)」への言及は、2人またはそれより多いそのような対象を含むなどである。
本明細書に引用したすべての刊行物、特許、および特許出願は、前述であるか後述であるかを問わず、全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本発明の方法
本発明者らは、細胞媒介性イムノアッセイ法(CMIアッセイ法)を用いて対象の免疫能を測定する方法を特定した。免疫能、特に細胞媒介性免疫能を測定するように設計されたCMIアッセイ法を用いて、抗原に対するドナーのT細胞応答をモニターすることができる。本発明者らは、多種多様な個体における細胞媒介性免疫応答を検出するために、ウイルス抗原の適切なプールを選択できることを確認した。ウイルス抗原のプールは、免疫適格性の個体において、個体の背景に関わらず、応答をもたらす。したがって、このアッセイ法を用いて、イムノコンピテントな個体、およびまた、効果的な免疫応答を開始できない個体を特定することができる。
したがって、本発明は、対象の免疫能を測定するための方法を提供し、この方法は、免疫細胞、例えば対象からの末梢血単核細胞(PBMC)を含む試料に対して細胞媒介性イムノアッセイ法(CMI)を実施することを含み、この方法は、少なくとも3種のウイルス抗原に由来するペプチドのプールに対する免疫応答をインビトロで検出することを含む。
この方法は、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、または少なくとも6種のウイルス抗原、最大7種または8種のウイルス抗原に由来するペプチドのプールを含んでよい。
特に好ましい態様において、ペプチドは、3種、4種、5種、または6種のウイルス抗原に由来する。特に好ましい態様において、ペプチドは、3種、4種、または5種(ただし、これより多くない)ウイルス抗原に由来する。本発明の別の局面において、ペプチドは、2種、3種、または4種のウイルス抗原に由来し、EBVに由来する抗原のプールをさらに含むが、他のいかなるウイルス抗原も含まない。
ペプチドのプールは、単一種のウイルスの、複数種のウイルスの、またはすべて異なるウイルスのウイルス抗原に由来するペプチドを含んでよい。ペプチドのプールは、同じウイルスおよび異なるウイルスのウイルス抗原に由来するペプチドを含んでよい。本発明の好ましい局面において、少なくとも3種のウイルス抗原は、少なくとも2種のウイルス、好ましくは3種、4種、5種、または6種のウイルスに由来する。好ましい態様において、少なくとも3種のウイルス抗原は、ヒトアデノウイルス3、インフルエンザウイルス、エプスタイン・バーウイルス、および呼吸器合胞体ウイルスのうちの1つまたは複数に由来する。
より好ましい態様において、ウイルス抗原は、ヒトアデノウイルス3に由来するヘキソンタンパク質、インフルエンザウイルスに由来する基質タンパク質1、インフルエンザウイルスに由来するヌクレオカプシドタンパク質、エプスタイン・バーウイルスに由来するBZLF-1タンパク質、および呼吸器合胞体ウイルスに由来する融合糖タンパク質G0より選択される。インフルエンザウイルスは、任意のインフルエンザ株であってよい。特に好ましい態様において、インフルエンザウイルスは、インフルエンザ株H3N2である。
本発明の1つの態様において、ウイルス抗原のプールは、ヒトアデノウイルス3のヘキソンタンパク質、呼吸器合胞体ウイルスの融合糖タンパク質G0、およびインフルエンザウイルスのヌクレオカプシドタンパク質からなる。
本発明の別の態様において、ウイルス抗原のプールは、ヒトアデノウイルス3のヘキソンタンパク質、インフルエンザウイルスの基質タンパク質1、インフルエンザウイルスのヌクレオカプシドタンパク質、および呼吸器合胞体ウイルスの融合糖タンパク質G0からなる。
本発明のさらなる態様において、ウイルス抗原のプールは、ヒトアデノウイルス3のヘキソンタンパク質、エプスタイン・バーウイルスのトランスアクチベータータンパク質BZLF1、および呼吸器合胞体ウイルスの融合糖タンパク質G0からなる。
別の好ましい態様において、ウイルス抗原のうちの1つまたは複数は、エプスタイン・バーウイルスに由来し、これらのウイルス抗原は、BALF-4、BMLF-1、BRLF-1、BZLF-1 EBNA-1、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-4、LMP-1、およびLMP-2タンパク質のうちの1つまたは複数を含む。特に好ましい態様において、EBVに由来するペプチドのプールが提供され、このペプチドのプールは、BALF-4、BMLF-1、BRLF-1、BZLF-1 EBNA-1、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-4、LMP-1、およびLMP-2タンパク質のそれぞれに由来するペプチドを含む。このようなEBVペプチドのプールは、ヒトアデノウイルス3のヘキソンタンパク質、インフルエンザウイルスの基質タンパク質1、インフルエンザウイルスのヌクレオカプシドタンパク質、および呼吸器合胞体ウイルスの融合糖タンパク質G0と組み合わせて提供されてよい。
CMI応答についてのアッセイ法
細胞媒介性免疫(CMI)応答は、個体の免疫状態を明らかにするために使用される。典型的には、臨床免疫学の分野において、CMI応答という用語は、皮膚試験、リンパ球増殖アッセイ法、および特異的抗原の存在下で免疫細胞、例えば末梢血単核細胞(PBMC)によって産生されるサイトカインの検出を包含する。本発明の方法は、インビトロでの細胞媒介性免疫応答を検出することを含んでよい。具体的には、インビトロでの、ペプチドに対するサイトカインに基づくCMI応答が、本発明の方法において検出され得る。
