CN109313179A

CN109313179A - 用于确定对象的细胞介导的免疫能力的方法

Info

Publication number: CN109313179A
Application number: CN201780021829.1A
Authority: CN
Inventors: 斯科特·塔斯克
Original assignee: Oxford Immunotec Ltd
Current assignee: Oxford Immunotec Ltd
Priority date: 2016-03-29
Filing date: 2017-03-27
Publication date: 2019-02-05
Anticipated expiration: 2037-03-27
Also published as: JP6940517B2; ES2833932T3; EP3436819B1; US20190064145A1; EP3436819A1; CN109313179B; US11112401B2; GB201605210D0; JP2019511722A; WO2017168135A1

Abstract

本发明涉及用于确定对象的细胞介导的免疫能力的方法。所述方法包括对包含来自所述对象的免疫细胞的样品进行细胞介导的免疫测定(CMI)。所述方法还包括体外检测对肽池的免疫响应，其中，所述肽池由至少3种病毒抗原衍生。

Description

用于确定对象的细胞介导的免疫能力的方法

技术领域

本发明涉及用于确定对象的细胞介导的免疫能力的方法。特别地，该方法包括对包含免疫细胞的样品进行细胞介导的免疫测定并检测对至少三种病毒抗原的免疫响应，所述免疫细胞例如从对象获得的外周血单核细胞(PBMC)。

背景技术

免疫能力涉及个体中正常起作用的免疫响应的存在，包括适应性(T细胞和B细胞)免疫响应和固有(补体和Toll样受体)免疫响应。设计用于测量免疫能力(特别是细胞介导的免疫能力)的测定可用于监测供体对抗原的T细胞响应。对个体的免疫能力，特别是其发动细胞介导的免疫响应的一般能力，进行测量或监测是可取的。例如，免疫能力评估对于临床医生来说可用于若干疾病状况(包括移植、癌症、自身免疫疾病、HIV和疫苗试验)。

提供免疫功能测量的测定包括市售产品Cylex Immunknow和QFT Monitor。混合淋巴细胞反应(MLR)也可用于评估个体的免疫响应。

Cylex Immunknow测量用PHA刺激后全血中ATP的产生。这依赖于血液样品中包含的细胞的非特异性刺激。该测定对测量免疫功能的有效性得到了不同的结果(Lipschultzet al.(2014))。

提供对免疫功能的定性和定量测量(QuantiferonPack Insert 2014)。特别地，QFM涉及用固有(TLR介导的)+适应性(TCR介导的)抗原的组合刺激全血。通过ELISA检测从响应于抗原的细胞分泌的IFNγ。QFM读数使得供体分为3类：低(<15IU/mL IFNγ)、中(15-1000IU/mL IFNγ)和高(IU/mL IFNγ)。

研究界已将混合淋巴细胞反应(MLR)测定用作T细胞功能的预测因子(Manji etal.(1975))。特别地，MLR测定涉及将PBMC样品与来自对照的PBMC(处理以防止增殖)混合，添加放射性染料，并且通过放射性染料的衰变来测量样品PBMC的增殖。

发明内容

本发明人已经确定，可以通过使用选择的病毒抗原来确定个体的细胞介导的免疫能力。通过选择合适的病毒抗原池，可以确定各种个体的免疫能力，从而允许开发用于测试各种个体的免疫能力的单一测定系统。

根据本发明，提供一种用于确定对象的细胞介导的免疫能力的方法，其中所述方法包括对包含免疫细胞的样品进行细胞介导的免疫测定(CMI)，所述免疫细胞例如来自对象的外周血单核细胞(PBMC)，所述方法包括体外检测对肽池的免疫响应，其中所述肽池由至少三种病毒抗原衍生而来。

根据权利要求1所述的方法，其中所述池或肽由至少4种、5种或6种病毒抗原衍生而来。

在优选的实施方式中，所述肽池由3种、4种或5种病毒抗原衍生而来。

在一个方面，所述病毒抗原选自人3型腺病毒的六邻体蛋白、流感病毒的基质蛋白1(H3N2)、爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein Barr virus)的BZLF-1蛋白、流感病毒的核衣壳蛋白、呼吸道合胞病毒的融合糖蛋白G0。

在本发明的一个方面，所述病毒抗原由人3型腺病毒的六邻体蛋白、呼吸道合胞病毒的融合糖蛋白G0和流感病毒的核衣壳蛋白组成。

在本发明的另一个方面，所述病毒抗原由人3型腺病毒的六邻体蛋白、流感病毒的基质蛋白1、流感病毒的核衣壳蛋白和呼吸道合胞病毒的融合糖蛋白G0组成。

在本发明的另一个方面，所述病毒抗原由人3型腺病毒的六邻体蛋白，爱泼斯坦巴尔病毒的反式激活因子蛋白BZLF1和呼吸道合胞病毒的融合糖蛋白G0组成。

在本发明的另一个方面，所述病毒抗原由人3型腺病毒的六邻体蛋白、爱泼斯坦巴尔病毒的BALF-4、BMLF-1、BRLF-1、BZLF-1、EBNA-1、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-4、LMP-1和LMP-2蛋白、流感病毒的基质蛋白1、流感病毒的核衣壳蛋白和呼吸道合胞病毒的融合糖蛋白G0组成。

附图说明

图1.在ELISPOT测定中六邻体、EBV、MP1、NP、FGF0和BZLF1的加速稳定性测试的示例图。

图2.在ELISPOT测定中总结的组合肽池(ICA混合物)与个体肽池(添加物)的对比示例图。

图3.在ELISPOT测定中不同种族的测试供体。

图4.显示了在ELISPOT测定中使用ICA Mix测试有免疫能力的供体中的响应变化的示例图。

具体实施方式

应当理解，可以根据本领域的特定需要而适用所公开方法的不同应用。还应理解，本文使用的术语仅用于描述本发明的特定实施方式的目的，而非意在限制性。

另外，除非内容另有明确说明，在本说明书和所附权利要求中使用的单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指代物。因此，例如，所提及的“片段”包括“多个片段”，所提及的“细胞”包括两个或更多个这样的细胞，所提及的“对象”包括两个或更多个这样的对象，等等。

无论在上文或下文中，本文引用的所有出版物、专利和专利申请，均在此整体并入供参考。

本发明的方法

本发明人已经鉴定了使用细胞介导的免疫测定(CMI测定)确定对象的免疫能力的方法。设计用于测量免疫能力(特别是细胞介导的免疫能力)的CMI测定可用于监测供体对抗原的T细胞响应。发明人已经确定可以选择合适的病毒抗原池以检测各种个体中的细胞介导的免疫响应。无论个体景如何，病毒抗原池均在有免疫能力的个体中提供响应。因此，该测定可用于鉴定有免疫能力的个体，以及那些不能引起有效免疫响应的个体。

因此，本发明提供了一种用于确定对象免疫能力的方法，其中所述方法包括对包含免疫细胞的样品进行细胞介导的免疫测定(CMI)，所述免疫细胞例如来自对象的外周血单核细胞(PBMC)，所述方法包括体外检测对肽池的免疫响应，其中所述肽池由至少3种病毒抗原衍生。