免疫系の細胞は、抗原による刺激の後に、サイトカインのような免疫エフェクター分子を産生することができる。CMIアッセイ法は、細胞試料を抗原と共にインキュベートすること、および選択された抗原に対して個体が細胞媒介性免疫応答を生じることができることを示すために、サイトカインのような免疫エフェクター分子の存在(もしくは非存在)または量を測定することを含む。CMIアッセイ法で使用するための細胞には、全血試料、免疫細胞、例えば末梢血単核細胞(PMBC)を含む試料、ならびにリンパ球(特にT細胞)および抗原提示細胞(APC)の単離された集団が含まれ得る。APCは、各T細胞の表面のT細胞受容体が抗原を認識できるように抗原をプロセシングするのに関与している。抗原認識は、サイトカイン産生を誘発し得る。
サイトカインを産生する細胞は、フローサイトメトリーによって特定することができる。フローサイトメトリーは、サイトカイン産生細胞の頻度および/または細胞によるサイトカイン産生の量を定量するのに使用され得る。抗原誘発性サイトカインは、アッセイ媒体中に放出され、例えばELISA法によって直接的に検出され得るか、または酵素結合イムノスポットアッセイ法(ELISPOT)を用いて、サイトカイン分泌T細胞の頻度の観点から定量され得る。本発明の方法は、好ましくは、ELISPOTを含む。
酵素結合イムノスポットアッセイ法(ELISPOT)は、別名フィルターイムノプラークアッセイ法としても公知であり、元々は、個々の抗体分泌B細胞を検出および定量するために開発された。開発された当時、この技術は、従来のプラーク形成細胞アッセイ法に代わる迅速かつ用途の広い方法を提供した。最近の改良により、ELISPOTの感度が向上し、その結果、1秒当たりわずか100分子の特定タンパク質を産生する細胞を検出することができる。このため、ELISPOTアッセイ法は、従来のELISAアッセイ法よりはるかに感度が高くなっている。ELISPOTアッセイ法は、タンパク質分泌細胞のすぐ近くを取り囲む環境で、比較的高濃度の所与のタンパク質性細胞産物(例えばサイトカイン)を利用する。これらの細胞産物を、高親和性抗体を用いて捕捉および検出する。ELISPOTアッセイ法は、Current Protocols in Immunology, Unit 6.19 pages 6.19. 1-8で概説されている。
典型的には、ELISPOTアッセイ法は、6つの段階を含む:(1)メンブレンで裏打ちしたマイクロタイタープレートに、精製したサイトカイン特異的抗体をコーティングする段階;(2)プレートをブロッキングして、他の任意のタンパク質の非特異的吸収を防止する段階;(3)適切な試薬と共にサイトカイン分泌細胞をインキュベーションする段階;(4)細胞および試薬の除去;(5)標識した第2の抗サイトカイン抗体を添加する段階;ならびに(6)メンブレン上の抗体-サイトカイン複合体を検出する段階。
免疫応答
インビトロで検出される免疫応答は、本発明の少なくとも3種のウイルス抗原によって誘発される任意の応答であってよい。免疫応答は、任意のタイプの免疫細胞によって媒介されてよい。特に好ましい態様において、免疫応答は、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、および単球より選択される1種または複数種の免疫細胞を含み得る末梢血単核細胞(PBMC)によって媒介される。典型的には、免疫応答は、サイトカイン分泌を評価することによって、好ましくはインターフェロンγ(IFN-γ)分泌を評価することによって、測定される。サイトカイン分泌を測定する方法は、当技術分野において周知である。免疫応答は、好ましくはT細胞応答である。
免疫応答は、インビトロで起こってよい。好ましくは、免疫応答は、インビトロのCMI応答である。CMI応答は、抗体を要さない免疫応答である。その代わりに、CMI応答は、細胞障害性T細胞活性化、様々なサイトカインの産生の増加、および/または抗原に応答しての様々なサイトカインの放出を伴い得る。インビトロのCMI応答を検出するための方法は、当技術分野において公知であり、上記に詳細に説明している。
本発明の方法は、免疫応答の存在または非存在を検知し得る。本発明の方法に基づく少なくとも3種のウイルス抗原に対する免疫応答の存在は、対象が免疫適格性であることを示し得る。本発明の方法に基づく少なくとも3種のウイルス抗原に対する免疫応答の非存在は、対象の免疫適格性が低いことを示し得る。
断片
本発明の方法によるウイルス抗原の断片は、親配列のN末端および/またはC末端の切断によって誘導される、5個もしくはそれより多いアミノ酸を含む配列であってよい。例えば、断片は、約5個もしくはそれより多い、約6個もしくはそれより多い、約7個もしくはそれより多い、約8個もしくはそれより多い、約9個もしくはそれより多い、約10個もしくはそれより多い、約11個もしくはそれより多い、約12個もしくはそれより多い、約13個もしくはそれより多い、約14個もしくはそれより多い、約15個もしくはそれより多い、約16個もしくはそれより多い、約17個もしくはそれより多い、約18個もしくはそれより多い、約19個もしくはそれより多い、約20個もしくはそれより多い、約21個もしくはそれより多い、約22個もしくはそれより多い、約23個もしくはそれより多い、約24個もしくはそれより多い、約25個もしくはそれより多い、約26個もしくはそれより多い、または約27個もしくはそれより多いアミノ酸を含んでよい。断片は、約5〜約27、約6〜約26、約7〜約25、約8〜約24、約9〜約23、約10〜約22、約11〜約21、約12〜約20、約13〜約19、約14〜約18、約12〜約18、約12〜約15、約15〜約18、約13〜約17、約14〜約16、約5〜約10、約10〜約15、約15〜約20、約20〜約25、または約10〜約20アミノ酸長であってよい。