所述方法可包括由至少3种、至少4种、至少5种或至少6种病毒抗原，高达7种或8种病毒抗原衍生的肽池。

在特别优选的实施方式中，所述肽由3种、4种、5种或6种病毒抗原衍生。在特别优选的实施方式中，所述肽由3种、4种或5种(但不会更多)病毒抗原衍生。在本发明的供选择的方面，所述肽由2种、3种或4种病毒抗原衍生，并另外包含由EBV衍生的抗原池，但不包含任何其他病毒抗原。

所述肽池可包含由单一病毒的病毒抗原、多于一种病毒的病毒抗原或由来自不同病毒的所有病毒抗原衍生的肽。所述肽池可包含由相同病毒和不同病毒的病毒抗原衍生的肽。在本发明的一个优选方面，至少3种病毒抗原由至少2种病毒，优选3种、4种、5种或6种病毒衍生。在优选的实施方式中，至少3种病毒抗原由人3型腺病毒、流感病毒、爱泼斯坦巴尔病毒和呼吸道合胞病毒中的一种或多种衍生。

在更优选的实施方式中，所述病毒抗原选自由人3型腺病毒衍生的六邻体蛋白、由流感病毒衍生的基质蛋白1、由流感病毒衍生的核衣壳蛋白、由爱泼斯坦巴尔病毒衍生的BZLF-1蛋白和由呼吸道合胞病毒衍生的融合糖蛋白G0。所述流感病毒可以是任何流感病毒株。在特别优选的实施方式中，所述流感病毒是H3N2流感病毒株。

在本发明的一种实施方式中，所述病毒抗原池由人3型腺病毒的六邻体蛋白、呼吸道合胞病毒的融合糖蛋白G0和流感病毒的核衣壳蛋白组成。

在本发明的另一种实施方式中，所述病毒抗原池由人3型腺病毒的六邻体蛋白、流感病毒的基质蛋白1、流感病毒的核衣壳蛋白和呼吸道合胞病毒的融合糖蛋白G0组成。

在本发明的另一种实施方式中，所述病毒抗原池由人3型腺病毒的六邻体蛋白、爱泼斯坦巴尔病毒的反式激活因子蛋白BZLF1和呼吸道合胞病毒的融合糖蛋白G0组成。

在另一个优选的实施方式中，一种或多种所述病毒抗原由爱泼斯坦巴尔病毒衍生，其中所述病毒抗原包含BALF-4、BMLF-1、BRLF-1、BZLF-1、EBNA-1、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-4、LMP-1和LMP-2蛋白中的一种或多种。在一个特别优选的实施方式中，提供由EBV衍生的肽池，该肽池包括由BALF-4、BMLF-1、BRLF-1、BZLF-1、EBNA-1、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-4、LMP-1和LMP-2蛋白中的每种蛋白衍生的肽。这种EBV肽池可以与人3型腺病毒的六邻体蛋白、流感病毒的基质蛋白1、流感病毒的核衣壳蛋白和呼吸道合胞病毒的融合糖蛋白G0组合提供。

针对CMI响应的分析

使用细胞介导的免疫(CMI)响应来定义个体的免疫状态。通常，在临床免疫学领域，术语CMI响应包括皮肤测试、淋巴细胞增殖测定和免疫细胞(例如在特定抗原存在下的外周血单核细胞(PBMC))产生的细胞因子的检测。本发明的方法可包括检测体外细胞介导的免疫响应。特别地，可以在本发明的方法中检测基于体外细胞因子的针对肽的CMI响应。

免疫系统的细胞能够在被抗原刺激后产生免疫效应分子，例如细胞因子。CMI测定包括将细胞样品与抗原一起孵育并测量免疫效应分子(例如细胞因子)的存在(或不存在)或数量，以提供对个体产生针对所选抗原的细胞介导的免疫响应的能力的指示。用于CMI测定的细胞可包括全血样品、包含免疫细胞的样品(例如外周血单核细胞(PMBC))以及分离的淋巴细胞(特别是T细胞)和抗原呈递细胞(APC)的群。APC参与处理抗原，以便抗原可以由每个T细胞表面上的T细胞受体识别。抗原识别可诱导细胞因子的产生。

产生细胞因子的细胞可以通过流式细胞术鉴定。流式细胞术可用于量化产生细胞因子的细胞的频率和/或由细胞产生的细胞因子的量。可以将抗原诱导的细胞因子释放到测定培养基中，并通过例如ELISA法直接检测，或用酶联免疫斑点测定(ELISPOT)根据分泌细胞因子的T细胞的频率进行定量。本发明的方法优选包括ELISPOT。

首先开发了酶联免疫斑点测定(ELISPOT)(也称为过滤免疫噬斑测定)，以检测和定量个体的分泌抗体的B细胞。在开发出该技术时，该技术提供了常见的噬斑形成测定的快速通用的替代方案。最近的修改改善了ELISPOT的灵敏度，使得可以检测到每秒产生少到100个特异性蛋白质分子的细胞。这使得ELISPOT测定比常规ELISA测定更灵敏。ELISPOT测定利用在紧紧围绕分泌蛋白质的细胞的环境中相对高浓度的给定蛋白质类细胞产物(例如细胞因子)。使用高亲和力抗体来捕获并检测这些细胞产物。在Current Protocols inImmunology,Unit 6.19pages 6.19.1-8评述了ELISPOT试验。

ELISPOT测定通常包括六个步骤：(1)将纯化的细胞因子特异性抗体包被到衬有膜的微量滴定板上；(2)封闭平板以防止任何其他蛋白质的非特异性吸附；(3)用适当的试剂孵育分泌细胞因子的细胞；(4)移除细胞和试剂；(5)添加经标记的第二抗细胞因子抗体；(6)检测膜上的抗体-细胞因子复合物。

免疫响应

体外检测的免疫响应可以是由本发明的至少三种病毒抗原触发的任何响应。免疫响应可以由任何类型的免疫细胞介导。在特别优选的实施方式中，免疫响应由外周血单核细胞(PBMC)介导，所述外周血单核细胞可包含选自T细胞、天然杀伤(NK)细胞和单核细胞的一种或多种类型的免疫细胞。通常，通过评估细胞因子分泌，优选通过评估干扰素γ(IFN-γ)分泌，来测量免疫响应。本领域熟知测量细胞因子分泌的方法。免疫响应优选是T细胞响应。

免疫响应可以在体外发生。优选地，免疫响应是体外CMI响应。CMI响应是一种不涉及抗体的免疫响应。相反，CMI响应可能涉及细胞毒性T细胞活化、各种细胞因子产量的增加和/或响应抗原的各种细胞因子的释放。本领域已知的并且在上文中详细描述了用于检测体外CMI响应的方法。

本发明的方法可以检测免疫响应的存在或不存在。根据本发明的方法对至少三种病毒抗原的免疫响应的存在可以表明对象是有免疫能力的。根据本发明的方法对至少三种病毒抗原不存在免疫响应可以表明对象具有低的免疫能力。

片段

根据本发明的方法的病毒抗原片段可以是包含5个或更多个氨基酸的序列，其通过在亲本序列的N末端和/或C末端截短而衍生。例如，所述片段可包含约5个或更多个、约6个或更多个、约7个或更多个、约8个或更多个、约9个或更多个、约10个或更多个、约11个或更多个、约12个或更多个、约13个或更多个、约14个或更多个、约15个或更多个、约16个或更多个、约17个或更多个、约18个或更多个、约19个或更多个、约20个或更多个、约21个或更多个、约22个或更多个、约23个或更多个更多、约24个或更多个、约25个或更多个、约26个或更多个、或约27个或更多个氨基酸。所述片段的长度可以是约5至约27个、约6至约26个、约7至约25个、约8至约24个、约9至约23个、约10至约22个、约11至约21个、约12至约20个、约13至约19个、约14至约18个、约12至约18个、约12至约15个、约15至约18个、约13至约17个、约14至约16个、约5至约10个、约10至约15个、约15至约20个、约20至约25个或约10至约20个氨基酸。

片段可以在化学上由亲本蛋白衍生，例如通过蛋白水解切割衍生，或者可以在知理智感上由亲本蛋白衍生，例如通过利用亲本蛋白的氨基酸序列并基于该序列合成片段而衍生。可以使用本领域熟知的方法来合成片段。

术语“片段”不仅包括其中氨基酸残基通过肽(-CO-NH-)键连接的分子，还包括其中肽键换向的分子。可以使用本领域已知的方法，例如Meziere et al(1997)J.Immunol.159,3230-3237中描述的那些，来制备这种逆反肽模拟物(retro-inversopeptidomimetic)。该方法涉及制备假肽(pseudopeptide)，所述假肽包含涉及骨架而不涉及侧链方向的改变。Meziere et al(1997)表明，至少对于MHC II类分子和T辅助细胞响应，这些假肽是有用的。包含NH-CO键而不是CO-NH肽键的逆反肽对蛋白水解具有更强的抗性。

类似地，可以完全省去肽键，条件是使用保留氨基酸残基的碳原子之间的间隔的合适的接头部分；特别优选的是，如果接头部分具有与肽键基本上相同的电荷分布和基本上相同的平面性。还应理解，可以方便地在片段的N-或C-末端对片段进行阻断，以便帮助降低对外蛋白水解消化的敏感性。例如，可以通过与羧酸反应来保护肽的N-末端氨基，并且可以通过与胺反应来保护肽的C-末端羧基。还可以在片段的N-末端和/或C-末端添加一个或多个另外的氨基酸残基，例如以增加片段的稳定性。修饰的其他实例包括糖基化和磷酸化。另一个可能的修饰是，可以用亚甲基基团取代在R或K侧链胺上的氢(-NH₂→-NH(Me)或-N(Me)₂)。

根据本发明方法的至少三种病毒抗原的片段还可以包括增加或减少片段的体内半衰期的片段变体。能够增加根据本发明的片段的半衰期的变体的实例包括片段的拟肽类似物、片段的D-氨基酸衍生物和肽-拟肽杂合体。所述片段还可以包含片段的D-氨基酸形式。使用D-氨基酸而不是L-氨基酸制备多肽大大降低了这种试剂正常代谢过程所致的任何不希望的分解，减少了需要给药的试剂的量以及其给药频率。也可以使用亲本蛋白的D-氨基酸形式。

根据本发明方法的片段可以由mRNA编码的亲本蛋白的剪接变体衍生，所述mRNA由编码亲本蛋白链的初级转录物的选择性剪接产生。所述片段还可以由至少保留亲本蛋白的MHC结合或抗体结合特性的亲本蛋白的氨基酸突变体、糖基化变体和其他共价衍生物衍生。示例性衍生物包括其中本发明的片段通过取代、化学方式、酶促方式或其他适当方式用天然存在的氨基酸以外的部分共价修饰的分子。

片段池

本发明的方法可以包括体外检测对包含一个或多个片段的肽池的免疫响应。所述肽池可以包含由单一病毒、多余一种病毒或来源于所有不同病毒的病毒抗原衍生的片段。所述肽池可包含由相同病毒和不同病毒的病毒抗原衍生的片段。在本发明的一个优选方面，一个或多个片段由至少3种病毒抗原衍生，所述至少3种病毒抗原由两种病毒，优选来源于3种、4种、5种或6种病毒衍生。在优选的实施方式中，一种或多种片段由至少3种病毒抗原衍生，所述至少3种病毒抗原由人3型腺病毒、流感病毒、爱泼斯坦巴尔病毒和呼吸道合胞病毒中的一种或多种。

在更优选的实施方式中，所述肽池包含该一种或多种病毒抗原的一个或多个片段，所述病毒抗原选自由人3型腺病毒衍生的六邻体蛋白、由流感病毒衍生的基质蛋白1、由流感病毒衍生的核衣壳蛋白、由爱泼斯坦巴尔病毒衍生的BZLF蛋白和由呼吸道合胞病毒衍生的融合糖蛋白G0。所述流感病毒可以是任何流感病毒株。在特别优选的实施方式中，所述流感病毒是H3N2流感病毒株。

在本发明的一种实施方式中，所述肽池包含该一种或多种病毒抗原的一个或多个片段，所述病毒抗原由人3型腺病毒的六邻体蛋白、呼吸道合胞病毒的融合糖蛋白G0和流感病毒的核衣壳蛋白组成。

在本发明的另一种实施方式中，所述肽池包含该一种或多种病毒抗原的一个或多个片段，所述病毒抗原由人3型腺病毒的六邻体蛋白、流感病毒的基质蛋白1、流感病毒的核衣壳蛋白和呼吸道合胞病毒的融合糖蛋白G0组成。

在本发明的又一种实施方式中，所述肽池包含该一种或多种病毒抗原的一个或多个片段，所述病毒抗原由人类腺病毒3的六邻体蛋白、爱泼斯坦巴尔病毒的反式激活因子蛋白BZLF1和呼吸道合胞病毒的融合糖蛋白G0组成。

在本发明的一种实施方式中，所述肽池包含由爱泼斯坦巴尔病毒衍生的一种或多种病毒抗原的一个或多个片段，其中所述病毒抗原包含BALF-4、BMLF-1、BRLF-1、BZLF-1、EBNA-1、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-4、LMP-1和/或LMP-2蛋白。在特别优选的实施方式中，提供包含由EBV衍生的一个或多个片段的肽池，所述肽池包含由BALF-4、BMLF-1、BRLF-1、BZLF-1、EBNA-1、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-4、LMP-1和/或LMP-2蛋白中的每种蛋白衍生的片段。这种EBV肽片段池可以与人3型腺病毒的六邻体蛋白，流感病毒的基质蛋白1，流感病毒的核衣壳蛋白和呼吸道合胞病毒的融合糖蛋白G0组合提供。

该池可包括1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、或250个或更多个由至少3种病毒抗原衍生的片段。

在一种实施方式中，本发明的方法包括体外检测对包含片段的肽池的免疫响应。优选地，该方法包括体外检测对肽池的免疫响应，其中该肽池包含一种或多种病毒抗原的一个或多个片段。进一步优选地，该方法包括体外检测对肽池的免疫响应，其中该肽池包含一种或多种病毒抗原中的每种病毒抗原的一个或多个片段。