これらの断片は、例えばタンパク質分解切断によって親タンパク質から化学的に誘導してもよく、または例えば親タンパク質のアミノ酸配列を利用し、その配列に基づいて断片を合成することによって、知的な意味で親タンパク質から誘導することができる。断片は、当技術分野において周知の方法を用いて合成されてよい。
「断片」という用語は、アミノ酸残基がペプチド(-CO-NH-)結合によって連結されている分子だけでなく、ペプチド結合が逆向きになっている分子も含む。このようなレトロ-インバーソペプチドミメティックは、当技術分野において公知の方法、例えばMeziere et al (1997) J. Immunol.159, 3230-3237で説明されているものなどを用いて作製することができる。このアプローチは、主鎖に関わるが側鎖の向きには関わらない変化を含む擬似ペプチドを作製することを含む。Meziere et al (1997)は、少なくともMHCクラスIIおよびTヘルパー細胞の応答のために、これらの擬似ペプチドが有用であることを示している。CO-NHペプチド結合の代わりにNH-CO結合を含むレトロインバースペプチドの方が、タンパク質分解に対する耐性がずっと高い。
同様に、アミノ酸残基の炭素原子間の間隔を保持する適切なリンカー部分が使用されることを条件として、ペプチド結合が完全に省かれてもよい;これは、リンカー部分がペプチド結合と実質的に同じ電荷分布および実質的に同じ平面性を有している場合、特に好ましい。細胞外タンパク分解消化に対する感受性を低くするのを助けるために、断片のN末端またはC末端を便宜的にブロックしてよいこともまた、理解されるであろう。例えば、カルボン酸と反応させることによってペプチドのN末端アミノ基を保護してもよく、アミンと反応させることによってペプチドのC末端カルボキシル基を保護してもよい。例えば、断片の安定性を高めるために、断片のN末端および/またはC末端に1つまたは複数の付加的なアミノ酸残基を付加してもよい。修飾の他の例には、グリコシル化およびリン酸化が含まれる。別の実施可能な修飾は、RまたはKの側鎖アミンの水素をメチレン基で置換してよいというものである(-NH2→-NH(Me)または-N(Me)2)。
本発明の方法に基づく少なくとも3種のウイルス抗原の断片には、インビボでの断片の半減期を延長または短縮する断片の変種も含まれてよい。本発明による断片の半減期を延長することができる変種の例には、断片のペプトイド類似体、断片のD-アミノ酸誘導体、およびペプチド-ペプトイドハイブリッドが含まれる。断片は、D-アミノ酸型の断片も含んでよい。L-アミノ酸ではなくD-アミノ酸を用いてポリペプチドを調製すると、通常の代謝過程によるそのような作用物質の任意の望まれない分解が大きく減少して、投与される必要がある作用物質の量が、投与頻度と共に減少する。D-アミノ酸型の親タンパク質も使用されてよい。
本発明の方法による断片は、親タンパク質鎖をコードする一次転写産物の選択的スプライシングによって生じるmRNAにコードされる、親タンパク質のスプライス変種に由来してもよい。断片は、親タンパク質の少なくともMHC結合特性または抗体結合特性を保持している、親タンパク質のアミノ酸変異体、グリコシル化変種、および他の共有結合誘導体に由来してもよい。例示的な誘導体には、本発明の断片が、置換、化学的、酵素的、または他の適切な手段によって、天然に存在するアミノ酸以外の部分で共有結合的に修飾されている分子が含まれる。
断片プール
本発明の方法は、1つまたは複数の断片を含むペプチドのプールに対する免疫応答をインビトロで検出することを含んでよい。ペプチドのプールは、単一種のウイルスの、複数種のウイルスの、またはすべて異なるウイルスのウイルス抗原に由来する断片を含んでよい。ペプチドのプールは、同じウイルスおよび異なるウイルスのウイルス抗原に由来する断片を含んでよい。本発明の好ましい局面において、1つまたは複数の断片は、少なくとも3種のウイルス抗原、すなわち、2種のウイルス、好ましくは3種、4種、5種、または6種のウイルスに由来する少なくとも3種のウイルス抗原に由来する。好ましい態様において、1つまたは複数の断片は、少なくとも3種のウイルス抗原、すなわち、ヒトアデノウイルス3、インフルエンザウイルス、エプスタイン・バーウイルス、および呼吸器合胞体ウイルスのうちの1つまたは複数に由来する少なくとも3種のウイルス抗原に由来する。
より好ましい態様において、ペプチドのプールは、ヒトアデノウイルス3に由来するヘキソンタンパク質、インフルエンザウイルスに由来する基質タンパク質1、インフルエンザウイルスに由来するヌクレオカプシドタンパク質、エプスタイン・バーウイルスに由来するBZLFタンパク質、および呼吸器合胞体ウイルスに由来する融合糖タンパク質G0より選択される1種または複数種のウイルス抗原の1つまたは複数の断片を含む。インフルエンザウイルスは、任意のインフルエンザ株であってよい。特に好ましい態様において、インフルエンザウイルスは、インフルエンザ株H3N2である。
本発明の1つの態様において、ペプチドのプールは、ヒトアデノウイルス3のヘキソンタンパク質、呼吸器合胞体ウイルスの融合糖タンパク質G0、およびインフルエンザウイルスのヌクレオカプシドタンパク質からなる1種または複数種のウイルス抗原の1つまたは複数の断片を含む。
本発明の別の態様において、ペプチドのプールは、ヒトアデノウイルス3のヘキソンタンパク質、インフルエンザウイルスの基質タンパク質1、インフルエンザウイルスのヌクレオカプシドタンパク質、および呼吸器合胞体ウイルスの融合糖タンパク質G0からなる1種または複数種のウイルス抗原の1つまたは複数の断片を含む。
本発明のさらなる態様において、ペプチドのプールは、ヒトアデノウイルス3のヘキソンタンパク質、エプスタイン・バーウイルスのトランスアクチベータータンパク質BZLF1、および呼吸器合胞体ウイルスの融合糖タンパク質G0からなる1種または複数種のウイルス抗原の1つまたは複数の断片を含む。
本発明の1つの態様において、ペプチドのプールは、エプスタイン・バーウイルスに由来する1種または複数種のウイルス抗原の1つまたは複数の断片を含み、これらのウイルス抗原は、BALF-4、BMLF-1、BRLF-1、BZLF-1 EBNA-1、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-4、LMP-1、および/またはLMP-2タンパク質を含む。特に好ましい態様において、EBVに由来する1つまたは複数の断片を含むペプチドのプールが提供され、このペプチドのプールは、BALF-4、BMLF-1、BRLF-1、BZLF-1 EBNA-1、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-4、LMP-1、および/またはLMP-2タンパク質のそれぞれに由来する断片を含む。このようなEBVペプチド断片のプールは、ヒトアデノウイルス3のヘキソンタンパク質、インフルエンザウイルスの基質タンパク質1、インフルエンザウイルスのヌクレオカプシドタンパク質、および呼吸器合胞体ウイルスの融合糖タンパク質G0と組み合わせて提供されてよい。
プールは、少なくとも3種のウイルス抗原に由来する、1個もしくはそれより多い、2個もしくはそれより多い、3個もしくはそれより多い、4個もしくはそれより多い、5個もしくはそれより多い、6個もしくはそれより多い、7個もしくはそれより多い、8個もしくはそれより多い、9個もしくはそれより多い、10個もしくはそれより多い、15個もしくはそれより多い、20個もしくはそれより多い、25個もしくはそれより多い、50個もしくはそれより多い、75個もしくはそれより多い、100個もしくはそれより多い、200個もしくはそれより多い、または250個もしくはそれより多い断片を含んでよい。
1つの態様において、本発明の方法は、断片を含むペプチドのプールに対する免疫応答をインビトロで検出することを含む。好ましくは、この方法は、1種または複数種のウイルス抗原の1つまたは複数の断片を含むペプチドのプールに対する免疫応答をインビトロで検出することを含む。さらに好ましくは、この方法は、1種または複数種のウイルス抗原のそれぞれの1つまたは複数の断片を含むペプチドのプールに対する免疫応答をインビトロで検出することを含む。
下記に説明するように、方法は、1つまたは複数のタンパク質断片ライブラリーに対する免疫応答をインビトロで検出することも含んでよい。
タンパク質断片ライブラリー
1つの態様において、プール中の断片は、タンパク質断片ライブラリーを形成する。タンパク質断片ライブラリーは、親タンパク質、すなわち本発明の場合、ヒトアデノウイルス3に由来するヘキソンタンパク質、インフルエンザウイルスに由来する基質タンパク質1、インフルエンザウイルスに由来するヌクレオカプシドタンパク質、エプスタイン・バーウイルスに由来するBALF-4、BMLF-1、BRLF-1、BZLF-1 EBNA-1、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-4、LMP-1、およびLMP-2タンパク質、ならびに呼吸器合胞体ウイルスに由来する融合糖タンパク質G0、に由来する複数の断片であって、親タンパク質の配列の少なくとも10％、例えば、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％を全体として包含する、複数の断片を含む。本発明において、プール中の断片は、好ましくは、それらの断片の由来元であるタンパク質の配列の少なくとも80％を包含するタンパク質断片ライブラリーを形成する。より好ましくは、プール中の断片は、それらの断片の由来元であるタンパク質の配列全体を包含するタンパク質断片ライブラリーを形成する。
タンパク質断片ライブラリーは、CD4+T細胞および/またはCD8+T細胞を刺激することができる断片を含んでよい。好ましくは、タンパク質断片ライブラリーは、CD4+T細胞とCD8+T細胞の両方を刺激することができる断片を含む。刺激のために最適な断片サイズがCD4+T細胞とCD8+T細胞とでは異なることは、当技術分野において公知である。約9個のアミノ酸からなる断片(9mer)は、典型的にはCD8+T細胞のみを刺激し、約20個のアミノ酸からなる断片(20mer)は、典型的にはCD4+T細胞のみを刺激する。大まかに言えば、CD8+T細胞は、配列に基づいて抗原を認識する傾向があるのに対し、CD4+T細胞は、より高次の構造に基づいて抗原を認識する傾向があることが、この理由である。しかし、約15個のアミノ酸からなる断片(15mer)は、CD4+T細胞とCD8+T細胞の両方を刺激することができる。したがって、タンパク質断片ライブラリーは、約15アミノ酸長、例えば、約12アミノ酸長、約13アミノ酸長、約14アミノ酸長、約15アミノ酸長、約16アミノ酸長、約17アミノ酸長、または約18アミノ酸長である断片を好ましくは含む。