如下所述，该方法还可以包括体外检测对一种或多种蛋白质片段文库的免疫响应。

蛋白质片段文库

在一种实施方式中，池中的片段形成蛋白质片段文库。蛋白质片段文库包含来源于亲本蛋白的多个片段，对于本发明，由人3型腺病毒衍生的六邻体蛋白、由流感病毒衍生的基质蛋白1、由流感病毒衍生的核衣壳蛋白，由爱泼斯坦巴尔病毒衍生的BALF-4、BMLF-1、BRLF-1、BZLF-1EBNA-1、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-4、LMP-1和LMP-2蛋白和由呼吸道合胞病毒衍生的融合糖蛋白G0一起涵盖亲本蛋白序列的至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％。在本发明中，池中的片段优选形成蛋白质片段文库，所述蛋白质片段文库涵盖衍生所述片段的蛋白质的至少80％的序列。更优选地，池中的片段形成蛋白质片段文库，所述蛋白质片段文库涵盖衍生所述片段的蛋白质的整个序列。

所述蛋白质片段文库可包含能够刺激CD4+和/或CD8+T细胞的片段。优选地，所述蛋白质片段文库包含能够刺激CD4+和CD8+T细胞二者的片段。本领域已知，用于刺激CD4+和CD8+T细胞的最佳片段大小是不同的。由约9个氨基酸(9聚体)组成的片段通常仅刺激CD8+T细胞，由约20个氨基酸(20聚体)组成的片段通常仅刺激CD4+T细胞。广义地说，这是因为CD8+T细胞倾向于基于抗原的序列识别其抗原，而CD4+T细胞倾向于基于抗原的高级结构识别其抗原。然而，由约15个氨基酸(15聚体)组成的片段可刺激CD4+和CD8+T细胞。因此，所述蛋白质片段文库优选包含长度为约15个氨基酸的片段，例如长度为约12个氨基酸、约13个氨基酸、约14个氨基酸、约15个氨基酸、约16个氨基酸、约17个氨基酸或约18个氨基酸的片段。

池中的所有片段的长度可以是相同的。供选择地，池可包含长度不同的片段。上文讨论了片段长度。

蛋白质片段文库可包含其序列重叠的片段。因此，每个池可包括其序列重叠的片段。序列可以以一个或多个氨基酸重叠，例如以2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多、13个或更多、14个或更多、15个或更多、16个或更多、17个或更多、18个或更多、19个或更多，或20个或更多个氨基酸重叠。优选地，所述序列以9个或更多个氨基酸重叠，例如以10个或更多个、11个或更多个或12个或更多个氨基酸重叠，因为这使包含能够刺激CD8+T细胞的9聚体的片段的数量最大化。更优选地，所述序列以11个氨基酸重叠。池中的所有重叠片段可以以相同数量的氨基酸重叠。供选择地，池可以包含其序列以不同数量的氨基酸重叠的片段。

所述蛋白质片段文库可包含长度为12至18(例如12至15、15至18、13至17或14至16)个氨基酸的、以9至12(例如9至11或10至12)个氨基酸重叠的片段。例如，所述蛋白质片段文库可包含(i)长度为14个氨基酸的、以9、10或11个氨基酸重叠的片段，(ii)长度为15个氨基酸的、以9、10或11个氨基酸重叠的片段，或(iii)长度为16个氨基酸的、以9、10或11个氨基酸重叠的片段。所述蛋白质片段文库优选包含长度为15个氨基酸的、以11个氨基酸重叠的片段。

片段的一般属性如上所述。

爱泼斯坦巴尔病毒池可包含由爱泼斯坦巴尔病毒肽衍生的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个片段，其中不要求重叠片段。例如，所述肽池可包含表6中所示的肽。

样品

使用从对象获得的样品进行针对本发明的至少三种病毒抗原的免疫响应的体外检测。在优选实施方式中，该样品是血液样品。

对象

本发明的方法可用于确定任何合适对象的免疫能力。该对象通常是人类对象。

细胞

在一种实施方式中，本发明的方法包括对包含免疫细胞(例如外周血单核细胞)的样品进行细胞介导的免疫测定，所述方法包括体外检测针对由至少三种病毒抗原衍生的肽池的免疫响应。所述肽池可以包含一种或多种病毒抗原的一个或多个片段或一种或多种病毒抗原中的每种病毒抗原的一个或多个片段。所述病毒抗原可包含一个或多个蛋白质片段文库。

通常使样品与足量的至少三种病毒抗原接触以产生对病毒抗原的免疫响应。可以使样品与肽池接触，其中肽或片段在接触样品之前已经合并；或者使用病毒抗原或片段的任何组合依次或同时与每种病毒抗原或片段接触。在优选的实施方式中，使样品同时与所有病毒抗原接触，其中病毒抗原在接触样品之前已经合并。

可以使样品与任何量的至少三种病毒抗原(例如约1ng/ml、约5ng/ml、约10ng/ml、约50ng/ml、约100ng/ml、约500ng/ml、约1μg/ml、约5μg/ml、约10μg/ml、约50μg/ml、约100μg/ml、约500μg/ml、1mg/ml、约5mg/ml、约10mg/ml、约50mg/ml、约100mg/ml或约500mg/ml的至少三种病毒抗原)接触。可以同时或依次使样品与至少三种病毒抗原接触。

所述免疫细胞可包含选自T细胞、B细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、固有淋巴细胞(ILC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞和胸腺细胞的一种或多种类型的免疫细胞。包含免疫细胞的样品可包含免疫细胞群。所述群可包含所有这些类型的免疫细胞。所述群可包含外周血单核细胞(PBMC)。PBMC样品包含T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞。免疫细胞群可以包含T细胞。在一种实施方式中，免疫细胞群包含外周血单核细胞。

所述细胞样品与所述至少三种病毒抗原的接触可以以任何合适的体积进行。典型的样品体积的范围为约10μl至约1ml，优选为约50μl至约500μl，更优选为约100μl至约200μl。通常，细胞与所述至少三种病毒抗原接触的时间长度为约5分钟至约50小时，例如约10分钟至约40小时、约20分钟至约30小时、约30分钟至约20小时、约45分钟至约12小时、约1小时至约6小时，优选为约10分钟至约2小时。可以使细胞与抗原接触过夜。

可以在任何合适的温度下使细胞与抗原接触。合适的温度通常在与衍生细胞的人或动物的正常体温相同的范围内。通常，孵育是在固定温度下进行，所述固定温度在约4℃至大约38℃之间，优选在约20℃至约38℃之间，更优选地为约37℃。

细胞通常存在于孔中。细胞优选存在于平板的孔中，该平板优选是衬有膜的板。样品更优选存在于标准96或384孔板的孔中。这种板是Fisher scientific、VWR供应商的市售Nunc、Starstedt或Falcon。孔通常具有约25μl至约250μl、约30μl至约200μl、约40μl至约150μl或约50至100μl的容量。从对象获得的细胞可以在用于该方法之前进行培养。这使得在待测定的每个样品中存在相等数量的贴壁细胞。供选择地，如果细胞被固定或捕获，则可以在铺布前对细胞(例如新鲜血细胞)计数。本领域技术人员熟知用于培养细胞的技术。通常在37℃，5％CO₂的标准条件下，在补充有血清的培养基中培养细胞。

可以在任何合适的烧瓶或容器中培养细胞，然后将其转移到孔中。通常在孔中培养细胞。细胞优选在包含两个或更多个孔的平板(例如标准96或384孔板)中培养。用标记物孵育细胞通常涉及用包含标记物的合适溶液替换每个孔中的培养基。本领域技术人员熟知合适的溶液。