プール中の断片すべてが同じ長さであってもよい。あるいは、プールは、様々な長さの断片を含んでもよい。断片の長さは上記に考察した。
タンパク質断片ライブラリーは、配列が重複している断片を含んでよい。したがって、各プールは、配列が重複している断片を含んでよい。これらの配列は、1つまたは複数のアミノ酸が、例えば、2個もしくはそれより多い、3個もしくはそれより多い、4個もしくはそれより多い、5個もしくはそれより多い、6個もしくはそれより多い、7個もしくはそれより多い、8個もしくはそれより多い、9個もしくはそれより多い、10個もしくはそれより多い、11個もしくはそれより多い、12個もしくはそれより多い、13個もしくはそれより多い、14個もしくはそれより多い、15個もしくはそれより多い、16個もしくはそれより多い、17個もしくはそれより多い、18個もしくはそれより多い、19個もしくはそれより多い、または20個もしくはそれより多いアミノ酸が重複してよい。これらの配列は、9個またはそれより多いアミノ酸、例えば、10個もしくはそれより多い、11個もしくはそれより多い、または12個もしくはそれより多いアミノ酸が重複していることが好ましく、これによりCD8+T細胞を刺激することができる9merを含む断片の数が最大になることがその理由である。より好ましくは、配列は、11個のアミノ酸が重複している。プール中の重複断片のすべてにおいて、同じ数のアミノ酸が重複していてもよい。あるいは、プールは、配列において様々な数のアミノ酸が重複している断片を含んでもよい。
タンパク質断片ライブラリーは、9〜12(例えば、9〜11または10〜12)個のアミノ酸が重複している12〜18(例えば、12〜15、15〜18、13〜17、または14〜16)アミノ酸長の断片を含んでよい。例えば、タンパク質断片ライブラリーは、(i)9個、10個、もしくは11個のアミノ酸が重複している14アミノ酸長の、(ii)9個、10個、もしくは11個のアミノ酸が重複している15アミノ酸長の、または(iii)9個、10個、もしくは11個のアミノ酸が重複している16アミノ酸長の、断片を含んでよい。タンパク質断片ライブラリーは、好ましくは、11個のアミノ酸が重複している15アミノ酸長の断片を含む。
断片の一般的特性は、上述した。
エプスタイン・バーウイルスのプールは、重複している断片が必要とされない、エプスタイン・バーウイルスペプチドに由来する1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、または26個の断片を含んでよい。例えば、ペプチドのプールは、表6に示すペプチドを含んでよい。
試料
本発明の少なくとも3種のウイルス抗原に対する免疫応答のインビトロ検出は、対象から得られた試料を用いて実施する。好ましい態様において、試料は、血液試料である。
対象
本発明の方法は、任意の適切な対象の免疫能を測定するのに使用され得る。通常、対象はヒト対象である。
細胞
1つの態様において、本発明の方法は、免疫細胞、例えば末梢血単核細胞を含む試料に対して細胞媒介性イムノアッセイ法を実施することを含み、この方法は、少なくとも3種のウイルス抗原に由来するペプチドのプールに対する免疫応答をインビトロで検出することを含む。ペプチドのプールは、ウイルス抗原のうちの1種もしくは複数種の1つもしくは複数の断片または1種もしくは複数種のウイルス抗原のそれぞれの1つもしくは複数の断片を含んでよい。これらのウイルス抗原は、1つまたは複数のタンパク質断片ライブラリーを構成してよい。
典型的には、試料を十分な量の少なくとも3種のウイルス抗原と接触させて、ウイルス抗原に対する免疫応答を生じさせる。試料は、ペプチドまたは断片が試料への接触前に混合されているペプチドのプールと接触させてもよく;あるいは試料は、各ウイルス抗原もしくは断片と逐次的に、またはウイルス抗原もしくは断片の任意の組合せを用いて同時に、接触させてもよい。好ましい態様において、試料は、すべてのウイルス抗原と同時に接触させられ、その際、これらのウイルス抗原は、試料への接触前に混合されている。
試料は、任意の量の少なくとも3種のウイルス抗原、例えば、約1ng/ml、約5ng/ml、約10ng/ml、約50ng/ml、約100ng/ml、約500ng/ml、約1μg/ml、約5μg/ml、約10μg/ml、約50μg/ml、約100μg/ml、約500μg/ml、1mg/ml、約5mg/ml、約10mg/ml、約50mg/ml、約100mg/ml、または約500mg/mlの少なくとも3種のウイルス抗原と接触させてよい。試料は、同時または逐次的に、少なくとも3種のウイルス抗原と接触させてよい。
免疫細胞は、T細胞、B細胞、樹状細胞、好中球、好塩基球、肥満細胞、好酸球、自然リンパ球系細胞(ILC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、マクロファージ、および胸腺細胞より選択される1つまたは複数のタイプの免疫細胞を含んでよい。免疫細胞を含む試料は、免疫細胞の集団を含んでよい。集団は、これらのタイプの免疫細胞のすべてを含んでもよい。集団は、末梢血単核細胞(PBMC)を含んでよい。PBMCの試料は、T細胞、B細胞、NK細胞、および単球を含む。免疫細胞の集団は、T細胞を含んでよい。1つの態様において、免疫細胞の集団は、末梢血単核細胞を含む。
細胞試料を少なくとも3種のウイルス抗原と接触させることは、任意の適切な体積で実施してよい。試料の典型的な体積は、約10μl〜約1ml、好ましくは約50μl〜約500μl、より好ましくは約100μl〜約200μlの範囲である。典型的には、細胞を少なくとも3種のウイルス抗原と接触させる時間の長さは、約5分〜約50時間、例えば約10分〜約40時間、約20分〜約30時間、約30分〜約20時間、約45分〜約12時間、約1時間〜約6時間、好ましくは約10分〜約2時間である。細胞を、抗原と一晩接触させてもよい。
細胞は、任意の適切な温度で抗原と接触させてよい。典型的には、適切な温度は、細胞の由来元であるヒトまたは動物の通常の体温と同じ範囲の温度である。典型的には、インキュベーションは、約4℃〜約38℃の間、好ましくは約20℃〜約38℃の間の定温で、より好ましくは約37℃で、実施される。
典型的には、細胞は、ウェル中に存在する。好ましくは、細胞は、好ましくはメンブレンで裏打ちしたプレートである平らなプレートのウェル中に存在する。より好ましくは、試料は、標準的な96ウェルプレートまたは384ウェルプレートのウェル中に存在する。このようなプレートは、Fisher scientific、VWR suppliers、Nunc、Starstedt、またはFalconから市販されている。典型的には、ウェルの容量は、約25μl〜約250μl、約30μl〜約200μl、約40μl〜約150μl、または約50〜100μlである。対象から得られる細胞は、方法で使用される前に培養されてよい。これにより、分析される各試料中に、等しい数の付着細胞が存在することが可能になる。あるいは、細胞が固定または捕捉される場合、新鮮な血液細胞のような細胞を播種前に計数してもよい。細胞を培養するための技術は、当業者には周知である。典型的には、細胞は、血清を補充した培地において37℃、5％CO2の標準条件下で培養される。
細胞は、任意の適切なフラスコまたは容器中で培養し、次いで、ウェルに移してよい。典型的には、細胞は、ウェル中で培養される。好ましくは、細胞は、2個またはそれより多いウェルを含む平らなプレート、例えば、標準的な96ウェルプレートまたは384ウェルプレート中で培養される。典型的には、細胞をマーカーと共にインキュベートすることは、各ウェル中の培地を、マーカーを含む適切な溶液と交換することを伴う。適切な溶液は、当業者に周知である。
免疫応答性
前述したように、本発明の方法は、少なくとも3種のウイルス抗原に対する免疫応答をインビトロで検出することを含む。免疫応答の検出は、対象が免疫適格性であることを示す。免疫応答の検出の欠如(または検出のないこと)は、対象が免疫応答性ではなく、低い免疫能を有していることを示す。例えば、免疫適格性アッセイ法における免疫適格性ドナーとは、陰性対照においてスポットがなく、陽性対照において20個より多いスポットを示し、イムノコンピテンシーアッセイ法(ICA)抗原に応答して特異的IFN-γスポットを生じるドナーである。
治療的応用
本発明は、免疫細胞、例えば対象からの末梢血単核細胞(PBMC)を含む試料に対して細胞媒介性イムノアッセイ法(CMI)を実施することを含み、少なくとも3種のウイルス抗原に由来するペプチドのプールに対する免疫応答をインビトロで検出することを含む、対象の免疫能を測定するための方法を提供する。本発明の方法は、少なくとも3種のウイルス抗原に対するドナーの幅広いT細胞応答をモニターするために、臨床で有用であり得る。これは、移植、癌、自己免疫疾患、HIVを含むいくつかの疾患状態に関する患者の免疫能を評価する際、およびワクチン試験において、臨床医の助けになり得る。
実施例1-免疫原性が最も高い抗原の選択
ELISPOTアッセイ法によって、23個の市販のペプチドプールを用いて健常ドナー試料(31〜167)をスクリーニングした。免疫適格性ドナーのカバー率が最も良かったペプチドプールを特定するために、任意の10スポットのカットオフを設定した。次いで、各ペプチドプールに対する応答を、このカットオフを用いて評価した。表1は、応答性ドナーの比率に基づいてペプチドプールを順位付けしたものである。
（表１）ペプチドプールの順位付け
Figure 2019511722
Figure 2019511722
この解析により、応答性が最も高い5種の抗原の選択が可能になった(任意の10スポットのカットオフを基準とする)―ヘキソン、MP1、EBV、NP、およびFGF0。
ヘキソン、MP1、EBV、NP、およびFGF0に対する応答が弱かったドナー(<10スポット)を、残りのスクリーニング抗原に対する応答について評価した。BZLF1抗原は、これらのドナーにおいて10個を超えるスポット計数値を示したため、さらに試験するために選択した。
実施例2 溶解性
特別仕様のペプチドプール(ヘキソン、EBV、MP1、NP、FGF0、およびBZLF1)を合成し、凍結乾燥させたプールとして供給した。ジメチルスルホキシド(DMSO)を用いて、これらのペプチドプールを溶解して、プール中のペプチド1つ当たり625μg/mLの濃度にした。
すべてのペプチドプールの溶解を、首尾よく完了した。溶解性の問題は認められなかった。