免疫响应性

如上所述，本发明的方法包括体外检测针对至少三种病毒抗原的免疫响应。检测到免疫响应表明对象是有免疫能力的。检测到缺乏(或没有检测到)免疫响应表明对象并非是有免疫响应的并且具有低免疫能力。例如，免疫能力测定中的有免疫能力的供体为在阴性对照中无斑点，在阳性对照中超过20个斑点，并且响应于免疫能力测定(ICA)抗原而产生特异性IFN-γ斑点的供体。

治疗应用

本发明提供了一种用于确定对象的免疫能力的方法，其中所述方法包括对包含免疫细胞(例如来自对象的外周血单核细胞(PBMC))的样品进行细胞介导的免疫测定(CMI)，所述方法包括体外检测对肽池的免疫响应，其中所述肽池由至少三种病毒抗原衍生。本方法可在临床上使用以监测供体对至少三种病毒抗原的广泛T细胞响应。在评估患者对若干疾病状况(包括移植、癌症、自身免疫疾病、HIV和疫苗试验)的免疫能力时，这可能对临床医生有所帮助。

1实施例

实施例1-选择最具免疫原性的抗原

在ELISPOT测定中用23种市售肽池筛选健康供体样品(31-167)。为了鉴定对有免疫能力的供体给予最佳覆盖率的肽池，定义了任意10个斑点截止。然后使用该截止来评估对每个肽池的响应。表1基于有响应的供体的百分比对肽池进行排序。

表1.肽池的排序

该分析允许选择5种最有响应的抗原(基于任意10个斑点截止)-六邻体、MP1、EBV、NP和FGF0。

评估作为对六邻体、MP1、EBV、NP和FGF0的弱响应者(<10个斑点)的供体对剩余筛选的抗原的响应。在这些供体中，BZLF1抗原产生大于10的斑点计数，因此选择BZLF1抗原进行进一步测试。

实施例2-溶解度

合成定制肽池(六邻体、EBV、MP1、NP、FGF0和BZLF1)并以冻干池提供。使用二甲基亚砜(DMSO)，以池中每种肽浓度为625μg/mL溶解肽池。

成功地完成所有肽池的溶解。没有观察到溶解度问题。

实施例3-评估各个肽池的稳定性

使用加速稳定性研究评估每个肽池在工作浓度(3μg/mL)下的稳定性。简言之：将工作浓度的肽池在37℃下储存8周。然后在ELISPOT测定中与新鲜稀释的肽池(对照)比较以测试加压的肽池。对于每个供体，测试3次重复样。研究结果如图1所示。

统计分析(曼-惠特尼检验)确定，对照和在37℃下储存8周的肽之间的斑点计数没有显显著的统计学差异。

实施例4-组合免疫原性抗原

重新评估ELISPOT测定中对肽池进行筛选所产生的数据，以确定如果将来自不同抗原的肽组合成一个池的供体的理论覆盖率。这通过添加个体肽池的斑点计数(例如，供体15，六邻体斑点计数＝5，EBV斑点计数＝26，NP斑点计数＝5，理论混合物16斑点计数＝36)来进行。针对每种混合物，计算在10-350个斑点范围内的供体的百分比。该分析的结果如表2所示。

表2.ELISPOT测定中肽池的理论组合和所得供体的百分比覆盖率(N＝94-100)

理论分析鉴定了：

·10种混合物会使大于95％的所评估的供体响应。

·理论上，混合物25和26的斑点计数会达到ELISPOT酶标仪上准确计数的上限(400+个斑点)。这降低了10-350个斑点计数范围内的供体的百分比。

·选择13种混合物以在ELISPOT测定中进行进一步测试(表3)。

表3.所选定的用于免疫竞争力测定(ICA)的肽池的混合物。

为了确认实现组合肽池的预测性能，用32个供体在ELISPOT测定中对肽池单独和在混合物中进行测试。将用混合物获得的斑点计数与来自个体抗原的添加物斑点计数进行比较(例如，供体9743，六邻体斑点计数＝5，MP1斑点计数＝10，FGF0斑点计数＝6，混合物1斑点计数＝28)。该比较的结果如图2所示。

统计分析(曼-惠特尼检验)确定个体肽池的添加物斑点计数与组合的ICA混合物之间没有显著的统计学差异。

实施例5-ICA混合物的制备

将溶解的肽池(池中每种肽为625μg/mL)组合成免疫能力测定(ICA)混合物。在制备期间没有观察到任何问题。

实施例6-种族

在ELISPOT测定中用自35名高加索人、10名非裔美国人、10名西班牙裔人和9名亚洲人供体收集的血样测试了所选择的13种ICA混合物。该测试的结果如图3所示。

使用10个斑点截止来确定有响应的供体的数量(表4)。

表4.基于任意10个斑点截止的对ICA混合物有响应的供体的百分比

基于10个斑点截止，无论何种种族，13种混合物中的4种(ICA混合物2、6、9和12)在≥90％的供体中是有响应的。

实施例7-随时间推移针对ICA混合物的响应的波动

为了确定由ICA混合物诱导的响应的自然变化，在ELISPOT测定中用ICA混合物在以下时间点测试6个有免疫能力的供体：第0、3、7、14、28、56和84天。

图4示出了在较短的时间段(7天)内和较长的时间段(84天)内对两个示例性混合物的响应变化。

通过BioBridges进行统计分析。

简言之：使用来自所有时间点的数据计算每个供体的各个混合物的变化系数(％CV)。在此之后，将来自6个供体的每种混合物的％CV值分组并计算平均值。这些％CV的平均值是在ELISPOT测定中使用ICA混合物时斑点计数变化的量度，参见表4的总结。

表5.在ELISPOT测定中对ICA混合物的免疫能力响应的自然变化的统计分析(N＝6)

ICA混合物	变异(7天内)	变异(84天内)
			混合物1	20％	26％
混合物2	16％	21％
			混合物3	13％	23％
混合物4	11％	18％
			混合物5	22％	25％
混合物6	18％	23％
			混合物7	24％	31％
混合物8	18％	25％
			混合物9	19％	25％
混合物10	21％	24％
			混合物11	27％	34％
混合物12	21％	23％
			混合物13	25％	24％

表6

爱泼斯坦巴尔病毒，反式激活因子蛋白BZLF1 Prot ID：P03206 SEQ ID NO：27

MMDPNSTSEDVKFTPDPYQVPFVQAFDQATRVYQDLGGPSQAPLPCVLWPVLPEPLPQGQLTAYHVSTAPTGSWFSAPQPAPENAYQAYAAPQLFPVSDITQNQQTNQAGGEAPQPGDNSTVQTAAAVVFACPGANQGQQLADIGVPQPAPVAAPARRTRKPQQPESLEECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDLLNF

人3型腺病毒，六邻体蛋白Prot ID：P36849 SEQ ID NO：28

>sp|P36849|CAPSH_ADE03六邻体蛋白OS＝人B型腺病毒血清3型GN＝L3 PE＝2 SV＝2

MATPSMMPQWAYMHIAGQDASGYLSPGLVQFARATDTYFSMGNKFRNPTVAPTHDVTTDRSQRLMLRFVPVDREDNTYSYKVRYTLAVGDNRVLDMASTFFDIRGVLDRGPSFKPYSGTAYNSLAPKGAPNTSQWIVTTNGDNAVTTTTNTFGIASMKGGNITKEGLQIGKDITTTEGEEKPIYADKTYQPEPQVGEESWTDTDGTNEKFGGRALKPATNMKPCYGSFARPTNIKGGQAKNRKVKPTTEGGVETEEPDIDMEFFDGRDAVAGALAPEIVLYTENVNLETPDSHVVYKPETSNNSHANLGQQAMPNRPNYIGFRDNFVGLMYYNSTGNMGVLAGQASQLNAVVDLQDRNTELSYQLLLDSLGDRTRYFSMWNQAVDSYDPDVRIIENHGIEDELPNYCFPLNGIGPGHTYQGIKVKTDDTNGWEKDANVAPANEITIGNNLAMEINIQANLWRSFLYSNVALYLPDVYKYTPPNITLPTNTNTYEYMNGRVVSPSLVDSYINIGARWSLDPMDNVNPFNHHRNAGLRYRSMLLGNGRYVPFHIQVPQKFFAVKNLLLLPGSYTYEWNFRKDVNMVLQSSLGNDLRTDGATISFTSINLYATFFPMAHNTASTLEAMLRNDTNDQSFNDYLSAANMLYPIPANATNIPISIPSRNWAAFRGWSFTRLKTKETPSLGSGFDPYFVYSGSIPYLDGTFYLNHTFKKVAIMFDSSVSWPGNDRLLSPNEFEIKRTVDGEGYNVAQCNMTKDWFLVQMLANYNIGYQGFYIPEGYKDRMYSFFRNFQPMSRQVVDEVNYTDYKAVTLPYQHNNSGFVGYLAPTMRQGEPYPANYPYPLIGTTAVKSVTQKKFLCDRTMWRIPFSSNFMSMGALTDLGQNMLYANSAHALDMTFEVDPMDEPTLLYLLFEVFDVVRVHQPHRGVIEAVYLRTPFSAGNATT

甲型流感(H3N2)病毒，核蛋白ProtID：I6LFN1 SEQ ID NO：29

>tr|I6LFN1|I6LFN1_9INFA核蛋白OS＝甲型流感病毒(A/Nanchang/A2/1994(H3N2))GN＝NPPE＝3SV＝1

MASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIDGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSLTIERMVLSAFDERRNRYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYKRVDGRWMRELVLYDKEEIRRIWRQANNGDDATAGLTHMMIWHSNLNDTTYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGIGTMVMELIRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRSAYERMCNILKGKFQTAAQRAMMDQVRESRNPGNAEIEDLIFSARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVSSGYNFEKEGYSLVGIDPFKLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRLLSFIRGTKVSPRGKLSTRGVQIASNENMDNMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISVQPTFSVQRNLPFEKSTVMAAFTGNTEGRTSDMRAEIIRMMEGAKPEEVSFRGRGVFELSDEKATNPIVPSFDMSNEGSYFFGDNAEEYDN

呼吸道合胞病毒，融合糖蛋白F0 ProtID：O36634 SEQ ID NO：30

>sp|O36634|FUS_HRSVB融合糖蛋白F0OS＝B型人呼吸道合胞病毒(菌株B1)GN＝FPE＝1 SV＝1

MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITTIIIVIIVVLLSLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSK

甲型流感病毒(H3N2)基质蛋白1.ProtID：Q67157 SEQ ID NO：31

>sp|Q67157|M1_I68A0基质蛋白1OS＝甲型流感病毒(A/Aichi/2/1968H3N2株)GN＝M PE＝3 SV＝1

MSLLTEVETYVLSIVPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKNTDLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTCPSERGLQRRRFVQNALNGNGDPNNMDRAVKLYRKLKREITFHGAKEIALSYSAGALASCMGLIYNRMGAVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHRSHRQMVTTTNPLIRHENRMVLASTTAKAMEQMAGSSEQAAEAMEVASQARQMVQAMRAIGTHPRSSAGLKDDLLENLQAYQKRMGVQMQRFK

序列表

<110> 牛津免疫科技有限公司

<120> Assay

<130> N407245WO

<150> GB1605210.0

<151> 2016-03-29

<160> 31

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 1

Phe Leu Asp Lys Gly Thr Tyr Thr Leu

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 2

Gly Leu Cys Thr Leu Val Ala Met Leu

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 3

Asp Tyr Cys Asn Val Leu Asn Lys Glu Phe

1 5 10

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 4

Ala Thr Ile Gly Thr Ala Met Tyr Lys

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 5

Arg Val Arg Ala Tyr Thr Tyr Ser Lys

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 6

Arg Ala Lys Phe Lys Gln Leu Leu

1 5

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 7

Glu Pro Leu Pro Gln Gly Gln Leu Thr Ala Tyr

1 5 10

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 8

His Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu Tyr

1 5 10

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 9

Gln Ala Lys Trp Arg Leu Gln Thr Leu

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 10

Phe Leu Arg Gly Arg Ala Tyr Gly Leu

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 11

Arg Pro Pro Ile Phe Ile Arg Arg Leu

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 12

Tyr Pro Leu His Glu Gln His Gly Met

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 13

Arg Leu Arg Ala Glu Ala Gln Val Lys

1 5

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 14

Ala Val Phe Asp Arg Lys Ser Asp Ala Lys

1 5 10

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 15

Arg Arg Ile Tyr Asp Leu Ile Glu Leu

1 5

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 16

Glu Glu Asn Leu Leu Asp Phe Val Arg Phe

1 5 10

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 17

Gln Pro Arg Ala Pro Ile Arg Pro Ile

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 18

Ile Val Thr Asp Phe Ser Val Ile Lys

1 5

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 19

Tyr Leu Leu Glu Met Leu Trp Arg Leu

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 20

Pro Tyr Leu Phe Trp Leu Ala Ala Ile

1 5

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 21

Ile Glu Asp Pro Pro Phe Asn Ser Leu

1 5

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 22

Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys

1 5 10

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 23

Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu

1 5

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 24

Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Leu

1 5

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 25

Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Ser Leu

1 5

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 26

Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val

1 5

<210> 27

<211> 245

<212> PRT

<213> Epstein Barr Virus

<400> 27

Met Met Asp Pro Asn Ser Thr Ser Glu Asp Val Lys Phe Thr Pro Asp

1 5 10 15

Pro Tyr Gln Val Pro Phe Val Gln Ala Phe Asp Gln Ala Thr Arg Val

20 25 30

Tyr Gln Asp Leu Gly Gly Pro Ser Gln Ala Pro Leu Pro Cys Val Leu

35 40 45

Trp Pro Val Leu Pro Glu Pro Leu Pro Gln Gly Gln Leu Thr Ala Tyr

50 55 60

His Val Ser Thr Ala Pro Thr Gly Ser Trp Phe Ser Ala Pro Gln Pro

65 70 75 80

Ala Pro Glu Asn Ala Tyr Gln Ala Tyr Ala Ala Pro Gln Leu Phe Pro

85 90 95

Val Ser Asp Ile Thr Gln Asn Gln Gln Thr Asn Gln Ala Gly Gly Glu

100 105 110

Ala Pro Gln Pro Gly Asp Asn Ser Thr Val Gln Thr Ala Ala Ala Val

115 120 125

Val Phe Ala Cys Pro Gly Ala Asn Gln Gly Gln Gln Leu Ala Asp Ile

130 135 140

Gly Val Pro Gln Pro Ala Pro Val Ala Ala Pro Ala Arg Arg Thr Arg

145 150 155 160

Lys Pro Gln Gln Pro Glu Ser Leu Glu Glu Cys Asp Ser Glu Leu Glu

165 170 175

Ile Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys

180 185 190

Phe Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser

195 200 205

Ser Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Gln Met Cys Pro Ser

210 215 220

Leu Asp Val Asp Ser Ile Ile Pro Arg Thr Pro Asp Val Leu His Glu

225 230 235 240

Asp Leu Leu Asn Phe

245

<210> 28

<211> 944

<212> PRT

<213> Human Adenovirus 3

<400> 28

Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ala Tyr Met His Ile Ala

1 5 10 15

Gly Gln Asp Ala Ser Gly Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala

20 25 30

Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Ser Met Gly Asn Lys Phe Arg Asn Pro