実施例3 個々のペプチドプールの安定性の評価
使用濃度(3μg/mL)の各ペプチドプールの安定性を、加速安定性試験を用いて評価した。手短に言えば、次のとおりである:使用濃度のペプチドプールを37℃で8週間保存した。次いで、ELISPOTアッセイ法において、ストレスを加えたペプチドプールを、新たに希釈したペプチドプール(対照)と比較して試験した。各ドナーについて、3つのレプリケートを試験した。これらの研究の結果を図1に示している。
統計学的解析(マンホイットニーの検定)により、対照と37℃で8週間保存されたペプチドとでスポット計数値に統計学的有意差はないと判定された。
実施例4 免疫原性抗原の混合
ELISPOTアッセイ法でのペプチドプールのスクリーニングから得られたデータを再評価して、あたかも様々な抗原に由来するペプチドが混合されて1つのプールにされたかのように、ドナーの理論的カバー率を決定した。これは、個々のペプチドプールについてのスポット計数値を足すことによって実施した(例えば、ドナー15、ヘキソンスポット計数値=5、EBVスポット計数値=26、NPスポット計数値=5、理論上のミックス16スポット計数値=36)。スポット10〜350個の範囲内のドナーの比率を各ミックスについて計算した。この解析の結果を表2に示している。
（表２）ELISPOTアッセイ法におけるペプチドプールの理論上の組合せおよび結果として得られたドナーのカバー率(n=94〜100)
Figure 2019511722
Figure 2019511722
理論上の解析によって、以下のことを確認した:
・10種のミックスが、評価したドナーの95％超に応答を生じさせたであろうこと。
・ミックス25および26が、ELISPOTプレートリーダー上で正確に計数可能である上限であるスポット計数値(400+スポット)を理論上与えるであろうこと。これにより、スポット計数値10〜350個の範囲内のドナーの比率が低下した。
・13種のミックスをELISPOTアッセイ法でさらに試験するために選択した(表3)。
（表３）イムノコンピテンシーアッセイ法(ICA)のために選択したペプチドプールのミックス
Figure 2019511722
混合ペプチドプールの予測されるパフォーマンスが達成されるであろうことを確認するために、32種のドナーを用いるELISPOTアッセイ法において、ペプチドプールを個別に、およびミックスとして試験した。これらのミックスについて得られたスポット計数値を、個々の抗原に由来するスポット計数値を足した値と比較した(例えば、ドナー9743、ヘキソンスポット計数値=5、MP1スポット計数値=10、FGF0スポット計数値=6、ミックス1スポット計数値=28)。この比較の結果を図2に示す。
統計学的解析(マンホイットニーの検定)により、個々のペプチドプールのスポット計数値を足した値と混合ICAミックスとで統計学的有意差はないと判定された。
実施例5 ICAミックスの調製
溶解させたペプチドプール(プール中のペプチド1つ当たり625μg/mL)を混合して、イムノコンピテンシーアッセイ法(ICA)ミックスとした。調製時に問題は認められなかった。
実施例6 民族性
35名のコーカサス人ドナー、10名のアフリカ系アメリカ人ドナー、10名のラテンアメリカ系ドナー、および9名のアジア人ドナーから採取した血液試料を用いるELISPOTアッセイ法において、13種の選択されたICAミックスを試験した。この試験で得られた結果を図3に示している。
10スポットのカットオフを用いて、応答性ドナーの数を決定した(表4)。
（表４）任意の10スポットのカットオフを基準とする、ICAミックスに対して応答性のドナーの比率
Figure 2019511722
13種のミックスのうちの4つ(ICAミックス2、6、9、および12)は、10スポットのカットオフを基準として、民族性に関わらず、試験したドナーの90％以上で応答性であった。
実施例7 ICAミックスに対する応答の経時的変動
ICAミックスによって誘導される応答の自然変動を明らかにするために、ELISPOTアッセイ法でICAミックスを用いて、6名の免疫適格性血液ドナーを次の時点:0日目、3日目、7日目、14日目、28日目、56日目、および84日目に試験した。
図4は、2つのミックス例について、短期間(7日)および長期間(84日)における応答の変動を示す。
統計学的解析は、BioBridgesによって実施された。手短に言えば、次のとおりである:各ドナーの全時点のデータを用いて、個々のミックスに対して変動係数(％CV)を算出した。この後、6名のドナーから得られた各ミックスに対する％CV値をグループ分けし、平均値を算出した。これらの％CVの平均値は、ELISPOTアッセイ法においてICAミックスを用いたスポット計数値の変動の尺度であり、概略については表4を参照されたい。
（表５）ELISPOTアッセイ法におけるICAミックスに対する免疫適格性応答の自然変動の統計学的解析(n=6)
Figure 2019511722
（表６）
Figure 2019511722
Figure 2019511722
エプスタイン・バーウイルス、トランスアクチベータータンパク質BZLF1 タンパク質ID:P03206 SEQ ID NO: 27
Figure 2019511722
ヒトアデノウイルス3、ヘキソンタンパク質 タンパク質ID: P36849 SEQ ID NO: 28
>sp|P36849|CAPSH_ADE03 ヘキソンタンパク質 OS=ヒトアデノウイルスB血清型3 GN=L3 PE=2 SV=2
Figure 2019511722
インフルエンザA(H3N2)ウイルス、核タンパク質 タンパク質ID:I6LFN1 SEQ ID NO: 29
>tr|I6LFN1|I6LFN1_9INFA 核タンパク質 OS=インフルエンザAウイルス(A/ナンチャン/A2/1994(H3N2)) GN=NP PE=3 SV=1
Figure 2019511722
呼吸器合胞体ウイルス、融合糖タンパク質F0 タンパク質ID:O36634 SEQ ID NO: 30
>sp|O36634|FUS_HRSVB 融合糖タンパク質F0 OS=ヒト呼吸器合胞体ウイルスB(B1株) GN=F PE=1 SV=1
Figure 2019511722
インフルエンザAウイルス(H3N2)。基質タンパク質1。タンパク質ID:Q67157 SEQ ID NO: 31
>sp|Q67157|M1_I68A0 基質タンパク質1 OS=インフルエンザAウイルス(A株/アイチ/2/1968 H3N2) GN=M PE=3 SV=1
Figure 2019511722

Claims (18)

  1. 対象からの免疫細胞を含む試料に対して細胞媒介性イムノアッセイ法(CMI)を実施することを含み、少なくとも3種のウイルス抗原に由来するペプチドのプールに対する免疫応答をインビトロで検出することを含む、対象の細胞媒介性免疫能を測定するための方法。
  2. 免疫細胞が末梢血単核細胞(PBMC)である、請求項1に記載の方法。
  3. 免疫細胞がT細胞である、請求項1または請求項2に記載の方法。
  4. プールまたはペプチドが、少なくとも4種、5種、または6種のウイルス抗原に由来する、請求項1に記載の方法。
  5. ペプチドのプールが、3種、4種、または5種のウイルス抗原に由来する、請求項1に記載の方法。
  6. ウイルス抗原が、ヒトアデノウイルス3のヘキソンタンパク質、インフルエンザウイルスの基質タンパク質1(H3N2)、エプスタイン・バーウイルスのBZLF-1タンパク質、インフルエンザウイルスのヌクレオカプシドタンパク質、呼吸器合胞体ウイルスの融合糖タンパク質G0より選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
  7. ウイルス抗原が、ヒトアデノウイルス3のヘキソンタンパク質、呼吸器合胞体ウイルスの融合糖タンパク質G0、およびインフルエンザウイルスのヌクレオカプシドタンパク質からなる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
  8. ウイルス抗原が、ヒトアデノウイルス3のヘキソンタンパク質、インフルエンザウイルスの基質タンパク質1、インフルエンザウイルスのヌクレオカプシドタンパク質、および呼吸器合胞体ウイルスの融合糖タンパク質G0からなる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
  9. ウイルス抗原が、ヒトアデノウイルス3のヘキソンタンパク質、エプスタイン・バーウイルスのトランスアクチベータータンパク質BZLF1、および呼吸器合胞体ウイルスの融合糖タンパク質G0からなる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
  10. ウイルス抗原が、ヒトアデノウイルス3のヘキソンタンパク質、エプスタイン・バーウイルスのBALF-4、BMLF-1、BRLF-1、BZLF-1 EBNA-1、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-4、LMP-1、およびLMP-2タンパク質、インフルエンザウイルスの基質タンパク質1、インフルエンザウイルスのヌクレオカプシドタンパク質、ならびに呼吸器合胞体ウイルスの融合糖タンパク質G0からなる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
  11. ペプチドのプールが、1種または複数種のウイルス抗原の1つまたは複数の断片を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  12. ペプチドのプールが、1種または複数種のウイルス抗原のそれぞれの1つまたは複数の断片を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記断片が、前記断片の由来元であるウイルス抗原の配列の少なくとも80％を包含するタンパク質断片ライブラリーを形成する、請求項11〜12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記断片が、前記断片の由来元であるウイルス抗原の配列全体を包含するタンパク質断片ライブラリーを形成する、請求項13に記載の方法。
  15. 前記断片が、重複している配列を有している、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記配列において、11個のアミノ酸が重複している、請求項15に記載の方法。
  17. 前記断片が15アミノ酸長である、請求項11〜16のいずれか一項に記載の方法。
  18. 付随する説明および/または図面のいずれか1つを参照して実質的に本明細書において説明した方法。
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