35 40 45

Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu

50 55 60

Met Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu Asp Asn Thr Tyr Ser Tyr

65 70 75 80

Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met

85 90 95

Ala Ser Thr Phe Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser

100 105 110

Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly

115 120 125

Ala Pro Asn Thr Ser Gln Trp Ile Val Thr Thr Asn Gly Asp Asn Ala

130 135 140

Val Thr Thr Thr Thr Asn Thr Phe Gly Ile Ala Ser Met Lys Gly Gly

145 150 155 160

Asn Ile Thr Lys Glu Gly Leu Gln Ile Gly Lys Asp Ile Thr Thr Thr

165 170 175

Glu Gly Glu Glu Lys Pro Ile Tyr Ala Asp Lys Thr Tyr Gln Pro Glu

180 185 190

Pro Gln Val Gly Glu Glu Ser Trp Thr Asp Thr Asp Gly Thr Asn Glu

195 200 205

Lys Phe Gly Gly Arg Ala Leu Lys Pro Ala Thr Asn Met Lys Pro Cys

210 215 220

Tyr Gly Ser Phe Ala Arg Pro Thr Asn Ile Lys Gly Gly Gln Ala Lys

225 230 235 240

Asn Arg Lys Val Lys Pro Thr Thr Glu Gly Gly Val Glu Thr Glu Glu

245 250 255

Pro Asp Ile Asp Met Glu Phe Phe Asp Gly Arg Asp Ala Val Ala Gly

260 265 270

Ala Leu Ala Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn Val Asn Leu Glu

275 280 285

Thr Pro Asp Ser His Val Val Tyr Lys Pro Glu Thr Ser Asn Asn Ser

290 295 300

His Ala Asn Leu Gly Gln Gln Ala Met Pro Asn Arg Pro Asn Tyr Ile

305 310 315 320

Gly Phe Arg Asp Asn Phe Val Gly Leu Met Tyr Tyr Asn Ser Thr Gly

325 330 335

Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln Leu Asn Ala Val Val

340 345 350

Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln Leu Leu Leu Asp

355 360 365

Ser Leu Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met Trp Asn Gln Ala Val

370 375 380

Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn His Gly Ile Glu

385 390 395 400

Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Asn Gly Ile Gly Pro Gly

405 410 415

His Thr Tyr Gln Gly Ile Lys Val Lys Thr Asp Asp Thr Asn Gly Trp

420 425 430

Glu Lys Asp Ala Asn Val Ala Pro Ala Asn Glu Ile Thr Ile Gly Asn

435 440 445

Asn Leu Ala Met Glu Ile Asn Ile Gln Ala Asn Leu Trp Arg Ser Phe

450 455 460

Leu Tyr Ser Asn Val Ala Leu Tyr Leu Pro Asp Val Tyr Lys Tyr Thr

465 470 475 480

Pro Pro Asn Ile Thr Leu Pro Thr Asn Thr Asn Thr Tyr Glu Tyr Met

485 490 495

Asn Gly Arg Val Val Ser Pro Ser Leu Val Asp Ser Tyr Ile Asn Ile

500 505 510

Gly Ala Arg Trp Ser Leu Asp Pro Met Asp Asn Val Asn Pro Phe Asn

515 520 525

His His Arg Asn Ala Gly Leu Arg Tyr Arg Ser Met Leu Leu Gly Asn

530 535 540

Gly Arg Tyr Val Pro Phe His Ile Gln Val Pro Gln Lys Phe Phe Ala

545 550 555 560

Val Lys Asn Leu Leu Leu Leu Pro Gly Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Asn

565 570 575

Phe Arg Lys Asp Val Asn Met Val Leu Gln Ser Ser Leu Gly Asn Asp

580 585 590

Leu Arg Thr Asp Gly Ala Thr Ile Ser Phe Thr Ser Ile Asn Leu Tyr

595 600 605

Ala Thr Phe Phe Pro Met Ala His Asn Thr Ala Ser Thr Leu Glu Ala

610 615 620

Met Leu Arg Asn Asp Thr Asn Asp Gln Ser Phe Asn Asp Tyr Leu Ser

625 630 635 640

Ala Ala Asn Met Leu Tyr Pro Ile Pro Ala Asn Ala Thr Asn Ile Pro

645 650 655

Ile Ser Ile Pro Ser Arg Asn Trp Ala Ala Phe Arg Gly Trp Ser Phe

660 665 670

Thr Arg Leu Lys Thr Lys Glu Thr Pro Ser Leu Gly Ser Gly Phe Asp

675 680 685

Pro Tyr Phe Val Tyr Ser Gly Ser Ile Pro Tyr Leu Asp Gly Thr Phe

690 695 700

Tyr Leu Asn His Thr Phe Lys Lys Val Ala Ile Met Phe Asp Ser Ser

705 710 715 720

Val Ser Trp Pro Gly Asn Asp Arg Leu Leu Ser Pro Asn Glu Phe Glu

725 730 735

Ile Lys Arg Thr Val Asp Gly Glu Gly Tyr Asn Val Ala Gln Cys Asn

740 745 750

Met Thr Lys Asp Trp Phe Leu Val Gln Met Leu Ala Asn Tyr Asn Ile

755 760 765

Gly Tyr Gln Gly Phe Tyr Ile Pro Glu Gly Tyr Lys Asp Arg Met Tyr

770 775 780

Ser Phe Phe Arg Asn Phe Gln Pro Met Ser Arg Gln Val Val Asp Glu

785 790 795 800

Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Lys Ala Val Thr Leu Pro Tyr Gln His Asn

805 810 815

Asn Ser Gly Phe Val Gly Tyr Leu Ala Pro Thr Met Arg Gln Gly Glu

820 825 830

Pro Tyr Pro Ala Asn Tyr Pro Tyr Pro Leu Ile Gly Thr Thr Ala Val

835 840 845

Lys Ser Val Thr Gln Lys Lys Phe Leu Cys Asp Arg Thr Met Trp Arg

850 855 860

Ile Pro Phe Ser Ser Asn Phe Met Ser Met Gly Ala Leu Thr Asp Leu

865 870 875 880

Gly Gln Asn Met Leu Tyr Ala Asn Ser Ala His Ala Leu Asp Met Thr

885 890 895

Phe Glu Val Asp Pro Met Asp Glu Pro Thr Leu Leu Tyr Leu Leu Phe

900 905 910

Glu Val Phe Asp Val Val Arg Val His Gln Pro His Arg Gly Val Ile

915 920 925

Glu Ala Val Tyr Leu Arg Thr Pro Phe Ser Ala Gly Asn Ala Thr Thr

930 935 940

<210> 29

<211> 498

<212> PRT

<213> Influenza A Virus

<400> 29

Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp

1 5 10 15

Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Lys Met

20 25 30

Ile Asp Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys

35 40 45

Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu

50 55 60

Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Arg Tyr Leu Glu

65 70 75 80

Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile

85 90 95

Tyr Lys Arg Val Asp Gly Arg Trp Met Arg Glu Leu Val Leu Tyr Asp

100 105 110

Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Asp Asp

115 120 125

Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Met Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn

130 135 140

Asp Thr Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp

145 150 155 160

Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser

165 170 175

Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Ile Gly Thr Met Val Met Glu

180 185 190

Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg

195 200 205

Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ser Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn

210 215 220

Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Ala Met Met Asp

225 230 235 240

Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu

245 250 255

Ile Phe Ser Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His

260 265 270

Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Pro Ala Val Ser Ser Gly

275 280 285

Tyr Asn Phe Glu Lys Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe

290 295 300

Lys Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Tyr Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu

305 310 315 320

Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala

325 330 335

Ala Phe Glu Asp Leu Arg Leu Leu Ser Phe Ile Arg Gly Thr Lys Val

340 345 350

Ser Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn

355 360 365

Glu Asn Met Asp Asn Met Glu Ser Ser Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg

370 375 380

Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg

385 390 395 400

Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg

405 410 415

Asn Leu Pro Phe Glu Lys Ser Thr Val Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn

420 425 430

Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Ala Glu Ile Ile Arg Met Met

435 440 445

Glu Gly Ala Lys Pro Glu Glu Val Ser Phe Arg Gly Arg Gly Val Phe

450 455 460

Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Asn Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp

465 470 475 480

Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr

485 490 495

Asp Asn

<210> 30

<211> 574

<212> PRT

<213> Human Respiratory Syncytial Virus B

<400> 30

Met Glu Leu Leu Ile His Arg Leu Ser Ala Ile Phe Leu Thr Leu Ala

1 5 10 15

Ile Asn Ala Leu Tyr Leu Thr Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe

20 25 30

Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Arg Gly Tyr Phe Ser Ala Leu

35 40 45

Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile

50 55 60

Lys Glu Thr Lys Cys Asn Gly Thr Asp Thr Lys Val Lys Leu Ile Lys

65 70 75 80

Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu

85 90 95

Met Gln Asn Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Ala Pro

100 105 110

Gln Tyr Met Asn Tyr Thr Ile Asn Thr Thr Lys Asn Leu Asn Val Ser

115 120 125

Ile Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val

130 135 140

Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu

145 150 155 160

Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Asn Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys

165 170 175

Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val

180 185 190

Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asn Asn Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn

195 200 205

Gln Gln Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln

210 215 220

Gln Lys Asn Ser Arg Leu Leu Glu Ile Asn Arg Glu Phe Ser Val Asn

225 230 235 240

Ala Gly Val Thr Thr Pro Leu Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu

245 250 255

Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys

260 265 270

Leu Met Ser Ser Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile

275 280 285

Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro

290 295 300

Ile Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro

305 310 315 320

Leu Cys Thr Thr Asn Ile Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg

325 330 335

Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe

340 345 350

Pro Gln Ala Asp Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp

355 360 365

Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Ser Leu Cys Asn Thr

370 375 380

Asp Ile Phe Asn Ser Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr

385 390 395 400

Asp Ile Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys

405 410 415

Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile

420 425 430

Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp

435 440 445

Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Leu Glu Gly

450 455 460

Lys Asn Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Tyr Tyr Asp Pro

465 470 475 480

Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn

485 490 495

Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Arg Ser Asp Glu Leu

500 505 510

Leu His Asn Val Asn Thr Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr

515 520 525

Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Val Leu Leu Ser Leu Ile Ala Ile

530 535 540

Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Lys Asn Thr Pro Val Thr Leu Ser

545 550 555 560

Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Lys

565 570

<210> 31

<211> 252

<212> PRT

<213> Influenza A Virus

<400> 31

Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Val Pro

1 5 10 15

Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Asp Val Phe

20 25 30

Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Ala Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr

35 40 45

Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe

50 55 60

Thr Leu Thr Cys Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Val

65 70 75 80

Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Arg Ala

85 90 95

Val Lys Leu Tyr Arg Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala

100 105 110

Lys Glu Ile Ala Leu Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met

115 120 125

Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Ala Val Thr Thr Glu Val Ala Phe

130 135 140

Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg

145 150 155 160

Ser His Arg Gln Met Val Thr Thr Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu

165 170 175

Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met

180 185 190

Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala Ser Gln

195 200 205

Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Ala Ile Gly Thr His Pro Arg

210 215 220

Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asp Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr

225 230 235 240

Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys

245 250

Claims

1.一种用于确定对象的细胞介导的免疫能力的方法，其中，所述方法包括对包含来自所述对象的免疫细胞的样品进行细胞介导的免疫测定(CMI)，所述方法包括体外检测对肽池的免疫响应，其中，所述肽池由至少3种病毒抗原衍生。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞是外周血单核细胞(PBMC)。

3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞是T细胞。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肽池由至少4种、5种或6种病毒抗原衍生。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肽池由3种、4种或5种病毒抗原衍生。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述病毒抗原选自人3型腺病毒的六邻体蛋白、流感病毒的基质蛋白1(H3N2)、爱泼斯坦巴尔病毒的BZLF-1蛋白、流感病毒的核衣壳蛋白、呼吸道合胞病毒的融合糖蛋白G0。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述病毒抗原由人3型腺病毒的六邻体蛋白、呼吸道合胞病毒的融合糖蛋白G0和流感病毒的核衣壳蛋白组成。

8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述病毒抗原由人3型腺病毒的六邻体蛋白、流感病毒的基质蛋白1、流感病毒的核衣壳蛋白和呼吸道合胞病毒的融合糖蛋白G0组成。

9.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述病毒抗原由人3型腺病毒的六邻体蛋白、爱泼斯坦巴尔病毒的反式激活因子蛋白BZLF1和呼吸道合胞病毒的融合糖蛋白G0组成。

10.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述病毒抗原由以下蛋白组成：人3型腺病毒的六邻体蛋白；爱泼斯坦巴尔病毒的BALF-4、BMLF-1、BRLF-1、BZLF-1、EBNA-1、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-4、LMP-1和LMP-2蛋白；流感病毒的基质蛋白1；流感病毒的核衣壳蛋白；和呼吸道合胞病毒的融合糖蛋白G0。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述肽池包含一种或多种所述病毒抗原的一个或多个片段。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述肽池包含一种或多种所述病毒抗原中的每种病毒抗原的一个或多个片段。

13.根据权利要求11至12中任一项所述的方法，其特征在于，所述片段形成蛋白质片段文库，所述蛋白质片段文库涵盖衍生所述片段的所述病毒抗原的至少80％的序列。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述片段形成蛋白质片段文库，所述蛋白质片段文库涵盖衍生所述片段的所述病毒抗原的整个序列。

15.根据权利要求11至13所述的方法，其特征在于，所述片段具有重叠序列。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述序列以11个氨基酸重叠。

17.根据权利要求11至16的方法，其特征在于，所述片段的长度为15个氨基酸。

18.一种参考所附说明书和/或附图中的任一幅的基本上如本文所述的方法。